[0001] 本发明有关于使用乳酸杆菌菌株组合来预防和/或治疗代谢综合征关联性疾病(metabolic syndrome‑related disorders)以及降血糖，其中该乳酸杆菌菌株组合包含有副干酪乳酸杆菌(Lactobacillus paracasei)LM‑141以及植物乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)LM‑151，其分别以保藏编号NITE‑BP‑03580以及NITE‑BP‑03581被保藏于日本的国家技术评估学会，专利微生物保藏中心[National Institute of Technology and Evaluation(NITE)Patent Microorganisms Depositary,NPMD]。本发明也有关于一种用来降血糖的乳酸杆菌菌株组合，其包含有这些乳酸杆菌菌株。

[0002] 当人体摄取过量的高油脂食物并缺乏足够的运动时，过多的热量会以脂肪的形式储存于脂肪组织(adipose tissue)中而形成体脂肪(body fat)。当人体体内的体脂肪不正常地累积或是脂肪代谢(fat metabolism)出现异常时，就可能会引发各种代谢综合征关联性疾病(metabolic syndrome‑related disorders)，包括：肥胖(obesity)、高甘油三酯血症(hypertriglyceridemia)、糖尿病(diabetes mellitus)、高血压(hypertension)以及心血管疾病(cardiovascular disease)等。

[0003] 目前临床上用于预防和/或治疗代谢综合征关联性疾病的方法，除了控制饮食与维持运动习惯外，还包括服用抗肥胖药物(anti‑obesity medication)、降血糖药物(hypoglycemic agents)或降血脂药物(hypolipidemic agents)。然而，长期服用这些药物不但无法达到所欲的疗效，更可能会导致患者产生严重的副作用(side effects)。因此，本领域的相关技术人员皆致力于开发可以有效地预防和/或治疗代谢综合征关联性疾病并且不会产生非所欲的副作用的药物。

[0004] 乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB)属于一般被公认为安全的(generally recognized as safe,GRAS)并且为人所熟悉与广泛使用的益生菌(probiotics)。常见的乳酸菌包括：乳酸杆菌属(Lactobacillus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、肠球菌属(Enterococcus)以及链球菌属(Streptococcus)等。

[0005] 已有研究指出，副干酪乳酸杆菌(Lactobacillus paracasei)(又被称为Lacticaseibacillus paracasei)具有抗肥胖以及降血脂等功效。例如，在2021年刊登于华艺在线图书馆的硕士论文[名称：“探讨Lactobacillus paracasei LM‑141对于高脂食物诱导的肥胖鼠代谢功能异常改善的影响(Effects of Lactobacillus paracasei LM‑141on improving metabolic dysfunctions in high‑fat diet‑induced obese rats)”]中，作者林志杰通过对带有高脂肪饲料(HFD)‑诱发的肥胖[high fat diet(HFD)‑induced obesity]的大鼠投予申请人所提供的副干酪乳酸杆菌LM‑141而发现到，副干酪乳酸杆菌LM‑141能够有效地减轻大鼠的体重、降低体脂肪与血糖，以及减缓肝脏脂肪堆积，进而达到改善肥胖与减少代谢综合征关联性疾病(metabolic syndrome‑related disorders)发生的效用。

[0006] 虽然已存在有上述文献报道，本领域中仍然存在有需要去筛选出可以有效预防和/或治疗代谢综合征关联性疾病的微生物以供产业界所需。

[0007] 于本发明中，申请人意外地发现，副干酪乳酸杆菌(Lactobacillus paracasei)LM‑141以及植物乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)LM‑151的组合使用对于带有高脂肪饲料(HFD)‑诱发的肥胖[high fat diet(HFD)‑induced obesity]的大鼠在降低血糖以及减缓葡萄糖耐受性不良(impaired glucose tolerance)的效用上具有优异的协同效应(synergistic effect)，因而被预期具有预防和/或治疗代谢综合征关联性疾病(metabolic syndrome‑related disorders)的高潜力。

[0008] 于是，在第一个方面，本发明提供一种乳酸杆菌菌株组合供应用于制备用来预防和/或治疗代谢综合征关联性疾病的组合物的用途，其中该乳酸杆菌菌株组合包含有副干酪乳酸杆菌LM‑141以及植物乳酸杆菌LM‑151，其分别以保藏编号NITE‑BP‑03580以及NITE‑BP‑03581被保藏于日本的国家技术评估学会，专利微生物保藏中心[National Institute of Technology and Evaluation(NITE)Patent Microorganisms Depositary,NPMD]。

[0009] 在第二个方面，本发明提供一种用于治疗具有或被怀疑具有代谢综合征关联性疾病的个体的方法，其包括对该个体投予如上所述的乳酸杆菌菌株组合。

[0010] 较佳地，该代谢综合征关联性疾病选自由下列所构成的群组：肥胖(obesity)、高血糖症(hyperglycemia)、糖尿病(diabetes mellitus)、血脂异常(dyslipidemia)、高血脂症(hyperlipidemia)、脂肪肝(fatty liver)，以及它们的组合。

[0011] 在第三个方面，本发明提供一种乳酸杆菌菌株组合供应用于制备用来降血糖的组合物的用途，其中该乳酸杆菌菌株组合包含有如上所述的副干酪乳酸杆菌LM‑141(NITE‑BP‑03580)以及植物乳酸杆菌LM‑151(NITE‑BP‑03581)。

[0012] 在第四个方面，本发明提供一种用来降血糖的方法，其包括对有此需要的个体投予如上所述的乳酸杆菌菌株组合。

[0013] 较佳地，副干酪乳酸杆菌LM‑141(NITE‑BP‑03580)以及植物乳酸杆菌LM‑151(NITE‑BP‑03581)的菌数比落在1：0.1至1：10的范围内。

[0014] 较佳地，该组合物是食品组合物。

[0015] 较佳地，该组合物是药学组合物。

[0016] 更佳地，该药学组合物呈供非经肠道投药、口服投药或局部投药的剂型。

[0017] 在第五个方面，本发明提供一种用来降血糖的乳酸杆菌菌株组合，其包含有如上所述的副干酪乳酸杆菌LM‑141(NITE‑BP‑03580)以及植物乳酸杆菌LM‑151(NITE‑BP‑03581)。

[0018] 较佳地，副干酪乳酸杆菌LM‑141(NITE‑BP‑03580)以及植物乳酸杆菌LM‑151(NITE‑BP‑03581)的菌数比落在1：0.1至1：10的范围内。

[0019] 为了这本说明书的目的，将被清楚地了解的是：文字“包含有(comprising)”意指“包含但不限于”，以及文字“包括(comprises)”具有对应的意义。

[0020] 除非另外有所定义，在本文中所使用的所有技术性与科学术语具有本领域技术人员所共同了解的意义。本领域技术人员会认知到许多与那些被描述于本文中者相似或等效的方法和材料，它们可被用于实施本发明。当然，本发明决不受到所描述的方法和材料的限制。

[0021] 本发明提供一种乳酸杆菌菌株组合供应用于制备用来预防和/或治疗代谢综合征关联性疾病(metabolic syndrome‑related disorders)的组合物的用途，其中该乳酸杆菌菌株组合包含有副干酪乳酸杆菌(Lactobacillus paracasei)LM‑141以及植物乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)LM‑151，其分别以保藏编号NITE‑BP‑03580以及NITE‑BP‑03581被保藏于日本的国家技术评估学会，专利微生物保藏中心[National Institute of Technology and Evaluation(NITE)Patent Microorganisms Depositary,NPMD]。

[0022] 如本文中所使用的，术语“代谢综合征(metabolic syndrome)”意指个体因慢性代谢异常而导致一种或多种关联性疾病共同发生的情形。

[0023] 依据本发明，该代谢综合征关联性疾病可包括，但不限于：代谢综合征本身；肥胖(obesity)；高血糖症(hyperglycemia)；高胰岛素血症(hyperinsulinemia)；糖尿病(diabetes mellitus)[包括第2型糖尿病(type 2diabetes mellitus,T2DM)]及其所引起的并发症(complications)[诸如，糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy)、糖尿病白内障(diabetic cataract)、糖尿病神经病变(diabetic neuropathy)、糖尿病肾病变(diabetic nephropathy)以及糖尿病心肌病变(diabetic cardiomyopathy)等]；血脂异常(dyslipidemia)[包括高血脂症(hyperlipidemia)、高甘油三酯血症(hypertriglyceridemia)、高胆固醇血症(hypercholesterolemia)以及高脂蛋白血症(hyperlipoproteinemia)]；高血压(hypertension)；心血管疾病(cardiovascular diseases,CVDs)[诸如，冠状动脉疾病(coronary artery diseases,CADs)、心肌梗塞(myocardial infarction)、中风(stroke)、心脏衰竭(heart failure)、心绞痛(angina pectoris)以及心律不整(cardiac arrhythmias)等]；脂肪肝(fatty liver)[又称肝脏脂肪变性(hepatic steatosis)，包括急性脂肪肝(acute fatty liver)、慢性脂肪肝(chronic fatty liver)、大囊泡性脂肪肝(macrovesicular fatty liver)、小囊泡性脂肪肝(microvesicular fatty liver)，以及非酒精性脂肪肝(non‑alcoholic fatty liver disease,NAFLD)]；肝纤维化(hepatic fibrosis)；以及肝硬化(cirrhosis)。

[0024] 较佳地，该代谢综合征关联性疾病是肥胖。

[0025] 较佳地，该代谢综合征关联性疾病是T2DM。

[0026] 如本文中所使用的，术语“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”代谢综合征关联性疾病意指该疾病的严重性(severity)或该疾病的症状(symptom)被减少(reduced)，或是该疾病被部分地(partially)或完全地(entirely)消除(eliminated)。

[0027] 如本文中所使用的，术语“预防(preventing)”或“预防(prevention)”代谢综合征关联性疾病意指个体在还没有被诊断具有该疾病时，消除(eliminate)或减少(reduce)该疾病的发生率(incidence)，以及减缓(slow)、延迟(delay)、控制(control)或减少(decrease)该疾病的可能性(likelihood)或机率(probability)。

[0028] 依据本发明，该代谢综合征关联性疾病的预防和/或治疗包括下列至少一者：降低血糖、减轻体重、降低体脂肪、降低血脂，以及减缓肝脏脂肪堆积。

[0029] 较佳地，该代谢综合征关联性疾病的预防和/或治疗是降低血糖。

[0030] 于是，本发明也提供一种乳酸杆菌菌株组合供应用于制备用来降血糖的组合物的用途，其中该乳酸杆菌菌株组合包含有副干酪乳酸杆菌LM‑141(NITE‑BP‑03580)以及植物乳酸杆菌LM‑151(NITE‑BP‑03581)。此外，本发明也提供一种用来降血糖的乳酸杆菌菌株组合，其包含有如上所述的副干酪乳酸杆菌LM‑141以及植物乳酸杆菌LM‑151。

[0031] 如本文中所使用的，术语“组合”意指将用于治疗疾病的两种以上的活性成分合并使用，以供共投药(co‑administering)给需要该治疗的个体。换句话说，这些活性成分可被合并为单一剂型(single dosage form)或者以分开的剂型(separate dosage forms)来同时地(simultaneously)投药。可选地，这些活性成分也可以分开的剂型而被交替地(alternately)或依序地(sequentially)投药，且彼此间隔一段预定时间。较佳地，该预定时间的长度可视需求来进行调整，而使得这些活性成分在个体中的药理效用(pharmacological effect)在时间上重叠或不重叠。在本发明的一个较佳具体例中，副干酪乳酸杆菌LM‑141与植物乳酸杆菌LM‑151呈单一剂型。

[0032] 依据本发明，在该乳酸杆菌菌株组合中，副干酪乳酸杆菌LM‑141以及植物乳酸杆菌LM‑151的菌数比落在1：0.1至1：10的范围内。较佳地，该菌数比落在1：1至1：10的范围内。在本发明的一个较佳具体例中，该菌数比是1：1。

[0033] 依据本发明，该乳酸杆菌菌株组合具有范围落在2×106至2×108CFU/mL内的细菌7
浓度。在本发明的一个较佳具体例中，该细菌浓度是2×10CFU/mL。

[0034] 依据本发明，副干酪乳酸杆菌LM‑141以及植物乳酸杆菌LM‑151可以是活菌或死菌、经浓缩的(concentrated)或未经浓缩的(non‑concentrated)、液态(liquid)、糊状(paste)、半固态(semi‑solid)，或固态(solid)[例如，丸(pellet)、细颗粒(granule)或粉末(powder)]，并且可以是经热灭活的(heat‑inactivated)、经冷冻的(frozen)、经干燥的(dried)，或经冷冻‑干燥的(freeze‑dried)[例如，可呈冷冻干燥形式或喷雾/流化床干燥(spray/fluid bed dried)形式]。在本发明的一个较佳具体例中，副干酪乳酸杆菌LM‑141与植物乳酸杆菌LM‑151皆呈活菌的形式存在。

[0035] 依据本发明，该组合物可以是食品组合物(food composition)，例如呈食品添加物(food additive)的形式，其可以被添加至可食性材料(edible material)中以制备供人类或动物食用的食品产品。依据本发明，该食物产品的实例可包括，但不限于：流体乳品(fluid milk products)，例如牛奶(milk)以及浓缩牛奶(concentrated milk)；发酵乳品(fermented milk)，例如酸奶(yogurt)、酸乳(sour milk)以及冷冻优格(frozen yogurt)；奶粉(milk powder)；冰淇淋(ice cream)；奶酪(cream cheeses)；干酪(dry cheeses)；豆奶(soybean milk)；乳酸菌发酵饮料(lactic acid bacteria fermented beverages)，例如发酵豆奶(fermented soybean milk)；蔬果汁(vegetable‑fruit juices)；果汁(fruit juices)；运动饮料(sports drinks)；甜点(confectionery)；果冻(jelly)；糖果(candies)；婴儿食品(infant food)，例如婴儿乳(infant formula)；保健食品(health foods)，例如中草药保健品；动物饲料(animal feeds)；以及膳食补充品(dietary supplements)。

[0036] 依据本发明，该组合物可以是药学组合物(pharmaceutical composition)。

[0037] 依据本发明，该药学组合物可呈适合于非经肠道投药(parenteral administration)、口服投药(oral administration)或局部投药(topical 
administration)的剂型(dosage form)。较佳地，该药学组合物呈供口服投药的剂型。

[0038] 依据本发明，该药学组合物可进一步包含有被广泛地使用于药物制造技术的药学上可接受的载剂(pharmaceutically acceptable carrier)。例如，该药学上可接受的载剂可包含一种或多种选自下列的试剂：溶剂(solvent)、缓冲液(buffer)、乳化剂(emulsifier)、悬浮剂(suspending agent)、分解剂(decomposer)、崩解剂(disintegrating agent)、分散剂(dispersing agent)、粘结剂(binding agent)、赋形剂(excipient)、稳定剂(stabilizing agent)、螯合剂(chelating agent)、稀释剂(diluent)、胶凝剂(gelling agent)、防腐剂(preservative)、润湿剂(wetting agent)、润滑剂(lubricant)、吸收延迟剂(absorption delaying agent)、脂质体(liposome)以及类似物。有关这些试剂的选用与数量落在本领域技术人员的专业素养与例行技术范畴内。

[0039] 依据本发明，该药学组合物可利用本领域技术人员所详知的技术而被制造成适合于非经肠道投药的剂型[包括注射品(injection)，例如，无菌的水性溶液(sterile aqueous solution)或分散液(dispersion)]，且以选自由下列所构成的群组中的途径来投药：腹膜内注射(intraperitoneal injection)、胸膜内注射(intrapleural injection)、肌肉内注射(intramuscular injection)、静脉内注射(intravenous injection)、动脉内注射(intraarterial injection)、关节内注射(intraarticular injection)、滑液内注射(intrasynovial injection)、椎管内注射(intrathecal injection)、颅内注射(intracranial injection)、表皮内注射(intraepidermal injection)、皮下注射(subcutaneous injection)、皮内注射(intradermal injection)、病灶内注射(intralesional injection)、以及舌下投药(sublingual administration)。

[0040] 依据本发明，该药学组合物可利用本领域技术人员所详知的技术而被制造成适合于口服投药的剂型，这包括，但不限于：无菌的粉末、锭剂(tablet)、片剂(troche)、口含锭(lozenge)、丸剂(pellet)、胶囊(capsule)、分散性粉末(dispersible powder)或细颗粒(granule)、溶液、悬浮液(suspension)、乳剂(emulsion)、糖浆(syrup)、酏剂(elixir)、浓浆(slurry)以及类似物。

[0041] 依据本发明，该药学组合物也可利用本领域技术人员所详知的技术而被制造成适合于局部地施用于皮肤上的外部制剂(external preparation)，这包括，但不限于：乳剂(emulsion)、凝胶(gel)、软膏(ointment)、乳霜(cream)、贴片(patch)、擦剂(liniment)、粉末(powder)、气溶胶(aerosol)、喷雾(spray)、乳液(lotion)、乳浆(serum)、糊剂(paste)、泡沫(foam)、滴剂(drop)、悬浮液(suspension)、油膏(salve)以及绷带(bandage)。

[0042] 本发明也提供一种用于治疗具有或被怀疑具有代谢综合征关联性疾病的个体的方法，其包括对该个体投予(administering)如上所述的乳酸杆菌菌株组合。本发明也提供一种用来降血糖的方法，其包括对有此需要的个体投予如上所述的乳酸杆菌菌株组合。

[0043] 如本文中所使用的，术语“投予”以及“投药(administration)”可被交换地使用，并且意指通过任何合适的途径来对个体导入(introducing)、提供(providing)或递送(delivering)预定的活性成分以执行其预期的效用。

[0044] 如本文中所使用的，术语“个体(subject)”意指任何感兴趣的哺乳类动物，诸如人(humans)、猴子(monkeys)、牛(cows)、绵羊(sheep)、马(horses)、猪(pigs)、山羊(goats)、狗(dogs)、猫(cats)、小鼠(mice)以及大鼠(rats)。

[0045] 依据本发明，该乳酸杆菌菌株组合的投药剂量与投药次数会视下列因素而变化：要被治疗的疾病的严重性，投药途径，以及要被治疗的个体的年龄、身体状况与反应。一般而言，该乳酸杆菌菌株组合可呈单一剂量或是分成多个剂量的形式而被非经肠地道、口服地或局部地投药。

[0046] 本发明将就下面的实施例来做进一步说明，但应了解的是，这些实施例只是供例示说明用，而不应被解释为本发明的实施上的限制。

[0047] ＜实施例＞

[0048] 一般实验材料：

[0049] 1.副干酪乳酸杆菌(Lactobacillus paracasei)LM‑141：

[0050] 申请人使用台式泡菜(购自于中国台湾传统市场)作为样品来源并且利用Lactobacilli MRS琼脂(Lactobacilli MRS Agar)(BD Difco)分离筛选出1株乳酸杆菌分离株LM‑141。

[0051] 接着，将该乳酸杆菌分离株LM‑141拿来进行下列的16S rDNA序列分析(16S rDNA sequence analysis)：首先，以乳酸杆菌分离株LM‑141的基因组DNA作为模板(template)，并使用一组针对细菌的16S rDNA基因而设计的具有下面所示的核苷酸序列的引物对(primer pair)正向引物F1与反向引物R1来进行聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)，以扩增出乳酸杆菌分离株LM‑141的16S rDNA片段。有关PCR的反应条件被显示于下面表1中。

[0052] 正向引物F1

[0053] 5’‑agagtttgatcctggctcag‑3’(序列辨识编号：1)

[0054] 反向引物R1

[0055] 5’‑gtattaccgcggctgctg‑3’(序列辨识编号：2)

[0056] 表1.PCR的反应条件

[0057]

[0058] 于完成PCR后，通过1.5％琼脂糖凝胶电泳(agarose gel electrophoresis)来确认有否得到大小约为550bp的PCR扩增产物，并从凝胶回收纯化该经确认的PCR产物。

[0059] 之后，经由测序分析而得到乳酸杆菌分离株LM‑141的16SrDNA序列(序列辨识编号：3)，并进一步经与NCBI网站中的基因资料库比对后发现，乳酸杆菌分离株LM‑141的16S rDNA序列与副干酪乳酸杆菌(Lactobacillus paracasei)的16S rDNA序列[Genbank登录编号(accession number)：NC_014334.2]间具有97％的相似性，因而被鉴定为一种副干酪乳酸杆菌分离株，并将它命名为副干酪乳酸杆菌LM‑141。该副干酪乳酸杆菌LM‑141已于2021年1月29日以保藏编号BCRC  911037保藏于中国台湾的食品工业发展研究所(Food Industry Research and Development Institute,FIRDI)的生物资源保存及研究中心(Bioresource Collection and Research Center,BCRC)(300新竹市食品路331号，台湾，中国)。

[0060] 另外，该副干酪乳酸杆菌LM‑141也有依据布达佩斯条约(the Budapest Treaty)的规定，于2022年1月4日以保藏编号NITE‑BP‑03580被保藏于日本的国家技术评估学会，专利微生物保藏中心[National Institute of Technology and Evaluation(NITE)Patent Microorganisms Depositary,NPMD]。

[0061] 2.植物乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)LM‑151：

[0062] 申请人使用乳牛生乳(购自于中国屏东县万丹乡建伟畜牧场)作为样品来源并且利用Lactobacilli MRS琼脂(BD Difco)分离筛选出1株乳酸杆菌分离株LM‑151。

[0063] 接着，依据上面第1点当中所述的方法，使用正向引物F1与反向引物R1以及上面表1所示的PCR的反应条件来对该乳酸杆菌分离株LM‑151进行16S rDNA序列分析，并且利用NCBI网站中的基因资料库来进行比对。而比对结果发现，乳酸杆菌分离株LM‑151的16S rDNA序列(序列辨识编号：4)与植物乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)的16S rDNA序列[Genbank登录编号：NT_597789.1]间具有96％的相似性，因而被鉴定为一种植物乳酸杆菌分离株，并将它命名为植物乳酸杆菌LM‑151。该植物乳酸杆菌LM‑151已有依据布达佩斯条约的规定，于2022年1月4日以保藏编号NITE‑BP‑03581被保藏于日本的国家技术评估学会，专利微生物保藏中心(NPMD)。

[0064] 3.实验动物：

[0065] 在下面的实施例中所使用的雄性Sprague‑Dawley(SD)大鼠(6周大)购自于中国乐斯科生物科技股份有限公司(BioLasco Taiwan Co.,Ltd,China)。所有的实验动物被饲养于一个光照与黑暗各为12小时、室温维持在25±1℃的独立空调的动物房内，而且水分与饲料被充分地供给。有关实验动物的饲养环境、处理以及一切实验程序均符合卫生研究院(Institutes of Health)的实验动物饲养管理及使用规范(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)。

[0066] 4.在下面的实施例中所使用的一般饲料(normal diet)与高脂肪饲料(high fat diet,HFD)具有下面表2所示的配方。

[0067] 表2.一般饲料与高脂肪饲料的配方

[0068]

[0069] 一般实验方法：

[0070] 1.统计学分析(statistical analysis)：

[0071] 在下面的实施例中，各组的实验数据以“平均值(mean)±平均值的标准误差(standard error of the mean,SEM)”来表示。所有数据采用Sigma Plot统计软件(version 10.0,Systat Software Inc.)来进行统计分析，并通过史徒登氏t‑试验(Student’s t‑test)来作分析，以评估各组间的差异性。若所得到的统计比对结果是p＜0.05，代表有统计学显著性(statistical significance)。

[0072] 实施例1.本发明含有2株乳酸杆菌菌株的混合物在改善肥胖‑相关的代谢综合征(obesity‑related metabolic syndrome)上的效用评估

[0073] 实验材料：

[0074] 1.制备各个乳酸杆菌菌株的菌液：

[0075] 首先，将副干酪乳酸杆菌LM‑141与植物乳酸杆菌LM‑151分别接种至MRS肉汤培养基(MRS Broth)(BD Difco)中，并于37℃下进行培养历时12小时。之后，所得到的培养物在4℃下以4,000rpm进行离心历时10分钟，接着倒除上清液，而沉淀物(pellets)以适量的PBS7
予以洗涤，然后以适量的灭菌水予以散浮并调整成具有2×10CFU/mL的细菌浓度(以平板计数培养基来进行菌数计数)，借此而得到各个乳酸杆菌菌株的菌液。

[0076] 2.制备含有2株乳酸杆菌菌株的混合物：

[0077] 将上面第1项当中所得到的副干酪乳酸杆菌LM‑141以及植物乳酸杆菌LM‑151的菌液以1：1的菌数比来进行混合，借此而得到含有2株乳酸杆菌菌株的混合物。

[0078] 实验方法：

[0079] A.肥胖的诱发与乳酸杆菌菌株的投药：

[0080] 首先，将雄性SD大鼠随机地分成5组，其中包括1个正常对照组、1个病理对照组、2个单菌组(也就是单菌组1与单菌组2)以及1个复合菌组(每组n＝5)。接着，通过口服胃管灌食法(oral gavage)的方式，对单菌组1与单菌组2的大鼠分别投药以1mL在上面“实验材料”的第1项当中所得到的副干酪乳酸杆菌LM‑141菌液与植物乳酸杆菌LM‑151菌液，以及对复合菌组的大鼠投药以1mL在上面“实验材料”的第2项当中所得到的含有2株乳酸杆菌菌株的混合物。至于正常对照组以及病理对照组的大鼠则被投药以1mL的反渗透水。各组大鼠每天被投药一次，投药时间总共历时14天。

[0081] 在开始投药后的第1天起，病理对照组、各个单菌组以及复合菌组的大鼠被喂食以高脂肪饲料，而正常对照组的大鼠则被喂食以一般饲料，总共历时14天。

[0082] B.生物样品的制备：

[0083] 在开始投药后的第14天结束时，通过口服胃管灌食法的方式，对各组大鼠投予葡萄糖溶液(厂牌为Riedel‑de 货号为16325)(剂量为2g/kg)，并在投予葡萄糖溶液前(也就是第0分钟)以及投予葡萄糖溶液后的第30分钟通过静脉穿刺采血而从各组大鼠的尾部静脉来收集血液，由此所得到的血液样品被拿来进行下面第C项的实验。

[0084] C.口服葡萄糖耐受性试验(oral glucose tolerance test,OGTT)：

[0085] 在上面第B项中所得到的各组大鼠在投予葡萄糖溶液前(也就是第0分钟)以及投予葡萄糖溶液后的第30分钟所收集到的2个血液样品使用Rightest GM550血糖监测系统(Rightest GM550 blood glucose monitoring system)(Bionime,Taichung,Taiwan,China)来进行血液葡萄糖浓度(mg/dL)的测定，继而将所测得的血液葡萄糖浓度相对于时间来作图，而绘制出血糖浓度‑时间曲线(blood glucose concentration‑time curve)。位于该曲线下的面积(area under the curve,AUC)是通过使用梯形法则(trapezoidal rule)而被计算出来的。

[0086] 之后，依照上面“一般实验方法”的第1项“统计学分析”当中所述的方法来分析所得到的实验数据。

[0087] 结果：

[0088] 下面表3显示各组大鼠在投予葡萄糖溶液30分钟后的血液葡萄糖浓度(mg/dL)。

[0089] 表3.各组大鼠的血液葡萄糖浓度

[0090]

[0091] **：各组与病理对照组作比较，p＜0.01。

[0092] ***：各组与病理对照组作比较，p＜0.001。

[0093] ##：复合菌组与单菌组1作比较，p＜0.01。

[0094] 复合菌组与单菌组2作比较，p＜0.01。

[0095] 由表3可见，与正常对照组相较下，病理对照组的大鼠的血液葡萄糖浓度有显著的升高，这表示HFD已诱发大鼠的葡萄糖代谢异常。而与病理对照组相较下，单菌组1与复合菌组的大鼠的血液葡萄糖浓度都有显著的降低，其中又以复合菌组的降低幅度更为显著，相对地，单菌组2的大鼠的血液葡萄糖浓度则没有显著降低的情形。这个实验结果显示：单独使用植物乳酸杆菌LM‑151在降低血液葡萄糖浓度上并不具有显著的效用，但是，当它与副干酪乳酸杆菌LM‑141组合使用时反而能够达到优异的降低效用。

[0096] 下面表4显示各组大鼠在投予葡萄糖溶液30分钟后的AUC。

[0097] 表4.各组大鼠所测得的AUC

[0098]

[0099] ****：复合菌组与病理对照组作比较，p＜0.0001。

[0100] ####：复合菌组与单菌组1作比较，p＜0.0001。

[0101] 复合菌组与单菌组2作比较，p＜0.0001。

[0102] 由表4可见，与正常对照组相较下，病理对照组的大鼠的AUC有显著的升高，这表示HFD已诱发大鼠产生葡萄糖耐受性不良(impaired glucose tolerance)。而与病理对照组相较下，单菌组1与单菌组2的大鼠的AUC分别只降低了20.95％与7.49％(将病理对照组的AUC当作100％)，而复合菌组的大鼠的AUC则能够降低63.38％。这个实验结果显示：组合使用植物乳酸杆菌LM‑151与副干酪乳酸杆菌LM‑141在葡萄糖耐受性不良上能够协同地(synergistically)达到改善的效用。

[0103] 综合以上的实验结果可知：植物乳酸杆菌LM‑151只有在与副干酪乳酸杆菌LM‑141组合使用时能够在降低血糖以及减缓葡萄糖耐受性不良的效用上展现出优异的协同效应(synergistic effect)。因此，申请人认为：副干酪乳酸杆菌LM‑141与植物乳酸杆菌LM‑151的特定组合可以作为预防和/或治疗代谢综合征关联性疾病(metabolic syndrome‑related disorders)的较佳组合。

[0104] 于本说明书中被引述的所有专利和文献以其整体被并入本申请作为参考数据。若有所冲突时，本申请详细说明(包含限定在内)将占上风。

[0105] 虽然本发明已参考上述特定的具体例被描述，明显地在不背离本发明的范围和精神下可作出很多的修改和变化。因此意欲的是，本发明只受如随文检附的权利要求书所示者的限制。

[0106] 生物材料保藏信息说明

[0107] 保藏编号：NITE‑BP‑03580

[0108] 分类命名：LM‑141

[0109] 保藏日期：2022年1月4日

[0110] 保藏单位：国家技术评估学会，专利微生物保藏中心(NITE  Patent Microorganisms Depositary,NPMD)

[0111] 保藏单位地址：邮编292‑0818日本国千叶县木更津市上总镰足2‑5‑8122号室(#122,2‑5‑8Kazusakamatari,Kisarazu‑shi,Chiba292‑0818,Japan)

[0112] 保藏编号：NITE‑BP‑03581

[0113] 分类命名：LM‑151

[0114] 保藏日期：2022年1月4日

[0115] 保藏单位：国家技术评估学会，专利微生物保藏中心

[0116] 保藏单位地址：邮编292‑0818日本国千叶县木更津市上总镰足2‑5‑8122号室。