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一种鉴定酱卤乳鸽储藏过程中特定腐败菌的方法

申请号 CN202311203902.0 申请日 2023-09-19 公开(公告)号 CN117305425A 公开(公告)日 2023-12-29
申请人 珠海市金同农产品有限公司; 仲恺农业工程学院; 拱北海关技术中心; 发明人 罗赛; 刘巧瑜; 姚丽锋; 曾令智; 王小玉; 黄伟英; 黎财慧; 吴松起; 游淑珠;
摘要 本 发明 公开了一种鉴定酱卤乳鸽储藏过程中特定腐败菌的方法,包括对储藏过程中的酱卤乳鸽进行间隔取样,获得不同储藏时期的样品;所述样品置于带滤膜的无菌袋中,加入无菌生理盐 水 浸泡后进行多次离心操作,将下层菌体沉淀转移至冻存管中保存;高通量测序; 微 生物 分离纯化和微生物鉴定等过程。本发明解决了酱卤乳鸽中菌群复杂、储藏过程中不断变化、特定腐败菌难以鉴定的问题,获得了测定范围广、结果准确和 精度 高等技术效果,方便用于判断酱卤乳鸽的储藏期和食用安全性。
权利要求

1.一种鉴定酱卤乳鸽储藏过程中特定腐败菌的方法,其特征在于,包括如下步骤:
1)取样
对储藏过程中的酱卤乳鸽进行间隔取样,获得不同储藏时期的样品;
2)处理
所述样品置于带滤膜的无菌袋中,加入无菌生理盐浸泡后进行多次离心操作,将下层菌体沉淀转移至冻存管中保存;
3)高通量测序
采用PCR扩增技术对16S rDNAV3‑V4区进行扩增,所用的引物序列为341F
(5’‑CCTACGGGNGGCWGCAG‑3’)和805R
(5’‑GACTACHVGGGTATCTAATCC‑3’);
4)生物分离纯化
从菌落计数结束后生长数目在30‑300CFU的平板,根据菌落特征,从每种培养基上挑取
5‑10个菌落,采用平板划线的方式接种于相应的培养基上,重复多次,直到得到纯化的单菌落;再通过革兰氏染色显微镜镜检和过化氢酶试验进行初步筛选,挑取的纯菌落富集后,保存备用。
5)微生物鉴定
将步骤4)中的纯菌落进行DNA提取、16S rDNA V3‑V4区PCR扩增及测序,上游引物为27F(5’‑AGAGTTTGATCCTGGCTCAG‑3’),下游引物为1492R(5’‑AAGGAGGTGATCCAGCCGCA‑3’)。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤1)中所述间隔取样为分别在酱卤乳鸽储藏的第0、10、20、30、35、40、45、50d进行无菌取样,每次取样100g。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤2)中所述无菌生理盐水为100mL,浸泡时间为10min。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤2)中所述多次离心操作为取浸泡后的
50mL滤液于离心管中,在4℃和4000rpm条件下离心10min,随后移取上清液20mL到一个新的离心管中,在4℃和4000rpm条件下离心20min;所述冻存管为2mL冻存管;所述保存条件为‑
80℃。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤4)中所述菌落特征包括形态、大小、边缘结构、颜色
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤4)中所述培养基具体为:菌落总数选用平板计数培养基及36℃/48h培养条件,肠杆菌选用VRBA琼脂培养基及36℃/24h培养条件,葡萄球菌选用Baird‑Parker琼脂培养基及36℃/48h培养条件,乳酸菌选用MRS琼脂培养基及36℃/72h培养条件,假单胞菌选用CFC培养基及28℃/48h培养条件,热杀索丝菌选用STAA培养基及28℃/48h培养条件,霉菌和酵母选用孟加拉红培养基及28℃/5d培养条件。
7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤4)中挑取的纯菌落用营养肉汤培养基富集后,用甘油保存在‑80℃箱中备用。
8.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤5)中PCR反应体系为:模板DNA为1μL体积,上游引物为10μM浓度1μL体积,下游引物为10μM浓度1μL体积,Dntp(mix)为10mM浓度1μL体积,Taq Buffer(with MgCl2)为10X浓度2.5μL体积,Taq酶为5U/μL浓度0.2μL体积,加ddH2O至25μL。
9.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤5)中PCR反应程序为:①预变性——95℃下5min,②变性——94℃下30sec,③退火——63℃下30sec且每循环降0.5℃,④延伸——72℃下30sec,⑤循环②‑④10cycles,⑥变性——95℃下30sec,⑦退火——58℃下
30sec,⑧延伸——72℃下30sec,⑨循环⑥‑⑧30cycles,⑩修复延伸——72℃下10min,保温——4℃。
10.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤5)中,将测序结果通过NCBI数据库进行Blast相似序列检索和序列比对,序列同源性超过97%即视为同一物种。

说明书全文

一种鉴定酱卤乳鸽储藏过程中特定腐败菌的方法

技术领域

[0001] 本发明属于食品加工技术领域,具体涉及一种鉴定酱卤乳鸽储藏过程中特定腐败菌的方法。

背景技术

[0002] 食品腐败通常指发生生物、化学或物理变化,使食品品质发生改变,达到无法被消费者接受的程度。当食物中的不同成分相互反应或与添加的某些改变食物感官特性的成分发生反应时,食物就会发生化学变质,例如化、酶促褐变和非酶褐变。潮湿的食物过度脱或干燥的食物吸收过多的水分时,食物的物理腐败就会发生;微生物大量生长繁殖,代谢形成生物胺、硫化物和有机酸等副产物,也会导致食品的腐败。
[0003] 微生物的生长繁殖是引起食品腐败变质最主要的原因。全球食物约有25%是因为发生微生物腐败而造成的食品损失,是全球密切关注的问题。腐败变质不仅会降低食品的营养价值,产生的腐败微生物及其毒素在内的多种有毒有害物质还会带来食品安全问题,威胁消费者的身体健康和生命安全。低温肉制品在加工过程中使用的加热温度较低,虽然可以杀灭绝大多数微生物,但不能完全杀死细菌芽孢和一些耐热菌,再加上原料肉初始微生物数量较多,生产过程中受到外界环境污染等问题,使微生物在产品的贮藏、运输和销售过程中容易生长和繁殖,保质期较短。肉制品中常见的腐败微生物有:革兰氏阴性需氧嗜冷的假单胞菌(Pseudomonas)、醋酸杆菌(Acinetobacter)、气单胞菌(Aeromonas)和兼性厌氧的肠杆菌(Enterobacteriaceae),以及革兰氏阳性的葡萄球菌(Staphylococcus)、乳杆菌(Lacotbacillus)、热杀索丝菌(Brochothrix themosphacat)。
[0004] 乳酸菌对食品有益,常用于各种食品和原材料的发酵,有助于形成特色味、质地并有延长保质期的作用,但一些物种可以在食品腐败中发挥重要的控制作用。乳酸菌是真空包装低温肉制品中常见的优势腐败菌群。胡萍在真空包装烟熏火腿切片中发现清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)和弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)是导致腐败的优势菌群。除了乳酸菌,假单胞菌(Pseudomonas)和肠杆菌(Lactobacillus)也是低温肉制品中常见的腐败菌。假单胞菌能在低温下生长繁殖,分解蛋白质和脂肪的能较强,尤其是荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)。余娟在探究导致盐水鹅腐败变质的微生物中分离出了荧光假单胞菌。肉制品的腐败通常伴随着异味的产生,这些异味主要来源于微生物代谢产生的挥发性物质,肠杆菌科细菌能够将基酸代谢出有恶臭味的挥发性化合物,如二胺和硫酸盐,在食品腐败中发挥关键作用。
[0005] 肉鸽是广东特色肉类食品,因其营养丰富、肉质鲜美,近年来越来越受到消费者的喜爱,在我国的肉品消费市场比重也在逐年上升。目前,国内肉鸽的消费方式以鲜鸽和在餐馆热菜销售为主,低温加工的方式可以更好的保证肉鸽鲜嫩的口感,并且不容易破坏其营养成分,因此可以将肉鸽的生产产业链向低温肉制品延伸。由于加工过程中未经高温处理,并不能完全杀死一些芽孢和耐热菌,同时产品在真空包装低温贮藏条件下,厌氧及兼性厌氧的微生物容易滋生和繁殖,产品容易出现发粘、发酸、涨袋和变色等质量问题,缩短产品的储存寿命。因此,找出与其品质变化相关的微生物是延长此类产品货架期及促进低温肉鸽制品产业发展的基础
[0006] 基于上述现有技术,急需一种能够适用酱卤乳鸽储藏过程中特定腐败菌的鉴定方法。

发明内容

[0007] 本发明的目的是提供一种鉴定酱卤乳鸽储藏过程中特定腐败菌的方法,使其解决酱卤乳鸽中菌群复杂、储藏过程中不断变化、特定腐败菌难以鉴定的问题,获得了测定范围广、结果准确和精度高等技术效果,方便用于判断酱卤乳鸽的储藏期和食用安全性。
[0008] 为了实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
[0009] 一种鉴定酱卤乳鸽储藏过程中特定腐败菌的方法,包括如下步骤:
[0010] 1)取样
[0011] 对储藏过程中的酱卤乳鸽进行间隔取样,获得不同储藏时期的样品;
[0012] 2)处理
[0013] 所述样品置于带滤膜的无菌袋中,加入无菌生理盐水浸泡后进行多次离心操作,将下层菌体沉淀转移至冻存管中保存;
[0014] 3)高通量测序
[0015] 采用PCR扩增技术对16S rDNAV3‑V4区进行扩增,所用的引物序列为341F(5’‑CCTACGGGNGGCWGCAG‑3’)和805R
[0016] (5’‑GACTACHVGGGTATCTAATCC‑3’);
[0017] 4)微生物分离纯化
[0018] 从菌落计数结束后生长数目在30‑300CFU的平板,根据菌落特征,从每种培养基上挑取5‑10个菌落,采用平板划线的方式接种于相应的培养基上,重复多次,直到得到纯化的单菌落;再通过革兰氏染色显微镜镜检和过氧化氢酶试验进行初步筛选,挑取的纯菌落富集后,保存备用。
[0019] 5)微生物鉴定
[0020] 将步骤4)中的纯菌落进行DNA提取、16S rDNAV3‑V4区PCR扩增及测序,上游引物为27F(5’‑AGAGTTTGATCCTGGCTCAG‑3’),下游引物为1492R(5’‑AAGGAGGTGATCCAGCCGCA‑3’)。
[0021] 进一步地,步骤1)中所述间隔取样为分别在酱卤乳鸽储藏的第0、10、20、30、35、40、45、50d进行无菌取样,每次取样100g。
[0022] 进一步地,步骤2)中所述无菌生理盐水为100mL,浸泡时间为10min。
[0023] 进一步地,步骤2)中所述多次离心操作为取浸泡后的50mL滤液于离心管中,在4℃和4000rpm条件下离心10min,随后移取上清液20mL到一个新的离心管中,在4℃和4000rpm条件下离心20min;所述冻存管为2mL冻存管;所述保存条件为‑80℃。
[0024] 进一步地,步骤3)中高通量测序的扩增反应程序为:98℃预变性45s;98℃变性15s,57℃退火30s,72℃延伸1min,循环20次;72℃末端延伸10min,4℃条件下保温。
[0025] 进一步地,步骤3)中高通量测序的PCR扩增反应体系为:H2O为10.5μL,gDNA(30ng)为1μL,2×KAPAHiFiMix为12.5μL,3AF‑P1R(10μM)为1.0μL。
[0026] 进一步地,步骤4)中所述菌落特征包括形态、大小、边缘结构、颜色
[0027] 进一步地,步骤4)中所述培养基具体为:菌落总数选用平板计数培养基及36℃/48h培养条件,肠杆菌选用VRBA琼脂培养基及36℃/24h培养条件,葡萄球菌选用Baird‑Parker琼脂培养基及36℃/48h培养条件,乳酸菌选用MRS琼脂培养基及36℃/72h培养条件,假单胞菌选用CFC培养基及28℃/48h培养条件,热杀索丝菌选用STAA培养基及28℃/48h培养条件,霉菌和酵母选用孟加拉红培养基及28℃/5d培养条件。
[0028] 进一步地,步骤4)中挑取的纯菌落用营养肉汤培养基富集后,用甘油保存在‑80℃冰箱中备用。
[0029] 进一步地,步骤5)中PCR反应体系为:模板DNA为1μL体积,上游引物为10μM浓度1μL体积,下游引物为10μM浓度1μL体积,Dntp(mix)为10mM浓度1μL体积,Taq Buffer(with MgCl2)为10X浓度2.5μL体积,Taq酶为5U/μL浓度0.2μL体积,加ddH2O(双蒸水)至25μL。
[0030] 进一步地,步骤5)中PCR反应程序为:①预变性——95℃下5min,②变性——94℃下30sec,③退火——63℃下30sec且每循环降0.5℃,④延伸——72℃下30sec,⑤循环②‑④10cycles,⑥变性——95℃下30sec,⑦退火——58℃下30sec,⑧延伸——72℃下30sec,⑨循环⑥‑⑧30cycles,⑩修复延伸——72℃下10min, 保温——4℃。
[0031] 进一步地,步骤5)中,将测序结果通过NCBI数据库进行Blast相似序列检索和序列比对,序列同源性超过97%即视为同一物种。
[0032] 本发明具有以下有益效果:
[0033] (1)本发明开发出了鉴定酱卤乳鸽储藏过程中特定腐败菌的方法,解决了低温酱卤乳鸽中菌群复杂、储藏过程中不断变化、特定腐败菌难以鉴定的问题。
[0034] (2)高通量检测方法能从和属水平上探究贮藏期间微生物群落丰度和多样性。传统微生物培养法能精确测定贮藏期间微生物数量的变化结合16S rDNA V3‑V4区测序可鉴定出酱卤乳鸽中菌株的数量。本方法中采用高通量检测结合传统微生物培养鉴定,具有测定范围广、结果准确,精度高等特点。
[0035] (3)本发明能准确测定储藏过程中酱卤乳鸽中微生物菌群的变化,从而判定酱卤乳鸽的储藏期和食用安全性。附图说明
[0036] 图1为酱卤乳鸽在贮藏期间中的细菌组成基于门水平的分类图;
[0037] 图2为酱卤乳鸽在贮藏期间中的细菌组成基于属水平的分类图;
[0038] 图3为贮藏期间细菌样品在属水平的物种注释及丰度信息热图。

具体实施方式

[0039] 以下结合实施例对本发明的原理和特征进行描述,所举实例只用于解释本发明,并非用于限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0040] 一种高通量检测和传统微生物培养结合鉴定酱卤乳鸽储藏过程中特定腐败菌的方法,包括以下步骤:
[0041] (1)制备酱卤乳鸽:屠宰好的乳鸽→清洗→热水烫皮→小火卤煮20min→关火浸泡30min→60℃烘1h→冷却后真空包装→8℃下贮藏。
[0042] (2)取样与处理:酱卤乳鸽制作完成后,迅速移置于8℃的冰箱储藏,分别第0、10、20、30、35、40、45、50d无菌取样。100g样品置于带滤膜的无菌袋中,加入100mL无菌生理盐水,浸泡10min后取50mL滤液于离心管中,在4℃,4000rpm离心10min,随后移取上清液20mL到一个新的离心管中,在4℃,10000rpm离心20min,把下层菌体沉淀转移到2mL冻存管,‑80℃保存。
[0043] (3)高通量测序:采用PCR扩增技术对16S rDNAV3‑V4区进行扩增,所用的引物序列为341F(5’‑CCTACGGGNGGCWGCAG‑3’)和805R(5’‑GACTACHVGGGTATCTAATCC‑3’)。高通量测序的PCR扩增反应体系为:H2O为10.5μL,gDNA(30ng)为1μL,2×KAPAHiFiMix为12.5μL,3AF‑P1R(10μM)为1.0μL。高通量测序的扩增反应程序为:98℃预变性45s;98℃变性15s,57℃退火30s,72℃延伸1min,循环20次;72℃末端延伸10min,4℃条件下保温。
[0044] (4)微生物培养条件及所用的选择性培养基如下表1所示。从菌落计数结束后生长数目在30~300CFU的平板,根据菌落特征(形态、大小、边缘结构、颜色等),从每种培养基上挑取5~10个菌落,采用平板划线的方式接种于相应的培养基上,重复进行2~3次,直到得到纯化的单菌落。然后再进行革兰氏染色及显微镜镜检,过氧化氢酶试验等进行初步筛选,挑取的纯菌落用营养肉汤培养基富集后,用甘油保存在‑80℃冰箱中备用,用于后续的接种及菌种鉴定。
[0045] 表1贮藏过程中微生物培养条件
[0046]
[0047]
[0048] (5)菌种的鉴定
[0049] 将上述保存好的菌种送往上海生工生物工程有限公司进行DNA的提取、16S rDNAV3‑V4区PCR扩增及测序。采用细菌通用引物进行PCR扩增,上游引物为27F(5’‑AGAGTTTGATCCTGGCTCAG‑3’),下游引物为1492R(5’‑AAGGAGGTGATCCAGCCGCA‑3’)。PCR反应体系及程序如表2和表3。将测序结果通过NCBI数据库进行Blast相似序列检索和序列比对,序列同源性超过97%即视为同一物种。
[0050] 表2PCR扩增反应体系
[0051]
[0052] 表3PCR扩增反应程序
[0053]
[0054]
[0055] 结果:
[0056] 高通量检测酱卤乳鸽储藏过程中微生物种类的变化:酱卤乳鸽在贮藏期间中的细菌组成基于门水平的分类见图1,基于属水平的分类见图2,贮藏期间细菌样品在属水平的物种注释及丰度信息热图见图3。
[0057] 图1中,酱卤乳鸽在贮藏期间中的细菌组成主要有厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria)。贮藏30、40和45d的厚壁菌门占主要优势,在30d时占比达到98.97%,随着贮藏时间的延长,变化趋势呈波浪形,到第50d时占比最少,相对丰度大幅下降至25.55%。变形菌门是第二个主要细菌菌群,变化趋势与厚壁菌门呈负相关,是贮藏35d和50d的优势细菌,在第50d时相对丰度最高,达到74.21%。
[0058] 丰度占比前30的属的动态变化情况见图2,不同菌群在贮藏期间增长趋势有所差异。占优势的厚壁菌门在属分类水平上主要有肉食杆菌属(Carnobacterium)、巨型球菌属(Macrococcus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)等;在变形菌门中含有沙雷氏菌属(Serratia)、嗜冷菌属(Psychrobacter)、泛菌属(Pantoea)等。
[0059] 图3中颜色的深浅表示在这个贮藏时间的丰度的高低。贮藏30~35d时,具有高丰度的物种较少;35d后,具有较高丰度的物种开始增加,物种多样性也随着增加。贮藏30d具有高丰度的物种为巨型球菌属;贮藏35d,高丰度物种变为嗜冷菌属和葡萄球菌属;贮藏40~50d,肉食杆菌属和沙雷氏菌属生长迅速,占主导地位。葡萄球菌属、肉食杆菌属和沙雷氏菌属是低温冷藏食品中常见的腐败微生物。
[0060] 菌落计数结束后纯化得到单菌落,然后进行革兰氏染色及显微镜镜检,过氧化氢酶试验等进行初步筛选,挑取的纯菌落用营养肉汤培养基富集后,16S rDNA V3‑V4区PCR扩增及测序结果见表4。假单胞菌虽在贮藏期间有检出,但是数量级始终处于较低水平,霉菌和酵母在整个贮藏期间含量极少甚至未检出,表明假单胞菌、霉菌和酵母与酱卤乳鸽腐败变质的关联度较弱。在25~30d各种选择培养基均未检出菌落;到了贮藏中期第35d,酱卤乳鸽的初始菌相有葡萄球菌、乳酸菌和假单胞菌;第40d,开始检测出肠杆菌和热杀索丝菌。随着贮藏时间的延长,除了乳酸菌呈先增加后下降的趋势,其他各类菌数量都有一定程度的增加。食品贮藏期长短与微生物的类型及数量密切相关,由表4可知,贮藏35d的优势菌群为葡萄球菌;贮藏40~45d的优势菌群为乳酸菌;贮藏50d的优势菌群为肠杆菌。
[0061] 表4酱卤乳鸽贮藏期间微生物数量的变化
[0062]
[0063] 将分离到的菌落进行16S rDNAV3‑V4区扩增测序,经NCBI对比后结果如表5所示。酱卤乳鸽贮藏30d开始有微生物生长,但菌种比较单一,只在PCA培养基分离到一种菌为溶酪大球菌(Macrococcus caseolyticus)。当贮藏35d时,B‑P培养基、MRS培养基和CFC培养基开始有相应菌落生长,主要鉴定出葡萄球菌(Staphylococcus equorum、Staphylococcus saprophyticus)和假单胞菌(Pseudomonas sp.)。当贮藏40d时,VRBA培养基和STAA培养基也开始有相应菌落生长,菌群多样性进一步增加,主要菌群有肠杆菌(Serratia liquefaciens、Pantoea sp.)、葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus、Staphylococcus warneri)、乳酸球菌(Enterococcuspseudoavium)和热杀索丝菌(Brochothrix thermosphacta)。随着贮藏时间的延长,还从MRS培养基分离到了肉食杆菌
(Carnobacterium divergens、Carnobacterium maltaromaticum)。
[0064] 表5基于16S rDNAV3‑V4区鉴定分离纯化的菌落
[0065]
[0066]
[0067]
[0068] 上述具体实施方式相对于现有技术获得了如下技术效果:
[0069] (1)本发明开发出了鉴定酱卤乳鸽储藏过程中特定腐败菌的方法,解决了低温酱卤乳鸽中菌群复杂、储藏过程中不断变化、特定腐败菌难以鉴定的问题。
[0070] (2)高通量检测方法能从门和属水平上探究贮藏期间微生物群落丰度和多样性。传统微生物培养法能精确测定贮藏期间微生物数量的变化结合16S rDNA V3‑V4区测序可鉴定出酱卤乳鸽中菌株的数量。本方法中采用高通量检测结合传统微生物培养鉴定,具有测定范围广、结果准确,精度高等特点。
[0071] (3)本发明能准确测定储藏过程中酱卤乳鸽中微生物菌群的变化,从而判定酱卤乳鸽的储藏期和食用安全性。
[0072] 尽管已经示出和描述了本发明的实施例,本领域的普通技术人员可以理解:在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型,本发明的范围由权利要求及其等同物限定。