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抗人乳头瘤病毒HPV的鼠李糖乳杆菌及其应用

申请号 CN202211524924.2 申请日 2022-12-01 公开(公告)号 CN115895967B 公开(公告)日 2024-01-12
申请人 上海利康精准医疗技术有限公司; 优检安评(上海)检测技术有限公司; 发明人 毛丹丹; 卞雪莲; 傅咏南; 王校;
摘要 本 申请 提供了一种鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus)CGMCC No.25853,并提供了该菌在抑制人 乳头 瘤病毒HPV方面的应用。得益于鼠李糖乳杆菌CGMCC No.25853能显著抑制人乳头瘤病毒HPV生长和繁殖的能 力 ;其在诸如 益生菌 粉剂、益生菌棒剂、益生菌乳膏和/或益生菌 敷料 凝胶等产品中具有极优的应用前景。
权利要求

1.一种抗人乳头瘤病毒HPV的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus) LK‑08,其保藏编号为:CGMCC NO.25853,保藏单位为中国普通生物菌种保藏管理中心。
2.权利要求1所述的抗人乳头瘤病毒HPV的鼠李糖乳杆菌在制备抑制HPV病毒增殖表达的产品中的应用,所述的产品选自益生菌粉剂、益生菌棒剂、益生菌乳膏或益生菌敷料凝胶。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,所述鼠李糖乳杆菌抑制的人乳头瘤HPV病毒包括HPV‑16、HPV‑18、HPV‑30、HPV‑31、HPV‑33。
4.一种益生菌敷料凝胶,其特征在于,包含权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌LK‑08,其活
5
菌数不低于5×10CFU/g。
5.根据权利要求4所述的益生菌敷料凝胶,其特征在于,由如下重量百分比的组分组成:鼠李糖乳杆菌0.1‑10%、蛋白裂解物0‑10%、干扰素0‑1.0%、聚合物凝胶为余量。
6.根据权利要求5所述的益生菌敷料凝胶,其特征在于,所述蛋白裂解物由茶多糖、HPV E6蛋白、HPV E7蛋白中的一种或多种灭活裂解制得。
7.根据权利要求5所述的益生菌敷料凝胶,其特征在于,所述干扰素为IFN‑α、IFN‑β、IFN‑γ和IFN‑T中的一种或多种。
8.根据权利要求5所述的益生菌敷料凝胶,其特征在于,所述聚合物凝胶由聚乙二醇和聚乙丙交酯按重量比1:(1.2‑1.8)共聚而成。
9.权利要求4‑8任一所述的益生菌敷料凝胶的制备方法,其特征在于,具体步骤如下:
S1、先将聚乙二醇在100‑120℃的条件下真空1‑2h,再通入氩气冷却至80℃,然后加入聚乙丙交酯单体和催化剂‑辛酸亚
S2、待反应温度升至140‑156℃,并于常压氩气氛围下反应4‑8h后,先除未反应的单体和低沸点产物,得聚合物凝胶,再加入鼠李糖乳杆菌、蛋白裂解物、干扰素,然后经洗涤、冷冻干燥,即得益生菌敷料凝胶。

说明书全文

抗人乳头瘤病毒HPV的鼠李糖乳杆菌及其应用

技术领域

[0001] 本申请涉及生物技术领域,更具体地说,它涉及一种抗人乳头瘤病毒HPV的鼠李糖乳杆菌及其应用。

背景技术

[0002] 鼠李糖乳杆菌(LactobacillusrhamnosusGG,LGG)为乳杆菌属、鼠李糖杆菌种,是无质粒、厌耐酸、不产芽孢的革兰氏阳性菌,普遍存在于人和动物肠道内,具有耐受性强、耐抗生素等生物学优点。
[0003] 相关技术中试验和文献表明,鼠李糖乳杆菌可通过下调MAPK,JAK/STAT,NF‑kB途径中磷酸化蛋白的表达平,抑制炎症因子IL‑8的表达,从而起到调节肠道菌群,预防治疗胃肠道感染和腹泻的作用。
[0004] 综上可知,现阶段虽已公开鼠李糖乳杆菌在缓解肠炎方面的应用,但受限于反应机理和条件,尚未见有关鼠李糖乳杆菌在抗HPV方面的应用及报道,因此迫切需要筛选出一种具有抗HPV功效的鼠李糖乳杆菌。发明内容
[0005] 为填补鼠李糖乳杆菌在抗HPV方面的空白,本申请特筛选提供一种具备抗人乳头瘤病毒HPV功效的鼠李糖乳杆菌及其应用。
[0006] 第一方面,本申请提供一种抗人乳头瘤病毒HPV的鼠李糖乳杆菌LK‑08(Lactobacillusrhamnosus),其保藏编号为:CGMCCNO.25853,保藏单位为:CGMCC。
[0007] 上述筛选而来的鼠李糖乳杆菌LK‑08(Lactobacillusrhamnosus),除有效填补了该菌种在抗HPV方面的空白应用,能通过抑制人乳头瘤病毒HPVE6、E7蛋白的表达外,还具有抗炎抑菌的效果,具有极高的应用价值。
[0008] 第二方面,本申请提供一种鼠李糖乳杆菌在制备舒缓细菌及真菌性妇科炎症和/或抑制HPV病毒增殖表达的产品中的应用。
[0009] 优选的,所述鼠李糖乳杆菌抑制的人乳头瘤HPV病毒包括HPV‑16、HPV‑18、HPV‑30、HPV‑31、HPV‑33。
[0010] 优选的,所述的产品选自益生菌粉剂、益生菌棒剂、益生菌乳膏和/或益生菌敷料凝胶。
[0011] 上述包含有该鼠李糖乳杆菌的益生菌粉剂、益生菌棒剂、益生菌乳膏和/或益生菌敷料凝胶的产品应用,其均能有效利用HPV病毒的嗜上皮细胞特性,通过滞留于患处并进入靶组织,从而发挥其舒缓细菌及真菌性妇科炎症和/或抑制HPV病毒增殖表达的功效。
[0012] 第三方面,本申请提供一种益生菌敷料凝胶,采用如下技术方案:
[0013] 一 种 益 生 菌 敷 料 凝 胶 ,包 含 所 述 的 鼠 李 糖 乳 杆 菌 L K ‑ 0 85
(Lactobacillusrhamnosus),其活菌数不低于5×10CFU/g。
[0014] 优选的,由如下重量百分比的组分组成:鼠李糖乳杆菌0.1‑10%、蛋白裂解物0‑10%、干扰素0‑1.0%、敷料凝胶为余量。
[0015] 优选的,所述蛋白裂解物由茶多糖、HPVE6蛋白、HPVE7蛋白中的一种或多种灭活裂解制得。
[0016] 优选的,所述干扰素为IFN‑α、IFN‑β、IFN‑γ、IFN‑T和IFN‑ω中的一种或多种。
[0017] 优选的,所述聚合物凝胶由聚乙二醇和聚乙丙交酯按重量比1:(1.2‑1.8)共聚而成。
[0018] 通过采用上述技术方案,由上述原料复配而成的益生菌敷料凝胶,除具备给药便捷、长效缓释、性能稳定的优点外,还可有效滞留于患处发挥其功效,且不易对机体造成损害,易于洗去;
[0019] 分析其原因可能如下:负载于聚乙二醇和聚乙丙交酯共聚而成的聚合物凝胶内的鼠李糖乳杆菌、蛋白裂解物和干扰素,其不易受患处不利因素干扰的同时,可通过其缓释和复配作用,长效的作用于患处,从而实现对细菌及真菌性妇科炎症的舒缓和/或HPV病毒的抑制。
[0020] 第四方面,本申请提供一种益生菌敷料凝胶的制备工艺:
[0021] 一种益生菌敷料凝胶的制备方法,具体步骤如下:
[0022] S1、先将聚乙二醇在100‑120℃的条件下真空除水1‑2h,再通入氩气冷却至80℃,然后加入聚乙丙交酯单体和催化剂‑辛酸亚
[0023] S2、待反应温度升至140‑156℃,并于常压氩气氛围下反应4‑8h后,先除未反应的单体和低沸点产物,得聚合物凝胶,再加入鼠李糖乳杆菌、蛋白裂解物、干扰素,然后经洗涤、冷冻干燥,即得益生菌敷料凝胶。
[0024] 通过采用上述技术方案,显著简化制备工艺的同时,无额外添加剂和助剂投入,继而使得益生菌敷料凝胶性能相对稳定,均具有优异的舒缓炎症和抗HPV的功效,且得益于凝胶体系的特殊性,其内活菌量不易受干扰、功效更为持久,因而具有较高的经济效益。
[0025] 综上所述,本申请具有以下有益效果:
[0026] 1、本申请中筛选而来的鼠李糖乳杆菌LK‑08(Lactobacillusrhamnosus)保藏编号CGMCC No.25853,其在制备舒缓细菌及真菌性妇科炎症和/或抑制HPV病毒增殖表达的产品中具有极高的应用价值;
[0027] 2、本申请由上述原料复配而成的益生菌敷料凝胶,兼具给药便捷、长效缓释、性能稳定等优点,可通过长效的滞留于患处发挥其抗炎、抗HPV的功效的同时,还不易对机体造成损害;
[0028] 3、本申请中益生菌敷料凝胶的制备工艺,除显著简化了工艺外,还免去了加热和添加剂的影响,且所得益生菌敷料凝胶的性能相对稳定,均具有长效优良的抗炎及抗HPV功效,适用于产业化的高效益生产。

具体实施方式

[0029] 以下结合实施例对本申请作进一步详细说明。
[0030] 制备例
[0031] 制备例1
[0032] 一种抗人乳头瘤病毒HPV的鼠李糖乳杆菌LK‑08(Lactobacillus rhamnosus),其保藏编号为:CGMCC NO.25853,保藏日期为2022年9月3号;保藏单位为:CGMCC;保藏单位地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,取样活化后于MRS固体培养基上30℃厌氧扩增培养48h,备用。
[0033] 制备例2‑8
[0034] 一种蛋白裂解物,其灭活裂解的蛋白质原料不同,具体如下表所示,并通过如下裂解步骤制得:
[0035] A、先将120℃灭活5min后的蛋白质原料置于0.01mol/LPBS缓冲液中,并调节灭活液中蛋白质总含量在2000μg/mL;
[0036] B、向灭活液中加入占灭活液总重量0.8%的裂解剂TritonX‑100和0.6%的去氧胆酸钠,于26℃裂解120min后,得裂解液;
[0037] C、先使用300KD膜超滤透析除去裂解液中裂解剂TritonX‑100和去氧胆酸钠,再经12000rpm离心2h去除杂蛋白后,收集上清并过滤除菌,即得蛋白裂解物。
[0038] 表:制备例2‑8中灭活裂解的蛋白质原料
[0039]
[0040]
[0041] 性能检测试验选取各实施例和对比例中制得的益生菌敷料凝胶进行测试,并进行抗人乳头瘤HPV病毒的体外作用试验,具体的试验步骤和试验条件如下;
[0042] 先以HPV‑16假病毒颗粒侵染由中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所提供的人宫颈癌HeLa细胞,并以常规方法培育;
[0043] 再取对数处于生长期、生长状况良好的Hela细胞接种于24孔板内,待细胞贴壁24h后,流加益生菌敷料凝胶(1g),分别测试其干预12h、24h、48h、72h后HPV的含量(copies/cell)。
[0044] 实施例
[0045] 实施例1‑6
[0046] 一种益生菌敷料凝胶,其原料各组分及用量如下表所示(g),并采用如下制备工艺制得:
[0047] S1、先将聚乙二醇在120℃的条件下真空除水1h,再通入氩气冷却至80℃,然后加入聚乙丙交酯单体和占聚乙二醇总重量0.5%的辛酸亚锡;
[0048] 其中聚乙二醇和聚乙丙交酯的重量比为1:1.2;
[0049] S2、待反应温度升至148℃,并于常压氩气氛围下反应6h后,先去除未反应的单体和低沸点产物,得聚合物凝胶,再加入鼠李糖乳杆菌、蛋白裂解物、干扰素,然后经洗涤、冷冻干燥,即得益生菌敷料凝胶;
[0050] 其中鼠李糖乳杆菌由制备例1制得,活菌数为1×108CFU/g;蛋白裂解物由制备例2制得;干扰素由IFN‑α、IFN‑γ和IFN‑T和按1:1:0.8组成。
[0051] 表:实施例1‑6中益生菌敷料凝胶各组分及其重量(g)
[0052]
[0053] 对比例1
[0054] 一种敷料凝胶,与实施例1的区别之处在于,不含制备例1中的鼠李糖乳杆菌,由等量的聚合物凝胶替代。
[0055] 对比例2
[0056] 一种益生菌凝胶,与实施例1的区别之处在于,所含鼠李糖乳杆菌为鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus),其保藏编号为:CGMCCNO.24049,保藏单位为:CGMCC。
[0057] 抽取上述实施例1‑6和对比例1‑2中的益生菌敷料凝胶,按上述试验步骤和标准测试其干预12h、24h、48h、72h后的HPV含量(copies/cell),测试结果取平均值(Mean±SD,n=8)记入下表。
[0058] 表:实施例1‑6、对比例1组HPV含量(copies/cell)
[0059]
[0060]
[0061] 从上表中可以看出,实施例1‑6中制得的益生菌敷料凝胶均具有优良的抗HPV病毒效果,其在干预12h、24h、48h、72h后的HPV含量分别为8.62±0.22‑9.40±0.21;7.25±0.15‑8.22±0.25;3.76±0.20‑7.18±0.52;2.71±0.11‑6.76±0.48;
[0062] 相比于不含鼠李糖乳杆菌的对比例1(空白对照组)和所含鼠李糖乳杆菌非特殊筛选而来的对比例2其抗HPV病毒的性能均具有显著提升,尤其在48h、72h等长时段干预下的抑制作用最为显著;
[0063] 还需特别说明的是:对比例2在48h、72h等长时段干预下的微弱抑制效果,可能是源于鼠李糖乳杆菌自身的抗菌、消炎功效和免疫调节能,对HPV病毒的增殖和表达产生了一定阻碍作用。
[0064] 综上可见,上述筛选而来的鼠李糖乳杆菌LK‑08(Lactobacillusrhamnosus),其有效填补了该菌种在抗HPV方面的空白应用,可通过抑制人乳头瘤病毒HPVE6、E7蛋白的表达,发挥稳定高效的抗HPV功效;
[0065] 上述负载有鼠李糖乳杆菌、蛋白裂解物和干扰素聚合物凝胶,其作为敷料凝胶时,得益于其形态和特性,具备给药便捷、长效缓释、性能稳定等优点,临床应用中可通过长效滞留于患处发挥其抗HPV功效。
[0066] 此外从实施例1‑4还可以看出鼠李糖乳杆菌LK‑08的用量越多其抗HPV效果相应的越高,但高于5%后仅在初期仍具有一定优势,最终效果相持平或等同,故此优选鼠李糖乳杆菌LK‑08的用量为0.1‑10%,且蛋白裂解物和干扰素还可进一步加强敷料凝胶的抗HPV性能,参见实施例5‑6。
[0067] 实施例7‑13
[0068] 一种益生菌敷料凝胶,与实施例5的不同之处在于,所用蛋白裂解物的使用情况不同,具体对应关系如下表所示。
[0069] 表:实施例7‑13中蛋白裂解物使用情况对照表
[0070]
[0071]
[0072] 抽取上述实施例7‑13中的益生菌敷料凝胶,按上述试验步骤和标准测试其干预12h、24h、48h、72h后的HPV含量(copies/cell),测试结果取平均值(Mean±SD,n=8)记入下表。
[0073] 表:实施例5、7‑13组HPV含量(copies/cell)
[0074]
[0075] 从上表中可以看出,实施例5、7‑13中制得的益生菌敷料凝胶均具有优良的抗HPV病毒效果,其在干预12h、24h、48h、72h后的HPV含量分别为7.51±0.16‑9.11±0.16;6.42±0.13‑8.10±0.11;5.24±0.24‑6.72±0.31;4.88±0.42‑6.28±0.22;
[0076] 可见上述负载有鼠李糖乳杆菌、蛋白裂解物和干扰素聚合物凝胶,其作为敷料凝胶时,除得益于其形态和特性,具备给药便捷、长效缓释、性能稳定等优点外,其蛋白裂解物还具有强化抗HPV功效的作用;
[0077] 且根据蛋白裂解物裂解原料的选择不同,其性能也有所差异,且多组分的蛋白原料间还具有一定复配效果,参见实施例10‑13,其中以茶多糖、HPVE6蛋白和/或HPVE7蛋白为最优复配,分析其原因可能如下:
[0078] 本领域公知:HPV病毒为无包膜双链小分子环状DNA病毒,由蛋白衣壳和遗传物质DNA组成,其中蛋白衣壳由L1和L2组成,其中L1蛋白的C端和L2蛋白的N端均具有富含正电荷基酸(R和K),即核定位信号
[0079] 其侵染过程也是主要借助该核定位信号与HeLa细胞内相应的受体结合而完成的,因而当本申请所用的蛋白裂解物,同时带有大量负电荷的糖蛋白以及与核定位信号相似的裂解序列时,其可分别通过于携带正电荷的病毒外壳蛋白结合和提前与HeLa细胞内相应的受体结合,从而协同抑制HPV病毒的增殖和表达。
[0080] 实施例14
[0081] 一种益生菌敷料凝胶,与实施例5的不同之处在于,所用干扰素由IFN‑α、IFN‑β和IFN‑γ和按1:2:1组成。
[0082] 实施例15
[0083] 一种益生菌敷料凝胶,与实施例5的不同之处在于,所用干扰素由IFN‑α、IFN‑β、IFN‑γ和IFN‑T按1:2:1:0.8组成。
[0084] 抽取上述实施例14‑15中的益生菌敷料凝胶,按上述试验步骤和标准测试其干预12h、24h、48h、72h后的HPV含量(copies/cell),测试结果取平均值(Mean±SD,n=8)记入下表。
[0085] 表:实施例5、14‑15组HPV含量(copies/cell)
[0086]
[0087] 从上表中可以看出,实施例5、7‑13中制得的益生菌敷料凝胶均具有优良的抗HPV病毒效果,其在干预12h、24h、48h、72h后的HPV含量分别为9.10±0.15‑9.15±0.15;8.02±0.11‑8.18±0.12;6.70±0.30‑6.75±0.28;6.25±0.20‑6.30±0.24;
[0088] 可见上述负载有鼠李糖乳杆菌、蛋白裂解物和干扰素聚合物凝胶,其作为敷料凝胶时,除得益于其形态和特性,具备给药便捷、长效缓释、性能稳定等优点外,其干扰素还具有强化抗HPV功效的作用;
[0089] 且根据干扰素的选择和复配不同,其性能也略有差异,且多种干扰素之间还具有一定复配效果,参见实施例5、14‑15,但并非干扰素的种类越多越好,分析其原因可能如下:
[0090] 上述干扰素主要通过与靶细胞表面干扰素受体结合,诱导靶细胞内多种抗病毒蛋白,阻止病毒蛋白质的合成,抑制病毒核酸的复制、转录,从而实现抗病毒的目的,其干扰素种类过多时会对靶细胞造成损毁;
[0091] 以及通过激活巨噬细胞的吞噬活性达到增强自体免疫的目的,但此试验为体外试验,因而在实施例5、14‑15的数据中并未体现,但在实际临床应用过程中该干扰素的添加具有极高的实用价值。
[0092] 实施例16
[0093] 一种益生菌敷料凝胶,与实施例1的不同之处在于,所用聚合物凝胶由聚乙二醇和聚乙丙交酯按重量比1:1.5共聚而成。
[0094] 实施例17
[0095] 一种益生菌敷料凝胶,与实施例1的不同之处在于,所用聚合物凝胶由聚乙二醇和聚乙丙交酯按重量比1:1.8共聚而成。
[0096] 实施例18
[0097] 一种益生菌敷料凝胶,与实施例1的不同之处在于,所用聚合物凝胶由聚乙二醇和聚乙丙交酯按重量比1:2.0共聚而成。
[0098] 实施例19
[0099] 一种益生菌敷料凝胶,与实施例1的不同之处在于,所用聚合物凝胶的制备步骤参数不同,具体如下所示:S1、先将聚乙二醇在100℃的条件下真空除水2h,再通入氩气冷却至80℃,然后加入聚乙丙交酯单体和占聚乙二醇总重量0.5%的辛酸亚锡;
[0100] S2、待反应温度升至140℃,并于常压氩气氛围下反应8h后,去除未反应的单体和低沸点产物,即得聚合物凝胶。
[0101] 实施例20
[0102] 一种益生菌敷料凝胶,与实施例1的不同之处在于,所用聚合物凝胶的制备步骤参数不同,具体如下所示:S1、先将聚乙二醇在120℃的条件下真空除水1h,再通入氩气冷却至80℃,然后加入聚乙丙交酯单体和占聚乙二醇总重量0.5%的辛酸亚锡;
[0103] S2、待反应温度升至156℃,并于常压氩气氛围下反应4h后,去除未反应的单体和低沸点产物,即得聚合物凝胶。
[0104] 抽取上述实施例16‑20中的益生菌敷料凝胶,按上述试验步骤和标准测试其干预12h、24h、48h、72h后的HPV含量(copies/cell),测试结果取平均值(Mean±SD,n=8)记入下表。
[0105] 表:实施例1、16‑20组HPV含量(copies/cell)
[0106]
[0107] 从上表中可以看出,实施例1、16‑20中制得的益生菌敷料凝胶均具有优良的抗HPV病毒效果,其在干预12h、24h、48h、72h后的HPV含量分别为9.38±0.22‑9.48±0.22;8.20±0.22‑8.31±0.28;7.18±0.40‑7.31±0.40;6.70±0.35‑6.85±0.42;
[0108] 可见上述负载鼠李糖乳杆菌、蛋白裂解物和干扰素的聚合物凝胶,得益于其形态和特性,其更有利于长效性的抗HPV,在48h、72h时均有不同程度提升,参照实施例1、16‑20,分析其原因可能如下:所得聚合物凝胶除使得内部有效活菌数不易受外界不利因素干扰的同时,还可通过各有效成分的缓释及复配,长效稳定的对HPV病毒进行抑制,因而极其适用于临床应用,且本身易对机体造成损害,仅清水即可洗去。
[0109] 本具体实施例仅仅是对本申请的解释,其并不是对本申请的限制,本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改,但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。