[0001] 本发明涉及微生物应用技术领域，具体涉及一种促进骨成长的约氏乳杆菌JYLO‑010及菌剂、应用。

[0002] 幼儿生长期间骨骼发育较快，如果存在缺钙，会影响骨骼的发育，一般通过食用含钙量高的食物或者喝含钙口服液进行补钙，然而这些钙只有小部分会被身体吸收，大部分会被排出体外，吸收率较低。目前促进儿童骨成长的方法包括以下几种：一、进行适当运动：通过弹跳、跳跃等运动可以刺激骨头发育，从而促进儿童骨生长。二、保持充足的睡眠：骨头主要在夜间时生长，且生长激素在夜间时分泌比较多，保持充足的睡眠、养成早睡早起的好习惯可以促进儿童骨生长。三、通过在儿童奶粉中添加蛋白质、维生素、矿物质等物质实现促进儿童骨成长的目的。目前市面上大多数的促进骨成长的保健品由多种营养物质复配而成，由于缺乏儿童对这些营养物质的吸收率和利用率较低，其促进骨骼成长发育的效果并不显著。

[0003] 随着人们对骨骼成长发育研究的日益加深，发现肠道益生菌对于骨骼成长发育具有一定的促进作用。益生菌在肠道内产生的短链脂肪酸可以降低肠道的环境pH值，减少肠道中的钙与磷形成化合物，从而促进钙的吸收；益生菌刺激肠道细胞产生的肠促胰素，肠促胰素包括一系列由肠道分泌，具有葡萄糖浓度依赖性促进胰岛素分泌作用的激素，包括葡萄糖依赖促胰肽（GIP）和胰高血糖素样肽1（GLP‑1），也可以促进钙吸收和骨形成。因此，开发肠道益生菌、研制益生菌类促成长产品逐渐成为研究热点。

[0004] 针对市面上促进儿童骨成长的产品效果不显著的问题，本发明提供一种促进骨成长的约氏乳杆菌JYLO‑010及菌剂、应用。约氏乳杆菌JYLO‑010能够显著提高体内维生素D含量、促进肠道对钙的吸收以及增加股骨骨密度的能力，能够通过提高体内维生素D含量、钙含量和骨密度水平来实现促进儿童骨骼发育的效果。

[0005] 第一方面，本发明提供一种促进骨成长的约氏乳杆菌JYLO‑010，约氏乳杆菌（Lactobacillus johnsonii）JYLO‑010于2022年3月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.24538，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

[0006] 第二方面，本发明提供一种约氏乳杆菌JYLO‑010菌剂，包括上述约氏乳杆菌JYLO‑010的菌体。

[0007] 进一步的，制备方法具体包括以下步骤：

[0008] （1）制备MRS液体培养基和MRS平板培养基；

[0009] （2）取保藏的约氏乳杆菌JYLO‑010在MRS平板培养基上活化，将活化后菌接种于MRS液体培养基中培养，获得菌液；

[0010] （3）将菌液离心后，收集菌体，使用无菌生理盐水洗涤后，重悬于质量浓度为15%的复原脱脂乳中，获得悬浊液；调整悬浊液浓度，获得菌悬液，将菌悬液冷冻干燥后，获得菌粉；

[0011] （4）将菌粉与低聚异麦芽糖混合，制成菌剂。

[0012] 进一步的，步骤（1）中，制备MRS液体培养基的方法为：将蛋白胨10g、牛肉粉5g、三水醋酸钠5g、七水磷酸氢二钾2g、吐温80 1mL、四水硫酸锰0.05g、柠檬酸三铵2g、葡萄糖20g、七水硫酸镁0.2g、蒸馏水1000mL混合后，用HCl调pH至6.8，搅拌混匀后，在121℃、
0.1MPa下灭菌20min，即可。

[0013] 进一步的，步骤（2）中，活化后菌接种于MRS液体培养基的接种量为1% 2%。~

[0014] 进一步的，步骤（2）中，培养温度为35 38℃，培养时间为24 36h。~ ~

[0015] 进一步的，步骤（3）中，调整悬浊液浓度为1.0×1010 2.0×1010cfu/mL。~

[0016] 第三方面，本发明提供一种上述约氏乳杆菌JYLO‑010在制备促进儿童骨成长的产品中的应用。

[0017] 本发明的有益效果在于：

[0018] 本发明提供的约氏乳杆菌JYLO‑010能够显著提高小鼠体内的25‑羟基维生素D含量，进而促进小鼠对钙的表观吸收率。检测结果表明，服用约氏乳杆菌JYLO‑010菌剂能够显著提高小鼠的股骨骨密度。进一步地，经试验验证，约氏乳杆菌JYLO‑010可以有效促进成骨细胞的增殖、分化和成熟并抑制破骨细胞形成。因此，约氏乳杆菌JYLO‑010对于制备促进儿童骨成长的产品方面具有重要意义。

[0019] 为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

[0020] 实施例1 菌种的分离鉴定

[0021] 1、菌株筛选及纯化

[0022] （1）菌株来源：2017年10月于云南曲靖农民自制泡菜采集样品，放入样品转运箱中带回实验室备用。

[0023] （2）制备样品：

[0024] ①取灭菌后的生理盐水（0.85%）至于无菌三角瓶中，然后将步骤（1）采集的样品1g加入其中，振荡，待用；

[0025] ②对步骤①的溶液稀释制成不同浓度梯度的样品，分别为10‑1、10‑2、10‑3、10‑4、10‑5 ‑6 ‑7、10 、10 ，标号分别为1#、2#、3#、4#、5#、6#、7#，待用。

[0026] （3）制备MRS平板培养基：

[0027] 蛋白胨10g、牛肉粉 5g、三水醋酸钠5g、七水磷酸氢二钾2g、吐温80 1mL、四水硫酸锰0.05g、柠檬酸三铵2g、葡萄糖20g、七水硫酸镁0.2g、琼脂15g、蒸馏水1000mL；将上述原料混合后，自然pH，搅拌菌液后，在121℃、0.1MPa下灭菌20min，将灭菌后的培养基倒入平皿中，放凉后待用。

[0028] （4）培养菌株：将1#、2#、3#、4#、5#、6#、7#号溶液分别使用涂布器涂布在MRS平板培养基中，于37℃、厌氧条件下培养48h；

[0029] （5）按照以下菌落特征挑选菌落：

[0030] 直径1 2mm，菌落圆润、边缘整齐、微白色中间有凸起，溶钙圈较大，并选择过氧化~氢酶阴性，革兰氏阳性的菌株。

[0031] （6）分离纯化

[0032] 根据步骤（5）的菌落和生化特征挑取5个单菌落，采用划线法接种至MRS平板培养基上纯化2 3次，于37℃、厌氧条件下培养48h，挑取单菌落，置于甘油管中‑80℃保藏。~

[0033] 2、鉴定

[0034] 将分离纯化后得到的单菌落送去鉴定，鉴定单位：生工生物工程（上海）股份有限公司，鉴定过程中，使用的引物如下：

[0035] 引物序列：

[0036] 27F：5'‑AGAGTTTGATCCTGGCTCAG‑3'

[0037] 1492R：5'‑GGTTACCTTGTTACGACTT‑3'

[0038] 鉴定过程中得到的菌株的基因序列为：

[0039] CACCGGCTTTGGGTGTTACAGACTCTCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCGTGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCGTGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAGTCCGAACTGAGAACGGCTTTAAGAGATCCGCTTGCCTTCGCAGGTTCGCTTCTCGTTGTACCGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCATTAGAGTGCCCAACTTAGTGATGGCAACTAATGACAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCACCACCTGTCTCAGCGTCCCCGAAGGGAACACCTAATCTCTTAGGTTTGCACTGGATGTCAAGACCTGGTAAGGCTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTGAGAGGCGGAAACCTCCCAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTACCCATGCTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTTGCAGACCAGAGAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCATATATCTACGCATTCCACCGCTACACATGGAGTTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTTCAACAGTTTCTGATGCAATTCTCCGGTTGAGCCGAAGGCTTTCACATCAGACTTATTGAACCGCCTGCACTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGACTTTCTAAGTAATTACCGTCAAATAAAGGCCAGTTACTACCTCTATCTTTCTTCACTACCAACAGAGCTTTACGAGCCGAAACCCTTCTTCACTCACGCGGCGTTGCTCCATCAGACTTTCGTCCATTGTGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTTTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGATCAGTCTCTCAACTCGGCTATGCATCATTGCCTTGGTAAGCCGTTACCTTACCAACTAGCTAATGCACCGCAGGTCCATCCAAGAGTGATAGCAGAACCATCTTTCAAACTCTAGACATGCGTCTAGTGTTGTTATCCGGTATTAGCATCTGTTTCCAGGTGTTATCCCAGTCTCTTGGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTCGCTTGTATCTAGTTTCATTTAGTGCAAGCACCAAAATCATCTAGGCAAGCTCGCTCGACTGCAGTA

[0040] 鉴定结果为：该菌株为约氏乳杆菌（Lactobacillus johnsonii），其分类单元为：Bacteria;Firmicutes;Bacilli;Lactobacillales;Lactobacillaceae;Lactobacillus。

[0041] 将鉴定后的菌株命名为约氏乳杆菌JYLO‑010，将该菌株送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏信息如下；

[0042] 分类命名：约氏乳杆菌Lactobacillus johnsonii，保藏日期：2022年3月17日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏编号：CGMCC No.24538。

[0043] 实施例2 制备约氏乳杆菌JYLO‑010菌剂

[0044] （1）制备MRS液体培养基和MRS平板培养基：将蛋白胨10g、牛肉粉5g、三水醋酸钠5g、七水磷酸氢二钾2g、吐温80 1mL、四水硫酸锰0.05g、柠檬酸三铵2g、葡萄糖20g、七水硫酸镁0.2g、蒸馏水1000mL混合后，用HCl调pH至6.8，搅拌混匀后，在121℃、0.1MPa下灭菌
20min，制得MRS液体培养基；在制得的MRS液体培养基中添加15g/L的琼脂，放凉后即得MRS平板培养基。

[0045] （2）取保藏的约氏乳杆菌JYLO‑010在MRS平板培养基上活化1次，挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，然后在37℃条件下培养24h，获得菌液。

[0046] （3）将菌液离心后，收集菌体，使用无菌生理盐水洗涤后再次离心获得菌体，重悬于15%（w/w）的复原脱脂乳中，获得菌悬液，将菌悬液放入真空冷冻干燥机中进行冻干后获得菌粉。

[0047] （4）将菌粉与低聚果糖混合制成菌剂，低聚果糖购自保龄宝生物股份有限公司。

[0048] 在本实施例中，制备的约氏乳杆菌JYLO‑010菌剂中菌体数量为200亿/g。

[0049] 实施例3 制备约氏乳杆菌JYLO‑010菌剂

[0050] （1）制备MRS液体培养基和MRS平板培养基：将蛋白胨10g、牛肉粉5g、三水醋酸钠5g、七水磷酸氢二钾2g、吐温80 1mL、四水硫酸锰0.05g、柠檬酸三铵2g、葡萄糖20g、七水硫酸镁0.2g、蒸馏水1000mL混合后，用HCl调pH至6.8，搅拌混匀后，在121℃、0.1MPa下灭菌
20min，制得MRS液体培养基；在制得的MRS液体培养基中添加15g/L的琼脂，放凉后即得MRS平板培养基。

[0051] （2）取保藏的约氏乳杆菌JYLO‑010在MRS平板培养基上活化1次，将活化后挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，然后在37℃条件下培养24h，获得菌液。

[0052] （3）将菌液离心后，收集菌体，使用无菌生理盐水洗涤后再次离心获得菌体，重悬于15%（w/w）的复原脱脂乳中，获得菌悬液，将菌悬液放入真空冷冻干燥机中进行冻干后获得菌粉。

[0053] （4）将菌粉与低聚果糖混合制成菌剂，低聚果糖购自保龄宝生物股份有限公司。

[0054] 在本实施例中，制备的约氏乳杆菌JYLO‑010菌剂中菌体数量为100亿/g。

[0055] 实施例4 约氏乳杆菌JYLO‑010对小鼠体内25‑羟基维生素D含量的影响[0056] 购买4周龄昆明种小鼠（Kunming mice，KM小鼠）随机分为2组，每组20只，一组为对照组，另一组为实验组。实验组在日常饲料中加入实施例2制备的约氏乳杆菌JYLO‑010菌粉（用量为1g/d），对照组日常饲料中不添加约氏乳杆菌JYLO‑010菌粉，每天进行定量饲喂。饲喂14天后，使用小鼠25‑羟基维生素D（25‑OH‑VD）酶联免疫吸附测定试剂盒（购自赛诺利康生物技术(北京)有限公司）对KM小鼠血清中的25‑羟基维生素D进行含量测定，结果如下：

[0057] 表1 不同组别KM小鼠的血清25‑羟基维生素D含量

[0058]

[0059] 根据上表数据，经过方差分析得出实验组与对照组之间具有显著差异（P=0.021），说明约氏乳杆菌JYLO‑010能够显著提高小鼠体内的25‑羟基维生素D含量。

[0060] 实施例5 约氏乳杆菌JYLO‑010对小鼠钙的表观吸收率的影响

[0061] 购买4周龄昆明种小鼠（Kunming mice，KM小鼠）随机分为2组，每组20只，一组为对照组，另一组为实验组。对照组饲喂添加乳酸钙颗粒（钙含量为20mg/g）的低钙饲料（钙含量为0.4mg/g），实验组饲喂添加乳酸钙颗粒（钙含量为20mg/g）和实施例2制备的约氏乳杆菌JYLO‑010菌粉（用量为1g/d）的低钙饲料（钙含量为0.4mg/g）。饲喂14天后，将所有小鼠移入代谢笼中，进行3天钙代谢实验，记录每只小鼠每天的进食量；并收集72h粪便，在80℃烘干、称重，记录粪便量。将每天收集的鼠粪研磨成细末，过40目筛，混匀，依据《保健食品检验与评价技术规范》中钙吸收实验标准中所述方法消化后，配制成样品溶液，用火焰原子吸收法测定鼠粪中的钙含量，计算钙的表观吸收率。

[0062] 表2 不同组别KM小鼠的钙的表观吸收率

[0063]

[0064] 注：同一列中，上标含相同字母表示差异无统计学意义（P＞0.05），上标含不同字母表示差异有统计学意义（P＜0.05）。

[0065] 根据表2中的结果可知，经过方差分析，实验组与对照组KM小鼠的钙的表观吸收率之间具有显著差异（P＜0.05），说明约氏乳杆菌JYLO‑010能够显著提高小鼠对钙的表观吸收率。

[0066] 实施例6 约氏乳杆菌JYLO‑010对小鼠股骨骨密度的影响

[0067] 取实施例4处理后的空白组小鼠和实验组小鼠的股骨进行实验，采用双能X线骨密度仪测量小鼠股骨的骨密度。

[0068] 表3 不同组别KM小鼠的股骨骨密度

[0069]

[0070] 根据上表数据，经过方差分析，实验组与对照组之间具有显著差异（P＜0.05），说明约氏乳杆菌JYLO‑010能够显著提高小鼠的股骨骨密度。

[0071] 实施例7约氏乳杆菌JYLO‑010对成骨细胞的影响

[0072] 首先将约氏乳杆菌JYLO‑010菌粉制备成菌悬液（1×109CFU/mL）。将成骨细胞MC3T3‑E1 Subclone 14消化，制备成单细胞悬液，计数后将单细胞悬液浓度调整至5×4
10cell/mL，接种于96孔板中，每孔100µL。培养24h后，弃掉培养液，更换为新配制的含约氏乳杆菌菌悬液全培养基或空白全培养基(含10%FBS和1%的青‑链霉素)，置于培养箱内继续培养48h，每孔加入10µL 5.0mg/mL MTT溶液，4h后吸弃孔内液体，每孔加入150µL DMSO，振荡10min充分溶解结晶物，于490nm下测定吸光度值，并计算增殖率。

[0073] 表4 约氏乳杆菌JYLO‑010对成骨细胞的影响

[0074]

[0075] 由表4的结果可知，与空白组相比，约氏乳杆菌JYLO‑010可以显著地促进成骨细胞的增殖、分化和成熟。

[0076] 实施例7约氏乳杆菌JYLO‑010对破骨细胞的影响

[0077] 从出生48h以内乳兔后肢的股骨和胫骨中获取骨髓细胞悬液，过200目细胞筛，计6
数后将细胞悬液浓度调整至2×10 个/mL，接种于24孔板中培养，每孔500μL。24h后吸弃培养液，PBS轻洗1次，然后加入约氏乳杆菌JYLO‑010菌悬液或空白破骨诱导培养基（α‑MEM全‑8
培养基中加入10 mol/L 25‑羟基维生素D）继续培养，以后每隔2天换一次液。培养8天后弃培养液，PBS轻洗后进行TRAP染色，具体染色方法参照抗酒石酸酸性磷酸酶染色试剂盒（购自北京索莱宝生物科技有限公司）中所附说明书。染色后置于显微镜下观察，统计各培养孔内的TRAP阳性细胞个数。

[0078] 表5 约氏乳杆菌JYLO‑010对破骨细胞的影响

[0079]

[0080] 根据上表数据，与空白组相比，实验组的TRAP阳性细胞个数显著减少(P＜0.01)，说明约氏乳杆菌JYLO‑010能显著抑制破骨细胞形成。

[0081] 尽管通过优选实施例的方式对本发明进行了详细描述，但本发明并不限于此。在不脱离本发明的精神和实质的前提下，本领域普通技术人员可以对本发明的实施例进行各种等效的修改或替换，而这些修改或替换都应在本发明的涵盖范围内/任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。