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一种含乙脱氢酶的乳酸菌冻干粉及其制备方法和应用

申请号 CN202211526719.X 申请日 2022-11-30 公开(公告)号 CN116726150A 公开(公告)日 2023-09-12
申请人 江苏新申奥生物科技有限公司; 发明人 马凯;
摘要 本 发明 提出了一种含乙 醛 脱氢酶的乳酸菌冻干粉及其制备方法和应用,属于 益生菌 技术领域。将中药组合物经过 水 提取、 有机 溶剂 提取,固体与柠檬、西红柿榨汁液、 碳 源、氮源混合,接种活化后的益生菌 发酵 ,得到发酵产物;将发酵产物、乙醛脱氢酶、 乙醇 氧 化酶 、瑞士乳杆菌、海氏肠球菌、卡波姆、羧化壳聚糖混合加入水中, 固化 ,得到内层缓释颗粒,将魔芋葡甘聚糖、山药多糖、玉米低聚肽混合处理,得到多糖肽复合物,与内层缓释颗粒、中药水提取物、中药 有机溶剂 提取物、 氨 基酸、海藻酸钠混合加入水中,固化,得到含乙醛脱氢酶的乳酸菌冻干粉,能够起到解酒醒酒、改善 宿醉 、降低酒后不良反应、保护肝脏的效果,具有广阔得应用前景。
权利要求

1.一种含乙脱氢酶的乳酸菌冻干粉的制备方法,其特征在于,将葛根、甘草、猴头菇、蒲公英经过提取、有机溶剂提取过滤后,得到中药水提取物、中药有机溶剂提取物,固体与柠檬、西红柿榨汁液、源、氮源混合制得发酵底物,接种活化后的发酵乳杆菌LF021、长双歧杆菌BL5b和罗伊氏乳杆菌LR06进行发酵,得到发酵产物;将发酵产物、乙醛脱氢酶、乙醇化酶、瑞士乳杆菌、海氏肠球菌、卡波姆混合加入水中,加入溶有羧化壳聚糖的水溶液,乳化,加入金属离子溶液固化,得到内层缓释颗粒,将魔芋葡甘聚糖、山药多糖、玉米低聚肽混合经过声波处理和臭氧协同处理,得到多糖肽复合物,与内层缓释颗粒、中药水提取物、中药有机溶剂提取物、磺酸、丙酸、亮氨酸混合均匀后,加入溶有海藻酸钠的水溶液,乳化,加入金属离子溶液固化,冷冻干燥,得到含乙醛脱氢酶的乳酸菌冻干粉。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1.中药组合物的水提取:将葛根、甘草、猴头菇、蒲公英分别洗净、干燥、粉碎后得到中药组合物粉,加入水中,加热煮沸提取2‑3次,过滤,合并滤液,固体留用,滤液浓缩,干燥,得到水提取物;
S2.中药组合物的有机溶剂提取:将步骤S1得到的固体加入混合有机溶剂中,加热提取
2‑3次,过滤,合并滤液,固体留用,滤液去除有机溶剂,干燥,得到有机溶剂提取物;
S3.发酵底物的制备:将柠檬、西红柿混合榨汁,弃除固体,汁液与步骤S2得到的固体混合均匀,加入碳源和氮源,混合均匀后,加入无菌水,搅拌混合,灭菌,得到发酵底物;
S4.菌种的活化:将发酵乳杆菌LF021、长双歧杆菌BL5b和罗伊氏乳杆菌LR06分别接种至高氏培养基中,活化培养,得到菌种种子液;
S5.发酵:将步骤S4中的菌种种子液接种至步骤S3中的发酵底物中,发酵培养,得到发酵产物;
S6.多糖肽复合物的制备:将魔芋葡甘聚糖、山药多糖、玉米低聚肽混合均匀,超声波处理和臭氧协同处理,得到多糖肽复合物;
S7.氨基酸添加剂的制备:将牛磺酸、丙氨酸、亮氨酸混合均匀,得到氨基酸添加剂;
S8.复合酶的制备:将乙醛脱氢酶、乙醇氧化酶混合均匀,得到复合酶;
S9.内层缓释颗粒的制备:将步骤S5制得的发酵产物、步骤S8制得的复合酶、瑞士乳杆菌、海氏肠球菌、卡波姆混合均匀,加入水中,搅拌混合均匀,加入溶有羧化壳聚糖的水溶液,第一SPG快速膜乳化,形成乳液,加入金属离子溶液,常温固化,得到内层缓释颗粒;
S10.含乙醛脱氢酶的乳酸菌冻干粉的制备:将步骤S1制得的水提取物、步骤S2制得的有机溶剂提取物、步骤S6制得的多糖肽复合物、步骤S7制得的氨基酸添加剂、步骤S9制得的内层缓释颗粒混合均匀,加入溶有海藻酸钠的水溶液中,第二SPG快速膜乳化,形成乳液,加入金属离子溶液,固化,冷冻干燥,得到含乙醛脱氢酶的乳酸菌冻干粉。
3.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,步骤S1中所述葛根、甘草、猴头菇、蒲公英的质量比为5‑10:1‑3:3‑5:1‑2;所述中药组合物粉和水的固液比为1:5‑10g/mL;所述提取时间为1‑3h;步骤S2中所述混合有机溶剂为乙醇、乙酸乙酯、石油醚按照质量比为5‑7:
2‑4:1‑3的混合溶剂;所述固体和混合有机溶剂的固液比为1:3‑5g/mL;所述加热至温度
50‑70℃,提取时间为0.5‑1h。
4.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,步骤S3中所述柠檬、西红柿、固体、碳源、氮源、无菌水的质量比为7‑12:5‑10:3‑5:5‑10:3‑5:30‑50;所述碳源选自葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、果糖、淀粉、糖蜜、琼脂中的至少一种;所述氮源选自氨水、尿素、铵盐、硝酸盐、氨基酸、鱼粉中的至少一种;所述铵盐选自氯化铵、硝酸铵、硫酸铵中的至少一种;所述硝酸盐选自硝酸、硝酸钠、硝酸、硝酸锌、硝酸、硝酸镁、硝酸锰、硝酸中的至少一种;所述氨基酸选自甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸、亮氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸中的一种或几种混合;步骤S4中所述活化培养的条件为36‑39℃,30‑50%湿度下,50‑70r/min转速下,培养18‑24h;所述菌种种子液的含菌量为
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10‑10cfu/mL。
5.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,步骤S5中所述发酵乳杆菌LF021、长双歧杆菌BL5b和罗伊氏乳杆菌LR06的接种量分别为3‑5%、1‑3%、0.5‑1%,所述发酵培养的条件为36‑40℃,30‑50%湿度下,50‑70r/min转速下,培养48‑72h;步骤S6中所述魔芋葡甘聚糖、山药多糖、玉米低聚肽的质量比为3‑5:1‑2:2‑4;所述超声波处理和臭氧协同处理中,超声波功率为120‑150W,臭氧浓度为30‑70mg/L,气体流量为15‑25L/h,处理时间为5‑7s。
6.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,步骤S7中所述牛磺酸、丙氨酸、亮氨酸的质量比为7‑12:1‑3:2‑4;步骤S8中所述乙醛脱氢酶、乙醇氧化酶的质量比为10‑15:3‑5。
7.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,步骤S9中所述发酵产物、复合酶、瑞士乳杆菌、海氏肠球菌、卡波姆的质量比为15‑20:1‑2:0.5‑1:2‑3:1‑3;所述溶有羧化壳聚糖的水溶液中羧化壳聚糖的含量为12‑15wt%;所述第一SPG快速膜的孔径为300‑500nm;所述金属离子溶液为含有3‑5wt%的离子、镁离子、铝离子、铁离子、锌离子中的至少一种的溶液;步骤S10中所述水提取物、有机溶剂提取物、多糖肽复合物、氨基酸添加剂、内层缓释颗粒的质量比为3‑5:2‑4:0.5‑1:0.2‑0.5:4‑6;所述溶有海藻酸钠的水溶液中海藻酸钠的含量为7‑12wt%;所述第二SPG快速膜的孔径为10‑15μm;所述金属离子溶液为含有3‑5wt%的钙离子、镁离子、铝离子、铁离子、锌离子中的至少一种的溶液。
8.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,具体包括以下步骤:
S1.中药组合物的水提取:将5‑10重量份葛根、1‑3重量份甘草、3‑5重量份猴头菇、1‑2重量份蒲公英分别洗净、干燥、粉碎后得到中药组合物粉,加入水中,所述中药组合物粉和水的固液比为1:5‑10g/mL,加热煮沸提取1‑3h,提取2‑3次,过滤,合并滤液,固体留用,滤液浓缩,干燥,得到水提取物;
S2.中药组合物的有机溶剂提取:将步骤S1得到的固体加入混合有机溶剂中,所述固体和混合有机溶剂的固液比为1:3‑5g/mL,加热至50‑70℃提取0.5‑1h,提取2‑3次,过滤,合并滤液,固体留用,滤液去除有机溶剂,干燥,得到有机溶剂提取物;
所述混合有机溶剂为乙醇、乙酸乙酯、石油醚按照质量比为5‑7:2‑4:1‑3的混合溶剂;
S3.发酵底物的制备:将7‑12重量份柠檬、5‑10重量份西红柿混合榨汁,弃除固体,汁液与3‑5重量份步骤S2得到的固体混合均匀,加入5‑10重量份碳源和3‑5重量份氮源,混合均匀后,加入30‑50重量份无菌水,搅拌混合,紫外线灭菌,得到发酵底物;
S4.菌种的活化:将发酵乳杆菌LF021、长双歧杆菌BL5b和罗伊氏乳杆菌LR06分别接种至高氏培养基中,36‑39℃,30‑50%湿度下,50‑70r/min转速下,活化培养18‑24h,得到菌种
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种子液,含菌量为10‑10cfu/mL;
S5.发酵:将步骤S4中发酵乳杆菌LF021、长双歧杆菌BL5b和罗伊氏乳杆菌LR06的菌种种子液接种至步骤S3中的发酵底物中,所述发酵乳杆菌LF021、长双歧杆菌BL5b和罗伊氏乳杆菌LR06的接种量分别为3‑5%、1‑3%、0.5‑1%,36‑40℃,30‑50%湿度下,50‑70r/min转速下,发酵培养48‑72h,得到发酵产物;
S6.多糖肽复合物的制备:将3‑5重量份魔芋葡甘聚糖、1‑2重量份山药多糖、2‑4重量份玉米低聚肽混合均匀,120‑150W超声波下,通入臭氧处理,臭氧浓度为30‑70mg/L,气体流量为15‑25L/h,处理时间为5‑7s,得到多糖肽复合物;
S7.氨基酸添加剂的制备:将7‑12重量份牛磺酸、1‑3重量份丙氨酸、2‑4重量份亮氨酸混合均匀,得到氨基酸添加剂;
S8.复合酶的制备:将10‑15重量份乙醛脱氢酶、3‑5重量份乙醇氧化酶混合均匀,得到复合酶;
S9.内层缓释颗粒的制备:将15‑20重量份步骤S5制得的发酵产物、1‑2重量份步骤S8制得的复合酶、0.5‑1重量份瑞士乳杆菌、2‑3重量份海氏肠球菌、1‑3重量份卡波姆混合均匀,加入50重量份水中,搅拌混合均匀,加入70‑80重量份含有12‑15wt%的羧化壳聚糖水溶液,孔径为300‑500nm的第一SPG快速膜乳化,形成乳液,加入7‑12重量份含有3‑5wt%的钙离子、镁离子、铝离子、铁离子、锌离子中的至少一种的溶液,常温固化20‑30min,得到内层缓释颗粒;
S10.含乙醛脱氢酶的乳酸菌冻干粉的制备:将3‑5重量份步骤S1制得的水提取物、2‑4重量份步骤S2制得的有机溶剂提取物、0.5‑1重量份步骤S6制得的多糖肽复合物、0.2‑0.5重量份步骤S7制得的氨基酸添加剂、4‑6重量份步骤S9制得的内层缓释颗粒混合均匀,加入
100重量份含有7‑12wt%的海藻酸钠水溶液中,孔径为10‑15μm第二SPG快速膜乳化,形成乳液,加入7‑12重量份含有3‑5wt%的钙离子、镁离子、铝离子、铁离子、锌离子中的至少一种的溶液,固化10‑15min,冷冻干燥,得到含乙醛脱氢酶的乳酸菌冻干粉。
9.一种如权利要求1‑8任一项所述的制备方法制得的含乙醛脱氢酶的乳酸菌冻干粉。
10.一种如权利要求9所述含乙醛脱氢酶的乳酸菌冻干粉在制备解酒醒酒、保肝护肝产品中的应用。

说明书全文

一种含乙脱氢酶的乳酸菌冻干粉及其制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及益生菌技术领域,具体涉及一种含乙醛脱氢酶的乳酸菌冻干粉及其制备方法和应用。

背景技术

[0002] 我国喜酒者人数众多,约有60‑75%的成年的男性经常饮酒,且过量饮酒诱发的疾病比例逐年增长。过量饮酒易不仅导致肝损伤及相应的肝病变,而且会引发其他疾病,尤甚者会引起人体生理功能紊乱乃至死亡。过量饮酒导致的酒精性肝损伤已经成为肝病患得的最主要因素之一,于此同时过度酗酒导致患高血压疾病、胃癌等恶性疾、蛋白质等物质发生代谢紊乱时有发生。引起肝脏损伤最常见的毒物是酒精,过量饮酒导致的肝脏损伤已经成为世界性的医学难题。因此,如何醒酒、解酒及减少饮酒对人体胃肠、肝脏等脏器的伤害的需求已迫在眉睫,开发有效的解酒药物具有重要的意义和广阔的市场前景。
[0003] 酒精在体内降解主要通过肝中的乙醇脱氢酶负责将乙醇化为乙醛,生成的乙醛作为底物进一步在乙醛脱氢酶催化下转变为无害的乙酸。乙醛毒性高于乙醇,是造成宿醉的主要原因。适当通过口服补充乙醛脱氢酶,能够加速肠道酒精代谢,减少肝脏代谢压,从而缓解酒精引起的不适反应,减缓化学性肝损伤。
[0004] 过量饮酒后,通过大量服用基酸、维生素等小分子,可以加速机体新陈代谢,加快酒精分解,减弱酒精对于机体的损伤。另外,通过补充葡萄糖、乳糖等化合物能够快速补充能量,通过补充乳酸、乙酸等短链脂肪酸,可以有效中和肠道中的乙醇,都可以对不适症状有一定缓解作用。
[0005] 目前市场上的解酒产品中,主要为化学药品和中药制剂。其中,解酒醒酒的化学药品多是兴奋剂、维生素与氨基酸等成分,能快速的起到解酒、醒酒作用,但大部分的化学药品解酒机理是仅仅能促进酒精分解,起到暂时性的缓解作用,很难起到护肝作用,毒副作用大。而现有解酒醒酒的中药制剂原材料成分复杂,制作工艺繁琐,并且难以有效的改善酒后各种症状达到迅速解酒、标本兼顾的效果。
[0006] 另外,有实验证明,肠源性内毒素血症(intestinal endotoxemia,IETM)和酒精性肝损伤的发生、发展及预后转归有着密切的关系。正常的肠道屏障有阻止内毒素等大分子毒性物质入血的栅栏作用。乙醇被摄入肠道,会引起肠黏膜损伤,肠道菌群紊乱,产生大量内毒素,若细胞间紧密连接occludin蛋白结构及功能改变,就可能导致肠上皮细胞通透性增加,从而发生细菌移位及内毒素血症。内毒素引起肝细胞脂肪变性,肝脏损伤又可加重肠道微生态紊乱与内毒素血症,从而形成一个恶性循环。
[0007] 目前,通过外源补充活性益生菌起解酒作用的主要原理是,过量饮酒造成肠道微生态失衡而产生大量内毒素,直接或间接损伤肝脏;通过补充益生菌调节肠道菌群平衡,有助于减少肠源性内毒素的产生和吸收,从而维护肝脏健康,但此种方式仍然解酒效果不佳。

发明内容

[0008] 本发明的目的在于提出一种含乙醛脱氢酶的乳酸菌冻干粉及其制备方法和应用,能够改变肠道生物的组成,调节肠道菌群,提高肠道免疫力,减少氧化应激,缓解化学性肝损伤,从而达到解酒醒酒、改善宿醉、降低酒后不良反应、保护肝脏的效果,具有广阔得应用前景。
[0009] 本发明的技术方案是这样实现的:
[0010] 本发明提供一种含乙醛脱氢酶的乳酸菌冻干粉的制备方法,将葛根、甘草、猴头菇、蒲公英经过水提取、有机溶剂提取过滤后,得到中药水提取物、中药有机溶剂提取物,固体与柠檬、西红柿榨汁液、碳源、氮源混合制得发酵底物,接种活化后的发酵乳杆菌LF021、长双歧杆菌BL5b和罗伊氏乳杆菌LR06进行发酵,得到发酵产物;将发酵产物、乙醛脱氢酶、乙醇氧化酶、瑞士乳杆菌、海氏肠球菌、卡波姆混合加入水中,加入溶有羧化壳聚糖的水溶液,乳化,加入金属离子溶液固化,得到内层缓释颗粒,将魔芋葡甘聚糖、山药多糖、玉米低聚肽混合经过声波处理和臭氧协同处理,得到多糖肽复合物,与内层缓释颗粒、中药水提取物、中药有机溶剂提取物、磺酸、丙氨酸、亮氨酸混合均匀后,加入溶有海藻酸钠的水溶液,乳化,加入金属离子溶液固化,冷冻干燥,得到含乙醛脱氢酶的乳酸菌冻干粉。
[0011] 作为本发明的进一步改进,包括以下步骤:
[0012] S1.中药组合物的水提取:将葛根、甘草、猴头菇、蒲公英分别洗净、干燥、粉碎后得到中药组合物粉,加入水中,加热煮沸提取2‑3次,过滤,合并滤液,固体留用,滤液浓缩,干燥,得到水提取物;
[0013] S2.中药组合物的有机溶剂提取:将步骤S1得到的固体加入混合有机溶剂中,加热提取2‑3次,过滤,合并滤液,固体留用,滤液去除有机溶剂,干燥,得到有机溶剂提取物;
[0014] S3.发酵底物的制备:将柠檬、西红柿混合榨汁,弃除固体,汁液与步骤S2得到的固体混合均匀,加入碳源和氮源,混合均匀后,加入无菌水,搅拌混合,灭菌,得到发酵底物;
[0015] S4.菌种的活化:将发酵乳杆菌LF021、长双歧杆菌BL5b和罗伊氏乳杆菌LR06分别接种至高氏培养基中,活化培养,得到菌种种子液;
[0016] S5.发酵:将步骤S4中的菌种种子液接种至步骤S3中的发酵底物中,发酵培养,得到发酵产物;
[0017] S6.多糖肽复合物的制备:将魔芋葡甘聚糖、山药多糖、玉米低聚肽混合均匀,超声波处理和臭氧协同处理,得到多糖肽复合物;
[0018] S7.氨基酸添加剂的制备:将牛磺酸、丙氨酸、亮氨酸混合均匀,得到氨基酸添加剂;
[0019] S8.复合酶的制备:将乙醛脱氢酶、乙醇氧化酶混合均匀,得到复合酶;
[0020] S9.内层缓释颗粒的制备:将步骤S5制得的发酵产物、步骤S8制得的复合酶、瑞士乳杆菌、海氏肠球菌、卡波姆混合均匀,加入水中,搅拌混合均匀,加入溶有羧化壳聚糖的水溶液,第一SPG快速膜乳化,形成乳液,加入金属离子溶液,常温固化,得到内层缓释颗粒;
[0021] S10.含乙醛脱氢酶的乳酸菌冻干粉的制备:将步骤S1制得的水提取物、步骤S2制得的有机溶剂提取物、步骤S6制得的多糖肽复合物、步骤S7制得的氨基酸添加剂、步骤S9制得的内层缓释颗粒混合均匀,加入溶有海藻酸钠的水溶液中,第二SPG快速膜乳化,形成乳液,加入金属离子溶液,固化,冷冻干燥,得到含乙醛脱氢酶的乳酸菌冻干粉。
[0022] 作为本发明的进一步改进,步骤S1中所述葛根、甘草、猴头菇、蒲公英的质量比为5‑10:1‑3:3‑5:1‑2;所述中药组合物粉和水的固液比为1:5‑10g/mL;所述提取时间为1‑3h;
步骤S2中所述混合有机溶剂为乙醇、乙酸乙酯、石油醚按照质量比为5‑7:2‑4:1‑3的混合溶剂;所述固体和混合有机溶剂的固液比为1:3‑5g/mL;所述加热至温度为50‑70℃,提取时间为0.5‑1h。
[0023] 作为本发明的进一步改进,步骤S3中所述柠檬、西红柿、固体、碳源、氮源、无菌水的质量比为7‑12:5‑10:3‑5:5‑10:3‑5:30‑50;所述碳源选自葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、果糖、淀粉、糖蜜、琼脂中的至少一种;所述氮源选自氨水、尿素、铵盐、硝酸盐、氨基酸、鱼粉中的至少一种;所述铵盐选自氯化铵、硝酸铵、硫酸铵中的至少一种;所述硝酸盐选自硝酸、硝酸钠、硝酸、硝酸锌、硝酸、硝酸镁、硝酸锰、硝酸中的至少一种;所述氨基酸选自甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸、亮氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸中的一种或几种混合;步骤S4中所述活化培养的条件为36‑39℃,30‑50%湿8 9
度下,50‑70r/min转速下,培养18‑24h;所述菌种种子液的含菌量为10‑10cfu/mL。
[0024] 作为本发明的进一步改进,步骤S5中所述发酵乳杆菌LF021、长双歧杆菌BL5b和罗伊氏乳杆菌LR06的接种量分别为3‑5%、1‑3%、0.5‑1%,所述发酵培养的条件为36‑40℃,30‑50%湿度下,50‑70r/min转速下,培养48‑72h;步骤S6中所述魔芋葡甘聚糖、山药多糖、玉米低聚肽的质量比为3‑5:1‑2:2‑4;所述超声波处理和臭氧协同处理中,超声波功率为
120‑150W,臭氧浓度为30‑70mg/L,气体流量为15‑25L/h,处理时间为5‑7s。
[0025] 作为本发明的进一步改进,步骤S7中所述牛磺酸、丙氨酸、亮氨酸的质量比为7‑12:1‑3:2‑4;步骤S8中所述乙醛脱氢酶、乙醇氧化酶的质量比为10‑15:3‑5。
[0026] 作为本发明的进一步改进,步骤S9中所述发酵产物、复合酶、瑞士乳杆菌、海氏肠球菌、卡波姆的质量比为15‑20:1‑2:0.5‑1:2‑3:1‑3;所述溶有羧化壳聚糖的水溶液中羧化壳聚糖的含量为12‑15wt%;所述第一SPG快速膜的孔径为300‑500nm;所述金属离子溶液为含有3‑5wt%的离子、镁离子、铝离子、铁离子、锌离子中的至少一种的溶液;步骤S10中所述水提取物、有机溶剂提取物、多糖肽复合物、氨基酸添加剂、内层缓释颗粒的质量比为3‑5:2‑4:0.5‑1:0.2‑0.5:4‑6;所述溶有海藻酸钠的水溶液中海藻酸钠的含量为7‑12wt%;所述第二SPG快速膜的孔径为10‑15μm;所述金属离子溶液为含有3‑5wt%的钙离子、镁离子、铝离子、铁离子、锌离子中的至少一种的溶液。
[0027] 作为本发明的进一步改进,具体包括以下步骤:
[0028] S1.中药组合物的水提取:将5‑10重量份葛根、1‑3重量份甘草、3‑5重量份猴头菇、1‑2重量份蒲公英分别洗净、干燥、粉碎后得到中药组合物粉,加入水中,所述中药组合物粉和水的固液比为1:5‑10g/mL,加热煮沸提取1‑3h,提取2‑3次,过滤,合并滤液,固体留用,滤液浓缩,干燥,得到水提取物;
[0029] S2.中药组合物的有机溶剂提取:将步骤S1得到的固体加入混合有机溶剂中,所述固体和混合有机溶剂的固液比为1:3‑5g/mL,加热至50‑70℃提取0.5‑1h,提取2‑3次,过滤,合并滤液,固体留用,滤液去除有机溶剂,干燥,得到有机溶剂提取物;
[0030] 所述混合有机溶剂为乙醇、乙酸乙酯、石油醚按照质量比为5‑7:2‑4:1‑3的混合溶剂;
[0031] S3.发酵底物的制备:将7‑12重量份柠檬、5‑10重量份西红柿混合榨汁,弃除固体,汁液与3‑5重量份步骤S2得到的固体混合均匀,加入5‑10重量份碳源和3‑5重量份氮源,混合均匀后,加入30‑50重量份无菌水,搅拌混合,紫外线灭菌,得到发酵底物;
[0032] S4.菌种的活化:将发酵乳杆菌LF021、长双歧杆菌BL5b和罗伊氏乳杆菌LR06分别接种至高氏培养基中,36‑39℃,30‑50%湿度下,50‑70r/min转速下,活化培养18‑24h,得到8 9
菌种种子液,含菌量为10‑10cfu/mL;
[0033] S5.发酵:将步骤S4中发酵乳杆菌LF021、长双歧杆菌BL5b和罗伊氏乳杆菌LR06的菌种种子液接种至步骤S3中的发酵底物中,所述发酵乳杆菌LF021、长双歧杆菌BL5b和罗伊氏乳杆菌LR06的接种量分别为3‑5%、1‑3%、0.5‑1%,36‑40℃,30‑50%湿度下,50‑70r/min转速下,发酵培养48‑72h,得到发酵产物;
[0034] S6.多糖肽复合物的制备:将3‑5重量份魔芋葡甘聚糖、1‑2重量份山药多糖、2‑4重量份玉米低聚肽混合均匀,120‑150W超声波下,通入臭氧处理,臭氧浓度为30‑70mg/L,气体流量为15‑25L/h,处理时间为5‑7s,得到多糖肽复合物;
[0035] S7.氨基酸添加剂的制备:将7‑12重量份牛磺酸、1‑3重量份丙氨酸、2‑4重量份亮氨酸混合均匀,得到氨基酸添加剂;
[0036] S8.复合酶的制备:将10‑15重量份乙醛脱氢酶、3‑5重量份乙醇氧化酶混合均匀,得到复合酶;
[0037] S9.内层缓释颗粒的制备:将15‑20重量份步骤S5制得的发酵产物、1‑2重量份步骤S8制得的复合酶、0.5‑1重量份瑞士乳杆菌、2‑3重量份海氏肠球菌、1‑3重量份卡波姆混合均匀,加入50重量份水中,搅拌混合均匀,加入70‑80重量份含有12‑15wt%的羧化壳聚糖水溶液,孔径为300‑500nm的第一SPG快速膜乳化,形成乳液,加入7‑12重量份含有3‑5wt%的钙离子、镁离子、铝离子、铁离子、锌离子中的至少一种的溶液,常温固化20‑30min,得到内层缓释颗粒;
[0038] S10.含乙醛脱氢酶的乳酸菌冻干粉的制备:将3‑5重量份步骤S1制得的水提取物、2‑4重量份步骤S2制得的有机溶剂提取物、0.5‑1重量份步骤S6制得的多糖肽复合物、0.2‑
0.5重量份步骤S7制得的氨基酸添加剂、4‑6重量份步骤S9制得的内层缓释颗粒混合均匀,加入100重量份含有7‑12wt%的海藻酸钠水溶液中,孔径为10‑15μm第二SPG快速膜乳化,形成乳液,加入7‑12重量份含有3‑5wt%的钙离子、镁离子、铝离子、铁离子、锌离子中的至少一种的溶液,固化10‑15min,冷冻干燥,得到含乙醛脱氢酶的乳酸菌冻干粉。
[0039] 本发明进一步保护一种上述的制备方法制得的含乙醛脱氢酶的乳酸菌冻干粉。
[0040] 本发明进一步保护一种上述含乙醛脱氢酶的乳酸菌冻干粉在制备解酒醒酒、保肝护肝产品中的应用。
[0041] 本发明具有如下有益效果:
[0042] 本发明中药组合物包括葛根、甘草、猴头菇、蒲公英,其水提取物可以改善饮酒引起的体重、肝指数的变化和肝功能指标AST(天冬氨酸转氨酶Aspartate aminotransferase,AST)、ALT(丙氨酸转氨酶Alanine aminotransferase,ALT)和ALP(磷酸酶alkaline phosphatase,ALP)异常;对酒精诱导提高的血脂指标TC(总甘油三酯Total triglyceride,TG)和TG(总甘油三酯Total triglyceride,TG)起到了下调作用;同时有效提高了抗氧化指标GSH(谷胱甘肽Glutathione,GSH)、GST(谷胱甘肽s‑转移酶glutathione s‑transferase,GST)水平和显著增强了肝脏中ADH(乙醇脱氢酶Alcohol Dehydrogenase,ADH)活性。其混合有机溶剂提取物中,乙醇提取物能明显缩短醒酒时间,降低血液乙醇浓度,乙酸乙酯提取物能降低血清中的AST、ALT活力;石油醚提取物能显著提高肝脏中SOD(超氧化物歧化酶Superoxide dismutase,SOD)和GSH的活力,降低MDA(丙二醛Malondialdehyde,MDA)的含量及肝脏指数,其中,混合有机溶剂包括乙醇、乙酸乙酯和石油醚,三种有机溶剂的混合提取得到的提取物还能够同时增强ADH和ALDH(乙醛脱氢酶Acetaldehyde dehydrogenase,ALDH)的活性。
[0043] 柠檬、西红柿能同时增强ADH和ALDH的活性,与中药组合物的固体残渣混合后,加入碳源、氮源作用发酵底物,在酵母菌、乳酸菌的作用下,产生大量的抗氧化活性物质,增加肝脏中SOD的水平,对酒精引起的SOD衰竭起到保护作用,柠檬发酵产物还能显著抑制酒精引起的ALT、AST、肝脏TG和脂质过氧化水平的升高,同时也可改善酒精性肝损伤的组织病理学改变。
[0044] 本发明将罗伊氏乳杆菌LR06、长双歧杆菌BL5b混合发酵培养,具有协同增效的作用,长双歧杆菌BL5b分解底物提供乳酸、氨基酸等,为罗伊氏乳杆菌LR06的生长增殖提供了所需的营养物质,而罗伊氏乳杆菌LR06产生的甲酸、丙酸、丁酸、叶酸等,为发酵初始阶段长双歧杆菌BL5b的生长提供了有利的保障,长双歧杆菌BL5b大量增殖,产生大量的乳酸及氨基酸,促进嗜酸链球菌的生长,相辅相成,互相促进,从而促进发酵菌的发酵,产生了大量的抗氧化物质、降血脂物质,从而有效的改善酒精引起的肝脏氧化损伤,并通过调节血脂,降低血清和肝脏脂质含量。另外,当肝脏发生损伤时,酵母中所含的锌、B族维生素、还原性谷胱甘肽等生物活性成分,一方面可作为机体反应酶的合成原料,另一方面可有效清除体内氧离子及其自由基,保护肝细胞。
[0045] 魔芋葡甘聚糖、山药多糖、玉米低聚肽中,魔芋葡甘聚糖可通过对乙醇吸附作用降低进入血液乙醇含量,能提高血液中ADH、ALDH活力,升高SOD、GSH水平,降低MDA含量,降低血和脑中乙醛含量,山药多糖能够延长醉酒潜伏期,缩短醉酒维持时间,提高醉酒小鼠肝脏中ADH、ALDH活性,降低血清中乙醇和乙醛的浓度,降低肝组织中MDA含量,提高SOD和GSH含量,玉米低聚肽能增强ADH活性,清除自由基活性,降低酒精对肝脏的损伤,缩短协同小鼠的醉酒时间,降低血清中乙醇的含量。在低功率超声波和臭氧处理过程中,可以通过超声波作用导致蛋白质的结构发生变化,促进玉米低聚肽物质与臭氧结合反应,从而起到促进臭氧改性的作用;经过臭氧短时间氧化处理后的玉米低聚肽的二硫键含量升高,从而得到了二聚肽,初步提高了低聚肽的分子量;由于时间短,玉米低聚肽上的其他还原性氨基酸还未来得及发生氧化反应,因此,对蛋白肽的性质影响不大,同时,能提高氢键暴露,促进其与多糖的氢键结合,形成多糖肽的复合物,提高了其抗氧化活性,还能提高血液中的丙氨酸和亮氨+酸含量,使NAD稳定存在,起到很好的解酒醒酒的作用。
[0046] 牛磺酸通过调节肝细胞内Ca2+平衡,提高肝脏中乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的活性,减少过氧化物酶的释放,可有效保护肝细胞;丙氨酸、亮氨酸的添加能提高两者在血液中的+含量,使NAD稳定存在,起到很好的解酒醒酒的作用。
[0047] 乙醛脱氢酶、乙醇氧化酶是直接作用于乙醇降解的活性酶,通过将发酵产物、乙醛脱氢酶、乙醇氧化酶、瑞士乳杆菌、海氏肠球菌保护在羧化壳聚糖内,经过乳化后,在金属离子的作用下,羧化的壳聚糖交联形成颗粒的壁材,将上述活性物质包裹在微胶囊内部,形成从而形成了缓释结构,送入人体后,益生菌、蛋白酶不易于在胃部被人体分解,从而能在进入肠道后被降解释放出来,使得大量的益生菌、蛋白酶等能直接作用于肠道,起到高效的调节肠道菌群,益生菌通过调节肠道微生物菌群,减少细菌易位,减少肝脏炎症,蛋白酶能直接进入血液,作用于乙醇的降解中,从而减少乙醇对肝脏的损伤,起到保护肝脏的作用。
[0048] 最后,将各组分经过海藻酸钠的包埋,形成微胶囊结构,冷冻干燥后,低温保持,有利于保持各组分的活性,且使益生菌不易失活减少活菌量,起到长效保存,延长使用周期,提高活性物质的效果的作用。
[0049] 本发明制得的含乙醛脱氢酶的乳酸菌冻干粉能够改变肠道微生物的组成,调节肠道菌群,提高肠道免疫力,减少氧化应激,缓解化学性肝损伤,从而达到解酒醒酒、改善宿醉、降低酒后不良反应、保护肝脏的效果,具有广阔得应用前景。

具体实施方式

[0050] 下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
[0051] 发酵乳杆菌LF021,拉丁文名称:Lactobacillus fermentum,所述菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院3号,其保藏编号为CGMCC NO:22774,保藏日期为2021年6月24日。长双歧杆菌BL5b,拉丁文名称:Bifidobacterium longum,所述菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院3号,其保藏编号为CGMCC NO:17056,保藏日期为2019年1月2日。罗伊氏乳杆菌LR06,拉丁文名称:Lactobacillus reuteri,所述菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院3号,其保藏编号为CGMCC NO:22775,保藏日期为2021年6月24日。均由江苏新申奥生物科技有限公司提供。
[0052] 魔芋葡甘聚糖,含量大于80%,购于济南嘉格生物科技有限公司;山药多糖,购于山西玉宁生物科技有限公司;玉米低聚肽,含量大于99%,购于四川绿骋生物科技有限公司。
[0053] 乙醛脱氢酶,含量大于99%,购于山东尧同实业有限公司,乙醇氧化酶,黏度:150‑400mpa·s,购于江苏菲亚生物科技有限公司。
[0054] 实施例1
[0055] 本实施例提供一种含乙醛脱氢酶的乳酸菌冻干粉的制备方法,具体包括以下步骤:
[0056] S1.中药组合物的水提取:将5重量份葛根、1重量份甘草、3重量份猴头菇、1重量份蒲公英分别洗净、干燥、粉碎后得到中药组合物粉,加入水中,所述中药组合物粉和水的固液比为1:5g/mL,加热煮沸提取1h,提取2次,过滤,合并滤液,固体留用,滤液浓缩,70℃干燥3h,得到水提取物;
[0057] S2.中药组合物的有机溶剂提取:将步骤S1得到的固体加入混合有机溶剂中,所述固体和混合有机溶剂的固液比为1:3g/mL,加热至50℃提取0.5h,提取2次,过滤,合并滤液,固体留用,滤液减压去除有机溶剂,70℃干燥2h,得到有机溶剂提取物;
[0058] 所述混合有机溶剂为乙醇、乙酸乙酯、石油醚按照质量比为5:2:1的混合溶剂;
[0059] S3.发酵底物的制备:将7重量份柠檬、5重量份西红柿混合榨汁,弃除固体,汁液与3重量份步骤S2得到的固体混合均匀,加入5重量份葡萄糖和3重量份尿素,混合均匀后,加入30重量份无菌水,搅拌混合,紫外线灭菌,得到发酵底物;
[0060] S4.菌种的活化:将发酵乳杆菌LF021、长双歧杆菌BL5b和罗伊氏乳杆菌LR06分别接种至灭菌的高氏培养基中,36℃,30%湿度下,50r/min转速下,活化培养18h,得到菌种种8
子液,含菌量为10cfu/mL;
[0061] S5.发酵:将步骤S4中发酵乳杆菌LF021、长双歧杆菌BL5b和罗伊氏乳杆菌LR06的菌种种子液接种至步骤S3中的发酵底物中,所述发酵乳杆菌LF021、长双歧杆菌BL5b和罗伊氏乳杆菌LR06的接种量分别为3%、1%、0.5%,36℃,30%湿度下,50r/min转速下,发酵培养48h,得到发酵产物;
[0062] S6.多糖肽复合物的制备:将3重量份魔芋葡甘聚糖、1重量份山药多糖、2重量份玉米低聚肽混合均匀,120W超声波下,通入臭氧处理,臭氧浓度为30mg/L,气体流量为15L/h,处理时间为5s,得到多糖肽复合物;
[0063] S7.氨基酸添加剂的制备:将7重量份牛磺酸、1重量份丙氨酸、2重量份亮氨酸混合均匀,得到氨基酸添加剂;
[0064] S8.复合酶的制备:将10重量份乙醛脱氢酶、3重量份乙醇氧化酶混合均匀,得到复合酶;
[0065] S9.内层缓释颗粒的制备:将15重量份步骤S5制得的发酵产物、1重量份步骤S8制得的复合酶、0.5重量份瑞士乳杆菌、2重量份海氏肠球菌、1重量份卡波姆混合均匀,加入50重量份水中,搅拌混合均匀,加入70重量份含有12wt%的羧化壳聚糖水溶液,孔径为300nm的第一SPG快速膜乳化,形成乳液,加入7重量份含有3wt%的钙离子溶液,常温固化20min,3000r/min离心15min,洗涤固体,得到内层缓释颗粒;
[0066] S10.含乙醛脱氢酶的乳酸菌冻干粉的制备:将3重量份步骤S1制得的水提取物、2重量份步骤S2制得的有机溶剂提取物、0.5重量份步骤S6制得的多糖肽复合物、0.2重量份步骤S7制得的氨基酸添加剂、4重量份步骤S9制得的内层缓释颗粒混合均匀,加入100重量份含有7wt%的海藻酸钠水溶液中,孔径为10μm第二SPG快速膜乳化,形成乳液,加入7重量份含有3wt%的钙离子、镁离子、铝离子、铁离子、锌离子中的至少一种的溶液,常温固化10min,3000r/min离心15min,洗涤固体,冷冻干燥,得到含乙醛脱氢酶的乳酸菌冻干粉。
[0067] 实施例2
[0068] 本实施例提供一种含乙醛脱氢酶的乳酸菌冻干粉的制备方法,具体包括以下步骤:
[0069] S1.中药组合物的水提取:将10重量份葛根、3重量份甘草、5重量份猴头菇、2重量份蒲公英分别洗净、干燥、粉碎后得到中药组合物粉,加入水中,所述中药组合物粉和水的固液比为1:10g/mL,加热煮沸提取3h,提取3次,过滤,合并滤液,固体留用,滤液浓缩,70℃干燥3h,得到水提取物;
[0070] S2.中药组合物的有机溶剂提取:将步骤S1得到的固体加入混合有机溶剂中,所述固体和混合有机溶剂的固液比为1:5g/mL,加热至70℃提取1h,提取3次,过滤,合并滤液,固体留用,滤液减压去除有机溶剂,70℃干燥2h,得到有机溶剂提取物;
[0071] 所述混合有机溶剂为乙醇、乙酸乙酯、石油醚按照质量比为7:4:3的混合溶剂;
[0072] S3.发酵底物的制备:将12重量份柠檬、10重量份西红柿混合榨汁,弃除固体,汁液与5重量份步骤S2得到的固体混合均匀,加入5重量份葡萄糖、3重量份麦芽糖、2重量份乳糖、4重量份尿素、1重量份硝酸铵,混合均匀后,加入50重量份无菌水,搅拌混合,紫外线灭菌,得到发酵底物;
[0073] S4.菌种的活化:将发酵乳杆菌LF021、长双歧杆菌BL5b和罗伊氏乳杆菌LR06分别接种至灭菌的高氏培养基中,39℃,50%湿度下,70r/min转速下,活化培养24h,得到菌种种9
子液,含菌量为10cfu/mL;
[0074] S5.发酵:将步骤S4中发酵乳杆菌LF021、长双歧杆菌BL5b和罗伊氏乳杆菌LR06的菌种种子液接种至步骤S3中的发酵底物中,所述发酵乳杆菌LF021、长双歧杆菌BL5b和罗伊氏乳杆菌LR06的接种量分别为5%、3%、1%,40℃,50%湿度下,70r/min转速下,发酵培养72h,得到发酵产物;
[0075] S6.多糖肽复合物的制备:将5重量份魔芋葡甘聚糖、2重量份山药多糖、4重量份玉米低聚肽混合均匀,150W超声波下,通入臭氧处理,臭氧浓度为70mg/L,气体流量为25L/h,处理时间为7s,得到多糖肽复合物;
[0076] S7.氨基酸添加剂的制备:将12重量份牛磺酸、3重量份丙氨酸、4重量份亮氨酸混合均匀,得到氨基酸添加剂;
[0077] S8.复合酶的制备:将15重量份乙醛脱氢酶、5重量份乙醇氧化酶混合均匀,得到复合酶;
[0078] S9.内层缓释颗粒的制备:将20重量份步骤S5制得的发酵产物、2重量份步骤S8制得的复合酶、1重量份瑞士乳杆菌、3重量份海氏肠球菌、3重量份卡波姆混合均匀,加入50重量份水中,搅拌混合均匀,加入80重量份含有15wt%的羧化壳聚糖水溶液,孔径为500nm的第一SPG快速膜乳化,形成乳液,加入12重量份含有5wt%的镁离子溶液,常温固化30min,3000r/min离心15min,洗涤固体,得到内层缓释颗粒;
[0079] S10.含乙醛脱氢酶的乳酸菌冻干粉的制备:将5重量份步骤S1制得的水提取物、4重量份步骤S2制得的有机溶剂提取物、1重量份步骤S6制得的多糖肽复合物、0.5重量份步骤S7制得的氨基酸添加剂、6重量份步骤S9制得的内层缓释颗粒混合均匀,加入100重量份含有12wt%的海藻酸钠水溶液中,孔径为15μm第二SPG快速膜乳化,形成乳液,加入12重量份含有5wt%的钙离子溶液,常温固化15min,3000r/min离心15min,洗涤固体,冷冻干燥,得到含乙醛脱氢酶的乳酸菌冻干粉。
[0080] 实施例3
[0081] 本实施例提供一种含乙醛脱氢酶的乳酸菌冻干粉的制备方法,具体包括以下步骤:
[0082] S1.中药组合物的水提取:将7重量份葛根、2重量份甘草、4重量份猴头菇、1.5重量份蒲公英分别洗净、干燥、粉碎后得到中药组合物粉,加入水中,所述中药组合物粉和水的固液比为1:7g/mL,加热煮沸提取2h,提取3次,过滤,合并滤液,固体留用,滤液浓缩,70℃干燥3h,得到水提取物;
[0083] S2.中药组合物的有机溶剂提取:将步骤S1得到的固体加入混合有机溶剂中,所述固体和混合有机溶剂的固液比为1:4g/mL,加热至60℃提取1h,提取3次,过滤,合并滤液,固体留用,滤液减压去除有机溶剂,70℃干燥2h,得到有机溶剂提取物;
[0084] 所述混合有机溶剂为乙醇、乙酸乙酯、石油醚按照质量比为6:3:2的混合溶剂;
[0085] S3.发酵底物的制备:将10重量份柠檬、7重量份西红柿混合榨汁,弃除固体,汁液与4重量份步骤S2得到的固体混合均匀,加入4重量份葡萄糖、2重量份蔗糖、1重量份果糖、2重量份尿素、1重量份氯化铵、1重量份硝酸钾,混合均匀后,加入40重量份无菌水,搅拌混合,紫外线灭菌,得到发酵底物;
[0086] S4.菌种的活化:将发酵乳杆菌LF021、长双歧杆菌BL5b和罗伊氏乳杆菌LR06分别接种至灭菌的高氏培养基中,37℃,40%湿度下,60r/min转速下,活化培养21h,得到菌种种9
子液,含菌量为10cfu/mL;
[0087] S5.发酵:将步骤S4中发酵乳杆菌LF021、长双歧杆菌BL5b和罗伊氏乳杆菌LR06的菌种种子液接种至步骤S3中的发酵底物中,所述发酵乳杆菌LF021、长双歧杆菌BL5b和罗伊氏乳杆菌LR06的接种量分别为4%、2%、0.7%,38℃,40%湿度下,60r/min转速下,发酵培养56h,得到发酵产物;
[0088] S6.多糖肽复合物的制备:将4重量份魔芋葡甘聚糖、1.5重量份山药多糖、3重量份玉米低聚肽混合均匀,135W超声波下,通入臭氧处理,臭氧浓度为50mg/L,气体流量为20L/h,处理时间为6s,得到多糖肽复合物;
[0089] S7.氨基酸添加剂的制备:将10重量份牛磺酸、2重量份丙氨酸、3重量份亮氨酸混合均匀,得到氨基酸添加剂;
[0090] S8.复合酶的制备:将12重量份乙醛脱氢酶、4重量份乙醇氧化酶混合均匀,得到复合酶;
[0091] S9.内层缓释颗粒的制备:将17重量份步骤S5制得的发酵产物、1.5重量份步骤S8制得的复合酶、0.7重量份瑞士乳杆菌、2.5重量份海氏肠球菌、2重量份卡波姆混合均匀,加入50重量份水中,搅拌混合均匀,加入75重量份含有13.5wt%的羧化壳聚糖水溶液,孔径为400nm的第一SPG快速膜乳化,形成乳液,加入10重量份含有4wt%的铝离子溶液,常温固化
25min,3000r/min离心15min,洗涤固体,得到内层缓释颗粒;
[0092] S10.含乙醛脱氢酶的乳酸菌冻干粉的制备:将4重量份步骤S1制得的水提取物、3重量份步骤S2制得的有机溶剂提取物、0.7重量份步骤S6制得的多糖肽复合物、0.35重量份步骤S7制得的氨基酸添加剂、5重量份步骤S9制得的内层缓释颗粒混合均匀,加入100重量份含有10wt%的海藻酸钠水溶液中,孔径为12μm第二SPG快速膜乳化,形成乳液,加入10重量份含有4wt%的钙离子溶液,常温固化12min,3000r/min离心15min,洗涤固体,冷冻干燥,得到含乙醛脱氢酶的乳酸菌冻干粉。
[0093] 实施例4
[0094] 与实施例3相比,步骤S2中混合有机溶剂由单一的乙醇替代,其他条件均不改变。
[0095] 实施例5
[0096] 与实施例3相比,步骤S2中混合有机溶剂由单一的乙酸乙酯替代,其他条件均不改变。
[0097] 实施例6
[0098] 与实施例3相比,步骤S2中混合有机溶剂由单一的石油醚替代,其他条件均不改变。
[0099] 对比例1
[0100] 与实施例3相比,未经过步骤S1水提取,其他条件均不改变。
[0101] 具体包括以下步骤:
[0102] S1.中药组合物的有机溶剂提取:将7重量份葛根、2重量份甘草、4重量份猴头菇、1.5重量份蒲公英分别洗净、干燥、粉碎后得到中药组合物粉加入混合有机溶剂中,所述固体和混合有机溶剂的固液比为1:4g/mL,加热至60℃提取1h,提取3次,过滤,合并滤液,固体留用,滤液减压去除有机溶剂,70℃干燥2h,得到有机溶剂提取物;
[0103] 所述混合有机溶剂为乙醇、乙酸乙酯、石油醚按照质量比为6:3:2的混合溶剂;
[0104] S2.发酵底物的制备:将10重量份柠檬、7重量份西红柿混合榨汁,弃除固体,汁液与4重量份步骤S1得到的固体混合均匀,加入4重量份葡萄糖、2重量份蔗糖、1重量份果糖、2重量份尿素、1重量份氯化铵、1重量份硝酸钾,混合均匀后,加入40重量份无菌水,搅拌混合,紫外线灭菌,得到发酵底物;
[0105] S3.菌种的活化:将发酵乳杆菌LF021、长双歧杆菌BL5b和罗伊氏乳杆菌LR06分别接种至灭菌的高氏培养基中,37℃,40%湿度下,60r/min转速下,活化培养21h,得到菌种种9
子液,含菌量为10cfu/mL;
[0106] S4.发酵:将步骤S4中发酵乳杆菌LF021、长双歧杆菌BL5b和罗伊氏乳杆菌LR06的菌种种子液接种至步骤S2中的发酵底物中,所述发酵乳杆菌LF021、长双歧杆菌BL5b和罗伊氏乳杆菌LR06的接种量分别为4%、2%、0.7%,38℃,40%湿度下,60r/min转速下,发酵培养56h,得到发酵产物;
[0107] S5.多糖肽复合物的制备:将4重量份魔芋葡甘聚糖、1.5重量份山药多糖、3重量份玉米低聚肽混合均匀,135W超声波下,通入臭氧处理,臭氧浓度为50mg/L,气体流量为20L/h,处理时间为6s,得到多糖肽复合物;
[0108] S6.氨基酸添加剂的制备:将10重量份牛磺酸、2重量份丙氨酸、3重量份亮氨酸混合均匀,得到氨基酸添加剂;
[0109] S7.复合酶的制备:将12重量份乙醛脱氢酶、4重量份乙醇氧化酶混合均匀,得到复合酶;
[0110] S8.内层缓释颗粒的制备:将17重量份步骤S4制得的发酵产物、1.5重量份步骤S7制得的复合酶、0.7重量份瑞士乳杆菌、2.5重量份海氏肠球菌、2重量份卡波姆混合均匀,加入50重量份水中,搅拌混合均匀,加入75重量份含有13.5wt%的羧化壳聚糖水溶液,孔径为400nm的第一SPG快速膜乳化,形成乳液,加入10重量份含有4wt%的铝离子溶液,常温固化
25min,3000r/min离心15min,洗涤固体,得到内层缓释颗粒;
[0111] S9.含乙醛脱氢酶的乳酸菌冻干粉的制备:将7重量份步骤S1制得的有机溶剂提取物、0.7重量份步骤S5制得的多糖肽复合物、0.35重量份步骤S6制得的氨基酸添加剂、5重量份步骤S8制得的内层缓释颗粒混合均匀,加入100重量份含有10wt%的海藻酸钠水溶液中,孔径为12μm第二SPG快速膜乳化,形成乳液,加入10重量份含有4wt%的钙离子溶液,常温固化12min,3000r/min离心15min,洗涤固体,冷冻干燥,得到含乙醛脱氢酶的乳酸菌冻干粉。
[0112] 对比例2
[0113] 与实施例3相比,未经过步骤S2有机溶剂提取,其他条件均不改变。
[0114] 具体包括以下步骤:
[0115] S1.中药组合物的水提取:将7重量份葛根、2重量份甘草、4重量份猴头菇、1.5重量份蒲公英分别洗净、干燥、粉碎后得到中药组合物粉,加入水中,所述中药组合物粉和水的固液比为1:7g/mL,加热煮沸提取2h,提取3次,过滤,合并滤液,固体留用,滤液浓缩,70℃干燥3h,得到水提取物;
[0116] S2.发酵底物的制备:将10重量份柠檬、7重量份西红柿混合榨汁,弃除固体,汁液与4重量份步骤S1得到的固体混合均匀,加入4重量份葡萄糖、2重量份蔗糖、1重量份果糖、2重量份尿素、1重量份氯化铵、1重量份硝酸钾,混合均匀后,加入40重量份无菌水,搅拌混合,紫外线灭菌,得到发酵底物;
[0117] S3.菌种的活化:将发酵乳杆菌LF021、长双歧杆菌BL5b和罗伊氏乳杆菌LR06分别接种至灭菌的高氏培养基中,37℃,40%湿度下,60r/min转速下,活化培养21h,得到菌种种9
子液,含菌量为10cfu/mL;
[0118] S4.发酵:将步骤S3中发酵乳杆菌LF021、长双歧杆菌BL5b和罗伊氏乳杆菌LR06的菌种种子液接种至步骤S2中的发酵底物中,所述发酵乳杆菌LF021、长双歧杆菌BL5b和罗伊氏乳杆菌LR06的接种量分别为4%、2%、0.7%,38℃,40%湿度下,60r/min转速下,发酵培养56h,得到发酵产物;
[0119] S5.多糖肽复合物的制备:将4重量份魔芋葡甘聚糖、1.5重量份山药多糖、3重量份玉米低聚肽混合均匀,135W超声波下,通入臭氧处理,臭氧浓度为50mg/L,气体流量为20L/h,处理时间为6s,得到多糖肽复合物;
[0120] S6.氨基酸添加剂的制备:将10重量份牛磺酸、2重量份丙氨酸、3重量份亮氨酸混合均匀,得到氨基酸添加剂;
[0121] S7.复合酶的制备:将12重量份乙醛脱氢酶、4重量份乙醇氧化酶混合均匀,得到复合酶;
[0122] S8.内层缓释颗粒的制备:将17重量份步骤S4制得的发酵产物、1.5重量份步骤S7制得的复合酶、0.7重量份瑞士乳杆菌、2.5重量份海氏肠球菌、2重量份卡波姆混合均匀,加入50重量份水中,搅拌混合均匀,加入75重量份含有13.5wt%的羧化壳聚糖水溶液,孔径为400nm的第一SPG快速膜乳化,形成乳液,加入10重量份含有4wt%的铝离子溶液,常温固化
25min,3000r/min离心15min,洗涤固体,得到内层缓释颗粒;
[0123] S9.含乙醛脱氢酶的乳酸菌冻干粉的制备:将7重量份步骤S1制得的水提取物、0.7重量份步骤S5制得的多糖肽复合物、0.35重量份步骤S6制得的氨基酸添加剂、5重量份步骤S8制得的内层缓释颗粒混合均匀,加入100重量份含有10wt%的海藻酸钠水溶液中,孔径为12μm第二SPG快速膜乳化,形成乳液,加入10重量份含有4wt%的钙离子溶液,常温固化
12min,3000r/min离心15min,洗涤固体,冷冻干燥,得到含乙醛脱氢酶的乳酸菌冻干粉。
[0124] 对比例3
[0125] 与实施例3相比,步骤S1中不包括葛根,其他条件均不改变。
[0126] 具体包括以下步骤:
[0127] S1.中药组合物的水提取:将2重量份甘草、11重量份猴头菇、1.5重量份蒲公英分别洗净、干燥、粉碎后得到中药组合物粉,加入水中,所述中药组合物粉和水的固液比为1:7g/mL,加热煮沸提取2h,提取3次,过滤,合并滤液,固体留用,滤液浓缩,70℃干燥3h,得到水提取物;
[0128] S2.中药组合物的有机溶剂提取:将步骤S1得到的固体加入混合有机溶剂中,所述固体和混合有机溶剂的固液比为1:4g/mL,加热至60℃提取1h,提取3次,过滤,合并滤液,固体留用,滤液减压去除有机溶剂,70℃干燥2h,得到有机溶剂提取物;
[0129] 所述混合有机溶剂为乙醇、乙酸乙酯、石油醚按照质量比为6:3:2的混合溶剂;
[0130] S3.发酵底物的制备:将10重量份柠檬、7重量份西红柿混合榨汁,弃除固体,汁液与4重量份步骤S2得到的固体混合均匀,加入4重量份葡萄糖、2重量份蔗糖、1重量份果糖、2重量份尿素、1重量份氯化铵、1重量份硝酸钾,混合均匀后,加入40重量份无菌水,搅拌混合,紫外线灭菌,得到发酵底物;
[0131] S4.菌种的活化:将发酵乳杆菌LF021、长双歧杆菌BL5b和罗伊氏乳杆菌LR06分别接种至灭菌的高氏培养基中,37℃,40%湿度下,60r/min转速下,活化培养21h,得到菌种种9
子液,含菌量为10cfu/mL;
[0132] S5.发酵:将步骤S4中发酵乳杆菌LF021、长双歧杆菌BL5b和罗伊氏乳杆菌LR06的菌种种子液接种至步骤S3中的发酵底物中,所述发酵乳杆菌LF021、长双歧杆菌BL5b和罗伊氏乳杆菌LR06的接种量分别为4%、2%、0.7%,38℃,40%湿度下,60r/min转速下,发酵培养56h,得到发酵产物;
[0133] S6.多糖肽复合物的制备:将4重量份魔芋葡甘聚糖、1.5重量份山药多糖、3重量份玉米低聚肽混合均匀,135W超声波下,通入臭氧处理,臭氧浓度为50mg/L,气体流量为20L/h,处理时间为6s,得到多糖肽复合物;
[0134] S7.氨基酸添加剂的制备:将10重量份牛磺酸、2重量份丙氨酸、3重量份亮氨酸混合均匀,得到氨基酸添加剂;
[0135] S8.复合酶的制备:将12重量份乙醛脱氢酶、4重量份乙醇氧化酶混合均匀,得到复合酶;
[0136] S9.内层缓释颗粒的制备:将17重量份步骤S5制得的发酵产物、1.5重量份步骤S8制得的复合酶、0.7重量份瑞士乳杆菌、2.5重量份海氏肠球菌、2重量份卡波姆混合均匀,加入50重量份水中,搅拌混合均匀,加入75重量份含有13.5wt%的羧化壳聚糖水溶液,孔径为400nm的第一SPG快速膜乳化,形成乳液,加入10重量份含有4wt%的铝离子溶液,常温固化
25min,3000r/min离心15min,洗涤固体,得到内层缓释颗粒;
[0137] S10.含乙醛脱氢酶的乳酸菌冻干粉的制备:将4重量份步骤S1制得的水提取物、3重量份步骤S2制得的有机溶剂提取物、0.7重量份步骤S6制得的多糖肽复合物、0.35重量份步骤S7制得的氨基酸添加剂、5重量份步骤S9制得的内层缓释颗粒混合均匀,加入100重量份含有10wt%的海藻酸钠水溶液中,孔径为12μm第二SPG快速膜乳化,形成乳液,加入10重量份含有4wt%的钙离子溶液,常温固化12min,3000r/min离心15min,洗涤固体,冷冻干燥,得到含乙醛脱氢酶的乳酸菌冻干粉。
[0138] 对比例4
[0139] 与实施例3相比,步骤S1中不包括猴头菇,其他条件均不改变。
[0140] 具体包括以下步骤:
[0141] S1.中药组合物的水提取:将11重量份葛根、2重量份甘草、4重量份猴头菇、1.5重量份蒲公英分别洗净、干燥、粉碎后得到中药组合物粉,加入水中,所述中药组合物粉和水的固液比为1:7g/mL,加热煮沸提取2h,提取3次,过滤,合并滤液,固体留用,滤液浓缩,70℃干燥3h,得到水提取物;
[0142] S2.中药组合物的有机溶剂提取:将步骤S1得到的固体加入混合有机溶剂中,所述固体和混合有机溶剂的固液比为1:4g/mL,加热至60℃提取1h,提取3次,过滤,合并滤液,固体留用,滤液减压去除有机溶剂,70℃干燥2h,得到有机溶剂提取物;
[0143] 所述混合有机溶剂为乙醇、乙酸乙酯、石油醚按照质量比为6:3:2的混合溶剂;
[0144] S3.发酵底物的制备:将10重量份柠檬、7重量份西红柿混合榨汁,弃除固体,汁液与4重量份步骤S2得到的固体混合均匀,加入4重量份葡萄糖、2重量份蔗糖、1重量份果糖、2重量份尿素、1重量份氯化铵、1重量份硝酸钾,混合均匀后,加入40重量份无菌水,搅拌混合,紫外线灭菌,得到发酵底物;
[0145] S4.菌种的活化:将发酵乳杆菌LF021、长双歧杆菌BL5b和罗伊氏乳杆菌LR06分别接种至灭菌的高氏培养基中,37℃,40%湿度下,60r/min转速下,活化培养21h,得到菌种种9
子液,含菌量为10cfu/mL;
[0146] S5.发酵:将步骤S4中发酵乳杆菌LF021、长双歧杆菌BL5b和罗伊氏乳杆菌LR06的菌种种子液接种至步骤S3中的发酵底物中,所述发酵乳杆菌LF021、长双歧杆菌BL5b和罗伊氏乳杆菌LR06的接种量分别为4%、2%、0.7%,38℃,40%湿度下,60r/min转速下,发酵培养56h,得到发酵产物;
[0147] S6.多糖肽复合物的制备:将4重量份魔芋葡甘聚糖、1.5重量份山药多糖、3重量份玉米低聚肽混合均匀,135W超声波下,通入臭氧处理,臭氧浓度为50mg/L,气体流量为20L/h,处理时间为6s,得到多糖肽复合物;
[0148] S7.氨基酸添加剂的制备:将10重量份牛磺酸、2重量份丙氨酸、3重量份亮氨酸混合均匀,得到氨基酸添加剂;
[0149] S8.复合酶的制备:将12重量份乙醛脱氢酶、4重量份乙醇氧化酶混合均匀,得到复合酶;
[0150] S9.内层缓释颗粒的制备:将17重量份步骤S5制得的发酵产物、1.5重量份步骤S8制得的复合酶、0.7重量份瑞士乳杆菌、2.5重量份海氏肠球菌、2重量份卡波姆混合均匀,加入50重量份水中,搅拌混合均匀,加入75重量份含有13.5wt%的羧化壳聚糖水溶液,孔径为400nm的第一SPG快速膜乳化,形成乳液,加入10重量份含有4wt%的铝离子溶液,常温固化
25min,3000r/min离心15min,洗涤固体,得到内层缓释颗粒;
[0151] S10.含乙醛脱氢酶的乳酸菌冻干粉的制备:将4重量份步骤S1制得的水提取物、3重量份步骤S2制得的有机溶剂提取物、0.7重量份步骤S6制得的多糖肽复合物、0.35重量份步骤S7制得的氨基酸添加剂、5重量份步骤S9制得的内层缓释颗粒混合均匀,加入100重量份含有10wt%的海藻酸钠水溶液中,孔径为12μm第二SPG快速膜乳化,形成乳液,加入10重量份含有4wt%的钙离子溶液,常温固化12min,3000r/min离心15min,洗涤固体,冷冻干燥,得到含乙醛脱氢酶的乳酸菌冻干粉。
[0152] 对比例5
[0153] 与实施例3相比,步骤S3中未添加柠檬,其他条件均不改变。
[0154] 具体包括以下步骤:
[0155] S1.中药组合物的水提取:将7重量份葛根、2重量份甘草、4重量份猴头菇、1.5重量份蒲公英分别洗净、干燥、粉碎后得到中药组合物粉,加入水中,所述中药组合物粉和水的固液比为1:7g/mL,加热煮沸提取2h,提取3次,过滤,合并滤液,固体留用,滤液浓缩,70℃干燥3h,得到水提取物;
[0156] S2.中药组合物的有机溶剂提取:将步骤S1得到的固体加入混合有机溶剂中,所述固体和混合有机溶剂的固液比为1:4g/mL,加热至60℃提取1h,提取3次,过滤,合并滤液,固体留用,滤液减压去除有机溶剂,70℃干燥2h,得到有机溶剂提取物;
[0157] 所述混合有机溶剂为乙醇、乙酸乙酯、石油醚按照质量比为6:3:2的混合溶剂;
[0158] S3.发酵底物的制备:将17重量份西红柿榨汁,弃除固体,汁液与4重量份步骤S2得到的固体混合均匀,加入4重量份葡萄糖、2重量份蔗糖、1重量份果糖、2重量份尿素、1重量份氯化铵、1重量份硝酸钾,混合均匀后,加入40重量份无菌水,搅拌混合,紫外线灭菌,得到发酵底物;
[0159] S4.菌种的活化:将发酵乳杆菌LF021、长双歧杆菌BL5b和罗伊氏乳杆菌LR06分别接种至灭菌的高氏培养基中,37℃,40%湿度下,60r/min转速下,活化培养21h,得到菌种种9
子液,含菌量为10cfu/mL;
[0160] S5.发酵:将步骤S4中发酵乳杆菌LF021、长双歧杆菌BL5b和罗伊氏乳杆菌LR06的菌种种子液接种至步骤S3中的发酵底物中,所述发酵乳杆菌LF021、长双歧杆菌BL5b和罗伊氏乳杆菌LR06的接种量分别为4%、2%、0.7%,38℃,40%湿度下,60r/min转速下,发酵培养56h,得到发酵产物;
[0161] S6.多糖肽复合物的制备:将4重量份魔芋葡甘聚糖、1.5重量份山药多糖、3重量份玉米低聚肽混合均匀,135W超声波下,通入臭氧处理,臭氧浓度为50mg/L,气体流量为20L/h,处理时间为6s,得到多糖肽复合物;
[0162] S7.氨基酸添加剂的制备:将10重量份牛磺酸、2重量份丙氨酸、3重量份亮氨酸混合均匀,得到氨基酸添加剂;
[0163] S8.复合酶的制备:将12重量份乙醛脱氢酶、4重量份乙醇氧化酶混合均匀,得到复合酶;
[0164] S9.内层缓释颗粒的制备:将17重量份步骤S5制得的发酵产物、1.5重量份步骤S8制得的复合酶、0.7重量份瑞士乳杆菌、2.5重量份海氏肠球菌、2重量份卡波姆混合均匀,加入50重量份水中,搅拌混合均匀,加入75重量份含有13.5wt%的羧化壳聚糖水溶液,孔径为400nm的第一SPG快速膜乳化,形成乳液,加入10重量份含有4wt%的铝离子溶液,常温固化
25min,3000r/min离心15min,洗涤固体,得到内层缓释颗粒;
[0165] S10.含乙醛脱氢酶的乳酸菌冻干粉的制备:将4重量份步骤S1制得的水提取物、3重量份步骤S2制得的有机溶剂提取物、0.7重量份步骤S6制得的多糖肽复合物、0.35重量份步骤S7制得的氨基酸添加剂、5重量份步骤S9制得的内层缓释颗粒混合均匀,加入100重量份含有10wt%的海藻酸钠水溶液中,孔径为12μm第二SPG快速膜乳化,形成乳液,加入10重量份含有4wt%的钙离子溶液,常温固化12min,3000r/min离心15min,洗涤固体,冷冻干燥,得到含乙醛脱氢酶的乳酸菌冻干粉。
[0166] 对比例6
[0167] 与实施例3相比,步骤S3中未添加西红柿,其他条件均不改变。
[0168] 具体包括以下步骤:
[0169] S1.中药组合物的水提取:将7重量份葛根、2重量份甘草、4重量份猴头菇、1.5重量份蒲公英分别洗净、干燥、粉碎后得到中药组合物粉,加入水中,所述中药组合物粉和水的固液比为1:7g/mL,加热煮沸提取2h,提取3次,过滤,合并滤液,固体留用,滤液浓缩,70℃干燥3h,得到水提取物;
[0170] S2.中药组合物的有机溶剂提取:将步骤S1得到的固体加入混合有机溶剂中,所述固体和混合有机溶剂的固液比为1:4g/mL,加热至60℃提取1h,提取3次,过滤,合并滤液,固体留用,滤液减压去除有机溶剂,70℃干燥2h,得到有机溶剂提取物;
[0171] 所述混合有机溶剂为乙醇、乙酸乙酯、石油醚按照质量比为6:3:2的混合溶剂;
[0172] S3.发酵底物的制备:将17重量份柠檬榨汁,弃除固体,汁液与4重量份步骤S2得到的固体混合均匀,加入4重量份葡萄糖、2重量份蔗糖、1重量份果糖、2重量份尿素、1重量份氯化铵、1重量份硝酸钾,混合均匀后,加入40重量份无菌水,搅拌混合,紫外线灭菌,得到发酵底物;
[0173] S4.菌种的活化:将发酵乳杆菌LF021、长双歧杆菌BL5b和罗伊氏乳杆菌LR06分别接种至灭菌的高氏培养基中,37℃,40%湿度下,60r/min转速下,活化培养21h,得到菌种种9
子液,含菌量为10cfu/mL;
[0174] S5.发酵:将步骤S4中发酵乳杆菌LF021、长双歧杆菌BL5b和罗伊氏乳杆菌LR06的菌种种子液接种至步骤S3中的发酵底物中,所述发酵乳杆菌LF021、长双歧杆菌BL5b和罗伊氏乳杆菌LR06的接种量分别为4%、2%、0.7%,38℃,40%湿度下,60r/min转速下,发酵培养56h,得到发酵产物;
[0175] S6.多糖肽复合物的制备:将4重量份魔芋葡甘聚糖、1.5重量份山药多糖、3重量份玉米低聚肽混合均匀,135W超声波下,通入臭氧处理,臭氧浓度为50mg/L,气体流量为20L/h,处理时间为6s,得到多糖肽复合物;
[0176] S7.氨基酸添加剂的制备:将10重量份牛磺酸、2重量份丙氨酸、3重量份亮氨酸混合均匀,得到氨基酸添加剂;
[0177] S8.复合酶的制备:将12重量份乙醛脱氢酶、4重量份乙醇氧化酶混合均匀,得到复合酶;
[0178] S9.内层缓释颗粒的制备:将17重量份步骤S5制得的发酵产物、1.5重量份步骤S8制得的复合酶、0.7重量份瑞士乳杆菌、2.5重量份海氏肠球菌、2重量份卡波姆混合均匀,加入50重量份水中,搅拌混合均匀,加入75重量份含有13.5wt%的羧化壳聚糖水溶液,孔径为400nm的第一SPG快速膜乳化,形成乳液,加入10重量份含有4wt%的铝离子溶液,常温固化
25min,3000r/min离心15min,洗涤固体,得到内层缓释颗粒;
[0179] S10.含乙醛脱氢酶的乳酸菌冻干粉的制备:将4重量份步骤S1制得的水提取物、3重量份步骤S2制得的有机溶剂提取物、0.7重量份步骤S6制得的多糖肽复合物、0.35重量份步骤S7制得的氨基酸添加剂、5重量份步骤S9制得的内层缓释颗粒混合均匀,加入100重量份含有10wt%的海藻酸钠水溶液中,孔径为12μm第二SPG快速膜乳化,形成乳液,加入10重量份含有4wt%的钙离子溶液,常温固化12min,3000r/min离心15min,洗涤固体,冷冻干燥,得到含乙醛脱氢酶的乳酸菌冻干粉。
[0180] 对比例7
[0181] 与实施例3相比,步骤S3中未添加步骤S2得到的固体,其他条件均不改变。
[0182] 具体包括以下步骤:
[0183] S1.中药组合物的水提取:将7重量份葛根、2重量份甘草、4重量份猴头菇、1.5重量份蒲公英分别洗净、干燥、粉碎后得到中药组合物粉,加入水中,所述中药组合物粉和水的固液比为1:7g/mL,加热煮沸提取2h,提取3次,过滤,合并滤液,固体留用,滤液浓缩,70℃干燥3h,得到水提取物;
[0184] S2.中药组合物的有机溶剂提取:将步骤S1得到的固体加入混合有机溶剂中,所述固体和混合有机溶剂的固液比为1:4g/mL,加热至60℃提取1h,提取3次,过滤,合并滤液,固体留用,滤液减压去除有机溶剂,70℃干燥2h,得到有机溶剂提取物;
[0185] 所述混合有机溶剂为乙醇、乙酸乙酯、石油醚按照质量比为6:3:2的混合溶剂;
[0186] S3.发酵底物的制备:将10重量份柠檬、7重量份西红柿混合榨汁,弃除固体,汁液中加入4重量份葡萄糖、2重量份蔗糖、1重量份果糖、2重量份尿素、1重量份氯化铵、1重量份硝酸钾,混合均匀后,加入40重量份无菌水,搅拌混合,紫外线灭菌,得到发酵底物;
[0187] S4.菌种的活化:将发酵乳杆菌LF021、长双歧杆菌BL5b和罗伊氏乳杆菌LR06分别接种至灭菌的高氏培养基中,37℃,40%湿度下,60r/min转速下,活化培养21h,得到菌种种9
子液,含菌量为10cfu/mL;
[0188] S5.发酵:将步骤S4中发酵乳杆菌LF021、长双歧杆菌BL5b和罗伊氏乳杆菌LR06的菌种种子液接种至步骤S3中的发酵底物中,所述发酵乳杆菌LF021、长双歧杆菌BL5b和罗伊氏乳杆菌LR06的接种量分别为4%、2%、0.7%,38℃,40%湿度下,60r/min转速下,发酵培养56h,得到发酵产物;
[0189] S6.多糖肽复合物的制备:将4重量份魔芋葡甘聚糖、1.5重量份山药多糖、3重量份玉米低聚肽混合均匀,135W超声波下,通入臭氧处理,臭氧浓度为50mg/L,气体流量为20L/h,处理时间为6s,得到多糖肽复合物;
[0190] S7.氨基酸添加剂的制备:将10重量份牛磺酸、2重量份丙氨酸、3重量份亮氨酸混合均匀,得到氨基酸添加剂;
[0191] S8.复合酶的制备:将12重量份乙醛脱氢酶、4重量份乙醇氧化酶混合均匀,得到复合酶;
[0192] S9.内层缓释颗粒的制备:将17重量份步骤S5制得的发酵产物、1.5重量份步骤S8制得的复合酶、0.7重量份瑞士乳杆菌、2.5重量份海氏肠球菌、2重量份卡波姆混合均匀,加入50重量份水中,搅拌混合均匀,加入75重量份含有13.5wt%的羧化壳聚糖水溶液,孔径为400nm的第一SPG快速膜乳化,形成乳液,加入10重量份含有4wt%的铝离子溶液,常温固化
25min,3000r/min离心15min,洗涤固体,得到内层缓释颗粒;
[0193] S10.含乙醛脱氢酶的乳酸菌冻干粉的制备:将4重量份步骤S1制得的水提取物、3重量份步骤S2制得的有机溶剂提取物、0.7重量份步骤S6制得的多糖肽复合物、0.35重量份步骤S7制得的氨基酸添加剂、5重量份步骤S9制得的内层缓释颗粒混合均匀,加入100重量份含有10wt%的海藻酸钠水溶液中,孔径为12μm第二SPG快速膜乳化,形成乳液,加入10重量份含有4wt%的钙离子溶液,常温固化12min,3000r/min离心15min,洗涤固体,冷冻干燥,得到含乙醛脱氢酶的乳酸菌冻干粉。
[0194] 对比例8
[0195] 与实施例3相比,未进行步骤S1、S2,步骤S3中未添加步骤S2得到的固体,其他条件均不改变。
[0196] 具体包括以下步骤:
[0197] S1.发酵底物的制备:将10重量份柠檬、7重量份西红柿混合榨汁,弃除固体,汁液中加入4重量份葡萄糖、2重量份蔗糖、1重量份果糖、2重量份尿素、1重量份氯化铵、1重量份硝酸钾,混合均匀后,加入40重量份无菌水,搅拌混合,紫外线灭菌,得到发酵底物;
[0198] S2.菌种的活化:将发酵乳杆菌LF021、长双歧杆菌BL5b和罗伊氏乳杆菌LR06分别接种至灭菌的高氏培养基中,37℃,40%湿度下,60r/min转速下,活化培养21h,得到菌种种9
子液,含菌量为10cfu/mL;
[0199] S3.发酵:将步骤S2中发酵乳杆菌LF021、长双歧杆菌BL5b和罗伊氏乳杆菌LR06的菌种种子液接种至步骤S1中的发酵底物中,所述发酵乳杆菌LF021、长双歧杆菌BL5b和罗伊氏乳杆菌LR06的接种量分别为4%、2%、0.7%,38℃,40%湿度下,60r/min转速下,发酵培养56h,得到发酵产物;
[0200] S4.多糖肽复合物的制备:将4重量份魔芋葡甘聚糖、1.5重量份山药多糖、3重量份玉米低聚肽混合均匀,135W超声波下,通入臭氧处理,臭氧浓度为50mg/L,气体流量为20L/h,处理时间为6s,得到多糖肽复合物;
[0201] S5.氨基酸添加剂的制备:将10重量份牛磺酸、2重量份丙氨酸、3重量份亮氨酸混合均匀,得到氨基酸添加剂;
[0202] S6.复合酶的制备:将12重量份乙醛脱氢酶、4重量份乙醇氧化酶混合均匀,得到复合酶;
[0203] S7.内层缓释颗粒的制备:将17重量份步骤S3制得的发酵产物、1.5重量份步骤S6制得的复合酶、0.7重量份瑞士乳杆菌、2.5重量份海氏肠球菌、2重量份卡波姆混合均匀,加入50重量份水中,搅拌混合均匀,加入75重量份含有13.5wt%的羧化壳聚糖水溶液,孔径为400nm的第一SPG快速膜乳化,形成乳液,加入10重量份含有4wt%的铝离子溶液,常温固化
25min,3000r/min离心15min,洗涤固体,得到内层缓释颗粒;
[0204] S8.含乙醛脱氢酶的乳酸菌冻干粉的制备:将0.7重量份步骤S4制得的多糖肽复合物、0.35重量份步骤S5制得的氨基酸添加剂、5重量份步骤S7制得的内层缓释颗粒混合均匀,加入100重量份含有10wt%的海藻酸钠水溶液中,孔径为12μm第二SPG快速膜乳化,形成乳液,加入10重量份含有4wt%的钙离子溶液,常温固化12min,3000r/min离心15min,洗涤固体,冷冻干燥,得到含乙醛脱氢酶的乳酸菌冻干粉。
[0205] 对比例9
[0206] 与实施例3相比,步骤S5中未接种发酵乳杆菌LF021,其他条件均不改变。
[0207] 具体包括以下步骤:
[0208] S1.中药组合物的水提取:将7重量份葛根、2重量份甘草、4重量份猴头菇、1.5重量份蒲公英分别洗净、干燥、粉碎后得到中药组合物粉,加入水中,所述中药组合物粉和水的固液比为1:7g/mL,加热煮沸提取2h,提取3次,过滤,合并滤液,固体留用,滤液浓缩,70℃干燥3h,得到水提取物;
[0209] S2.中药组合物的有机溶剂提取:将步骤S1得到的固体加入混合有机溶剂中,所述固体和混合有机溶剂的固液比为1:4g/mL,加热至60℃提取1h,提取3次,过滤,合并滤液,固体留用,滤液减压去除有机溶剂,70℃干燥2h,得到有机溶剂提取物;
[0210] 所述混合有机溶剂为乙醇、乙酸乙酯、石油醚按照质量比为6:3:2的混合溶剂;
[0211] S3.发酵底物的制备:将10重量份柠檬、7重量份西红柿混合榨汁,弃除固体,汁液与4重量份步骤S2得到的固体混合均匀,加入4重量份葡萄糖、2重量份蔗糖、1重量份果糖、2重量份尿素、1重量份氯化铵、1重量份硝酸钾,混合均匀后,加入40重量份无菌水,搅拌混合,紫外线灭菌,得到发酵底物;
[0212] S4.菌种的活化:将长双歧杆菌BL5b和罗伊氏乳杆菌LR06分别接种至灭菌的高氏培养基中,37℃,40%湿度下,60r/min转速下,活化培养21h,得到菌种种子液,含菌量为9
10cfu/mL;
[0213] S5.发酵:将步骤S4中长双歧杆菌BL5b和罗伊氏乳杆菌LR06的菌种种子液接种至步骤S3中的发酵底物中,所述长双歧杆菌BL5b和罗伊氏乳杆菌LR06的接种量分别为2%、0.7%,38℃,40%湿度下,60r/min转速下,发酵培养56h,得到发酵产物;
[0214] S6.多糖肽复合物的制备:将4重量份魔芋葡甘聚糖、1.5重量份山药多糖、3重量份玉米低聚肽混合均匀,135W超声波下,通入臭氧处理,臭氧浓度为50mg/L,气体流量为20L/h,处理时间为6s,得到多糖肽复合物;
[0215] S7.氨基酸添加剂的制备:将10重量份牛磺酸、2重量份丙氨酸、3重量份亮氨酸混合均匀,得到氨基酸添加剂;
[0216] S8.复合酶的制备:将12重量份乙醛脱氢酶、4重量份乙醇氧化酶混合均匀,得到复合酶;
[0217] S9.内层缓释颗粒的制备:将17重量份步骤S5制得的发酵产物、1.5重量份步骤S8制得的复合酶、0.7重量份瑞士乳杆菌、2.5重量份海氏肠球菌、2重量份卡波姆混合均匀,加入50重量份水中,搅拌混合均匀,加入75重量份含有13.5wt%的羧化壳聚糖水溶液,孔径为400nm的第一SPG快速膜乳化,形成乳液,加入10重量份含有4wt%的铝离子溶液,常温固化
25min,3000r/min离心15min,洗涤固体,得到内层缓释颗粒;
[0218] S10.含乙醛脱氢酶的乳酸菌冻干粉的制备:将4重量份步骤S1制得的水提取物、3重量份步骤S2制得的有机溶剂提取物、0.7重量份步骤S6制得的多糖肽复合物、0.35重量份步骤S7制得的氨基酸添加剂、5重量份步骤S9制得的内层缓释颗粒混合均匀,加入100重量份含有10wt%的海藻酸钠水溶液中,孔径为12μm第二SPG快速膜乳化,形成乳液,加入10重量份含有4wt%的钙离子溶液,常温固化12min,3000r/min离心15min,洗涤固体,冷冻干燥,得到含乙醛脱氢酶的乳酸菌冻干粉。
[0219] 对比例10
[0220] 与实施例3相比,步骤S5中未接种长双歧杆菌BL5b和罗伊氏乳杆菌LR06,其他条件均不改变。
[0221] 具体包括以下步骤:
[0222] S1.中药组合物的水提取:将7重量份葛根、2重量份甘草、4重量份猴头菇、1.5重量份蒲公英分别洗净、干燥、粉碎后得到中药组合物粉,加入水中,所述中药组合物粉和水的固液比为1:7g/mL,加热煮沸提取2h,提取3次,过滤,合并滤液,固体留用,滤液浓缩,70℃干燥3h,得到水提取物;
[0223] S2.中药组合物的有机溶剂提取:将步骤S1得到的固体加入混合有机溶剂中,所述固体和混合有机溶剂的固液比为1:4g/mL,加热至60℃提取1h,提取3次,过滤,合并滤液,固体留用,滤液减压去除有机溶剂,70℃干燥2h,得到有机溶剂提取物;
[0224] 所述混合有机溶剂为乙醇、乙酸乙酯、石油醚按照质量比为6:3:2的混合溶剂;
[0225] S3.发酵底物的制备:将10重量份柠檬、7重量份西红柿混合榨汁,弃除固体,汁液与4重量份步骤S2得到的固体混合均匀,加入4重量份葡萄糖、2重量份蔗糖、1重量份果糖、2重量份尿素、1重量份氯化铵、1重量份硝酸钾,混合均匀后,加入40重量份无菌水,搅拌混合,紫外线灭菌,得到发酵底物;
[0226] S4.菌种的活化:将发酵乳杆菌LF021接种至灭菌的高氏培养基中,37℃,40%湿度9
下,60r/min转速下,活化培养21h,得到菌种种子液,含菌量为10cfu/mL;
[0227] S5.发酵:将步骤S4中发酵乳杆菌LF021的菌种种子液接种至步骤S3中的发酵底物中,所述发酵乳杆菌LF021的接种量分别为4%,38℃,40%湿度下,60r/min转速下,发酵培养56h,得到发酵产物;
[0228] S6.多糖肽复合物的制备:将4重量份魔芋葡甘聚糖、1.5重量份山药多糖、3重量份玉米低聚肽混合均匀,135W超声波下,通入臭氧处理,臭氧浓度为50mg/L,气体流量为20L/h,处理时间为6s,得到多糖肽复合物;
[0229] S7.氨基酸添加剂的制备:将10重量份牛磺酸、2重量份丙氨酸、3重量份亮氨酸混合均匀,得到氨基酸添加剂;
[0230] S8.复合酶的制备:将12重量份乙醛脱氢酶、4重量份乙醇氧化酶混合均匀,得到复合酶;
[0231] S9.内层缓释颗粒的制备:将17重量份步骤S5制得的发酵产物、1.5重量份步骤S8制得的复合酶、0.7重量份瑞士乳杆菌、2.5重量份海氏肠球菌、2重量份卡波姆混合均匀,加入50重量份水中,搅拌混合均匀,加入75重量份含有13.5wt%的羧化壳聚糖水溶液,孔径为400nm的第一SPG快速膜乳化,形成乳液,加入10重量份含有4wt%的铝离子溶液,常温固化
25min,3000r/min离心15min,洗涤固体,得到内层缓释颗粒;
[0232] S10.含乙醛脱氢酶的乳酸菌冻干粉的制备:将4重量份步骤S1制得的水提取物、3重量份步骤S2制得的有机溶剂提取物、0.7重量份步骤S6制得的多糖肽复合物、0.35重量份步骤S7制得的氨基酸添加剂、5重量份步骤S9制得的内层缓释颗粒混合均匀,加入100重量份含有10wt%的海藻酸钠水溶液中,孔径为12μm第二SPG快速膜乳化,形成乳液,加入10重量份含有4wt%的钙离子溶液,常温固化12min,3000r/min离心15min,洗涤固体,冷冻干燥,得到含乙醛脱氢酶的乳酸菌冻干粉。
[0233] 对比例11
[0234] 与实施例3相比,步骤S6中未进行超声波处理和臭氧协同处理,其他条件均不改变。
[0235] 具体包括以下步骤:
[0236] S1.中药组合物的水提取:将7重量份葛根、2重量份甘草、4重量份猴头菇、1.5重量份蒲公英分别洗净、干燥、粉碎后得到中药组合物粉,加入水中,所述中药组合物粉和水的固液比为1:7g/mL,加热煮沸提取2h,提取3次,过滤,合并滤液,固体留用,滤液浓缩,70℃干燥3h,得到水提取物;
[0237] S2.中药组合物的有机溶剂提取:将步骤S1得到的固体加入混合有机溶剂中,所述固体和混合有机溶剂的固液比为1:4g/mL,加热至60℃提取1h,提取3次,过滤,合并滤液,固体留用,滤液减压去除有机溶剂,70℃干燥2h,得到有机溶剂提取物;
[0238] 所述混合有机溶剂为乙醇、乙酸乙酯、石油醚按照质量比为6:3:2的混合溶剂;
[0239] S3.发酵底物的制备:将10重量份柠檬、7重量份西红柿混合榨汁,弃除固体,汁液与4重量份步骤S2得到的固体混合均匀,加入4重量份葡萄糖、2重量份蔗糖、1重量份果糖、2重量份尿素、1重量份氯化铵、1重量份硝酸钾,混合均匀后,加入40重量份无菌水,搅拌混合,紫外线灭菌,得到发酵底物;
[0240] S4.菌种的活化:将发酵乳杆菌LF021、长双歧杆菌BL5b和罗伊氏乳杆菌LR06分别接种至灭菌的高氏培养基中,37℃,40%湿度下,60r/min转速下,活化培养21h,得到菌种种9
子液,含菌量为10cfu/mL;
[0241] S5.发酵:将步骤S4中发酵乳杆菌LF021、长双歧杆菌BL5b和罗伊氏乳杆菌LR06的菌种种子液接种至步骤S3中的发酵底物中,所述发酵乳杆菌LF021、长双歧杆菌BL5b和罗伊氏乳杆菌LR06的接种量分别为4%、2%、0.7%,38℃,40%湿度下,60r/min转速下,发酵培养56h,得到发酵产物;
[0242] S6.多糖肽混合物的制备:将4重量份魔芋葡甘聚糖、1.5重量份山药多糖、3重量份玉米低聚肽混合均匀,得到多糖肽混合物;
[0243] S7.氨基酸添加剂的制备:将10重量份牛磺酸、2重量份丙氨酸、3重量份亮氨酸混合均匀,得到氨基酸添加剂;
[0244] S8.复合酶的制备:将12重量份乙醛脱氢酶、4重量份乙醇氧化酶混合均匀,得到复合酶;
[0245] S9.内层缓释颗粒的制备:将17重量份步骤S5制得的发酵产物、1.5重量份步骤S8制得的复合酶、0.7重量份瑞士乳杆菌、2.5重量份海氏肠球菌、2重量份卡波姆混合均匀,加入50重量份水中,搅拌混合均匀,加入75重量份含有13.5wt%的羧化壳聚糖水溶液,孔径为400nm的第一SPG快速膜乳化,形成乳液,加入10重量份含有4wt%的铝离子溶液,常温固化
25min,3000r/min离心15min,洗涤固体,得到内层缓释颗粒;
[0246] S10.含乙醛脱氢酶的乳酸菌冻干粉的制备:将4重量份步骤S1制得的水提取物、3重量份步骤S2制得的有机溶剂提取物、0.7重量份步骤S6制得的多糖肽混合物、0.35重量份步骤S7制得的氨基酸添加剂、5重量份步骤S9制得的内层缓释颗粒混合均匀,加入100重量份含有10wt%的海藻酸钠水溶液中,孔径为12μm第二SPG快速膜乳化,形成乳液,加入10重量份含有4wt%的钙离子溶液,常温固化12min,3000r/min离心15min,洗涤固体,冷冻干燥,得到含乙醛脱氢酶的乳酸菌冻干粉。
[0247] 对比例12
[0248] 与实施例3相比,未进行步骤S6,其他条件均不改变。
[0249] 具体包括以下步骤:
[0250] S1.中药组合物的水提取:将7重量份葛根、2重量份甘草、4重量份猴头菇、1.5重量份蒲公英分别洗净、干燥、粉碎后得到中药组合物粉,加入水中,所述中药组合物粉和水的固液比为1:7g/mL,加热煮沸提取2h,提取3次,过滤,合并滤液,固体留用,滤液浓缩,70℃干燥3h,得到水提取物;
[0251] S2.中药组合物的有机溶剂提取:将步骤S1得到的固体加入混合有机溶剂中,所述固体和混合有机溶剂的固液比为1:4g/mL,加热至60℃提取1h,提取3次,过滤,合并滤液,固体留用,滤液减压去除有机溶剂,70℃干燥2h,得到有机溶剂提取物;
[0252] 所述混合有机溶剂为乙醇、乙酸乙酯、石油醚按照质量比为6:3:2的混合溶剂;
[0253] S3.发酵底物的制备:将10重量份柠檬、7重量份西红柿混合榨汁,弃除固体,汁液与4重量份步骤S2得到的固体混合均匀,加入4重量份葡萄糖、2重量份蔗糖、1重量份果糖、2重量份尿素、1重量份氯化铵、1重量份硝酸钾,混合均匀后,加入40重量份无菌水,搅拌混合,紫外线灭菌,得到发酵底物;
[0254] S4.菌种的活化:将发酵乳杆菌LF021、长双歧杆菌BL5b和罗伊氏乳杆菌LR06分别接种至灭菌的高氏培养基中,37℃,40%湿度下,60r/min转速下,活化培养21h,得到菌种种9
子液,含菌量为10cfu/mL;
[0255] S5.发酵:将步骤S4中发酵乳杆菌LF021、长双歧杆菌BL5b和罗伊氏乳杆菌LR06的菌种种子液接种至步骤S3中的发酵底物中,所述发酵乳杆菌LF021、长双歧杆菌BL5b和罗伊氏乳杆菌LR06的接种量分别为4%、2%、0.7%,38℃,40%湿度下,60r/min转速下,发酵培养56h,得到发酵产物;
[0256] S6.氨基酸添加剂的制备:将10重量份牛磺酸、2重量份丙氨酸、3重量份亮氨酸混合均匀,得到氨基酸添加剂;
[0257] S7.复合酶的制备:将12重量份乙醛脱氢酶、4重量份乙醇氧化酶混合均匀,得到复合酶;
[0258] S8.内层缓释颗粒的制备:将17重量份步骤S5制得的发酵产物、1.5重量份步骤S7制得的复合酶、0.7重量份瑞士乳杆菌、2.5重量份海氏肠球菌、2重量份卡波姆混合均匀,加入50重量份水中,搅拌混合均匀,加入75重量份含有13.5wt%的羧化壳聚糖水溶液,孔径为400nm的第一SPG快速膜乳化,形成乳液,加入10重量份含有4wt%的铝离子溶液,常温固化
25min,3000r/min离心15min,洗涤固体,得到内层缓释颗粒;
[0259] S9.含乙醛脱氢酶的乳酸菌冻干粉的制备:将4重量份步骤S1制得的水提取物、3重量份步骤S2制得的有机溶剂提取物、0.35重量份步骤S6制得的氨基酸添加剂、5重量份步骤S8制得的内层缓释颗粒混合均匀,加入100重量份含有10wt%的海藻酸钠水溶液中,孔径为12μm第二SPG快速膜乳化,形成乳液,加入10重量份含有4wt%的钙离子溶液,常温固化
12min,3000r/min离心15min,洗涤固体,冷冻干燥,得到含乙醛脱氢酶的乳酸菌冻干粉。
[0260] 对比例13
[0261] 与实施例3相比,步骤S7中未添加牛磺酸,其他条件均不改变。
[0262] 具体包括以下步骤:
[0263] S1.中药组合物的水提取:将7重量份葛根、2重量份甘草、4重量份猴头菇、1.5重量份蒲公英分别洗净、干燥、粉碎后得到中药组合物粉,加入水中,所述中药组合物粉和水的固液比为1:7g/mL,加热煮沸提取2h,提取3次,过滤,合并滤液,固体留用,滤液浓缩,70℃干燥3h,得到水提取物;
[0264] S2.中药组合物的有机溶剂提取:将步骤S1得到的固体加入混合有机溶剂中,所述固体和混合有机溶剂的固液比为1:4g/mL,加热至60℃提取1h,提取3次,过滤,合并滤液,固体留用,滤液减压去除有机溶剂,70℃干燥2h,得到有机溶剂提取物;
[0265] 所述混合有机溶剂为乙醇、乙酸乙酯、石油醚按照质量比为6:3:2的混合溶剂;
[0266] S3.发酵底物的制备:将10重量份柠檬、7重量份西红柿混合榨汁,弃除固体,汁液与4重量份步骤S2得到的固体混合均匀,加入4重量份葡萄糖、2重量份蔗糖、1重量份果糖、2重量份尿素、1重量份氯化铵、1重量份硝酸钾,混合均匀后,加入40重量份无菌水,搅拌混合,紫外线灭菌,得到发酵底物;
[0267] S4.菌种的活化:将发酵乳杆菌LF021、长双歧杆菌BL5b和罗伊氏乳杆菌LR06分别接种至灭菌的高氏培养基中,37℃,40%湿度下,60r/min转速下,活化培养21h,得到菌种种9
子液,含菌量为10cfu/mL;
[0268] S5.发酵:将步骤S4中发酵乳杆菌LF021、长双歧杆菌BL5b和罗伊氏乳杆菌LR06的菌种种子液接种至步骤S3中的发酵底物中,所述发酵乳杆菌LF021、长双歧杆菌BL5b和罗伊氏乳杆菌LR06的接种量分别为4%、2%、0.7%,38℃,40%湿度下,60r/min转速下,发酵培养56h,得到发酵产物;
[0269] S6.多糖肽复合物的制备:将4重量份魔芋葡甘聚糖、1.5重量份山药多糖、3重量份玉米低聚肽混合均匀,135W超声波下,通入臭氧处理,臭氧浓度为50mg/L,气体流量为20L/h,处理时间为6s,得到多糖肽复合物;
[0270] S7.氨基酸添加剂的制备:将2重量份丙氨酸、3重量份亮氨酸混合均匀,得到氨基酸添加剂;
[0271] S8.复合酶的制备:将12重量份乙醛脱氢酶、4重量份乙醇氧化酶混合均匀,得到复合酶;
[0272] S9.内层缓释颗粒的制备:将17重量份步骤S5制得的发酵产物、1.5重量份步骤S8制得的复合酶、0.7重量份瑞士乳杆菌、2.5重量份海氏肠球菌、2重量份卡波姆混合均匀,加入50重量份水中,搅拌混合均匀,加入75重量份含有13.5wt%的羧化壳聚糖水溶液,孔径为400nm的第一SPG快速膜乳化,形成乳液,加入10重量份含有4wt%的铝离子溶液,常温固化
25min,3000r/min离心15min,洗涤固体,得到内层缓释颗粒;
[0273] S10.含乙醛脱氢酶的乳酸菌冻干粉的制备:将4重量份步骤S1制得的水提取物、3重量份步骤S2制得的有机溶剂提取物、0.7重量份步骤S6制得的多糖肽复合物、0.35重量份步骤S7制得的氨基酸添加剂、5重量份步骤S9制得的内层缓释颗粒混合均匀,加入100重量份含有10wt%的海藻酸钠水溶液中,孔径为12μm第二SPG快速膜乳化,形成乳液,加入10重量份含有4wt%的钙离子溶液,常温固化12min,3000r/min离心15min,洗涤固体,冷冻干燥,得到含乙醛脱氢酶的乳酸菌冻干粉。
[0274] 对比例14
[0275] 与实施例3相比,未进行步骤S7,其他条件均不改变。
[0276] 具体包括以下步骤:
[0277] S1.中药组合物的水提取:将7重量份葛根、2重量份甘草、4重量份猴头菇、1.5重量份蒲公英分别洗净、干燥、粉碎后得到中药组合物粉,加入水中,所述中药组合物粉和水的固液比为1:7g/mL,加热煮沸提取2h,提取3次,过滤,合并滤液,固体留用,滤液浓缩,70℃干燥3h,得到水提取物;
[0278] S2.中药组合物的有机溶剂提取:将步骤S1得到的固体加入混合有机溶剂中,所述固体和混合有机溶剂的固液比为1:4g/mL,加热至60℃提取1h,提取3次,过滤,合并滤液,固体留用,滤液减压去除有机溶剂,70℃干燥2h,得到有机溶剂提取物;
[0279] 所述混合有机溶剂为乙醇、乙酸乙酯、石油醚按照质量比为6:3:2的混合溶剂;
[0280] S3.发酵底物的制备:将10重量份柠檬、7重量份西红柿混合榨汁,弃除固体,汁液与4重量份步骤S2得到的固体混合均匀,加入4重量份葡萄糖、2重量份蔗糖、1重量份果糖、2重量份尿素、1重量份氯化铵、1重量份硝酸钾,混合均匀后,加入40重量份无菌水,搅拌混合,紫外线灭菌,得到发酵底物;
[0281] S4.菌种的活化:将发酵乳杆菌LF021、长双歧杆菌BL5b和罗伊氏乳杆菌LR06分别接种至灭菌的高氏培养基中,37℃,40%湿度下,60r/min转速下,活化培养21h,得到菌种种9
子液,含菌量为10cfu/mL;
[0282] S5.发酵:将步骤S4中发酵乳杆菌LF021、长双歧杆菌BL5b和罗伊氏乳杆菌LR06的菌种种子液接种至步骤S3中的发酵底物中,所述发酵乳杆菌LF021、长双歧杆菌BL5b和罗伊氏乳杆菌LR06的接种量分别为4%、2%、0.7%,38℃,40%湿度下,60r/min转速下,发酵培养56h,得到发酵产物;
[0283] S6.多糖肽复合物的制备:将4重量份魔芋葡甘聚糖、1.5重量份山药多糖、3重量份玉米低聚肽混合均匀,135W超声波下,通入臭氧处理,臭氧浓度为50mg/L,气体流量为20L/h,处理时间为6s,得到多糖肽复合物;
[0284] S7.复合酶的制备:将12重量份乙醛脱氢酶、4重量份乙醇氧化酶混合均匀,得到复合酶;
[0285] S8.内层缓释颗粒的制备:将17重量份步骤S5制得的发酵产物、1.5重量份步骤S7制得的复合酶、0.7重量份瑞士乳杆菌、2.5重量份海氏肠球菌、2重量份卡波姆混合均匀,加入50重量份水中,搅拌混合均匀,加入75重量份含有13.5wt%的羧化壳聚糖水溶液,孔径为400nm的第一SPG快速膜乳化,形成乳液,加入10重量份含有4wt%的铝离子溶液,常温固化
25min,3000r/min离心15min,洗涤固体,得到内层缓释颗粒;
[0286] S9.含乙醛脱氢酶的乳酸菌冻干粉的制备:将4重量份步骤S1制得的水提取物、3重量份步骤S2制得的有机溶剂提取物、0.7重量份步骤S6制得的多糖肽复合物、5重量份步骤S9制得的内层缓释颗粒混合均匀,加入100重量份含有10wt%的海藻酸钠水溶液中,孔径为12μm第二SPG快速膜乳化,形成乳液,加入10重量份含有4wt%的钙离子溶液,常温固化
12min,3000r/min离心15min,洗涤固体,冷冻干燥,得到含乙醛脱氢酶的乳酸菌冻干粉。
[0287] 对比例15
[0288] 与实施例3相比,未进行步骤S9内层缓释颗粒的制备,将各组分简单混合,其他条件均不改变。
[0289] 具体包括以下步骤:
[0290] S1.中药组合物的水提取:将7重量份葛根、2重量份甘草、4重量份猴头菇、1.5重量份蒲公英分别洗净、干燥、粉碎后得到中药组合物粉,加入水中,所述中药组合物粉和水的固液比为1:7g/mL,加热煮沸提取2h,提取3次,过滤,合并滤液,固体留用,滤液浓缩,70℃干燥3h,得到水提取物;
[0291] S2.中药组合物的有机溶剂提取:将步骤S1得到的固体加入混合有机溶剂中,所述固体和混合有机溶剂的固液比为1:4g/mL,加热至60℃提取1h,提取3次,过滤,合并滤液,固体留用,滤液减压去除有机溶剂,70℃干燥2h,得到有机溶剂提取物;
[0292] 所述混合有机溶剂为乙醇、乙酸乙酯、石油醚按照质量比为6:3:2的混合溶剂;
[0293] S3.发酵底物的制备:将10重量份柠檬、7重量份西红柿混合榨汁,弃除固体,汁液与4重量份步骤S2得到的固体混合均匀,加入4重量份葡萄糖、2重量份蔗糖、1重量份果糖、2重量份尿素、1重量份氯化铵、1重量份硝酸钾,混合均匀后,加入40重量份无菌水,搅拌混合,紫外线灭菌,得到发酵底物;
[0294] S4.菌种的活化:将发酵乳杆菌LF021、长双歧杆菌BL5b和罗伊氏乳杆菌LR06分别接种至灭菌的高氏培养基中,37℃,40%湿度下,60r/min转速下,活化培养21h,得到菌种种9
子液,含菌量为10cfu/mL;
[0295] S5.发酵:将步骤S4中发酵乳杆菌LF021、长双歧杆菌BL5b和罗伊氏乳杆菌LR06的菌种种子液接种至步骤S3中的发酵底物中,所述发酵乳杆菌LF021、长双歧杆菌BL5b和罗伊氏乳杆菌LR06的接种量分别为4%、2%、0.7%,38℃,40%湿度下,60r/min转速下,发酵培养56h,得到发酵产物;
[0296] S6.多糖肽复合物的制备:将4重量份魔芋葡甘聚糖、1.5重量份山药多糖、3重量份玉米低聚肽混合均匀,135W超声波下,通入臭氧处理,臭氧浓度为50mg/L,气体流量为20L/h,处理时间为6s,得到多糖肽复合物;
[0297] S7.氨基酸添加剂的制备:将10重量份牛磺酸、2重量份丙氨酸、3重量份亮氨酸混合均匀,得到氨基酸添加剂;
[0298] S8.复合酶的制备:将12重量份乙醛脱氢酶、4重量份乙醇氧化酶混合均匀,得到复合酶;
[0299] S9.混合物的制备:将17重量份步骤S5制得的发酵产物、1.5重量份步骤S8制得的复合酶、0.7重量份瑞士乳杆菌、2.5重量份海氏肠球菌混合均匀,得到混合物;
[0300] S10.含乙醛脱氢酶的乳酸菌冻干粉的制备:将4重量份步骤S1制得的水提取物、3重量份步骤S2制得的有机溶剂提取物、0.7重量份步骤S6制得的多糖肽复合物、0.35重量份步骤S7制得的氨基酸添加剂、5重量份步骤S9制得的混合物混合均匀,加入100重量份含有10wt%的海藻酸钠水溶液中,孔径为12μm第二SPG快速膜乳化,形成乳液,加入10重量份含有4wt%的钙离子溶液,常温固化12min,3000r/min离心15min,洗涤固体,冷冻干燥,得到含乙醛脱氢酶的乳酸菌冻干粉。
[0301] 对比例16
[0302] 与实施例3相比,未经过步骤S5发酵处理,其他条件均不改变。
[0303] 具体包括以下步骤:
[0304] S1.中药组合物的水提取:将7重量份葛根、2重量份甘草、4重量份猴头菇、1.5重量份蒲公英分别洗净、干燥、粉碎后得到中药组合物粉,加入水中,所述中药组合物粉和水的固液比为1:7g/mL,加热煮沸提取2h,提取3次,过滤,合并滤液,固体留用,滤液浓缩,70℃干燥3h,得到水提取物;
[0305] S2.中药组合物的有机溶剂提取:将步骤S1得到的固体加入混合有机溶剂中,所述固体和混合有机溶剂的固液比为1:4g/mL,加热至60℃提取1h,提取3次,过滤,合并滤液,固体留用,滤液减压去除有机溶剂,70℃干燥2h,得到有机溶剂提取物;
[0306] 所述混合有机溶剂为乙醇、乙酸乙酯、石油醚按照质量比为6:3:2的混合溶剂;
[0307] S3.发酵底物的制备:将10重量份柠檬、7重量份西红柿混合榨汁,弃除固体,汁液与4重量份步骤S2得到的固体混合均匀,加入4重量份葡萄糖、2重量份蔗糖、1重量份果糖、2重量份尿素、1重量份氯化铵、1重量份硝酸钾,混合均匀后,加入40重量份无菌水,搅拌混合,紫外线灭菌,得到发酵底物;
[0308] S4.多糖肽复合物的制备:将4重量份魔芋葡甘聚糖、1.5重量份山药多糖、3重量份玉米低聚肽混合均匀,135W超声波下,通入臭氧处理,臭氧浓度为50mg/L,气体流量为20L/h,处理时间为6s,得到多糖肽复合物;
[0309] S5.氨基酸添加剂的制备:将10重量份牛磺酸、2重量份丙氨酸、3重量份亮氨酸混合均匀,得到氨基酸添加剂;
[0310] S6.复合酶的制备:将12重量份乙醛脱氢酶、4重量份乙醇氧化酶混合均匀,得到复合酶;
[0311] S7.内层缓释颗粒的制备:将1.5重量份步骤S6制得的复合酶、0.7重量份瑞士乳杆菌、2.5重量份海氏肠球菌、2重量份卡波姆混合均匀,加入50重量份水中,搅拌混合均匀,加入75重量份含有13.5wt%的羧化壳聚糖水溶液,孔径为400nm的第一SPG快速膜乳化,形成乳液,加入10重量份含有4wt%的铝离子溶液,常温固化25min,3000r/min离心15min,洗涤固体,得到内层缓释颗粒;
[0312] S8.含乙醛脱氢酶的乳酸菌冻干粉的制备:将4重量份步骤S1制得的水提取物、3重量份步骤S2制得的有机溶剂提取物、0.7重量份步骤S4制得的多糖肽复合物、0.35重量份步骤S5制得的氨基酸添加剂、5重量份步骤S7制得的内层缓释颗粒混合均匀,加入100重量份含有10wt%的海藻酸钠水溶液中,孔径为12μm第二SPG快速膜乳化,形成乳液,加入10重量份含有4wt%的钙离子溶液,常温固化12min,3000r/min离心15min,洗涤固体,冷冻干燥,得到含乙醛脱氢酶的乳酸菌冻干粉。
[0313] 对比例17
[0314] 与实施例3相比,步骤S9中未添加海氏肠球菌,其他条件均不改变。
[0315] 具体包括以下步骤:
[0316] S1.中药组合物的水提取:将7重量份葛根、2重量份甘草、4重量份猴头菇、1.5重量份蒲公英分别洗净、干燥、粉碎后得到中药组合物粉,加入水中,所述中药组合物粉和水的固液比为1:7g/mL,加热煮沸提取2h,提取3次,过滤,合并滤液,固体留用,滤液浓缩,70℃干燥3h,得到水提取物;
[0317] S2.中药组合物的有机溶剂提取:将步骤S1得到的固体加入混合有机溶剂中,所述固体和混合有机溶剂的固液比为1:4g/mL,加热至60℃提取1h,提取3次,过滤,合并滤液,固体留用,滤液减压去除有机溶剂,70℃干燥2h,得到有机溶剂提取物;
[0318] 所述混合有机溶剂为乙醇、乙酸乙酯、石油醚按照质量比为6:3:2的混合溶剂;
[0319] S3.发酵底物的制备:将10重量份柠檬、7重量份西红柿混合榨汁,弃除固体,汁液与4重量份步骤S2得到的固体混合均匀,加入4重量份葡萄糖、2重量份蔗糖、1重量份果糖、2重量份尿素、1重量份氯化铵、1重量份硝酸钾,混合均匀后,加入40重量份无菌水,搅拌混合,紫外线灭菌,得到发酵底物;
[0320] S4.菌种的活化:将发酵乳杆菌LF021、长双歧杆菌BL5b和罗伊氏乳杆菌LR06分别接种至灭菌的高氏培养基中,37℃,40%湿度下,60r/min转速下,活化培养21h,得到菌种种9
子液,含菌量为10cfu/mL;
[0321] S5.发酵:将步骤S4中发酵乳杆菌LF021、长双歧杆菌BL5b和罗伊氏乳杆菌LR06的菌种种子液接种至步骤S3中的发酵底物中,所述发酵乳杆菌LF021、长双歧杆菌BL5b和罗伊氏乳杆菌LR06的接种量分别为4%、2%、0.7%,38℃,40%湿度下,60r/min转速下,发酵培养56h,得到发酵产物;
[0322] S6.多糖肽复合物的制备:将4重量份魔芋葡甘聚糖、1.5重量份山药多糖、3重量份玉米低聚肽混合均匀,135W超声波下,通入臭氧处理,臭氧浓度为50mg/L,气体流量为20L/h,处理时间为6s,得到多糖肽复合物;
[0323] S7.氨基酸添加剂的制备:将10重量份牛磺酸、2重量份丙氨酸、3重量份亮氨酸混合均匀,得到氨基酸添加剂;
[0324] S8.复合酶的制备:将12重量份乙醛脱氢酶、4重量份乙醇氧化酶混合均匀,得到复合酶;
[0325] S9.内层缓释颗粒的制备:将17重量份步骤S5制得的发酵产物、1.5重量份步骤S8制得的复合酶、3.2重量份瑞士乳杆菌、2重量份卡波姆混合均匀,加入50重量份水中,搅拌混合均匀,加入75重量份含有13.5wt%的羧化壳聚糖水溶液,孔径为400nm的第一SPG快速膜乳化,形成乳液,加入10重量份含有4wt%的铝离子溶液,常温固化25min,3000r/min离心15min,洗涤固体,得到内层缓释颗粒;
[0326] S10.含乙醛脱氢酶的乳酸菌冻干粉的制备:将4重量份步骤S1制得的水提取物、3重量份步骤S2制得的有机溶剂提取物、0.7重量份步骤S6制得的多糖肽复合物、0.35重量份步骤S7制得的氨基酸添加剂、5重量份步骤S9制得的内层缓释颗粒混合均匀,加入100重量份含有10wt%的海藻酸钠水溶液中,孔径为12μm第二SPG快速膜乳化,形成乳液,加入10重量份含有4wt%的钙离子溶液,常温固化12min,3000r/min离心15min,洗涤固体,冷冻干燥,得到含乙醛脱氢酶的乳酸菌冻干粉。
[0327] 测试例1
[0328] 将1g本发明实施例1‑3和对比例15制得的含乙醛脱氢酶的乳酸菌冻干粉分别加入到10mL人工模拟胃液和10mL人工模拟肠液中,在37℃、70r/min条件下分别反应2h和3h,另外,取等量的含乙醛脱氢酶的乳酸菌冻干粉先加入到10mL人工模拟胃液中,在37℃、70r/min条件下反应2h后,离心,再加入10mL人工模拟肠液中,在37℃、70r/min条件下继续反应3h。反应结束后进行益生菌群细胞计数。按照以下公式计算存活率:
[0329] 存活率(%)=Nt/N0×100%
[0330] 式中,Nt为孵育一定时间后存活的益生菌浓度(cfu/g),N0为益生菌原始浓度(cfu/g)。
[0331] 结果见表1。
[0332] 表1
[0333]
[0334] 由上表可知,本发明实施例1‑3制得的含乙醛脱氢酶的乳酸菌冻干粉中,益生菌经过羧化壳聚糖包埋在内层缓释颗粒内,在人工模拟胃液中,虽然外层海藻酸钠壳层崩塌,内层缓释颗粒能保持较好的完整性,转移至人工模拟肠液中后,海藻酸钠壳层和内层缓释颗粒结构均发生崩塌,益生菌暴露,说明该双层结构具有pH响应性和抵抗模拟胃液的特性,具有较好的靶向输送益生菌的效果。对比例15中没有制备内层缓释颗粒,由此可见,其在人工模拟胃液和先人工模拟胃液,后人工模拟肠液中的存活率大大下降,可见,单一的海藻酸钠壳层没有pH响应性。
[0335] 测试例2
[0336] 将实施例1‑3和对比例15制得的含乙醛脱氢酶的乳酸菌冻干粉分别置于pH为5.5、6、6.5、7、7.5的环境中,室温贮藏6个月后,判断其稳定性
[0337] 另将实施例1‑3和对比例15制得的含乙醛脱氢酶的乳酸菌冻干粉分别置于7℃、17℃、27℃、37℃、47℃温度下,贮藏6个月后,判断其稳定性。
[0338] 稳定性判断方法为:取样品5g,置于离心管中,以2500r/min转速离心30min后,观察是否水分析出及分层现象。
[0339] 结果见表2和表3。
[0340] 表2
[0341]
[0342] 表3
[0343]
[0344] 由上表可知,本发明实施例1‑3制得的含乙醛脱氢酶的乳酸菌冻干粉在pH为5.5‑7.5以及温度为7‑47℃范围内,6个月贮藏下仍具有很好的稳定性。对比例15仅为单层包埋,有一定的稳定性,但不适合极端pH值以及较高温度贮藏。
[0345] 测试例3
[0346] 选择SD雄性大鼠208只,随机分为正常组、模型组、阳性组、实施例1‑6组、对比例1‑17组,每组8只,自由饮水、饮食,适应性喂养1周后,每日给阳性组灌胃100mg/kg的海王金樽,实施例1‑6、对比例1‑17组分别灌胃100mg/kg相应实施例或对比例制得的含乙醛脱氢酶的乳酸菌冻干粉,正常组和模型组大鼠灌胃等量的生理盐水,连续给药30d。于末次给药
30min后,除正常组给予生理盐水外,其他组均灌胃白酒(酒精度数为56°),白酒灌胃剂量
15mL/kg。
[0347] 分别于灌酒后60、120min剪尾取血,止血后放回笼中,血液处理得到血清,使用试剂盒测定血液中的乙醇质量浓度。然后于灌酒后12h摘眼球取血,收集的血液处理得到血清,使用相应试剂盒检测血清中ALT、AST和TG水平。摘除眼球采血完成后,颈椎脱臼处死大鼠,快速取出肝脏,用预冷生理盐水漂洗并用滤纸吸干。剪取少量肝组织,加入生理盐水匀浆,4℃离心得到上清液。按照试剂盒说明书的方法测定肝脏组织中ADH、ALDH、SOD、MDA、GSH含量。
[0348] 大鼠血液灌酒后乙醇浓度的结果见表4。
[0349] 表4
[0350]
[0351] 注释:#为与正常组相比差异显著(P<0.05);*为与模型组相比差异显著(P<0.05)。下同。
[0352] 由上表可知,本发明实施例1‑3制得的含乙醛脱氢酶的乳酸菌冻干粉能显著降低血液中的乙醇质量浓度,具有一定的解酒作用。
[0353] 大鼠肝脏ADH和ALDH活力的结果见表5。
[0354] 表5
[0355]
[0356] 由上表可知,本发明实施例1‑3制得的含乙醛脱氢酶的乳酸菌冻干粉能显著提高血液中的ADH和ALDH活力,通过增强ADH和ALDH活力加快乙醇代谢,从而降低血液中的乙醇水平。
[0357] 大鼠肝损伤的结果见表6。
[0358]
[0359] 由上表可知,本发明实施例1‑3制得的含乙醛脱氢酶的乳酸菌冻干粉能显著降低大鼠血清中ALT、AST和TG水平,对肝脏具有一定的保护作用。
[0360] 大鼠氧化应激的结果见表7。
[0361] 表7
[0362]组别 SOD活力(U/mg) MDA含量(mmol/mg) GSH含量(μg/mg)
正常组 435.2±53.2 2.10±0.45 30.24±2.13
# # #
模型组 262.1±15.4 12.34±1.53 16.78±1.57
* * *
阳性组 410.7±35.7 3.97±1.24 24.57±1.85
* * *
实施例1 415.7±42.1 3.78±1.12 26.31±1.45
* * *
实施例2 417.5±39.5 3.80±1.31 26.78±1.10
* * *
实施例3 419.2±40.2 3.71±1.04 27.57±1.05
实施例4 395.2±45.2 4.52±1.32 22.34±1.04
实施例5 400.1±52.1 5.03±1.19 21.15±1.15
实施例6 356.2±49.5 6.21±1.06 20.12±1.19
对比例1 302.4±45.7 4.14±1.52 18.74±1.11
对比例2 335.6±47.2 7.10±1.32 19.45±1.05
对比例3 342.1±44.5 6.21±1.36 19.73±1.09
对比例4 338.4±43.6 5.79±1.44 19.61±1.32
对比例5 337.3±39.6 7.24±1.12 19.56±1.29
对比例6 342.5±52.4 6.75±1.09 19.78±1.35
对比例7 351.7±51.6 5.47±1.56 20.04±1.21
对比例8 289.7±51.1 8.10±1.39 17.68±1.24
对比例9 362.1±54.2 6.78±1.22 19.12±1.39
对比例10 354.2±49.6 7.14±1.35 19.37±1.33
对比例11 395.2±44.4 5.73±1.52 20.78±1.41
对比例12 375.4±46.2 7.32±1.72 18.64±1.22
对比例13 395.2±49.6 4.22±1.46 24.56±1.45
对比例14 392.1±42.6 4.56±1.21 24.12±1.02
对比例15 314.5±48.2 7.98±1.15 17.95±1.11
对比例16 345.1±54.2 7.42±1.53 18.97±1.42
对比例17 359.4±43.9 7.10±1.28 19.24±1.39
[0363] 由上表可知,本发明实施例1‑3制得的含乙醛脱氢酶的乳酸菌冻干粉能显著降低大鼠血清中MDA含量,提高SOD、GSH水平,对氧化应激具有一定的改善作用。
[0364] 实施例4、5、6与实施例3相比,步骤S2中混合有机溶剂由单一的乙醇、乙酸乙酯或石油醚替代,实施例4中酒后乙醇含量明显提高,实施例5中血清AST、ALT活力提高,实施例6中肝脏SOD和GSH活力下降,MDA含量提高,对比例2与实施例3相比,未经过步骤S2有机溶剂提取,其酒后乙醇含量明显提高、血清AST、ALT活力提高、肝脏SOD和GSH活力下降,MDA含量提高,且ADH和ALDH的活性下降。本发明中,乙醇提取物能明显缩短醒酒时间,降低血液乙醇浓度;乙酸乙酯提取物能降低血清中的AST、ALT活力;石油醚提取物能显著提高肝脏中SOD和GSH的活力,降低MDA的含量及肝脏指数,其中,混合有机溶剂包括乙醇、乙酸乙酯和石油醚,三种有机溶剂的混合提取得到的提取物还能够同时增强ADH和ALDH的活性。
[0365] 对比例1与实施例3相比,未经过步骤S1水提取,血清AST、ALT活力提高,TG含量提高,ADH活性下降,GSH活力下降。本发明中,水提取物可以改善饮酒引起的体重、肝指数的变化和肝功能指标AST、ALT和ALP异常;对酒精诱导提高的血脂指标TC和TG起到了下调作用;同时有效提高了抗氧化指标GSH、GST水平和显著增强了肝脏中ADH活性。
[0366] 对比例3、4与实施例3相比,步骤S1中不包括葛根或猴头菇,其他条件均不改变,GSH、SOD水平下降,ADH、ALDH活性下降,且灌酒后大鼠血液中乙醇含量明显增加。本发明中,葛根和猴头菇能明显提高抗氧化指标GSH、SOD水平和显著增强了肝脏中ADH、ALDH活性,缩短醒酒时间,两者具有协同增效的作用。
[0367] 对比例5、6与实施例3相比,步骤S3中未添加柠檬或西红柿,ADH、ALDH活性下降,GSH、SOD水平下降,MDA含量升高,对比例5中,ALT、AST、肝脏TG水平升高。对比例7与实施例3相比,步骤S3中未添加步骤S2得到的固体,GSH、SOD水平下降,且灌酒后大鼠血液中乙醇含量明显增加。对比例8与实施例3相比,未进行步骤S1、S2,步骤S3中未添加步骤S2得到的固体,其酒后乙醇含量明显提高,血清AST、ALT活力提高,肝脏TG水平升高,肝脏SOD和GSH活力下降,MDA含量提高,且ADH和ALDH的活性下降。本发明中,柠檬、西红柿能同时增强ADH和ALDH的活性,与中药组合物的固体残渣混合后,加入碳源、氮源作用发酵底物,在酵母菌、乳酸菌的作用下,产生大量的抗氧化活性物质,增加肝脏中SOD的水平,对酒精引起的SOD衰竭起到保护作用,柠檬发酵产物还能显著抑制酒精引起的ALT、AST、肝脏TG和脂质过氧化水平的升高,同时也可改善酒精性肝损伤的组织病理学改变。
[0368] 对比例9、10与实施例3相比,步骤S5中未接种发酵乳杆菌LF021或长双歧杆菌BL5b和罗伊氏乳杆菌LR06,其ALT、AST和TG水平提高,提高大鼠血清中MDA含量,降低SOD、GSH水平。对比例16与实施例3相比,未经过步骤S5发酵处理,其ALT、AST和TG水平提高,提高大鼠血清中MDA含量,降低SOD、GSH水平,ADH和ALDH活力下降。对比例17与实施例3相比,未添加海氏肠球菌,其ALT、AST和TG水平提高,提高大鼠血清中MDA含量,降低SOD、GSH水平,ADH和ALDH活力下降。本发明将罗伊氏乳杆菌LR06、长双歧杆菌BL5b混合发酵培养,具有协同增效的作用,长双歧杆菌BL5b大量增殖,产生大量的乳酸及氨基酸,促进嗜酸链球菌的生长,相辅相成,互相促进,从而促进发酵菌的发酵,产生了大量的抗氧化物质、降血脂物质,从而有效的改善酒精引起的肝脏氧化损伤,并通过调节血脂,降低血清和肝脏脂质含量。酵母中所含的锌、B族维生素、还原性谷胱甘肽等生物活性成分,一方面可作为机体反应酶的合成原料,另一方面可有效清除体内氧离子及其自由基,保护肝细胞。海氏肠球菌能起到明显的解酒醒酒的效果,同时通过改变肠道微生物的组成,调节肠道菌群,提高肠道免疫力,减少氧化应激,缓解化学性肝损伤,从而达到解酒醒酒、改善宿醉、降低酒后不良反应、保护肝脏的效果。
[0369] 对比例11与实施例3相比,步骤S6中未进行超声波处理和臭氧协同处理,其酒后乙醇含量明显提高,提高大鼠血清中MDA含量,降低SOD、GSH水平。在低功率超声波和臭氧处理过程中,可以通过超声波作用导致蛋白质的结构发生变化,促进玉米低聚肽物质与臭氧结合反应,从而起到促进臭氧改性的作用;经过臭氧短时间氧化处理后的玉米低聚肽的二硫键含量升高,从而得到了二聚肽,初步提高了低聚肽的分子量;由于时间短,玉米低聚肽上的其他还原性氨基酸还未来得及发生氧化反应,因此,对蛋白肽的性质影响不大,同时,能提高氢键暴露,促进其与多糖的氢键结合,形成多糖肽的复合物,提高了其抗氧化活性,还能提高血液中的丙氨酸和亮氨酸含量,使NAD+稳定存在,起到很好的解酒醒酒的作用。
[0370] 对比例12与实施例3相比,未进行步骤S6,其酒后乙醇含量明显提高,ALT、AST和TG水平提高,提高大鼠血清中MDA含量,降低SOD、GSH水平,ADH和ALDH活力下降。魔芋葡甘聚糖、山药多糖、玉米低聚肽中,魔芋葡甘聚糖可通过对乙醇吸附作用降低进入血液乙醇含量,能提高血液中ADH、ALDH活力,升高SOD、GSH水平,降低MDA含量,降低血和脑中乙醛含量,山药多糖能够延长醉酒潜伏期,缩短醉酒维持时间,提高醉酒小鼠肝脏中ADH、ALDH活性,降低血清中乙醇和乙醛的浓度,降低肝组织中MDA含量,提高SOD和GSH含量,玉米低聚肽能增强ADH活性,清除自由基活性,降低酒精对肝脏的损伤,缩短协同小鼠的醉酒时间,降低血清中乙醇的含量。
[0371] 对比例13与实施例3相比,步骤S7中未添加牛磺酸,其ADH和ALDH活性下降,ALT、AST和TG水平提高。对比例14与实施例3相比,未进行步骤S7,其酒后乙醇含量明显提高。牛2+
磺酸通过调节肝细胞内Ca 平衡,提高肝脏中乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的活性,减少过氧化物酶的释放,可有效保护肝细胞;丙氨酸、亮氨酸的添加能提高两者在血液中的含量,使NAD+
稳定存在,起到很好的解酒醒酒的作用。
[0372] 对比例15与实施例3相比,未进行步骤S9内层缓释颗粒的制备,将各组分简单混合。通过将发酵产物、乙醛脱氢酶、乙醇氧化酶、瑞士乳杆菌、海氏肠球菌保护在羧化壳聚糖内,经过乳化后,在金属离子的作用下,羧化的壳聚糖交联形成颗粒的壁材,形成了缓释结构,送入人体后,益生菌、蛋白酶不易于在胃部被人体分解,从而能在进入肠道后被降解释放出来,使得大量的益生菌、蛋白酶等能直接作用于肠道,起到高效的调节肠道菌群,益生菌通过调节肠道微生物菌群,减少细菌易位,减少肝脏炎症,蛋白酶能直接进入血液,作用于乙醇的降解中,从而减少乙醇对肝脏的损伤,起到保护肝脏的作用。
[0373] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。