[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种乳酸菌表面蛋白过表达体系构建和应用。

[0002] 益生菌被定义为活的微生物，当机体摄入足够的量时，能赋予宿主健康益处。人体肠道微生物群由1000多种共生菌和益生菌组成，其中，乳酸菌作为最常见的益生菌之一，是包括人类在内的哺乳动物胃肠道(GI)的天然居民，是肠道中的重要菌群之一。罗伊氏乳杆菌是已报道的几乎天然存在于所有脊椎动物和哺乳动物肠道内的乳酸菌。罗伊氏乳杆菌可改善肠道菌群分布，拮抗有害菌定植，避免罹患肠道疾病，对于预防腹泻、调节肠道菌群、提高免疫力等多个方面都有显著的成效。

[0003] 乳酸菌在胃肠道中存活是发挥益生作用的基础，而胃肠道中存在高浓度的胃酸、胆汁盐和丰富的消化酶，这对乳酸菌来说是一个严峻的挑战。可见，乳酸菌的黏附能力是促进其在胃肠道定植并抑制致病菌的黏附，发挥乳酸菌对健康有益作用的先决条件。在乳酸菌黏附在胃肠上皮细胞的过程中，细菌细胞表面成分如黏附素、多糖和表面黏附蛋白发挥了重要作用，其中表面蛋白对于乳酸菌在胃肠道的黏附起着尤为突出的作用。

[0004] 然而，细菌表面蛋白可通过分选酶依赖机制的LPxTG蛋白家族来发挥黏附作用。当LPxTG结构蛋白作为分选信号在胞内表达并分泌锚定胞外细胞壁的过程中，苏氨酸和甘氨酸(TG)之间的肽键被管家细胞壁分选酶(Sortase A,SrtA)酶切，然后暴露的苏氨酸末端与肽聚糖肽桥结构中的氨基酸催化形成肽键，从而使其锚定在细胞壁肽聚糖上发挥作用。通过LPxTG结构蛋白的辅助黏附作用，将提升乳酸菌在宿主肠道中的定植特性。而目前关于含LPxTG结构的乳酸菌表面蛋白的研究基本集中在蛋白本身的功能特性上，而对于蛋白在乳酸菌体内过表达后，对于提高乳酸菌在胃肠道耐受特性以及黏附能力的报道相对缺乏。

[0005] 本发明所要解决的第一个技术问题是针对现有技术而提供一种乳酸菌表面蛋白过表达体系构建，其能构建获得目的蛋白表达量高、胃肠道耐受功能特性好且细胞黏附好的乳酸菌表面蛋白过表达体系。

[0006] 本发明所要解决的第二个技术问题是针对现有技术而提供一种上述乳酸菌表面蛋白过表达体系在益生菌产品制备中的应用。

[0007] 本发明解决上述第一个技术问题所采用的技术方案为：一种乳酸菌表面蛋白过表达体系构建，其特征在于，包括以下步骤：

[0008] (1)以罗伊氏乳杆菌SH23的全基因组为模版，通过引物1‑LPxTG‑F/R，经PCR扩增获得基于LPxTG结构同时含有HIS标签的乳酸菌表面蛋白核酸；再以上述PCR产物为模板，通过引物2‑LPxTG‑F’/R’，经PCR扩增获得含有pMG36e质粒同源臂的乳酸菌表面蛋白核酸；

[0009] (2)以pMG36e质粒为模版，通过引物3‑pMG36e‑F/R，经PCR扩增获得pMG36e质粒核酸；

[0010] (3)根据步骤(1)和步骤(2)获得的乳酸菌表面蛋白核酸和pMG36e质粒核酸构建重组表达载体；

[0011] (4)将步骤(3)中得到的重组表达载体导入大肠杆菌BL‑21，获得大量重组表达载体；

[0012] (5)将步骤(4)中获得的大量重组表达载体电转进入罗伊氏乳杆菌SH23中，获得所需的乳酸菌表面蛋白过表达体系。

[0013] 进一步，所述乳酸菌表面蛋白核酸的序列如SEQ ID No.2所示。

[0014] 进一步，所述pMG36e质粒的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示。

[0015] 进一步，所述引物1‑LPxTG‑F/R的序列分别如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示，具体如下：

[0016] 引物1‑LPXTG‑F：GTGGTGGTGGTGGTGGTGATGGAACAACTAACAGTTACCC CAA；

[0017] 引物1‑LPXTG‑R：CTATTTCTCTCGTTTCTTCTTCAAACC。

[0018] 进一步，所述引物2‑LPxTG‑F’/R’的序列分别如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示，具体如下：

[0019] 引物2‑LPXTG‑F’：ttttaaatatgggtcgatcgGTGGTGGTGGTGGTGGTGAT；

[0020] 引物2‑LPXTG‑R’：catatcccgaggaccgaattCTATTTCTCTCGTTTCTTCTTCAAACC。

[0021] 进一步，所述引物3‑pMG36e‑F/R的序列分别如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示，[0022] 引物3‑pMG36e‑F：AATTCGGTCCTCGGGATATGA；

[0023] 引物3‑pMG36e‑R：CGATCGACCCATATTTAAAAAGC。

[0024] 进一步，所述步骤(1)中PCR反应体系为：20μL反应体系，模板1μL，上游引物1μL，下游引物1μL，2×Taq PCR MasterMix 10μL，dd H2O 7μL；

[0025] PCR扩增条件为：95℃预变性3min，95℃变性15sec，56℃退火15sec，72℃延伸1min，72℃再延伸5min，重复35个循环。

[0026] 进一步，所述步骤(2)中PCR反应体系为：20μL反应体系，模板1μL，上游引物1μL，下游引物1μL，2×Taq PCR MasterMix 10μL，dd H2O 7μL；

[0027] PCR扩增条件为：95℃预变性3min，95℃变性15sec，56℃退火15sec，72℃延伸2min，72℃再延伸5min，重复35个循环。

[0028] 进一步，所述步骤(4)中电转条件为：电场强度2000v，电阻400Ω，时间5ms，电容25mF。

[0029] 为进一步解决上述第二个技术问题所采用的技术方案为：一种如上所述的乳酸菌表面蛋白过表达体系在益生菌产品制备中的应用。

[0030] 与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明所构建的乳酸菌LPxTG表面蛋白过表达体系提高了该结构蛋白在乳酸菌体内的表达量，其特殊的LPxTG结构有助于乳酸菌发挥胃肠道耐受功能特性、细胞黏附特性等优点，利于乳酸菌在胃、肠道这种低酸性、充斥着各种消化酶的复杂环境中生存，使乳酸菌更好的在肠道发挥益生菌作用。

[0031] 进一步，本发明所设计的两对目的基因引物依次加入了含有6个组氨酸的HIS标签和含有质粒基因序列的同源臂，采用PCR扩增的方式获得目的基因及载体。获得产物浓度高、纯度高，含有HIS标签而便于后期目的基因蛋白表达与验证，且避免了传统双酶切带来的产品回收浓度低等的问题。附图说明

[0032] 图1为本发明实施例1中引物1、引物2的PCR扩增产物电泳图(a：引物1‑LPxTG‑F/R扩增产物；b：引物2‑LPxTG‑F’/R’)；

[0033] 图2为本发明实施例1中引物3的PCR扩增产物电泳图；

[0034] 图3为本发明实施例1中重组表达载体pMG36e‑LPxTG结构蛋白构建图谱；

[0035] 图4为本发明实施例1中含HIS标签重组蛋白Western Blot图；

[0036] 图5为本发明实施例2中所构建的含LPxTG结构的乳酸菌表面蛋白过表达体系对目的蛋白相对表达量的影响；

[0037] 图6为本发明实施例2中所构建的含LPxTG结构的乳酸菌表面蛋白过表达体系的目的蛋白SDS‑PAGE验证电泳图，注：M：protein Maker 17‑180kDa；WT：野生菌株；V：空载菌株；L：重组菌株；

[0038] 图7为本发明实施例3中所构建的含LPxTG结构的乳酸菌表面蛋白过表达体系对胃肠道耐受性的影响；

[0039] 图8为本发明实施例3中所构建的含LPxTG结构的乳酸菌表面蛋白过表达体系对Caco‑2细胞黏附的影响；

[0040] 图9为本发明实施例3中所构建的含LPxTG结构的乳酸菌表面蛋白过表达体系对7 8 9
Caco‑2细胞荧光黏附图(a：1×10 CFU/mL，b：1×10CFU/mL，c：1×10 CFU/mL；数字表示场景：1：荧光图，2：明场图，3：叠加图)。

[0041] 以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

[0042] 实施例1：基于含LPxTG结构的乳酸菌表面蛋白过表达体系的构建

[0043] 1.1构建过程包括以下步骤：

[0044] (a)以罗伊氏乳杆菌SH23(上海保藏生物技术中心，SHBCC)的全基因组为模版，通过引物1‑LPxTG‑F/R，经PCR扩增获得基于含LPxTG结构同时含有HIS标签的乳酸菌表面蛋白核酸；再以上述PCR产物为模板，通过引物2‑LPxTG‑F’/R’，经PCR扩增获得含有pMG36e质粒同源臂的乳酸菌表面蛋白核酸；

[0045] (b)以pMG36e质粒为模版，通过引物3‑pMG36e‑F/R，经PCR扩增获得pMG36e质粒核酸；

[0046] (c)根据步骤(a)和步骤(b)获得的乳酸菌表面蛋白核酸和pMG36e质粒核酸构建重组表达载体；

[0047] (d)将步骤(c)中得到的重组表达载体导入大肠杆菌BL‑21，获得大量重组表达载体；

[0048] (f)将步骤(d)中获得的大量重组表达载体电转进入罗伊氏乳杆菌SH23中，获得所需的乳酸菌表面蛋白过表达体系。

[0049] 其中，上述基于含LPxTG结构的乳酸菌表面蛋白的氨基酸序列(SEQ ID No.1)如下：

[0050] Met Glu Gln Leu Thr Val Thr Pro Thr Arg Thr Ile Asn Val Lys Tyr Pro Ser Gly Lys GluGlu Ser Ile Pro Gln Lys Val Thr Phe Thr Arg Thr Ala Ile Phe Asp Glu Val Thr Gly Glu Ile LysTyr Thr Glu Trp Leu Pro Gln Gly Thr Ala Gln Trp Ala Ser Tyr Gln Pro Thr Thr Val Thr GlyTyr Val Pro Ser Gln Lys Leu Val Pro Ala Met Thr Val Asn Pro Glu Ile Pro Asn Glu Thr ValAsp Ile Thr Tyr Asp Lys Ile Pro Glu Pro Gln Glu Gly Gln Glu Ile Ile Ser Tyr Gln Asp Ala AsnGly Gln Val Ile His Thr Gln Thr Val Thr Gly Glu Glu Gly Ser Asp Val Ser Phe Lys Pro GluVal Pro Thr Asn Trp Gln Pro Thr Gly Asp Leu Pro His Ser Val Lys Ile Thr Gly Gly Thr ThrVal Ile Val Ile Glu Ser Val Thr Val Pro Val Gln Glu His Lys Thr Val Thr Arg Ile Ile Val GluHis Leu Pro Ser Gly Asp Lys Gln Thr Val Gln Thr Val Val Leu Thr Gly Thr Gly Ala Lys AsnLeu Val Thr Gly Glu Val Thr Ala Ile Lys Trp Asp Cys Gly Glu Phe Ala Ala Phe Thr Pro AlaThr Val Pro Gly Tyr Thr Thr Asn Ile Ser Ile Val Pro Glu Met Asp Val Thr Val Ala Ser Gly AspSer Thr Val Glu Ile Asn Tyr Ile Pro Asn Glu Gln Thr Gly Phe Ile Ile Tyr Arg Asp Glu Asn GlyAsn Glu Ile Thr Arg Thr Ala Leu Gln Gly Lys Thr Gly Glu Ala Val Ala Ile Asn Pro Ala LeuPro Ala Gly Trp Glu Leu Val Pro Gly Gln Ser Ile Pro Ala Thr Val Met Ala Thr Pro Ala Gly IlePro Asn Val Val Val Leu Ile Lys His Gln Thr Ile Ile Val Lys Pro Gly Glu Glu Ala Pro Thr GlyLys Val Pro Gly Asn Pro Ser Thr Thr Tyr Glu Lys Met Glu Ser Leu Thr Lys Glu Ile Thr ArgThr Ile Thr Val Lys Leu Pro Asp Gly Gln Arg Gln Ile Ile Thr Gln Thr Val Lys Phe Thr Arg ThrAla Thr Phe Asp Ala Val Thr Gly Lys Val Thr Tyr Ser Gly Trp Gln Val Asp Gly Asn Asp GluTrp Pro Ala Tyr Thr Ala Pro Glu Ile Asn Gly Tyr Thr Ala Ser Gln Val Ser Ile Pro Ala Glu MetVal Ile Pro Ser Asp Glu Asn Gln Ser Ile Glu Ile Glu Tyr Thr Lys Asn Asn Gln Pro Val Glu ProAsp Lys Pro Val Thr Pro Ile Thr Pro Asp Gln Pro Thr Thr Pro Thr Asn Pro Asp Gln Pro AlaGln Pro Thr Glu Pro Ser Val Pro Ala Lys Pro Ile Ala Pro Thr Asn Asn Gly Asn Lys Val MetSer Gly Asn Gln Leu Pro Thr Glu Pro Val Glu Gln Glu Lys Gln Gln Val Ser Asn Gln His PheIle Ser His Gln Leu Thr Gln Thr Ser Leu Lys Glu Lys Ser Lys Ala Asn Ile Leu Pro Gln ThrGly Asn Asp Gln Asn Ser Gly Ser Ile Leu Gly Phe Ala Phe Ala Ala Leu Ala Ser Ile Leu GlyLeu Thr Gly Leu Lys Lys Lys Arg Glu Lys。

[0051] 进一步，上述基于含LPxTG结构的乳酸菌表面蛋白的核苷酸序列(SEQ ID No.2)如下：

[0052] ATGGAACAACTAACAGTTACCCCAACACGGACAATCAATGTTAAATACCCAAGTGGCAAGGAAGAGTCGATTCCACAAAAAGTTACATTTACCCGGACAGCGATCTTTGATGAAGTAACAGGTGAAATTAAATACACTGAATGGCTTCCTCAAGGCACTGCGCAATGGGCTAGTTATCAACCTACAACTGTTACGGGCTATGTACCTAGTCAAAAGCTTGTGCCAGCAATGACGGTAAATCCTGAGATACCAAATGAAACGGTTGACATCACGTACGATAAGATTCCGGAACCACAGGAAGGCCAAGAGATTATTAGTTACCAAGATGCAAATGGTCAAGTAATCCATACACAGACGGTTACTGGTGAAGAAGGCAGTGATGTTTCCTTCAAGCCAGAAGTTCCGACTAATTGGCAACCAACTGGCGACCTTCCTCATTCAGTAAAGATTACTGGCGGGACAACTGTGATCGTGATTGAGTCAGTTACTGTGCCAGTTCAAGAGCATAAGACGGTAACGCGGATAATCGTTGAGCACCTGCCAAGTGGTGATAAACAAACCGTGCAAACAGTTGTCTTAACCGGAACTGGGGCTAAGAATTTAGTCACTGGCGAAGTTACTGCCATTAAATGGGATTGTGGCGAATTTGCGGCCTTTACTCCTGCAACCGTACCAGGGTACACGACAAATATAAGTATTGTTCCTGAGATGGATGTCACAGTAGCCAGTGGTGACAGTACTGTCGAAATTAACTACATTCCTAATGAACAGACCGGATTTATCATTTACCGTGACGAAAATGGTAATGAAATTACACGAACTGCGCTCCAAGGTAAAACAGGTGAGGCGGTTGCGATCAATCCAGCTCTGCCAGCAGGTTGGGAACTTGTCCCCGGCCAATCAATTCCAGCAACAGTCATGGCTACTCCTGCTGGAATTCCAAATGTTGTCGTTTTGATCAAACATCAAACGATCATTGTAAAGCCGGGAGAAGAAGCCCCAACAGGAAAAGTTCCTGGTAATCCATCAACAACTTACGAGAAGATGGAATCCTTAACTAAAGAGATAACACGAACTATTACTGTTAAGCTGCCGGATGGACAACGCCAGATAATTACACAGACTGTTAAATTTACCAGGACGGCAACATTTGACGCGGTTACTGGCAAGGTAACCTATAGTGGCTGGCAAGTTGATGGTAATGATGAGTGGCCAGCATATACGGCTCCAGAAATTAATGGCTATACCGCTAGTCAGGTCTCTATTCCAGCTGAAATGGTTATTCCTAGTGACGAAAATCAGAGTATTGAGATTGAATACACTAAGAATAATCAACCAGTAGAACCTGATAAGCCAGTAACGCCAATTACACCTGATCAGCCAACGACACCGACTAATCCTGATCAACCGGCACAACCAACTGAACCATCAGTACCGGCTAAACCAATAGCACCAACAAATAATGGTAATAAGGTAATGTCTGGTAATCAATTGCCAACTGAACCGGTTGAACAAGAAAAGCAACAGGTTTCAAATCAACACTTTATCTCACACCAATTAACTCAGACTTCATTAAAAGAAAAGTCAAAAGCTAATATTCTTCCGCAAACTGGTAATGATCAAAATAGTGGTTCTATATTAGGATTCGCATTTGCTGCTCTGGCAAGTATCCTTGGTTTAACTGGTTTGAAGAAGAAACGAGAGAAATAG。

[0053] 进一步，上述pMG36e质粒的核苷酸序列为(SEQ ID No.9)：

[0054] GGTGATTTCAGAATCGAAAAAAAGAGTTATGATTTCTCTGACAAAAGAGCAAGATAAAAAATTAACAGATATGGCGAAACAAAAAGGTTTTTCAAAATCTGCGGTTGCGGCGTTAGCTATAGAAGAATATGCAAGAAAGGAATCAGAACAAAAAAAATAAGCGAAAGCTCGCGTTTTTAGAAGGATACGAGTTTTCGCTACTTGTTTTTGATAAGGTAATTATATCATGGCTATTAAAAATACTAAAGCTAGAAATTTTGGATTTTTATTATATCCTGACTCAATTCCTAATGATTGGAAAGAAAAATTAGAGAGTTTGGGCGTATCTATGGCTGTCAGTCCTTTACACGATATGGACGAAAAAAAAGATAAAGATACATGGAATAGTAGTGATGTTATACGAAATGGAAAGCACTATAAAAAACCACACTATCACGTTATATATATTGCACGAAATCCTGTAACAATAGAAAGCGTTAGGAACAAGATTAAGCGAAAATTGGGGAATAGTTCAGTTGCTCATGTTGAGATACTTGATTATATCAAAGGTTCATATGAATATTTGACTCATGAATCAAAGGACGCTATTGCTAAGAATAAACATATATACGACAAAAAAGATATTTTGAACATTAATGATTTTGATATTGACCGCTATATAACACTTGATGAAAGCCAAAAAAGAGAATTGAAGAATTTACTTTTAGATATAGTGGATGACTATAATTTGGTAAATACAAAAGATTTAATGGCTTTTATTCGCCTTAGGGGAGCGGAGTTTGGAATTTTAAATACGAATGATGTAAAAGATATTGTTTCAACAAACTCTAGCGCCTTTAGATTATGGTTTGAGGGCAATTATCAGTGTGGATATAGAGCAAGTTATGCAAAGGTTCTTGATGCTGAAACGGGGGAAATAAAATGACAAACAAAGAAAAAGAGTTATTTGCTGAAAATGAGGAATTAAAAAAAGAAATTAAGGACTTAAAAGAGCGTATTGAAAGATACAGAGAAATGGAAGTTGAATTAAGTACAACAATAGATTTATTGAGAGGAGGGATTATTGAATAAATAAAAGCCCCCTGACGAAAGTCGAAGGGGGTTTTTATTTTGGTTTGATGTTGCGATTAATAGCAATACAATTGCAATAAACAAAATGATCGACCTCGGGACCCCTATCTAGCGAACTTTTAGAAAAGATATAAAACATCAGAGTATGGACAGTTGCGGATGTACTTC

[0055] AGAAAAGATTAGATGTCTAAAAAGCTAGCTTTTTAGACATCTAAATCTAGGTACTA

[0056] AAACAATTCATCCAGTAAAATATAATATTTTATTTTCTCCCAATCAGGCTTGATCCCC

[0057] AGTAAGTCAAAAAATAGCTCGACATACTGTTCTTCCCCGATCGACCCGATTCACAA

[0058] AAAATAGGCACACGAAAAACAAGTTAAGGGATGCAGTTTATGCATCCCTTAACTTA

[0059] CTTATTAAATAATTTATAGCTATTGAAAAGAGATAAGAATTGTTCAAAGCTAATATTG

[0060] TTTAAATCGTCAATTCCTGCATGTTTTAAGGAATTGTTAAATTGATTTTTTGTAAATA

[0061] TTTTCTTGTATTCTTTGTTAACCCATTTCATAACGAAATAATTATACTTTTGTTTATCT

[0062] TTGTGTGATATTCTTGATTTTTTTCTACTTAATCTGATAAGTGAGCTATTCACTTTAG

[0063] GTTTAGGATGAAAATATTCTCTTGGAACCATACTTAATATAGAAATATCAACTTCTGC

[0064] CATTAAAAGTAATGCCAATGAGCGTTTTGTATTTAATAATCTTTTAGCAAACCCGTAT

[0065] TCCACGATTAAATAAATCTCATTAGCTATACTATCAAAAACAATTTTGCGTATTATAT

[0066] CCGTACTTATGTTATAAGGTATATTACCATATATTTTATAGGATTGGTTTTTAGGAAAT

[0067] TTAAACTGCAATATATCCTTGTTTAAAACTTGGAAATTATCGTGATCAACAAGTTTAT

[0068] TTTCTGTAGTTTTGCATAATTTATGGTCTATTTCAATGGCAGTTACGAAATTACACCT

[0069] CTTTACTAATTCAAGGGTAAAATGGCCTTTTCCTGAGCCGATTTCAAAGATATTATC

[0070] ATGTTCATTTAATCTTATATTTGTCATTATTTTATCTATATTATGTTTTGAAGTAATAAA

[0071] GTTTTGACTGTGTTTTATATTTTTCTCGTTCATTATAACCCTCTTTAATTTGGTTATAT

[0072] GAATTTTGCTTATTAACGATTCATTATAACCACTTATTTTTTGTTTGGTTGATAATGAA

[0073] CTGTGCTGATTACAAAAATACTAAAAATGCCCATATTTTTTCCTCCTTATAAAATTAG

[0074] TATAATTATAGCACGGTCGATCTTCTATATAAAAGATATATTATCTTATCAGTATTGTC

[0075] AATATATTCAAGGCAATCTGCCTCCTCATCCTCTTCATCCTCTTCGTCTTGGTAGCTT

[0076] TTTAAATATGGGTCGATCGAATTCGGTCCTCGGGATATGATAAGATTAATAGTTTTAG

[0077] CTATTAATCTTTTTTTATTTTTATTTAAGAATGGCTTAATAAAGCGGTTACTTTGGATT

[0078] TTTGTGAGCTTGGACTAGAAAAAAACTTCACAAAATGCTATACTAGGTAGGTAAAA

[0079] AAATATTCGGAGGAATTTTGAAATGGCAATCGTTTCAGCAGAAAAATTCGTAATTC

[0080] GAGCTCGCCCGGGGATCGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGCA

[0081] AAGTCTGAAAACGAAGGTGGCAGCTGCCGTTGAAGCGGCCAAGACAGTTGGTAA

[0082] AGGCGACGGTACAACCGGTACTAGCGACAAAGGCGGCGGTCAAGGTACCCCGGC

[0083] GCTACGATATTTGGAGTTGAGGTTCAAAGTCAAATGGTACTGATGACCGGTAAAAT

[0084] TTAATATTTTGAACCTTGCTTAGGCAGCTGACTTCACATTGTTGAGATCAGCTGCCT

[0085] TTTGCTTATAGTTCATTGAGTAGAAACGGTTCTGTTGCGAAGTTTGAAAATCAAAC

[0086] GCAAGCTCGATTTTTTATTAAAACGTCTCAAAATCGTTTCTGAGACGTTTTAGCGTT

[0087] TATTTCGTTTAGTTATCGGCATAATCGTTAAAACAGGCGTTATCGTAGCGTAAAAGC

[0088] CCTTGAGCGTAGCGTGGCTTTGCAGCGAAGATGTTGTCTGTTAGATTATGAAAGCC

[0089] GATGACTGAATGAAATAATAAGCGCAGCGCCCTTCTATTTCGGTTGGAGGAGGCTC

[0090] AAGGGAGTATGAGGGAATGAAATTCCCTCATGGGTTTGATTTTAAAAATTGCTTGC

[0091] AATTTTGCCGAGCGGTAGCGCTGGAAAATTTTTGAAAAAAATTTGGAATTTGGAAA

[0092] AAAATGGGGGGAAAGGAAGCGAATTTTGCTTCCGTACTACGACCCCCCATTAAGT

[0093] GCCGAGTGCCAATTTTTGTGCCAAAAACGCTCTATCCCAACTGGCTCAAGGGTTTA

[0094] AGGGGTTTTTCAATCGCCAACGAATCGCCAACGTTTTCGCCAACGTTTTTTATAAAT

[0095] CTATATTTAAGTAGCTTTATTGTTGTTTTTATGATTACAAAGTGATACACTAACTTTATAAAATTATTTGATTGGAGTTTTTTAAAT。

[0096] 具体构建过程如下：

[0097] 1.2获得罗伊氏乳杆菌SH23中所含的LPxTG结构表面蛋白目的基因序列(步骤a)[0098] 本实施例中罗伊氏乳杆菌SH23的全基因组采用全式金的Easy Pure Bacteria Genomic DNA Kit试剂盒进行提取，并用超微量分光光度计验证DNA浓度。

[0099] 根据NCBI数据库中公布的罗伊氏乳杆菌SH23中含LPxTG结构的表面蛋白的基因序列(如SEQ ID No.2所示)，用CE Design设计引物，引物上下游见表1所述(分别如SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示)，并由上海生工生物有限公司合成。

[0100] 进一步，以提取的罗伊氏乳杆菌SH23的全基因组为模板，采用引物1进行PCR扩增。反应体系如下：

[0101] 20μL反应体系，模板1μL，上游引物1μL，下游引物1μL，2×Taq PCR MasterMix10μL，dd H2O 7μL。

[0102] 按上述反应体系加样后进行扩增，扩增条件为：

[0103] 95℃预变性3min，95℃变性15sec，56℃退火15sec，72℃延伸1min，72℃再延伸5min，重复35个循环。

[0104] 经PCR扩增得到含LPxTG结构同时含有HIS标签的罗伊氏乳杆菌SH23表面蛋白核酸。

[0105] 进一步，以上述PCR产物为模板，采用引物2进行PCR扩增。反应体系如下：

[0106] 20μL反应体系，模板1μL，上游引物1μL，下游引物1μL，2×Taq PCR MasterMix10μL，dd H2O 7μL。

[0107] 按上述反应体系加样后进行扩增，扩增条件为：

[0108] 95℃预变性3min，95℃变性15sec，56℃退火15sec，72℃延伸1min，72℃再延伸5min，重复35个循环。

[0109] 经PCR扩增获得含有pMG36e质粒同源臂的罗伊氏乳杆菌SH23表面蛋白核酸。扩增产物电泳图如图1所示，a泳道为引物1扩增产物，b泳道为引物2扩增产物，目的基因大小均在1500bp之上，符合预期基因大小。

[0110] 表1含LPxTG结构的表面蛋白基因引物

[0111]

[0112] 1.3获得pMG36e质粒基因序列(步骤b)

[0113] 本实施例中pMG36e质粒采用诺唯赞FastPure Plasmid Mini Kit试剂盒进行提取，并用超微量分光光度计验证质粒浓度。

[0114] 根据NCBI数据库中公布的pMG36e质粒的基因序列(如SEQ ID No.9所示)，用CE Design设计引物，引物3上下游见表2所述(分别如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示)，并由上海生工生物有限公司合成。以提取的pMG36e质粒为模板，采用引物3进行PCR扩增。反应体系如下：

[0115] 20μL反应体系，模板1μL，上游引物1μL，下游引物1μL，2×Taq PCR MasterMix10μL，dd H2O 7μL。

[0116] 按上述反应体系加样后进行扩增，扩增条件为：

[0117] 95℃预变性3 min，95℃变性15 sec，56℃退火15 sec，72℃延伸2 min，72℃再延伸5 min，重复35个循环。

[0118] 扩增得到线性pMG36e质粒基因，对线性质粒基因进行纯化。扩增产物电泳图如图2所示，由图2可知线性质粒基因大小在3000 bp之上，符合预期质粒基因大小。

[0119] 表2 pMG36e质粒基因引物

[0120]

[0121] 1.4构建基于含LPxTG结构的乳酸菌表面蛋白的重组表达载体(步骤c)

[0122] 本实施例中基因采用诺唯赞FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit试剂盒进行纯化，纯化后的含LPxTG结构同时含有HIS标签的表层蛋白目的基因(引物2扩增)与线性表达载体pMG36e同源重组进行连接，连接反应体系为：

[0123] 10μL(2×ClonExpress Mix 5μL，线性化载体1μL，目的基因1μL，ddH2O补充至10μL)，其中线性化质粒载体与含LPxTG结构的表面蛋白目的基因片段的摩尔比为1:1，连接条件为50℃反应1h，重组质粒如图3所示。

[0124] 将重组后的质粒加入到克隆感受态细胞BL‑21(DE3)中，在冰上静置孵育30min后快速放入42℃的水浴锅中孵育90sec，接着移至冰盒中静置2min后加入900μL LB液体培养基吹打均匀。

[0125] 在摇床上震荡培养1h(37℃，200rpm)，在3000rpm离心2min后弃去上清液，加入等量LB液体培养基重悬，吸取菌液在加有红霉素(200mg/mL)的LB琼脂平板中涂布均匀过夜培养，挑取单菌落至LB红霉素抗性液体培养基(200mg/mL)中培养12h，菌液PCR鉴定并测序(由上海生工生物有限公司完成)，确定为成功导入重组质粒的大肠杆菌菌株。

[0126] 1.5构建含有LPxTG结构的乳酸菌表面蛋白过表达体系(步骤d和步骤f)

[0127] 将罗伊氏乳杆菌SH23接种于100mL MRS液体培养基中，于37℃恒温培养箱中过夜静止培养，活化3代。以2％的接种量接种于感受态培养基(6.8332g山梨醇、0.5g甘氨酸溶解于50mL MRS液体培养基)中，于37℃恒温培养箱中静置培养致OD600＝0.3～0.6。

[0128] 将培养好的感受态罗伊氏乳杆菌SH23冰水浴30min，用0℃左右的无菌水洗涤菌体3次(6000r/min、4℃、5min)。加入10mL的SM Buffer(16.3g蔗糖、0.036g六水合氯化镁溶于
50mL无菌水)重悬菌体，洗涤菌体2次(6000r/min、4℃、5min)。最后用2mL的SM Buffer重悬菌体，每管100μL分装于1.5mL的无菌离心管中，储存于‑80℃的冰箱中备用。

[0129] 采用诺唯赞FastPure Plasmid Mini Kit试剂盒从重组大肠杆菌BL‑21(DE3)中提取重组质粒和空载质粒。取10μL浓度为0.1μg/μL的重组质粒和空载质粒加入上述制备的感受态乳酸菌中，冰浴30min。将冰浴混合液加入预冷的2mm电转杯中，高压脉冲点击转化。转化条件：电场强度2000v，电阻400Ω，时间5ms，电容25mF。

[0130] 电转结束后迅速向带电转杯中加入900μL的预冷的复苏MRS液体培养基(6.832g山梨醇、0.056g氯化钙溶解于50mL MRS液体培养基)，混合均匀后导入无菌1.5mL离心管中，于37℃恒温培养箱中静置培养3h。复苏结束后离心(3000r/min、4℃、1min)弃去上清液，加入
1mL MRS液体培养基重悬菌体，取200μL菌液涂布到含有5μg/mL的红霉素的MRS平板上，于37℃恒温培养箱静置培养48h后挑取单菌落至MRS抗性液体培养基中培养12h，菌液PCR初步筛选，Western Blot(WB)鉴定，确定为成功导入重组质粒的乳酸菌菌株。

[0131] WB结果如图4所示，HIS标签蛋白在目的蛋白分子量(63kDa)附近出现，证明重组质粒已经成功导入罗伊氏乳杆菌SH23并表达。

[0132] 实施例2：过表达体系中目的蛋白表达量验证

[0133] 2.1 RT‑qPCR测定目的基因表达量

[0134] 将野生菌株、空载菌株、重组菌株活化3代，以2％的接种量接种于100mL MRS液体培养基中，于37℃恒温培养箱中静置培养致OD600＝1.0±0.01。

[0135] 采用美基HiPure Bacterial RNA Kit试剂盒提取野生菌株、空载菌株、重组菌株的RNA，测定RNA浓度及纯度。以上述提取的RNA作为模板去产生cDNA，在冰浴的无核酸酶的离心管中配制逆转录体系(4μLUEIris II RT MasterMix，500ng模板RNA，1μL dsDNase，RNase‑free water补充到20μL)，混匀轻轻混匀后瞬时离心使液体沉于底部，在PCR仪上进行下列条件的反应：37℃温育2min，55℃孵育10min，85℃，10sec。

[0136] 采用引物4进行RT‑qPCR扩增(具体如表3所述)，反应体系如下：20μL反应体系，模板1μL，上游引物0.4μL，下游引物0.4μL，2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10μL，dd H2O 8.2μL。按上述反应体系加样后进行扩增，扩增条件为：95℃预变性30sec，45个循环95℃10sec、60℃30sec。

[0137] RT‑qPCR结果如图5所示，与野生菌株相比较，空载菌株目的基因表达量为0.99，与野生菌株无显著差异；而重组菌株目的基因表达量为2.42，其目的基因表达量上调显著。

[0138] 表3 RT‑qPCR引物

[0139]

[0140] 2.2 SDS‑PAGE测定目的蛋白表达量。

[0141] 将野生菌株、空载菌株、重组菌株活化3代，以2％的接种量接种于100mL MRS液体培养基中，于37℃恒温培养箱中静置培养致OD600＝1.0±0.01。每份100mL MRS液体培养基中加入5mL的LiCl(5mol/L)溶液，于37℃振荡培养(200rpm/min，30min)。将3种菌液离心(6000r/min、4℃、5min)收集上清液，即得到表面蛋白粗提液。将表面蛋白粗提液过0.22μm的无菌亲水性滤膜，装入透析袋(14kDa，36mm)中于4℃透析，每隔6h更换一次透析液，24h后离心悬浊液并收集沉淀。采用生工Micro BCA Protein Assay Kit试剂盒测定蛋白浓度，调整蛋白浓度保持一致，进行SDS‑PAGA蛋白电泳。测定结果如图6所示，目的蛋白分子量大小为63kDa，在该分子量附近，野生菌株和空载菌株蛋白表达量过低，蛋白条带与背景颜色接近，而重组菌株目的蛋白条带亮度更亮、更清晰，重组菌株目的蛋白表达量更高。

[0142] 实施例3：过表达体系在胃肠道耐受功能特性和黏附功能特性中的应用。

[0143] 3.1过表达体系胃肠道耐受性分析

[0144] 将野生菌株、空载菌株、重组菌株活化3代，以2％的接种量接种于100mL MRS液体培养基中，于37℃恒温培养箱中静置培养致OD600＝0.8±0.01，调整菌体密度为OD600＝1.0±0.01。用无菌PBS洗涤菌体三次(6000r/min、4℃、5min)，然后将菌体重悬于等体积的人工胃液(pH 2，0.5％ NaCl，0.3％胃蛋白酶)中，在37℃培养箱中静置培养2h，在MRS琼脂培养基中测定细胞活力。

[0145] 用PBS洗涤菌体三次，再将菌体重悬于等体积的人工肠液(pH 8，0.5％ NaCl，0.5％牛胆汁盐，0.3％胰蛋白酶)中，在37℃培养箱中静置培养3h，在MRS琼脂培养基中测定细胞活力。

[0146] 结果如图7所示，野生菌株和空载菌株在经过2h胃液消化后活菌数分别为6.36log CFU/mL、6.47log CFU/mL，3h肠液消化后活菌数分别为5.14log CFU/mL、5.17log CFU/mL，两种菌株在经过胃液和肠液消化后组内无显著差异；重组菌株在经过2h胃液消化后活菌为6.90log CFU/mL，3h肠液消化后活菌为5.78log CFU/mL，与前两种菌株对比，其胃肠耐受特性有明显提高，存活率显著上升，重组菌株更有利于乳酸菌在胃、肠道这种低酸性、充斥着各种消化酶的复杂环境中生存。

[0147] 3.2过表达体系对Caco‑2细胞黏附分析

[0148] 取生长状态良好的Caco‑2细胞接种至6孔板和12孔板中，于37℃含5％CO2的培养箱中过夜生长使其贴壁。将野生菌株、空载菌株、重组菌株活化3代，以2％的接种量接种于100mL MRS液体培养基中，于37℃恒温培养箱中静置培养致OD600＝0.8，离心(3000r/min、4℃、5min)去上清液，用无菌PBS清洗菌体3次后重悬，使其OD600＝0.50±0.01、1.00±0.01、
1.50±0.01。然后用10μM的异硫氰酸荧光素(FITC)在37℃对野生菌株、空载菌株、重组菌株进行避光染色30min，用无菌PBS洗涤3次去除多余染料，用Tecan Infin M200Pro(瑞士Tecan集团)测定并记录乳酸菌的初始荧光强度A0(激发波长485nm；发射波长538nm)。

[0149] 将FITC染色的乳酸菌单独加入6孔板中并孵育2小时，并用PBS洗涤6孔板3次去除非粘性细菌，通过倒置荧光显微镜观察细胞并拍。将FITC染色的乳酸菌单独加入12孔板中并孵育2小时，并用PBS洗涤12孔板3次去除非粘性细菌，加入等体积的胰酶消化细胞，并收集消化液以确定荧光强度，将其记录为洗脱后的荧光值A1，根据公式计算细菌的黏附速率：细菌黏附率(％)＝(A1/A0)×100％，其中，A1：样品荧光值；A0：空白荧光值。

[0150] 结果如图8所示，随着菌体浓度的不断增大，菌株对Caco‑2细胞的黏附率下降，其7
中菌株浓度为1×10 CFU/mL黏附率最高，野生菌株、空载菌株和重组菌株黏附率分别为：
14.92％、15.53％、19.57％，重组菌株对Caco‑2细胞的黏附率明显提高，与其他两种菌株存
7 8 9
在显著差异。图9所示随着菌体浓度从1×10CFU/mL、1×10 CFU/mL增加到1×10CFU/mL，其
7
荧光强度也明显增强。其中菌株浓度为1×10CFU/mL的组别，重组菌株荧光强度与其他两组相比较，荧光强度更显著强于野生菌株和空载菌株，这与图8结果相对应。