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一种防治常见肠道致病菌的复方发酵中药饲料添加剂的制备方法及其用途
申请号	CN202210755888.4	申请日	2022-06-29	公开(公告)号	CN115211501B	公开(公告)日	2023-12-26
申请人	陈华友;			发明人	陈华友; 卢晨曦; 陈曦华; 蔡康涛; 姚丹; 陈华撑;
摘要	本发明属于生物饲料领域，具体涉及一种防治常见肠道致病菌的复方发酵中药饲料添加剂的制备方法及其用途；步骤为：活化菌株、培养得到芽孢杆菌、酵母菌和乳酸菌发酵种子液；将研磨成粉的复方中药材与豆粕、次粉混合后，添加复合酶得到发酵培养基，接种芽孢杆菌发酵种子液、酵母菌发酵种子液以及乳酸菌发酵种子液，在密闭条件下进行厌氧发酵后得到成品；本发明采用复方中药材进行菌酶协同发酵，发酵彻底，富含益生菌、有机酸等益生物质，可有效提养殖动物的肠道消化水平和免疫力等方面；针对对肠炎沙门氏菌、大肠杆菌、福氏志贺菌造成的细菌感染有显著的防治效果，且使用方便，利于工业生产、经济效益高。
权利要求	1.一种防治常见肠道致病菌的复方发酵中药饲料添加剂的制备方法，其特征在于，制备步骤如下：（1）配制中药发酵培养基：将复方中药材研磨成细粉，和豆粕、次粉、复合酶充分混合，得到固态发酵培养基；发酵培养基的各组分重量百分含量分别为：复方中药材30 70%； ~ 豆粕18 46%； ~ 次粉12 24%；复合酶添加量0.1 10%； ~ ~ 所述复方中药材由黄连、五味子、知母、五倍子、大黄、黄芩、甘草、诃子、儿茶按照等质量比例混合而成；所述复合酶由纤维素酶、半纤维素酶和单宁酶组成；（2）将芽孢杆菌、酵母菌和乳酸菌分别接种到相应的液体培养基进行活化培养，分别得到芽孢杆菌发酵种子液、酵母菌发酵种子液和乳酸菌发酵种子液；所述的芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌；所述酵母菌为热带假丝酵母；所述乳酸菌为植物乳杆菌、干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌；（3）接种步骤（2）得到的芽孢杆菌发酵种子液、酵母菌发酵种子液、乳酸菌发酵种子液于步骤（1）得到的发酵培养基中，调整发酵温度以及培养基的含水量，混合均匀，得到发酵混合物，在密闭条件下进行厌氧发酵后得到防治肠道致病菌的发酵中药饲料添加剂。 2.根据权利要求1所述的一种防治常见肠道致病菌的复方发酵中药饲料添加剂的制备方法，步骤（1）中所述豆粕在使用时需要烘干、研磨成粉末状使用；所述粉末是过50‑80目筛得到；所述复方中药材研磨成粉末状使用，所述粉末是过50目筛得到，所述纤维素酶、半纤维素酶、单宁酶的质量比为2:2:3；所述复合酶中，半纤维素酶酶活力为5万u/g，纤维素酶和单宁酶的酶活均为1万u/g。 3.根据权利要求1所述的一种防治常见肠道致病菌的复方发酵中药饲料添加剂的制备方法，其特征在于，步骤（3）中所述芽孢杆菌发酵种子液和酵母菌发酵种子液接种时的用量 7 与发酵培养基关系均为0.1 9mL：100g；所述芽孢杆菌和酵母菌的活菌总数均为1.0×10~ ~ 9 2.8×10cfu/mL；所述乳酸菌发酵种子液为植物乳杆菌发酵种子液、干酪乳杆菌发酵种子液和鼠李糖乳 8 9 杆菌发酵种子液，活菌总数为1.5×10 3.5×10 cfu/mL，所述乳酸菌发酵种子液的接种量~ 与发酵培养基关系为0.8 5.7mL：100g；所述乳酸菌发酵种子液、芽孢杆菌发酵种子液和酵~ 母菌发酵种子液接种时的体积比为2：2：3。 4.根据权利要求3所述的一种防治常见肠道致病菌的复方发酵中药饲料添加剂的制备方法，其特征在于，所述芽孢杆菌发酵种子液和酵母菌发酵种子液接种时的用量与发酵培养基关系均为2mL：100g。 5.根据权利要求1所述的一种防治常见肠道致病菌的复方发酵中药饲料添加剂的制备方法，其特征在于，步骤（3）中所述发酵混合物的含水量为40% 60%；所述发酵时间为5 20~ ~ 天，发酵温度为24 38℃。 ~ 6.根据权利要求1 5任一项所述的方法制备的复方发酵中药饲料添加剂。 ~ 7.根据权利要求6所述的复方发酵中药饲料添加剂在制备抑制肠道致病菌水产养殖饲料中的用途，其特征在于，所述肠道致病菌具体为肠炎沙门氏菌、大肠杆菌或福氏志贺菌。 8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，具体操作是：将复方发酵中药饲料添加剂添加到水产饲料中得到水产养殖饲料；所述复方发酵中药饲料添加剂的添加量占混合饲料的重量为5% 25%。 ~
说明书全文	一种防治常见肠道致病菌的复方发酵中药饲料添加剂的制备方法及其用途技术领域 [0001] 本发明属于生物饲料领域，具体涉及一种防治常见肠道致病菌的复方发酵中药饲料添加剂的制备方法及其用途。背景技术 [0002] 肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)、大肠杆菌(Escherichia coli)、福氏志贺菌(Shigella flexneri)是三种较为常见的肠道条件致病菌。如肠炎沙门氏菌是人畜共患病，具有极其广泛的动物宿主如哺乳类、鱼类、两栖类、鸟类、爬行类等等，感染动物后常导致严重疾病，它还是第二大食源致病菌人食用带菌的食物，会引起食物中毒，引发肠胃炎症、败血症等疾病。大肠杆菌，在自然界中广泛存在。大肠杆菌O157：H7是其的一个分型，其会导致动物源性传染病，会感染鸡、鸭、猪、牛、鱼类等养殖动物，且还会感染人类，引发出血性肠炎和溶血性尿毒症，危害人的生命。福氏志贺氏菌是一种革兰氏阴性致病菌，可引起细菌性痢疾，导致肠道的炎症反应。除感染人之外，还有研究表明鸡、鸭、兔、牛、鼠、犬、猕猴等动物幼崽也易感染此菌，对幼龄动物危害较为严重，导致动物腹泻、肠出血等情况。研究证实，这三种肠道致病菌虽然是条件致病菌，若其菌量爆发会在养殖业中会造成巨大的影响，为防治疾病养殖户往往盲目添加抗生素产品，随着抗生素的禁用，亟需寻找新的抗生素替代品。 [0003] 目前已经有部分研究将发酵中药用于动物养殖和疾病的防治，但其均未针对特定的病原菌进行发酵中药饲料添加剂的配方中药进行筛选设计，如专利CN113648393A和CN113521212A，其用于禽类养殖，以抵御养殖过程中的肠道疾病及其他器官炎症的产生，但其选择的中药未经过筛选，只是根据中药自身的特性进行简单叠加，针对病原菌不具有特异性。发明内容 [0004] 针对现有技术存在的问题，本发明提供一种防治常见的肠道致病菌的复方发酵中药饲料添加剂的制备方法及在养殖业中应用；本发明针对三种主要的肠道条件致病菌(肠炎沙门氏菌、大肠杆菌、福氏志贺菌)的抑菌中药进行了筛选，得到了一组对常见肠道致病菌具有较强抑制能力的复方中药材并将其进行发酵；通过改变不同中药与辅料的添加比例，来探究该复方中药材与发酵菌种之间的关系，以得到最适的中药添加比例。得到的饲料添加剂中富含益生菌，可有效提升养殖动物的免疫力，具还有酸香味和一定抑菌作用，便于贮藏。 [0005] 最后将制备的复方中药饲料添加剂用于动物养殖(中华鳖)；实验结果表明其在长期饲喂是能有效提升中华鳖的免疫功能，肠道消化水平等，在短期致病菌攻毒实验中，可有效提升中华鳖稚鳖的存活率。本发明所述的发酵中药可作为一个优质的饲料添加剂用于养殖业，且其针对常见的肠道致病菌如肠炎沙门氏菌、大肠杆菌、福氏志贺菌均有意想不到的防治效果。 [0006] 为实现上述发明目的，本发明采取的技术方案具体如下： [0007] (1)配制中药发酵培养基：将复方中药材研磨成细粉，和豆粕、次粉、复合酶充分混合，得到固态发酵培养基； [0008] 发酵培养基的各组分重量百分含量分别为：复方中药材30～70％；豆粕18～46％；次粉12～24％；复合酶添加量0.1～10％； [0009] 所述复方中药材由黄连、五味子、知母、五倍子、大黄、黄芩、甘草、诃子、儿茶按照等质量比例混合而成； [0010] 所述复合酶由纤维素酶、半纤维素酶和单宁酶组成； [0011] (2)将芽孢杆菌、酵母菌和乳酸菌分别接种到相应的液体培养基进行活化培养，分别得到芽孢杆菌发酵种子液、酵母菌发酵种子液和乳酸菌发酵种子液； [0012] (3)接种步骤(2)得到的芽孢杆菌种子液、酵母菌种子液、乳酸菌种子液于步骤(1)得到的发酵培养基中，调整发酵温度以及培养基的含水量，混合均匀，得到发酵混合物，在密闭条件下进行厌氧发酵后得到防治肠道致病菌的复方发酵中药饲料添加剂。 [0013] 优选的，步骤(1)中所述豆粕在使用时需要烘干、研磨成粉末状使用；所述粉末是过50目筛得到；所述复方中药材研磨成粉末状使用，所述粉末是过50目筛得到。 [0014] 所述纤维素酶、半纤维素酶、单宁酶的质量比为2:2:3；所述，复合酶中，半纤维素酶酶活力为5万u/g，纤维素酶和单宁酶的酶活均为1万u/g。 [0015] 优选的，所述发酵培养基的各组分重量百分含量分别为：复方中药材50％；豆粕30％；次粉20％；复合酶添加量1％。 [0016] 优选的，步骤(2)中所述的芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌；所述酵母菌为热带假丝酵母；所述乳酸菌为植物乳杆菌、干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌。 [0017] 优选的，步骤(3)中所述芽孢杆菌发酵种子液和酵母菌发酵种子液的接种量均为发酵培养基重量的0.1％～9％(V/W，mL/g；即种子液与培养基的用量关系为0.1～9mL：7 9 100g)；所述芽孢杆菌和酵母菌的活菌总数均为1.0×10～2.8×10cfu/mL； [0018] 所述乳酸菌发酵种子液为植物乳杆菌发酵种子液、干酪乳杆菌发酵种子液和鼠李8 9 糖乳杆菌发酵种子液，活菌总数为1.5×10～3.5×10cfu/mL，接种量为发酵培养基重量的 0.8％～5.7％(V/W，mL/g；即种子液与培养基的用量关系为0.8～5.7mL：100g)； [0019] 所述乳酸菌发酵种子液、芽孢杆菌发酵种子液和酵母菌发酵种子液接种时的体积比为2：2：3。 [0020] 优选的，所述芽孢杆菌发酵种子液和酵母菌发酵种子液的接种量均为发酵培养基重量的2％(V/W，mL/g)。 [0021] 优选的，步骤(3)中所述发酵混合物的含水量为40％～60％；所述发酵时间为5～20天，发酵温度为24～38℃。 [0022] 本发明所制备的添加剂用于添加到水产养殖饲料中抑制肠道致病菌的用途；所述肠道致病菌具体为肠炎沙门氏菌、大肠杆菌或福氏志贺菌；具体操作是：将发酵饲料添加剂添加到水产饲料中得到混合饲料进行喂养；所述复方发酵中药饲料添加剂的添加量占混合饲料的重量为5％～25％。 [0023] 技术方案的具体筛选过程如下： [0024] (1)中药原料的筛选： [0025] 从45种抑菌中药(乌梅、天冬、山茱萸、大蒜、五味子、黄连、鱼腥草、连翘、虎杖、马齿苋、青皮、知母、秦皮、夏枯草、苏木、地锦草、白头翁、诃子、艾叶、黄芩、黄芪、黄柏、五倍子、野菊花、女贞子、白术、板蓝根、银杏叶、蒲公英、荆芥、当归、杜仲、大黄、赤芍、杜仲叶、山楂、儿茶、地黄、甘草、川穹、金银花、大青叶、苍耳子、石榴皮、穿心莲)中，通过抑菌实验筛选得到发酵前后对肠炎沙门氏菌、大肠杆菌、福氏志贺菌具有较强抑菌效果的中药。抑菌实验采用琼脂扩散法，抑菌圈大小见表1、表2、表3。 [0026] 表1发酵前后中药原料对肠炎沙门氏菌抑菌圈的大小 [0027] [0028] [0029] 注：发酵前与发酵后抑菌圈直径每列中，标注相同大写字母的表示差异不显著(P＞0.05)，标注不同大写字母表示差异显著(P＜0.05)。不同中药发酵前后抑菌圈直径每行中，标注相同小写字母的表示差异不显著(P＞0.05)，标注不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)，且字母由先到后表示抑菌圈大小由大到小排列。“/”表示无抑菌效果。 [0030] 表2不同发酵中药饲料对大肠杆菌抑菌圈大小 [0031] [0032] [0033] 注：发酵前与发酵后抑菌圈直径每列中，标注相同大写字母的表示差异不显著(P＞0.05)，标注不同大写字母表示差异显著(P＜0.05)。不同中药发酵前后抑菌圈直径每行中，标注相同小写字母的表示差异不显著(P＞0.05)，标注不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)，且字母由先到后表示抑菌圈大小由大到小排列。“/”表示无抑菌效果。 [0034] 表3发酵前后中药原料对福氏志贺菌抑菌圈的大小 [0035] [0036] 注：发酵前与发酵后抑菌圈直径每列中，标注相同大写字母的表示差异不显著(P＞0.05)，标注不同大写字母表示差异显著(P＜0.05)。不同中药发酵前后抑菌圈直径每行中，标注相同小写字母的表示差异不显著(P＞0.05)，标注不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)，且字母由先到后表示抑菌圈大小由大到小排列。“/”表示无抑菌效果。 [0037] 根据实验结果显示，在针对肠炎沙门氏菌抑菌实验中，黄连、五味子、知母、五倍子表现出具有较强的抑菌能力。在针对大肠杆菌抑菌实验中，五倍子、大黄、黄芩、甘草表现出具有较强抑菌效果。在针对福氏志贺菌抑菌实验中，诃子、儿茶、五倍子、黄芩表现出具有较好地抑菌能力。综合抑菌结果，选择黄连、五味子、知母、五倍子、大黄、黄芩、甘草、诃子、儿茶，这九味中药材作为发酵原料。 [0038] (2)复方发酵中药饲料添加剂中部分关键中药材药效成分的鉴定 [0039] 1.黄芩发酵前后药效成分变化 [0040] A:色谱条件：采用月旭XB‑C18(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱，以甲醇(A)‑0.1％磷酸溶液(B)为流动相，梯度洗脱(0～10min，15％A→45％A，85％B→55％B；10～20min，45％A→57％A，55％B→43％B；20～40min，57％A→85％A，43％B→15％B)，检测波长为335nm，流速为0.8mL/min，进样量：10μL。 [0041] B:标准品溶液的制备 [0042] 精密称取黄芩苷、黄芩素、槲皮素标准品各20mg，60％甲醇溶解定容至10mL，作为标准品母液。将黄芩苷、黄芩素、槲皮素标准品母液各吸取1mL混合，作为混合标准品母液，准备完成后置于4℃冰箱备用。 [0043] C:中药浸提液制备 [0044] 黄芩发酵饲料添加剂制备方法为：黄芩50％(W/W)、豆粕30％(W/W)、次粉20％(W/W)。取用各个单一菌种的酵母菌菌液、芽孢杆菌菌液、乳酸菌菌液(培养至对数生长期)进行复方中药饲料添加剂的发酵，以10％(V/W，mL/g)的添加量加入到发酵原料中，加入蒸馏水控制含水量为50％(V/W，mL/g)翻拌均匀后，置于单向透气孔的发酵袋中置于30℃培养箱中厌氧发酵7天。 [0045] 五倍子发酵饲料添加剂制备方法为：五倍子50％(W/W)、豆粕30％(W/W)、次粉20％(W/W)。其他发酵条件及方法同黄芩发酵饲料添加剂制备。 [0046] 称取黄芩发酵饲料添加剂、五倍子发酵饲料添加剂1g于50mL锥形瓶中，加入10mL 60％甲醇溶液浸提30min；过滤取上清液，置于4℃冰箱保存备用。 [0047] 黄芩素、黄芩苷、槲皮素及黄芩发酵前后色谱图见图1。黄芩发酵后其黄芩素为9.99mg/g，为发酵前2.59mg/g的3.86倍。其槲皮素为4.99mg/g，为发酵前4.49mg/g的1.11倍。黄芩其主要有效成分为黄芩苷和黄芩素等，其具有抗菌抗病毒、抗氧化、抗肿瘤、保肝等等多种作用。而中药药理学研究显示，黄芩素抑制HIV‑1的活性及细胞毒性均强于黄芩苷，其利尿、抗真菌等作用也明显优于黄芩苷。药代动力学研究表明黄芩苷口服不易于被有机体，需要在肠道中经β－葡萄糖醛酸苷酶的水解后转化为黄芩素，黄芩素又经小肠黏膜中肠道内的尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶转化为黄芩苷后被吸收入血。本研究测定结果显示，发酵后黄芩中的黄芩苷减少，黄芩素含提升，可推断微生物发酵过程中可预先将黄芩中一部分黄芩苷转化为黄芩素，使其更易于机体的吸收和利用。这与汪研究相互佐证，发酵菌种中有产β‑葡萄糖醛酸酶的菌株，将黄芩中的黄芩苷转化为黄芩素。根据抑菌实验可观察到，经过发酵后其针对多种致病菌抑菌能力有所增强，其可能原因除了发酵后饲料中有机酸、抗菌肽的增加外，还可能为黄芩饲料中黄芩素含量的增加有关。 [0048] 2.五倍子发酵前后药效成分变化 [0049] A:没食子酸测定色谱条件：采用月旭XB‑C18(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱，以甲醇(A)‑0.1％磷酸溶液(B)为流动相，流动相以相同比例洗脱。甲醇(A)‑0.1％磷酸溶液(B)＝15：85。检测波长为270nm，流速为0.8mL/min，进样量：10μL。 [0050] B:标准品溶液的制备 [0051] 精密称取没食子酸标准品20mg，60％甲醇溶解定容至10mL，作为标准品母液，准备完成后置于4℃冰箱备用。 [0052] C:中药浸提液制备 [0053] 称取黄芩发酵饲料添加剂、五倍子发酵饲料添加剂1g于50mL锥形瓶中，加入10mL 60％甲醇溶液浸提30min。过滤取上清液，置于4℃冰箱保存备用。 [0054] 黄芩素、黄芩苷、槲皮素、没食子酸标准曲线见表4。 [0055] 表4.药效成分标准曲线 [0056] [0057] [0058] 没食子酸及发酵前后的色谱图见图2；五倍子发酵前没食子酸含量为1.20mg/g，发酵后没食子酸含量提升至5.78mg/g，为发酵前的4.82倍。五倍子主要成分是单宁类物质，如单宁酸、没食子酸等，具有较强的广谱抑菌效果。有研究表明单宁酸，具有抗菌、抗病毒、抗氧化等功效，但其缺点是具有抗营养作用，会与蛋白质、金属离子等反应，不易被有机体利用。而没食子酸，其也具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗氧化的功效，除此之外有研究表明其还有保肝、保护心脑血管、降血糖、降血脂、抗肿瘤等功能，但报道其没有抗营养作用，更有利于机体利用。实验结果表明五倍子经过发酵后，其没食子酸含量大幅提升，单宁酸含量减少。微生物发酵产生单宁酶可水解单宁生成没食子酸。 [0059] (3)发酵菌种的筛选 [0060] 发酵菌种的筛选：不同发酵菌种作用于复方中药会对复方中药产生不同的效果。因此，对发酵菌种进行筛选，以达到有效提升中药药效成分是十分有必要的。 [0061] 以复方中药、豆粕和次粉为发酵原料； [0062] 取用各个单一菌种的培养菌液进行复方中药饲料添加剂的发酵，以10％(V/W，mL/g)的添加量加入到发酵原料中，加入蒸馏水控制含水量为50％(V/W，mL/g)翻拌均匀后，置于单向透气孔的发酵袋中置于30℃培养箱中厌氧发酵，发酵7d后，得到不同单菌的复方发酵中药饲料添加剂；检测其药效成分变化，药效成分变化采用UV法测定其总多酚含量。 [0063] 其中发酵菌种分别为酿酒酵母、产朊假丝酵母、热带假丝酵母、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、发酵乳杆菌、乳双歧乳杆菌和植物乳杆菌 [0064] 发酵原料为(质量百分比)：复方中药材50％(黄连、五味子、知母、五倍子、大黄、黄芩、甘草、诃子、儿茶按照等质量比例混合)、豆粕30％、次粉20％。 [0065] 总酚测定方法： [0066] 1.总酚标准曲线的制作 [0067] 准确称取10mg(精确至0.1mg)没食子酸标准品，用蒸馏水溶解定容至50mL，此溶液中没食子酸含量为200mg/L，即为标准储备液，将其置于4℃冷柜中避光放置。 [0068] 准确量取标准储备液0.0，0.2，0.4，0.6，1.0，1.5mL分别加入10mL定容瓶中，用60％甲醇溶液定容，得到不同浓度的没食子酸溶液。然后分别移取不同浓度的没食子酸 1.0mL于20mL具塞试管中，加入2.5mL 0.1mol/L福林酚试剂，混匀，加入2.5mL 20％Na2CO3溶液，加水定容至10mL刻度线，混匀。在35℃水浴40min，取出后室温冷却避光静置20min。配制成浓度为0、4、8、12、20、30mg/L的标准浓度溶液，在765nm处测定其吸光度值，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。 [0069] 2.样品总酚的测定 [0070] 吸取1.0mL不同单菌的复方发酵中药饲料添加剂样品浸提液于20mL比色管中，2.5mL 0.1mol/L福林酚试剂，摇匀，加入2.5mL 20％Na2CO3溶液，加水定容至10mL刻度线，摇匀。在35℃水浴40min，取出后室温冷却避光静置20min，在765nm处测定其吸光度值。根据标准曲线计算待测液中总多酚的浓度。 [0071] 总酚标准曲线见图3，不同单菌复方发酵中药饲料添加剂发酵后总酚测定结果见图4；通过总酚的测定结果可观察到，不同的菌种单菌发酵均能在一定程度上提升其总酚的含量。在酵母菌中，热带假丝酵母可将中药中的总酚含量提升至发酵前的142.25％，为酵母菌中最高。在芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌提升总酚能力最强，可将中药中的总酚提高至发酵前的139.29％。在乳酸菌中，干酪乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌具有较好的效果，可将中药中的总酚提升至发酵前的135.82％以上。因此选择热带假丝酵母、解淀粉芽孢杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌作为发酵菌种。 [0072] (4)最适中药添加比例的确定 [0073] 经过抑菌实验结果显示，配方所选的中药具有广谱抑菌效果，对于发酵菌种其也可能会有一定的影响，因此需要确定一个合适的中药添加比例，以使其既可以发挥抑菌中药的抑菌效果，又能使发酵菌种生长。 [0074] 本发明通过改变发酵中不同的复方中药材添加比例。通过PMA‑qPCR检测的方法，测定发酵过程中，不同中药添加比例组别中发酵菌株的活菌数，探究复方中药与发酵菌株之间的关系，寻找得到一组既不影响发酵菌种生长，又可以发挥中药的抗菌作用的中药添加比例。 [0075] 将黄连、五味子、知母、五倍子、大黄、黄芩、甘草、诃子、儿茶按照等质量比例混合，为复方中药预混料。将豆粕次粉按照6:4的质量比混合，作为辅料预混料，设计七组实验，以复方中药和辅料预混料的混合物作为发酵原料，两者的质量和为100％，其中复方中药预混料添加质量比例分别为0％、10％、30％、50％、70％、90％、100％；发酵菌种以菌液的形式添加，添加量占发酵原料的2％(V/W，mL/g)，含水量为50％(V/W，mL/g)，发酵温度30℃；通过PMA‑qPCR的方法测定其发酵过程中的菌群变化。 [0076] Ⅰ.解淀粉芽孢杆菌在不同中药添加比例下其菌量的变化 [0077] 不同中药添加比例下，解淀粉芽孢杆菌的在发酵过程中的菌量变化如图5。可以观2 3 察到0％、10％中药添加组别中的解淀粉芽孢杆菌菌量都处于一个极低的水平(仅为10、10数量级)，并没有呈现增长生殖的现象。而随着中药的增加，其菌量不断地增加，其中50％、 70％、90％、100％中药添加量在发酵第7天仍维持在一个较高的菌量水平，分别为1.53* 5 5 5 5 10、1.9110、1.4610、1.3010copies/g。约是0％中药添加的200余倍。 [0078] 实验结果在一定程度上说明，该配方的复方中药添加对解淀粉芽孢杆菌的生长有益。在中药添加量为70％以下时，中药添加量越大，其增益效果越明显。但超过70％时，其增益效果有所下降。 [0079] Ⅱ.热带假丝酵母在不同中药添加比例下其菌量的变化 [0080] 不同中药添加比例下，热带假丝酵母在发酵过程中的菌量变化如图6。实验结果显示，发酵第1天时候，在中药添加量为0％～50％时，热带假丝酵母的菌量随着中药添加量的8 增加而增加。发酵第1天，中药添加量为50％时，酵母菌菌量最大，为6.2210 copies/g，是 0％中药添加量菌量的3.68倍。但中药添加量过高时(90％、100％)其对酵母菌的生长有一 7 定的抑制作用，其100％中药添加组在发酵第1天时，其菌量为6.8310copies/g，仅为50％中药添加组别的10.98％。但在发酵第7天时，高浓度的中药添加组别热带假丝酵母仍维持 8 8 一个较高的菌量，70％、90％、100％中药添加量组别菌量分别为2.0910、4.3210、2.07 8 10copies/g。 [0081] 实验结果在一定程度上说明，中药的添加对热带假丝酵母生长有利。 [0082] Ⅲ.干酪乳杆菌在不同中药添加比例下其菌量的变化 [0083] 不同中药添加比例下，干酪乳杆菌的在发酵过程中的菌量变化如图7。在发酵第1天时，低浓度的中药添加能有效提升发酵乳杆菌的菌量，但高浓度的中药添加会使其生长9 受到抑制。如10％中药添加组别，其干酪乳杆菌菌量为1.0110copies/g，是100％中药添 6 加量组别菌量6.2110 copies/g的162.64倍。在发酵第7天时，0％～50％中药添加组别的 8 4 干酪乳杆菌菌量仍能维持在10，但100％中药添加组别仅为10数量级。 [0084] Ⅳ.植物乳杆菌在不同中药添加比例下其菌量的变化 [0085] 不同中药添加比例下，植物乳杆菌的在发酵过程中的菌量变化如图8。实验结果显9 示在发酵第1天时，0％中药添加组别的植物乳杆菌菌量最大，为1.8510copies/g，其他组 8 别菌量均有所减少，但仍有10 数量级别。说明在发酵初期，中药添加对植物乳杆菌生长有微弱的抑制作用。但在发酵第7天，实验结果显示，一定量的中药添加(10％、30％、50％、 8 7 70％)能使菌量维持在10数量级别。而无中药添加组别的菌量仅为1.9010。说明一定量的中药的添加对植物乳杆菌的生长有益。但当中药添加量过高时，其植物乳杆菌生长受到抑 6 制，如当中药添加量为100％时，在发酵第1天，植物乳杆菌菌量仅为1.8410 copies/g，仅为0％中药添加组别的0.10％。 [0086] Ⅴ.鼠李糖乳杆菌在不同中药添加比例下其菌量的变化 [0087] 不同中药添加比例下，鼠李糖乳杆菌的在发酵过程中的菌量变化如图9。在发酵第6 1天时，当中药添加量为30％时，其鼠李糖乳杆菌菌量最大，为6.2010copies/g，是0％中 5 药添加组别菌量4.0110copies/g的15.46倍。当中药添加量为100％时，其菌量仅为3.32 3 10copies/g，仅为30％中药添加组别的0.05％。在发酵第7天是，50％中药添加组别鼠李糖 4 4 乳杆菌菌量最大，为5.4210copies/g，是0％中药添加组别菌量1.0610copies/g的5.11 2 倍。而100％中药添加组别菌量仅为2.8410 copies/g，仅为50％中药添加组别菌量的 0.52％。实验结果显示，少量的中药添加对鼠李糖乳杆菌生长有益，大量中药添加对鼠李糖乳杆菌生长不利。 [0088] 根据各个菌在不同中药添加比例中的菌量结果，综合考虑选择50％的中药添加比例作为后续用于实验的中药添加比例。在该中药添加比例下，各个发酵菌种均具有较好的生长，且中药添加量不至于过低影响其药效成分作用效果。 [0089] (5)最适酶添加量的确定 [0090] 由于复方中药中富含丰富的木质纤维素成分和单宁酶成分，因此，选择添加木质纤维素酶和单宁酶为发酵用酶。通过改变不同酶添加量，测定发酵前后总多酚的变化，确定最适的酶添加量。将黄连、五味子、知母、五倍子、大黄、黄芩、甘草、诃子、儿茶按照等比例混合，为复方中药预混料。将豆粕次粉按照一定比例混合(豆粕60％、次粉40％)，作为辅料预混料；然后以复方中药和辅料预混料的混合物作为发酵原料，两者的质量和为100％，[0091] 复合酶由纤维素酶、半纤维素酶、单宁酶以质量比2:2:3组成，添加量分为占发酵原料的质量百分比为0％、2％、4％、6％、8％、10％、12％； [0092] 实验结果见图10。结果显示，随着复合酶的添加，复方发酵中药饲料添加剂中的总酚含量不断增加，在大于1％时，其增幅趋于平缓。其可能原因为酶的添加，可帮助水解植物细胞壁成分，使胞内的多酚类物质更易释放出胞外。酶添加量为8％时，相较与前几个添加量组别有总酚微微下降的趋势。其原因可能为底物量一定，酶的量已经达到饱和，因此对总酚的增加没有那么显著的增益。且酶添加量过高，导致每克发酵中药添加剂中，中药占比减少，因此其每克发酵中药添加剂中的总酚含量降低。 [0093] 虽然在酶的添加量为6％时，其总酚含量最高，为30.42mg/g。但考虑到1％酶添加的组别其总酚含量与6％组别相差不大，为29.33mg/g。出于经济角度考虑，选择1％添加量。 [0094] 本发明的有益效果： [0095] (1)本发明针对三种主要的肠道条件致病菌(肠炎沙门氏菌、大肠杆菌、福氏志贺菌)的抑菌中药进行了筛选，得到了一组对常见肠道致病菌具有较强抑制能力的复方中药材并将其进行发酵。并针对发酵菌种、酶、对中药与辅料的添加比例和发酵菌种的生长关系进行了创造性的研究，得到最适的中药添加比例。最后将制备的复方发酵中药饲料添加剂用于动物养殖(如中华鳖)，实验结果表明其在长期饲喂是能有效提升中华鳖的免疫功能，肠道消化水平等，在短期致病菌攻毒实验中，可有效提升中华鳖稚鳖的存活率；并对常见的肠道致病菌如肠炎沙门氏菌、大肠杆菌、福氏志贺菌均有极好的防治效果。 [0096] (2)本发明首先通过抑菌实验筛选得到针对常见的肠道致病菌如肠炎沙门氏菌、大肠杆菌、福氏志贺菌具有较好抑菌效果的中药材；将复方中药材进行发酵处理，使其药效成分提升或转化为其它易于吸收的药效成分，且该饲料添加剂中富含益生菌，可有效提升养殖动物的免疫力，具还有酸香味和一定抑菌作用，便于贮藏。附图说明 [0097] 图1为黄芩素、黄芩苷、槲皮素及黄芩发酵前后色谱图；其中(a)黄芩苷标准峰、(b)黄芩素标准峰、(c)槲皮素标准峰、(d)黄芩发酵前色谱图、(e)黄芩发酵后色谱图； [0098] 图2为没食子酸及发酵前后的色谱图；其中(a)没食子酸标准峰、(b)五倍子发酵前标准峰、(c)五倍子发酵后标准峰； [0099] 图3为总酚的标准曲线图； [0100] 图4为不同菌株发酵中药后的总酚含量图； [0101] 图5为发酵过程中不同中药添加比例下解淀粉芽孢杆菌菌量的变化曲线图； [0102] 图6为发酵过程中不同中药添加比例下热带假丝酵母菌菌量的变化曲线图； [0103] 图7为发酵过程中不同中药添加比例下干酪乳杆菌菌量的变化曲线图； [0104] 图8为发酵过程中不同中药添加比例下植物乳杆菌菌量的变化曲线图； [0105] 图9为发酵过程中不同中药添加比例下鼠李糖乳杆菌菌量的变化曲线图； [0106] 图10为不同复合酶添加量对复方发酵中药饲料添加剂总酚的影响； [0107] 图11为中华鳖肠道石蜡切片；其中(a)为发酵中药组；(b)为中药组；(c)为全价粉料组。 [0108] 具体实施方法 [0109] 下面结合具体实施例对本发明作进一步描述。 [0110] 其中，漆酶购自于山东苏柯汉生物科技有限公司，酶活为10000U/g。酸性纤维素酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、单宁酶均购自于夏盛(北京)生物科技开发有限公司，酶活均为10000U/g。β‑葡聚糖酶购自于夏盛(北京)生物科技开发有限公司，酶活为50000U/g。 [0111] 菌种来源：Ⅰ芽孢杆菌：解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)；Ⅱ酵母菌：热带假丝酵母(Candida tropicalis)；Ⅲ乳酸菌：干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)ATCC11578、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CGMCC 1.577、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。 [0112] 实施例1： [0113] (1)芽孢杆菌、酵母菌和乳酸菌的活化培养： [0114] A、首先配置芽孢杆菌、酵母菌和乳酸菌的培养基； [0115] 芽孢杆菌液体和固体培养基：胰蛋白胨10g，氯化钠10g，酵母粉5g，蒸馏水1L，pH自然，121℃灭菌20min，芽孢杆菌固体培养基的成分同液体培养基；区别是加入琼脂15g。 [0116] 酵母菌液体和固体培养基：200g马铃薯煮软后8层纱布滤汁，葡萄糖20g，磷酸二氢钾3g，硫酸镁1.5g，蒸馏水定容至1L，pH自然，121℃灭菌20min；酵母菌固体培养基的成分同液体培养基，区别是加入琼脂15g； [0117] 乳酸菌液体和固体培养基：牛肉膏10g，胰蛋白胨10g，葡萄糖20g，酵母粉5g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸氢二铵2g，无水乙酸钠5g，吐温80 1mL，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，蒸馏水1L，pH7.2，121℃灭菌20min；乳酸菌固体培养基的成分同液体培养基，区别是加入琼脂15g； [0118] B、芽孢杆菌、酵母菌和乳酸菌的活化培养方法： [0119] 芽孢杆菌液体菌种培养：无菌条件下将‑80℃保存的甘油菌接种至芽孢杆菌固体培养基，30℃培养18h复苏菌种，挑取单菌落接种到装有100mL芽孢杆菌液体培养基的摇瓶(250mL)中，180r/min，30℃培养12h，得到芽孢杆菌发酵种子液；按实际需要再以2％(v/v，即每100mL液体培养基接种2mL发酵种子液)的接种量接种到液体培养基中扩大培养；所述芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌。 [0120] 酵母菌液体菌种培养：无菌条件下将‑80℃保存的甘油菌接种至酵母菌固体培养基，28℃培养20h复苏菌种，然后挑取单菌落接种到装有100mL酵母液体培养基的摇瓶(250mL)中，180r/min，28℃培养12h，得到酵母菌发酵种子液；按实际需要再以2％的接种量接种到液体培养基中扩大培养；所述酵母菌为热带假丝酵母。 [0121] 乳酸菌液体菌种培养：无菌条件下分别将‑80℃保存的甘油菌接种至乳酸菌固体培养基，37℃培养24h复苏菌种，挑取单菌落接种到装有50mL乳酸菌液体培养基的厌氧瓶(50mL)中，静置37℃培养18h，得到乳酸菌发酵种子液，按实际需要再以2％的接种量接种到液体培养基中扩大培养；所述乳酸菌为植物乳杆菌CGMCC1.557、干酪乳杆菌ATCC11578、鼠李糖乳杆菌CGMCC1.577。 [0122] (2)配置厌氧发酵培养基，各组分重量百分含量分别为：复方中药材50％(黄连、五味子、知母、五倍子、大黄、黄芩、甘草、诃子、儿茶按等质量比例混合)、豆粕30％、次粉20％、复合酶1％，混合均匀，得到厌氧发酵培养基。 [0123] (3)将步骤(1)活化培养后的解淀粉芽孢杆菌发酵种子液、热带假丝酵母发酵种子液、植物乳杆菌发酵种子液、干酪乳杆菌发酵种子液、鼠李糖乳杆菌发酵种子液接种到发酵培养基中，总接菌量为发酵培养基重量的2％，各个种子液的添加比例为(乳酸菌：芽孢杆8 9 菌：酵母菌＝2：2：3)，乳酸菌发酵种子液活菌总数为1.5×10～3.5×10cfu/mL；所述芽孢 7 9 杆菌和酵母菌的活菌总数均为1.0×10 ～2.8×10cfu/mL；所述酵母菌发酵种子液为热带 8 9 假丝酵母发酵种子液。乳酸菌发酵种子液活菌总数为1.5×10 ～3.5×10cfu/mL。混合均匀，调整含水量为45％，得到厌氧发酵混合物；置于发酵袋中在密封条件下进行厌氧发酵，发酵温度为30℃，发酵7天后获得成品，即为复方发酵中药饲料添加剂，发酵成品各指标检测结果见表5。 [0124] 表5是实施例1的发酵成品各检测指标的结果 [0125]检测项目含量总酚含量 30.83mg/g 总黄酮含量 10.32mg/g pH 4.51 5 解淀粉芽孢杆菌活菌数 1.53×10cfu/g 7 热带假丝酵母活菌数 6.19×10cfu/g 8 干酪乳杆菌活菌数 1.91×10cfu/g 8 植物乳杆菌活菌数 2.50×10cfu/g 4 鼠李糖乳杆菌活菌数 5.42×10cfu/g [0126] 实施例2： [0127] (1)芽孢杆菌、酵母菌和乳酸菌的活化培养，具体操作同实施例1； [0128] (2)配置好厌氧发酵培养基，各组分重量百分含量分别为：复方中药材50％(黄连、五味子、知母、五倍子、大黄、黄芩、甘草、诃子、儿茶按等比例混合)、豆粕30％、次粉20％、复合酶0％，混合均匀，得到厌氧发酵培养基。 [0129] (3)其他发酵条件同实施例1，最终得到发酵成品，各指标检测结果见表6。 [0130] 表6是实施例2的发酵成品各检测指标的结果 [0131]检测项目含量总酚含量 28.55mg/g 总黄酮含量 9.55mg/g pH 4.61 5 解淀粉芽孢杆菌活菌数 1.54×10cfu/g 7 热带假丝酵母活菌数 6.21×10cfu/g 8 干酪乳杆菌活菌数 1.90×10cfu/g 8 植物乳杆菌活菌数 2.47×10cfu/g 4 鼠李糖乳杆菌活菌数 5.46×10cfu/g [0132] 实施例3： [0133] (1)芽孢杆菌、酵母菌和乳酸菌的活化培养，具体操作同实施例1； [0134] (2)配置好厌氧发酵培养基，各组分重量百分含量分别为：复方中药材50％(黄连、五味子、知母、五倍子、大黄、黄芩、甘草、诃子、儿茶按等比例混合)、豆粕30％、次粉20％、复合酶6％，混合均匀，得到厌氧发酵培养基。 [0135] (3)其他发酵条件同实施例1，发酵成品各指标检测结果见表7。 [0136] 表7是实施例3的发酵成品各检测指标的结果 [0137] 检测项目含量总酚含量 33.45mg/g 总黄酮含量 13.44mg/g pH 4.22 5 解淀粉芽孢杆菌活菌数 1.58×10cfu/g 7 热带假丝酵母活菌数 6.44×10cfu/g 8 干酪乳杆菌活菌数 1.94×10cfu/g 8 植物乳杆菌活菌数 2.54×10cfu/g 4 鼠李糖乳杆菌活菌数 5.66×10cfu/g [0138] 实施例4： [0139] (1)芽孢杆菌、酵母菌和乳酸菌的活化培养，具体操作同实施例1； [0140] (2)配置好厌氧发酵培养基，各组分重量百分含量分别为：复方中药材30％(黄连、五味子、知母、五倍子、大黄、黄芩、甘草、诃子、儿茶按等比例混合)、豆粕46％、次粉24％、复合酶1％，混合均匀，得到厌氧发酵培养基。 [0141] (3)其他发酵条件同实施例1，发酵成品各指标检测结果见表8。 [0142] 表8是实施例4的发酵成品各检测指标的结果 [0143] [0144] [0145] 实施例5： [0146] (1)芽孢杆菌、酵母菌和乳酸菌的活化培养，具体操作同实施例1； [0147] (2)配置好厌氧发酵培养基，各组分重量百分含量分别为：复方中药材70％(黄连、五味子、知母、五倍子、大黄、黄芩、甘草、诃子、儿茶按等比例混合)、豆粕16％、次粉14％、复合酶1％，混合均匀，得到厌氧发酵培养基。 [0148] (3)其他发酵条件同实施例1，发酵成品各指标检测结果见表9。 [0149] 表9是实施例5的发酵成品各检测指标的结果 [0150] 检测项目含量总酚含量 42.33mg/g 总黄酮含量 14.55mg/g pH 4.67 5 解淀粉芽孢杆菌活菌数 1.91×10cfu/g 8 热带假丝酵母活菌数 2.09×10cfu/g 7 干酪乳杆菌活菌数 1.14×10cfu/g 8 植物乳杆菌活菌数 2.23×10cfu/g 4 鼠李糖乳杆菌活菌数 3.39×10cfu/g [0151] 实施例6：产品长期饲喂效果实验； [0152] 本发明实施例1制备的复方发酵中药饲料添加剂到普通水产饲料中得到混合饲料用于特种水产动物的喂养，添加量为得到混合饲料的5％～25％(以重量计)。 [0153] 选取江苏省丹阳市司徒镇迪飞生态循环农业基地甲鱼养殖试验场进行实验，养殖池长1.57m，宽1.22m，高0.72m，水深调整为0.5m。每个组别设置三个平行组，每个平行组养殖20只大小体重相近的中华鳖，时间为2021年10月到2022年1月，预实验15天，正式实验60天。试验用平均体质量(雌雄各半，平均体质量(200±15)g，健康的中华鳖。将其随机分为三组，对应饲料分别为发酵中药组、中药组和全价粉料组，中华鳖饲料配方见表11；全价粉料的组成成分见表10。 [0154] 其中：发酵中药组：10％发酵复方中药饲料添加剂和90％全价粉料； [0155] 中药组：复方中药饲料添加剂是实施例1中复方中药原料与豆粕、次粉混合后未经发酵的混合物；10％未经发酵的混合物和90％全价粉料； [0156] 全价粉料组是100％全价粉料； [0157] 发酵中药组、中药组、全价粉料组分别在试验开始前饲喂按照表11配方制备的软团饲料驯养2周，直至完全摄食该组别的饲料，日投饵料量为中华鳖体重的2％。试验开始后每日11：00‑14：00、19：00‑22：00投喂各自组别的软团状饲料，日投饵料量为中华鳖体重的2％，投喂1h后采用虹吸管清理残饵。养殖期间，水体pH在7到8.5之间，溶氧量为3到5mg/L，氨氮小于2mg/L，水体水温30℃。 [0158] 表10全价粉料组成成分 [0159] [0160] 表11中华鳖饲料配方 [0161] [0162] 中华鳖的饲料系数见表12。实验结果可观察到，发酵中药组别和全价粉料组别的中华鳖饲料系数无显著性差异，而中药组别的中华鳖饲料系数高于其他两组。中药组别其饲料系数最高，其可能原因为中药材主要为木质纤维素成分，未经菌酶发酵的中药材难以被甲鱼机体吸收利用。而复方中药经过发酵后，其中的药效成分、营养成分更有益于甲鱼机体吸收，如其中的木质纤维素成分被菌酶降解为糖类物质，粗蛋白被降解为小肽等等。其次发酵中药中的发酵菌种也可能随着中华鳖的摄入进入机体肠道定植提升其肠道消化吸收功能。 [0163] 表12中华鳖的饲料系数 [0164] [0165] 注1：饲料系数＝饲料消耗量/增重量×100％ [0166] 注2：同行数据标记相同字母表示差异不显著(P＞0.05)，无标记表示差异显著(P＜0.05)。 [0167] 中华鳖肠道切片见图11。绒毛高度、隐窝深度、绒毛高度/隐窝深度见表12。 [0168] 小肠是吸收养分的重要部位，小肠绒毛高度、隐窝深度、绒毛高度/隐窝深度比值都是衡量机体消化吸收功能的重要指标。小肠绒毛越长，小肠绒毛高度与隐窝深度的比值越大表明肠道消化吸收功能越强。发酵中药组的中华鳖小肠绒毛长度、小肠绒毛高度与隐窝深度的比值均比其他两组大，且生物饲料组别的大于全价粉料组别。 [0169] 表13复方发酵中药饲料添加剂对中华鳖肠道的影响 [0170] [0171] 注：同行数据标记相同字母表示差异不显著(P＞0.05)，无标记表示差异显著(P＜0.05)。 [0172] 发酵中药组、中药组和全价粉料组的血液生化指标见表14。谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)是评价肝功能是否正常的两个重要指标。当肝受到损伤时，细胞膜的通透性增高，转氨酶活性会升高。三个组别中，ALT、AST均为发酵中药组大于中药组大于全价粉料组。实验表明，中药对中华鳖的肝功能具有一定的保护效果，且经过发酵后，其对肝脏保护功能明显增强。尿素(UREA)、肌酐(CREA)、尿酸(UA)的含量与中华鳖的肾功能的蛋白质代谢相关。一旦肾功能降低或丧失，就会引起不同内源性化学成分如UREA、UA等物质在血液中积蓄，从而引发高尿酸血症。本试验结果显示，发酵中药组别的UREA、UA均小于其他两组，且中药组别中的UREA小于全价粉料组，UA和全价粉料组相差不大。可说明中药可有效提升甲鱼的肾功能，且经过发酵后其有增益效果。甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)的含量与脂代谢相关。甘油三酯其主要的功能是储存和供给能量，实验结果表明，实验中和对照组的血清中甘油三酯的含量相当，但发酵中药组中HDL高于其他两组。实验组HDL含量高说明复方发酵中药饲料在参与中华鳖胆固醇代谢作用有较好的增益效果。 [0173] 表14复方发酵饲料对中华鳖生化指标的影响 [0174] [0175] 注：同行数据标记字母表示差异不显著(P＞0.05)，无标记表示差异显著(P＜0.05)。 [0176] 实验组、对照组中华鳖的血清抗氧化免疫指标见表15。 [0177] 血清中溶菌酶(LSM)是由单核细胞、嗜中性细胞和巨噬细胞产生的能溶解细菌细胞壁的酶。它是一种重要的非特异性防御因子，也是水产动物的非特异性免疫防御水平的重要标志之一。三个组别溶菌酶酶活从高到低分别为发酵中药组、中药组、全价粉料组。一定程度上说明，复方中药可有效提升中华鳖的非特异性免疫，且经过发酵后，其非特异性免疫功能更强。 [0178] 中华鳖机体内中含有大量地多不饱和脂肪酸，其十分容易被氧化，从而导致疾病的产生。有研究表明抗氧化能力与非特异性免疫相关，提高机体抗氧化能力，可激发机体免疫功能，从而提高机体免疫力和抗病性。因此测定中华鳖血清抗氧化能力可侧面观测其免疫功能。通过测定三组中华鳖血清总抗氧化能力(T‑AOC)结果可得出，三组总抗氧化能力高到低分别为发酵中药组、中药组、全价粉料组。一定程度上说明，复方中药可有效提升中华鳖的抗氧化能力，且经过发酵后，其提升效果更强。 [0179] 酸性磷酸酶(ACP)是巨噬细胞中的溶酶体酶的标志酶，有其研究认为，ACP活力与机体损伤机制相关。三组间ACP酶活相差不大，实验结果说明，日粮添加复方发酵中药或中药不会对机体造成相关损伤。 [0180] 对于中华鳖来说，碱性磷酸酶(AKP)是一个十分重要的酶。它参与骨骼背甲形成、钙磷代谢。三个组别AKP酶活从大到小分别为全价粉料组别、发酵中药组别、中药组别。其可能原因为发酵中药组、中药组中10％为发酵中药和中药，复方中药材中的主要成分为木质纤维素成分，缺少蛋白质的补充，相较于全价粉料组别少了10％的鱼类蛋白质。因此其可能在一定程度上影响了甲鱼的钙磷代谢。但比较发酵中药和中药组别的AKP酶活，可以观察到发酵后，AKP酶活有所提升，因此可以在一定程度可说明，复方中药材经发酵后可有效提升其营养价值，可对其钙磷代谢有益。 [0181] 表15复方发酵中药饲料添加剂对中华鳖血清抗氧化免疫指标的影响 [0182] [0183] 综合上述试验结果，可说明在长期饲喂时添加复方中药材可有效提升甲鱼的肠道功能，提高中华鳖的免疫力，抗氧化能力等等，且经过复方中药材经过发酵后，其对甲鱼多种功能有更好地效果。 [0184] 实施例7：致病菌攻毒实验1 [0185] 本发明制备的复方发酵中药饲料添加剂到普通水产饲料中得到混合饲料用于特种水产动物的喂养，添加量为得到混合饲料的5％～25％(以重量计)。 [0186] 复方发酵中药饲料添加剂配方为：复方中药材50％(黄连、五味子、知母、五倍子、大黄、黄芩、甘草、诃子、儿茶按照等比例混合)、豆粕30％、次粉20％、复合酶1％。 [0187] 复方中药饲料添加剂组与复方发酵中药饲料添加剂配方相同，区别仅在于不进行发酵。 [0188] 选择雌雄各半、健康活跃的中华鳖稚鳖，其平均体重均在10±5g。将其随机分为三组，分别饲喂相同数量的A、B、C三组饲料，A为10％复方发酵中药饲料添加剂和90％全价粉料组、B为10％复方中药饲料添加剂组和90％全价粉料组，C为100％全价粉料饲料。每个组3个重复，每个30只中华鳖。 [0189] 攻毒实验开始时在日粮中添加肠炎沙门氏菌，平均每只稚鳖摄入致病菌约为8 10CFU菌量，随后正常饲喂不同日粮。各个组别中华鳖存活率见表16。 [0190] 表16肠炎沙门氏菌攻毒实验 [0191] [0192] 注：同行数据标记字母表示差异不显著(P＞0.05)，无标记表示差异显著(P＜0.05)。 [0193] 实施例8：致病菌攻毒实验2 [0194] 其他条件同实施例7，仅改变攻毒菌种为大肠杆菌。攻毒实验开始时在日粮中添加8 大肠杆菌，平均每只稚鳖摄入致病菌约为10CFU菌量，随后正常饲喂不同日粮。各个组别中华鳖存活率见表17。 [0195] 表17大肠杆菌攻毒实验 [0196] [0197] 注：同行数据标记字母表示差异不显著(P＞0.05)，无标记表示差异显著(P＜0.05)。 [0198] 实施例9：致病菌攻毒实验3 [0199] 其他条件同实施例7，仅改变攻毒菌种为福氏志贺菌。攻毒实验开始时在日粮中添8 加福氏志贺菌，平均每只稚鳖摄入致病菌约为10CFU菌量，随后正常饲喂不同日粮。各个组别中华鳖存活率见表18。 [0200] 表18福氏志菌攻毒实验 [0201] [0202] 注：同行数据标记字母表示差异不显著(P＞0.05)，无标记表示差异显著(P＜0.05)。 [0203] 实施例10：致病菌攻毒实验4 [0204] 其他条件同实施例7，仅改变攻毒菌种。攻毒实验开始时在日粮中添加肠炎沙门氏8 菌、大肠杆菌、福氏志贺菌混菌，平均每只稚鳖摄入致病菌约为10 CFU菌量，随后正常饲喂不同日粮。各个组别中华鳖存活率见表19。 [0205] 表19肠炎沙门氏菌、大肠杆菌、福氏志贺菌攻毒实验 [0206] [0207] 注：同行数据标记字母表示差异不显著(P＞0.05)，无标记表示差异显著(P＜0.05)。 [0208] 实施例11：致病菌攻毒实验5 [0209] 其他条件同实施例10相同，仅改变复方发酵中药饲料添加剂配方为：复方中药材30％(黄连、五味子、知母、五倍子、大黄、黄芩、甘草、诃子、儿茶按照等比例混合)、豆粕 60％、次粉30％、复合酶1％。进行攻毒实验。各个组别中华鳖存活率见表20。 [0210] 表20肠炎沙门氏菌、大肠杆菌、福氏志贺菌攻毒实验 [0211] [0212] 注：同行数据标记字母表示差异不显著(P＞0.05)，无标记表示差异显著(P＜0.05)。 [0213] 实施例12：致病菌攻毒实验5 [0214] 其他条件同实施例10相同，仅改变复方发酵中药饲料添加剂配方为：复方中药材70％(黄连、五味子、知母、五倍子、大黄、黄芩、甘草、诃子、儿茶按照等比例混合)、豆粕 16％、次粉14％、复合酶1％,进行攻毒实验。各个组别中华鳖存活率见表21。 [0215] 表21肠炎沙门氏菌、大肠杆菌、福氏志贺菌攻毒实验 [0216] [0217] 注：同行数据标记字母表示差异不显著(P＞0.05)，无标记表示差异显著(P＜0.05)。 [0218] 实施例13：致病菌攻毒实验6 [0219] 其他条件同实施例10相同，改变攻毒实验饲喂方式。在每日日粮中添加肠炎沙门8 氏菌、大肠杆菌、福氏志贺菌混菌，平均每只稚鳖摄入致病菌约为10CFU菌量，平均7天总摄 9 入致病菌菌量为2.110CFU/只。各个组别中华鳖存活率见表22。 [0220] 表22肠炎沙门氏菌、大肠杆菌、福氏志贺菌攻毒实验 [0221] [0222] [0223] 注：同行数据标记字母表示差异不显著(P＞0.05)，无标记表示差异显著(P＜0.05)。 [0224] 实施例14：致病菌攻毒实验8 [0225] 其他条件同实施例10相同，仅改变复方发酵中药饲料添加剂制备过程中的酶添加量，使酶添加量为0％。各个组别中华鳖存活率见表23。 [0226] 表23肠炎沙门氏菌、大肠杆菌、福氏志贺菌攻毒实验 [0227] [0228] 注：同行数据标记字母表示差异不显著(P＞0.05)，无标记表示差异显著(P＜0.05)。 [0229] 实施例15：致病菌攻毒实验9 [0230] 其他条件同实施例10相同，仅改变复方发酵中药饲料添加剂制备过程中的酶添加量，使酶添加量为6％。各个组别中华鳖存活率见表24。 [0231] 表24肠炎沙门氏菌、大肠杆菌、福氏志贺菌攻毒实验 [0232] [0233] 注：同行数据标记字母表示差异不显著(P＞0.05)，无标记表示差异显著(P＜0.05)。 [0234] 说明：以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案；因此，尽管本说明书参照上述的各个实施例对本发明已进行了详细的说明，但是本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明的权利要求范围内。