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益生菌组合及在肠道调节、私处护理和乳腺抗炎中的应用
申请号	CN202310176599.3	申请日	2023-02-28	公开(公告)号	CN117343857A	公开(公告)日	2024-01-05
申请人	广东益可维生物技术有限公司;			发明人	金庭飞; 朱泽娜; 黎旭; 张文朋; 叶长明;
摘要	本发明公开了一种益生菌组合物及其在肠道调节、私处护理和乳腺抗炎中的应用，以重量份数计，所述益生菌组合物包括长双歧杆菌W6810‑40份、两歧双歧杆菌Y2210‑40份、嗜酸乳杆菌K4315‑40份、干酪乳杆菌K3515‑40份和罗伊氏乳杆菌K0715‑40份。本发明所提供的益生菌组合物对肠道病原菌和阴道病原菌均有抑制作用，有利于女性私处护理。并且，本发明的益生菌组合物可以提高发酵底物中的β‑谷甾醇含量，进而增加抗炎、抗氧化、免疫调节等功效，有利于保持肠道健康、私处护理和乳腺抗炎。同时，本发明的益生菌组合物可以降低TNF‑α和IL‑6的含量，以减轻肠道不适及乳腺炎。
权利要求	1.一种益生菌组合物，其特征在于，以重量份数计，所述益生菌组合物包括长双歧杆菌W6810‑40份、两歧双歧杆菌Y2210‑50份、嗜酸乳杆菌K4315‑40份、干酪乳杆菌K3515‑50份和罗伊氏乳杆菌K0715‑40份。 2.如权利要求1所述的益生菌组合物，其特征在于，以重量份数计，所述益生菌组合物包括长双歧杆菌W6810‑40份、两歧双歧杆菌Y2210‑40份、嗜酸乳杆菌K4315‑40份、干酪乳杆菌K3515‑40份和罗伊氏乳杆菌K0715‑40份；优选地，以重量份数计，所述益生菌组合物包括长双歧杆菌W6810份、两歧双歧杆菌Y2210份、嗜酸乳杆菌K4330份、干酪乳杆菌K3520份和罗伊氏乳杆菌K0730份。 3.权利要求1或2所述的益生菌组合物在制备调节肠道菌群产品、制备女性私处护理产品或制备乳腺抗炎产品中的应用。 4.一种益生菌制品，其特征在于，所述益生菌制品由益生菌组合物制备而成，所述益生菌组合物包括重量比为(10‑40)：(10‑50)：(15‑40)：(15‑50)：(15‑40)的长双歧杆菌W68、两歧双歧杆菌Y22、嗜酸乳杆菌K43、干酪乳杆菌K35和罗伊氏乳杆菌K07；所述益生菌制品为调节肠道菌群的益生菌制品、女性私处护理制品或乳腺抗炎的益生菌制品。 5.如权利要求4所述的益生菌制品，其特征在于，所述益生菌组合物包括重量比为(10‑ 40)：(10‑40)：(15‑40)：(15‑40)：(15‑40)的长双歧杆菌W68、两歧双歧杆菌Y22、嗜酸乳杆菌K43、干酪乳杆菌K35和罗伊氏乳杆菌K07；优选地，所述益生菌组合物包括重量比为10：10：30：20：30的长双歧杆菌W68、两歧双歧杆菌Y22、嗜酸乳杆菌K43、干酪乳杆菌K35和罗伊氏乳杆菌K07。 6.如权利要求4所述的益生菌制品，其特征在于，所述调节肠道菌群包括抑制肠道病原菌，所述肠道病原菌包括：金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌、粪链球菌、变形杆菌、白假丝酵母菌、光滑假丝酵母菌和热带假丝酵母菌；所述女性私处护理包括抑制女性私处病原菌，所述女性私处病原菌包括：金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌、粪链球菌、变形杆菌、白假丝酵母菌、光滑假丝酵母菌和热带假丝酵母菌。 7.如权利要求4所述的益生菌制品，其特征在于，所述益生菌制品用于降低炎症因子表达水平以减轻乳腺炎症；优选地，所述炎症因子包括TNF‑α和IL‑6。 8.如权利要求4所述的益生菌制品，其特征在于，所述益生菌制品为益生菌发酵物，所述益生菌组合物用于提高发酵底物的β‑谷甾醇含量。 9.权利要求4所述的益生菌制品，其特征在于，所述益生菌制品包括益生菌冻干粉和益生菌发酵制品。 10.一种益生菌制品，其特征在于，由重量比为(10‑40)：(10‑50)：(15‑40)：(15‑50)： (15‑40)的长双歧杆菌W68、两歧双歧杆菌Y22、嗜酸乳杆菌K43、干酪乳杆菌K35和罗伊氏乳杆菌K07对发酵底物进行发酵而成；所述发酵底物由以下组分组成：低聚果糖3‑12份，水苏糖5‑11份，抗性糊精2‑8份，玉米须5‑11份，姜黄3‑9份，蜂蜜1‑6份，香橼1‑6份，山楂1‑6份，肉桂1‑6份，当归1‑6份，佛手1‑6份，玫瑰花1‑6份，桃仁1‑7份，藏红花提取物0.1‑0.7份，红枣3‑9份，桂圆3‑9份，冬瓜皮2‑8份，蒲公英2‑8份，金银花1‑3份，阿胶2‑8份，黄明胶1‑6份，枸杞子1‑6份。
说明书全文	益生菌组合及在肠道调节、私处护理和乳腺抗炎中的应用技术领域 [0001] 本发明涉及益生菌技术领域，尤其是一种益生菌组合物及其在肠道调节、私处护理和乳腺抗炎中的应用。背景技术 [0002] 当代社会生活压力大，与之带给女性的疾病问题接踵而至，如：肠道不适、私处不适、乳腺炎症等。女性私处有阴道微生态系统，阴道微生态失衡即是阴道菌群失调，可以引发需氧菌性阴道炎(AV)、细菌性阴道病(BV)、细胞溶解性阴道病(CV)、外阴阴道假丝酵母菌病(VVC)、滴虫阴道炎(TV)、性传播感染、尿路感染等女性生殖泌尿道感染性疾病。女性阴道内乳酸菌数量的减少或缺失，与子宫内膜炎和盆腔炎性疾病的高风险相关。当女性阴道的pH异常时，容易滋生大量的有害菌，导致益生菌群比重降低，进而产生瘙痒、白带异常、异味以及各种炎症等。此外，由于压力太大导致的内分泌失调、卵巢功能紊乱等，进而引发非哺乳期乳腺炎症，非哺乳期乳腺炎以病理组织学分类，常见类型主要包括浆细胞性乳腺炎(PCM)和肉芽肿性乳腺炎(GM)。 [0003] 妇科炎症不仅会影响日常生活和工作，也会对身心造成负面影响，严重者还可能导致不孕。目前对于妇科炎症主要通过抗生素(如：克霉唑栓、硝酸咪康唑栓、伊曲康唑、甲硝唑等)治疗。而抗生素的副作用非常大，且随着抗生素的广泛和不规范应用，临床上常出现抗生素耐药问题。非哺乳期乳腺炎症虽为乳腺良性炎症性疾病，但缺乏规范的药物治疗方法，外科手术切除复发率高，部分人经多种药物和手术治疗反复复发而迁延不愈，严重影响女性的正常生活和工作。非哺乳期乳腺炎症是临床上治疗方法均未解决的难治乳腺良性疾病之一，且其发病率呈增高趋势，已引起临床医生的重视。 [0004] 针对妇科炎症和非哺乳期乳腺炎症，积极寻找副作用较少、疗效较好的产品至关重要。发明内容 [0005] 为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于一种益生菌组合物。 [0006] 本发明的目的之二在于提供一种益生菌组合物的应用。 [0007] 本发明的目的之一采用如下技术方案实现： [0008] 本发明提供了一种益生菌组合物，所述益生菌组合物包括长双歧杆菌W68、两歧双歧杆菌Y22、嗜酸乳杆菌K43、干酪乳杆菌K35和罗伊氏乳杆菌K07。 [0009] 本申请的发明人经过大量创造性劳动，筛选出一组益生菌组合物，上述益生菌对常见肠道、阴道病原菌均有抑制生长的作用；并且经过进一步验证，上述筛选的益生菌产酸能力非常好，pH值均在4.4以下。 [0010] 经过β‑谷甾醇含量测定，本发明的益生菌组合物可以提高发酵底物中的β‑谷甾醇含量，进而增加抗炎、抗氧化、免疫调节等功效，有利于私处护理和乳腺抗炎。并且经过动物实验知，益生菌组合物可以降低TNF‑α、IL‑6的含量，减轻乳腺炎的炎症效果较佳。 [0011] 作为本发明所述益生菌组合物的优选实施方式，以重量份数计，所述益生菌组合物包括长双歧杆菌W6810‑40份、两歧双歧杆菌Y2210‑50份、嗜酸乳杆菌K4315‑40份、干酪乳杆菌K3515‑50份和罗伊氏乳杆菌K0715‑40份。 [0012] 优选地，以重量份数计，所述益生菌组合物包括长双歧杆菌W6810‑40份、两歧双歧杆菌Y2210‑40份、嗜酸乳杆菌K4315‑40份、干酪乳杆菌K3515‑40份和罗伊氏乳杆菌K0715‑40份。 [0013] 更加优选地，以重量份数计，所述益生菌组合物包括长双歧杆菌W6810份、两歧双歧杆菌Y2210份、嗜酸乳杆菌K4330份、干酪乳杆菌K3520份和罗伊氏乳杆菌K0730份。 [0014] 当上述益生菌采用上述重量份数时，对常见肠道、阴道病原菌抑制生长的作用更佳，有利于调节肠道菌群，提高私处护理和乳腺抗炎的效果。 [0015] 本发明的目的之二采用如下技术方案实现： [0016] 目的之一任一项所述的益生菌组合物在制备调节肠道菌群产品、制备女性私处护理产品或制备乳腺抗炎产品中的应用。 [0017] 一种益生菌制品，所述益生菌制品由益生菌组合物制备而成，所述益生菌组合物包括重量比为(10‑40)：(10‑50)：(15‑40)：(15‑50)：(15‑40)的长双歧杆菌W68、两歧双歧杆菌Y22、嗜酸乳杆菌K43、干酪乳杆菌K35和罗伊氏乳杆菌K07；所述益生菌制品为调节肠道菌群的益生菌制品、女性私处护理制品或乳腺抗炎的益生菌制品。 [0018] 作为本发明优选的方案，所述益生菌组合物包括重量比为(10‑40)：(10‑40)：(15‑40)：(15‑40)：(15‑40)的长双歧杆菌W68、两歧双歧杆菌Y22、嗜酸乳杆菌K43、干酪乳杆菌K35和罗伊氏乳杆菌K07。 [0019] 作为本发明优选的方案，所述益生菌组合物包括重量比为10：10：30：20：30的长双歧杆菌W68、两歧双歧杆菌Y22、嗜酸乳杆菌K43、干酪乳杆菌K35和罗伊氏乳杆菌K07。 [0020] 作为本发明优选的方案，所述调节肠道菌群包括抑制肠道病原菌，所述肠道病原菌包括：金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌、粪链球菌、变形杆菌、白假丝酵母菌、光滑假丝酵母菌和热带假丝酵母菌。 [0021] 作为本发明优选的方案，所述女性私处护理包括抑制女性私处病原菌，所述女性私处病原菌包括：金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌、粪链球菌、变形杆菌、白假丝酵母菌、光滑假丝酵母菌和热带假丝酵母菌。 [0022] 作为本发明优选的方案，所述益生菌制品用于降低炎症因子表达水平以减轻乳腺炎症；优选地，所述炎症因子包括TNF‑α和IL‑6。 [0023] 作为本发明优选的方案，所述益生菌制品为益生菌发酵物，所述益生菌组合物用于提高发酵底物的β‑谷甾醇含量。 [0024] 作为本发明优选的方案，所述益生菌制品包括益生菌冻干粉或益生菌发酵制品。 [0025] 作为本发明优选的方案，当所述益生菌制品用于调节肠道菌群时，所述益生菌制品包括益生菌冻干粉或益生菌发酵制品。所述益生菌制品优选为口服制剂，所述口服制剂的产品类型包括发酵制品、口服液、滴剂、片剂、粉剂、凝胶糖果、胶囊剂或颗粒剂等。 [0026] 作为本发明优选的方案，当所述益生菌制品用于女性私处护理时，所述益生菌制品包括益生菌冻干粉或益生菌发酵制品。所述益生菌制品可以为外用制剂或口服制剂。当为外用制剂时，其产品类型包括粉剂、发酵制品、胶囊剂、液体制剂等；当为口服制剂时，其产品类型包括发酵制品、口服液、滴剂、片剂、粉剂、凝胶糖果、胶囊剂或颗粒剂等。 [0027] 作为本发明优选的方案，当所述益生菌制品用于乳腺抗炎时，所述益生菌制品包括益生菌冻干粉或益生菌发酵制品。所述益生菌制品优选为口服制剂，所述口服制剂的产品类型包括发酵制品、口服液、滴剂、片剂、粉剂、凝胶糖果、胶囊剂或颗粒剂等。 [0028] 作为本发明优选的方案，所述益生菌制品为益生菌发酵制品，由重量比为(10‑40)：(10‑50)：(15‑40)：(15‑50)：(15‑40)的长双歧杆菌W68、两歧双歧杆菌Y22、嗜酸乳杆菌K43、干酪乳杆菌K35和罗伊氏乳杆菌K07对发酵底物进行发酵而成；所述发酵底物由以下组分组成：低聚果糖3‑12份，水苏糖5‑11份，抗性糊精2‑8份，玉米须5‑11份，姜黄3‑9份，蜂蜜 1‑6份，香橼1‑6份，山楂1‑6份，肉桂1‑6份，当归1‑6份，佛手1‑6份，玫瑰花1‑6份，桃仁1‑7份，藏红花提取物0.1‑0.7份，红枣3‑9份，桂圆3‑9份，冬瓜皮2‑8份，蒲公英2‑8份，金银花1‑ 3份，阿胶2‑8份，黄明胶1‑6份，枸杞子1‑6份。 [0029] 作为本发明优选的方案，所述发酵底物由以下组分组成：低聚果糖9份，水苏糖8份，抗性糊精5份，玉米须8份，姜黄6份，蜂蜜3份，香橼3份，山楂3份，肉桂3份，当归3份，佛手3份，玫瑰花3份，桃仁4份，藏红花提取物0.4份，红枣6份，桂圆6份，冬瓜皮5份，蒲公英5份，金银花2份，阿胶5份，黄明胶3份，枸杞子3份。 [0030] 作为本发明优选的方案，所述益生菌发酵制品的制备方法，包括以下步骤： [0031] 步骤1、熬胶：将阿胶、黄明胶粉碎，加入黄酒浸泡，炖煮溶解，得基料A； [0032] 步骤2、浸泡：将玉米须、姜黄、香橼、当归、肉桂、佛手、蒲公英、桃仁、玫瑰花、金银花、冬瓜皮粉碎，加8‑12倍量水超声，浸泡，得基料B； [0033] 步骤3、煎煮：将基料B煎煮，第一次过滤得基料C；取第一次过滤的滤渣加入6‑10倍量水煎煮，第二次过滤得基料D；取第二次过滤的滤渣加入4‑6倍量水煎煮，过滤得基料E；将红枣、桂圆、山楂、枸杞子加入4‑6倍量的水，炖煮，过滤得基料F； [0034] 步骤4、混合：将基料C、基料D、基料E、基料F倒入锅中搅拌混匀，再加入1/4重量份的低聚果糖、1/4重量份的水苏糖、1/4重量份的抗性糊精、蜂蜜、藏红花提取物混合搅拌溶解，得基料G，灭菌，得基料H； [0035] 步骤5、益生菌组合物的重量份按照目的之一所提供的益生菌组合物算，将1/4重量份的益生菌组合物和基料H混合发酵，得一级发酵物，再补充1/4重量份的益生菌组合物、1/4重量份的低聚果糖、1/4重量份的水苏糖、1/4重量份的抗性糊精，得二级发酵物；再补充 1/4重量份的益生菌组合物、1/4重量份的低聚果糖、1/4重量份的水苏糖、1/4重量份的抗性糊精，得三级发酵物；再补充1/4重量份的益生菌组合物、1/4重量份的低聚果糖、1/4重量份的水苏糖、1/4重量份的抗性糊精，得四级发酵物；将四级发酵物浓缩，收膏，得液体膏方，然后预冻，冻干，得益生菌发酵制品。 [0036] 作为本发明优选的方案，步骤3中，所述过滤的目数为100‑150目。 [0037] 作为本发明优选的方案，步骤5中，所述液体膏体的相对密度为1.12‑1.20。 [0038] 作为本发明优选的方案，步骤5中，将四级发酵物置于减压0.08MPa，72℃的条件下运行60分钟，得清膏。 [0039] 作为本发明优选的方案，步骤5中，所述冻干步骤包括： [0040] 预冻：将上述液体膏方倒入方格模具(3.0cm×3.0cm)，在‑40℃超低温冰箱里预冻处理，冻藏时间为12‑24h，得预冻后的膏方； [0041] 冻干：将预冻后的膏方置于干燥温度为‑40℃，真空度为10Pa‑40Pa，干燥时间为10‑12h的条件下真空冷冻干燥，然后置于功率160‑220W，作用时间10‑15s条件下震动；再将膏方置于干燥温度为‑20℃～‑40℃，真空度为10‑40Pa，干燥时间为10‑12h的条件下真空冷冻干燥，制得益生菌发酵制品。 [0042] 作为本发明优选的方案，所述发酵底物中各原料均为食品材料或药食同源材料。其中，低聚果糖能快速增殖肠道乳杆菌属和双歧杆菌属，正向调节肠道微生态，抑制有害菌的生长繁殖。水苏糖是“天然超强双歧因子”，无法被胃肠消化液分解，可直接被肠道微生物利用，双歧杆菌在肠道中会优先分解利用非消化性的低聚糖，还可以促进肠道蠕动、减少毒素在肠道的停滞时间，加速有毒有害物质排出。抗性糊精是水溶性膳食纤维，可通过选择性刺激大肠菌群中双歧杆菌和其他短链脂肪酸产生菌的生长来降低pH值，增加有益微生物、降低有害微生物的产生，以改善有益微生物群的繁殖环境。玉米须性平，味甘，归膀胱、肝、胆经，主治尿路感染、乳汁不通、白浊、消渴等。姜黄具有破血行气、通经止痛的功效，主治胸肋刺痛、闭经、症瘕、跌扑肿痛等。蜂蜜具有润燥、止痛、解毒的功效，主治肠燥便秘、胃脘疼痛、发炎等病症。香橼具有理气、舒郁、消痰、利膈的功效，主治肝胃气滞、胸协胀痛、脘腹痞满、呕吐噫气。山楂具有理气、舒郁、消痰、利膈的功效，主治肝胃气滞、胸协胀痛、脘腹痞满、呕吐噫气。肉桂具有补充元阳、暖养脾胃、温除积冷的功效，主治命门火衰、肢冷脉微、宫寒痛经等。当归性温，味甘、苦、辛，归心、肝、脾经，具有补血和血、润燥滑肠的功效，主治月经不调、经闭腹痛、痛经、盆腔炎、血瘀腹痛、便秘等。佛手具有舒肝理气、和胃化痰的功效，主治胸闷、肝胃不和、恶心、呕吐、湿盛痰多、腹胀痛等。玫瑰花具有舒肝理气、和胃化痰的功效，主治胸闷、肝胃不和、恶心、呕吐、月经不调、腹胀痛等。桃仁具有活血祛瘀、润肠通便的功效，主治经闭、痛经、月经不调、乳腺增生、盆腔良性肿瘤、症瘕痞块等。藏红花提取物为藏红花提取而得，藏红花具有活血通经、祛瘀止痛的功效，主治血瘀经闭、痛经、产后瘀滞腹痛、胸痹心痛、症瘕积聚等。红枣具有补脾和胃、益气生津的功效，主治胃虚食少、脾弱便溏、气血津液不足等。桂圆具有益心脾、补气血、安神助眠的功效，主治虚劳羸弱、神经衰弱、焦虑、心悸、饮食不佳等。冬瓜皮性微寒，味甘，归肺、大肠经，具有清热利水、消肿利尿的功效，主治周身水肿、小便不利、泄泻、尿赤热痛等。蒲公英具有清热解毒、利尿散结的功效，主治急性乳腺炎、尿路感染等。金银花具有清热解毒的功效，主治热毒血痢、痈疡、肿毒、瘰疬、痔瘘等病症。阿胶具有滋阴养血的功效，主治血虚、虚劳等。黄明胶具有润肠通便、止血消肿的功效，主治痈疽肿毒，止血止痛润燥等。枸杞子具有养肝滋肾、益精明目、抗肿瘤、抗突变、提高免疫力的功效，主治肝肾阴亏、虚劳精亏等。 [0043] 相比现有技术，本发明的有益效果在于： [0044] 本发明所提供的益生菌组合物对肠道病原菌和阴道病原菌均有抑制作用。并且，本发明的益生菌组合物可以提高发酵底物中的β‑谷甾醇含量，进而增加抗炎、抗氧化、免疫调节等功效，有利于私处护理和乳腺抗炎。同时，本发明的益生菌组合物可以降低TNF‑α和IL‑6的含量，以减轻乳腺炎症。 [0045] 生物材料保藏信息： [0046] 长双歧杆菌W68，保藏编号为CGMCC No.15028，分类命名为：长双歧杆菌Bifidobacterium longum，已于2017年12月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏单位的缩写为CGMCC。 [0047] 两歧双歧杆菌Y22，保藏编号为CGMCC NO.15708，分类命名为：两歧双歧杆菌Bifidobacterium bifidum，已于2018年4月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏单位的缩写为CGMCC。 [0048] 嗜酸乳杆菌K43，保藏编号为CGMCC No.15705，分类命名为：嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus，已于2018年04月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏单位的缩写为CGMCC。 [0049] 干酪乳杆菌K35，保藏编号为CGMCC No.15704，分类命名为：干酪乳杆菌Lactobacillus casei，已于2018年04月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏单位的缩写为CGMCC。 [0050] 罗伊氏乳杆菌K07，保藏编号为CGMCC No.15703，分类命名为：罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri，已于2018年04月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏单位的缩写为CGMCC。具体实施方式 [0051] 下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。在以下实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。 [0052] 一、益生菌对肠道病原菌和阴道病原菌的抑制实验 [0053] 实验益生菌菌株：动物双歧杆菌乳亚种Y6、鼠李糖乳杆菌YGG、长双歧杆菌W68、副干酪乳杆菌K9、两歧双歧杆菌Y22、植物乳杆菌FEED8、嗜酸乳杆菌K43、干酪乳杆菌K35、发酵乳杆菌FM‑12、罗伊氏乳杆菌K07，分别编号A‑J。所用菌株均来源于“广东益可维生物技术有限公司”。 [0054] 培养基： [0055] LB培养基(g/L)：胰蛋白胨10.0g/L，酵母提取物5.0g/L，NaCl10.0g/L，pH 7.0～7.2，配制固体培养基时需添加20g琼脂。 [0056] MRS培养基:葡萄糖20g、蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏5g、乙酸钠5g、磷酸氢二钾2g、柠檬酸氢二铵2g、硫酸镁0.58g和硫酸锰0.25g，吐温80 1mL和蒸馏水1000mL。用1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至7.2，115℃灭菌30min。固体培养基在液体培养基的基础上加入 1.6％的琼脂。 [0057] 1、病原菌拮抗实验： [0058] 1.1、实验病原菌菌株： [0059] 选取9种泌尿生殖道感染常见细菌和真菌：金黄色葡萄球菌(26111)、表皮葡萄球菌(26069)、大肠杆菌(24752)、粪链球菌(32221)、大肠杆菌(25922)、变形杆菌(49027)、白假丝酵母菌、光滑假丝酵母菌、热带假丝酵母菌，分别编号1‑9号，编号为1‑6号的菌株来源于中国药品生物制品检定所；编号为7‑9号的菌株来源于宁夏医科大学附属医院。 [0060] 1.2、益生菌培养菌液： [0061] 分别称取1g益生菌菌粉样品(A‑J)于9mL无菌生理盐水中，充分混匀，80℃水浴保温30min后，按照3％的接种量接种于MRS培养基中，37℃培养24h；然后，取菌液依次稀释至‑610 ，得益生菌的培养菌液，分别编号(A1‑J1)。 [0062] 研究方法：牛津杯法。在LB液体培养基中分别接种各类病原菌(编号1‑9号)，37℃8 过夜培养，然后分别取1mL病原菌菌液(标定为10 CFU/mL)加入100mL牛肉膏蛋白胨琼脂溶液中，充分混匀，倒入加有牛津杯的平板中，冷却后，取出牛津杯，将A1‑J1培养菌液(100μL)经0.25μL滤膜过滤后分别加入到平板上用牛津杯打出的直径为6mm的孔中，37℃孵育24h后，测量抑菌圈直径。结果如表1所示。 [0063] 表1不同菌株对常见肠道、阴道病原菌的拮抗作用结果展示表 [0064] [0065] [0066] [0067] 注：当样品为混合菌株时，将相应菌株培养液按照配比混合成100μL样品。 [0068] 由表1可得，上述10株益生菌对常见肠道病原菌、阴道病原菌均有抑制生长的作用，其中长双歧杆菌W68、两歧双歧杆菌Y22、嗜酸乳杆菌K43、干酪乳杆菌K35、发酵乳杆菌FM‑12、罗伊氏乳杆菌K07的抑菌圈直径较大，均在20+以上。 [0069] 为了获得对肠道病原菌和阴道病原菌抑制效果更好的方案，对不同的益生菌组合进行了筛选，记录结果于表1。 [0070] 从表1中的记录可得，在相同配比下，不同的菌株组合会对实验结果造成较大的影响，当以“长双歧杆菌W68、两歧双歧杆菌Y22、嗜酸乳杆菌K43、干酪乳杆菌K35、罗伊氏乳杆菌K07”这5株菌进行复配时，结果较优。此外，当菌株组合确定时，菌株的比例也会对实验结果造成较大影响，当长双歧杆菌W68：两歧双歧杆菌Y22：嗜酸乳杆菌K43：干酪乳杆菌K35：罗伊氏乳杆菌K07＝10：10：30：20：30时，对肠道病原菌、阴道病原菌的抑制效果最优。 [0071] 二、益生菌产酸实验 [0072] 无菌操作下，将长双歧杆菌W68、两歧双歧杆菌Y22、嗜酸乳杆菌K43、干酪乳杆菌K35、发酵乳杆菌FM‑12、罗伊氏乳杆菌K07分别用生理盐水溶解后，在MRS平板上分离纯化，37℃培养48h以上。从平板上挑取单菌落，接种至50mLMRS液体培养基中，37℃，180r/min震荡培养40～72h，测定pH，以判断乳酸菌产酸能力。结果如表2所示。 [0073] 表2 6株乳酸菌产酸试验结果 [0074] [0075] 女性阴道的pH值正常范围在3.8‑4.4，阴道内环境处于此pH值，阴道中的菌群会处于较好的平衡状态。菌株的产酸能力越好，就能更好地调节阴道处于低pH环境，抑制厌氧菌、条件致病菌等侵入和繁殖，保持阴道微生态平衡。此外，定殖后的菌株产生更多的短链脂肪酸，能修复及强化肠道黏膜屏障，平衡肠道微生态，保持肠道健康；能调节血液中代谢物的含量，有利于减轻乳腺炎症。由表2可得，上述6株益生菌均有产酸能力，其中随着发酵时间的延长，长双歧杆菌W68、两歧双歧杆菌Y22、嗜酸乳杆菌K43、干酪乳杆菌K35、罗伊氏乳杆菌K07产酸能力非常好，pH值均在4.4以下。这进一步说明了本发明筛选出的对肠道病原菌和阴道病原菌均有抑制效果的益生菌组合是合适的菌种组合。 [0076] 三、益生菌对β‑谷甾醇的影响实验 [0077] 3.1、益生菌组合物的制备 [0078] 按长双歧杆菌W68：两歧双歧杆菌Y22：嗜酸乳杆菌K43：干酪乳杆菌K35：罗伊氏乳杆菌K07＝(10‑40)：(10‑50)：(15‑40)：(15‑50)：(15‑40)的范围内，设置了10个益生菌组合，具体详见表3。 [0079] 表3益生菌组合物配方表 [0080] [0081] 3.2、益生菌发酵制品的制备 [0082] 益生菌发酵制品的制备方法，包括以下步骤： [0083] 1、将长双歧杆菌W68菌粉、两歧双歧杆菌Y22菌粉、嗜酸乳杆菌K43菌粉、干酪乳杆菌K35菌粉、罗伊氏乳杆菌K07菌粉分别按表3(组合1‑10)分别进行称样，制成益生菌组合物。 [0084] 2、将5份阿胶、3份黄明胶粉碎，加入黄酒浸泡，炖煮溶解，得基料A； [0085] 3、将8份玉米须、6份姜黄、3份香橼、3份当归、3份肉桂、3份佛手、5份蒲公英、4份桃仁、3份玫瑰花、2份金银花、5份冬瓜皮粉碎，加8‑12倍量水超声，浸泡，得基料B； [0086] 4、将基料B煎煮，第一次过滤得基料C；取第一次过滤的滤渣加入6‑10倍量水煎煮，第二次过滤得基料D；取第二次过滤的滤渣加入4‑6倍量水煎煮，过滤得基料E；将6份红枣、6份桂圆、3份山楂、3份枸杞子加入4‑6倍量的水，炖煮，用100‑150目的滤网过滤得基料F； [0087] 5、将基料C、基料D、基料E、基料F倒入锅中搅拌混匀，再加入2.25份低聚果糖、2份水苏糖、1.25份抗性糊精、3份蜂蜜、0.4份藏红花提取物混合搅拌溶解，得基料G； [0088] 6、灭菌步骤：将基料G以70‑75℃、1h灭菌，冷却至30‑32℃，得基料H； [0089] 7、菌种复活：在无菌操作下，将益生菌组合物(例如组合7)接种到灭菌的10％葡萄糖水溶液中，于21‑26℃下培养16‑19h，得基料I； [0090] 8、发酵步骤：将1/4重量份的基料I和基料H转入发酵罐中，将品温控制在29‑35℃，进行密闭发酵10h，得一级发酵物J；一级发酵物J按照步骤7灭菌后，再补充1/4重量份的基料I、2.25份低聚果糖、2份水苏糖、1.25份抗性糊精，再重复上述发酵操作即得到二级发酵物K；二级发酵物K按照步骤7灭菌后，再补充1/4重量份的基料I、2.25份低聚果糖、2份水苏糖、1.25份抗性糊精，再重复上述发酵操作即得到三级发酵物L；三级发酵物L按照步骤7灭菌后，再补充1/4重量份的基料I、2.25份低聚果糖、2份水苏糖、1.25份抗性糊精，再重复上述发酵操作即得到四级发酵物M； [0091] 9、浓缩步骤：将四级发酵物M加入液体真空浓缩煎药机中，减压0.08Mpa 72℃的条件下运行60分钟，得清膏N； [0092] 11、收膏步骤：将清膏N用文火加热，把基料A加入清膏内，不断用铲搅拌，搅拌至稠膏用细棒挑起夏天挂旗，冬天挂丝为度，相对密度为1.12‑1.20之间，待稠膏冷却后，装入清洗、干燥、消毒后的容器即得液体膏方O； [0093] 12、预冻步骤：将液体膏方O倒入方格模具(3.0cm×3.0cm)，在‑40℃超低温冰箱里预冻处理，冻藏时间为12‑24h，得基料P； [0094] 13、冻干步骤：将基料P放入真空冷冻干燥机中，启动真空冷冻干燥机，干燥温度‑40℃，抽真空至10‑40pa，干燥时间10‑12h，然后放到小型超声波发生器震动网格上，功率 160‑220W，作用时间10‑15s；第二次干燥温度‑20℃～‑40℃，抽真空至10‑40pa，干燥时间 10‑12h。 [0095] 物料冷却后，即得益生菌发酵制品7。其余益生菌组合物(例如组合1‑6、组合8‑10)也按照上述相同方法制备益生菌发酵制品，分别标注为益生菌发酵制品1‑6、8‑10。 [0096] 3.3、β‑谷甾醇含量测定 [0097] 采用β‑谷甾醇含量测定方法对益生菌发酵液的β‑谷甾醇进行含量检测，结果如表4。 [0098] β‑谷甾醇含量测定方法包括： [0099] 1、精密称取18mgβ‑谷甾醇标准样品，用氯仿溶解后定容到10mL(浓度为1.8mg/ml)。分别配制浓度为0mg/mL、0.108mg/mL、0.18mg/mL、0.36mg/mL、0.43mg/mL、0.54mg/mL、0.72mg/mL、0.9mg/mL甾醇标准液，在243nm处测定吸光度，建立标准曲线。 [0100] 2、分别称取益生菌发酵制品1‑10、空白组样品(空白样品的制备，与3.2益生菌发酵制品的制备方法相比，区别在于没有接种益生菌菌株)各1g加入85％乙醇，液固比为42.1(mL/g)，搅拌后分别在48.8℃提取87.1min，得到乙醇提取物质，过滤石油醚萃取后，挥干溶剂，氯仿溶解，得样品测试液，在243nm处测定吸光度。 [0101] 表4益生菌发酵培养液的β‑谷甾醇含量 [0102]组别 β‑谷甾醇含量(％) 空白样品 0.48 发酵制品1 2.36 发酵制品2 1.89 发酵制品3 2.04 发酵制品4 3.91 发酵制品5 2.84 发酵制品6 3.72 发酵制品7 4.10 发酵制品8 1.65 发酵制品9 1.76 发酵制品10 3.85 [0103] β‑谷甾醇是植物甾醇类成分之一，属于四环三萜类化合物，是真核生物细胞膜的主要组成成分，具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、免疫调节等功效。β‑谷甾醇能渗入细胞膜中并改变膜流动性，抑制对雄性激素敏感的人前列腺癌细胞增殖，诱导癌细胞凋亡且提高凋亡速率；通过嗜酸性粒细胞和分泌黏性因子减少氧自由基和炎症。此外，β‑谷甾醇及其糖苷可以增加T‑淋巴细胞增殖，增加自然杀伤细胞对癌细胞的裂解能力，增加Th‑1型淋巴细胞，Th‑2型淋巴细胞被抑制或没有变化。 [0104] 由表4可知，益生菌发酵制品1‑10中的β‑谷甾醇含量均明显高于空白组。本发明实施例提供的益生菌组合物可以提高发酵底物中的β‑谷甾醇含量，进而增加抗炎、抗氧化、免疫调节等功效，有利于肠私处护理和乳腺抗炎。 [0105] 当长双歧杆菌W68：两歧双歧杆菌Y22：嗜酸乳杆菌K43：干酪乳杆菌K35：罗伊氏乳杆菌K07＝(10‑40)：(10‑50)：(15‑40)：(15‑50)：(15‑40)时，此比例范围内的益生菌组合物均可提高发酵底物中的β‑谷甾醇含量。其中，长双歧杆菌W68：两歧双歧杆菌Y22：嗜酸乳杆菌K43：干酪乳杆菌K35：罗伊氏乳杆菌K07＝(10‑40)：(10‑40)：(15‑40)：(15‑40)：(15‑40)的效果更优，最优为长双歧杆菌W68：两歧双歧杆菌Y22：嗜酸乳杆菌K43：干酪乳杆菌K35：罗伊氏乳杆菌K07＝10：10：30：20：30。 [0106] 四、益生菌对TNF‑α和IL‑6的影响实验 [0107] 乳腺炎动物模型实验 [0108] 1、实验动物：ICR雌性哺乳期小鼠140只，购自上海市实验动物质量监督检查站，哺乳3‑7d，体重18‑25g。动物腺饲养温度控制在18‑25℃，相对湿度控制在50％‑60％，通风良好，小鼠自由饮水进食。 [0109] 2、实验菌株：标准金黄色葡萄球菌菌株(编号ATCC25923)，购自中国工业微生物菌种。 [0110] 3、菌悬液制备：金黄色葡萄球菌接种于LB液体培养基，37℃培养12h，将菌液10倍倍比稀释，测定OD值并接种于LB固体平板上，37℃培养箱中培养24h后，采用平板菌落计数法进行细菌计数。对菌液进行稀释，用PBS清洗，根据计数结果，用PBS调整细菌浓度为7 10CFU/mL细菌悬液。 [0111] 4、供试样品制备：将上述“三、益生菌对β‑谷甾醇的影响实验”中获取的空白样品、益生菌发酵制品1‑10加水溶解，配制成浓度为0.43g/mL的原药溶液，4℃冰箱保存，用前水浴加热至37℃。 [0112] 5、动物分组及实验处理：将小鼠随机分为14组，每组动物10只。 [0113] 空白对照组：乳腺注射无菌PBS 50μL，0.1mL/10g蒸馏水灌胃7d； [0114] 模型组：乳腺注射菌悬液50μL，0.1mL/10g蒸馏水灌胃7d； [0115] 阳性药(头孢噻肟)组：乳腺注射菌悬液50μL，0.1mL/10g头孢噻肟钠1次/日； [0116] 空白样品组：乳腺注射菌悬液50μL，0.1mL/10g空白样灌胃7d； [0117] 组合A：乳腺注射菌悬液50μL，0.1mL/10g的益生菌发酵制品1灌胃7d； [0118] 组合B：乳腺注射菌悬液50μL，0.1mL/10g的益生菌发酵制品2灌胃7d； [0119] 组合C：乳腺注射菌悬液50μL，0.1mL/10g的益生菌发酵制品3灌胃7d； [0120] 组合D：乳腺注射菌悬液50μL，0.1mL/10g的益生菌发酵制品4灌胃7d； [0121] 组合E：乳腺注射菌悬液50μL，0.1mL/10g的益生菌发酵制品5灌胃7d； [0122] 组合F：乳腺注射菌悬液50μL，0.1mL/10g的益生菌发酵制品6灌胃7d； [0123] 组合G：乳腺注射菌悬液50μL，0.1mL/10g的益生菌发酵制品7灌胃7d。 [0124] 组合H：乳腺注射菌悬液50μL，0.1mL/10g的益生菌发酵制品8灌胃7d。 [0125] 组合I：乳腺注射菌悬液50μL，0.1mL/10g的益生菌发酵制品9灌胃7d。 [0126] 组合J：乳腺注射菌悬液50μL，0.1mL/10g的益生菌发酵制品10灌胃7d。 [0127] 给药结束后，小鼠禁食12h，摘眼球取血，室温静置1h，然后于4000rpm/min、4℃离心15min分离血清，‑20℃保存备用。取血后处死小鼠，取出小鼠第4对乳腺、胸腺和脾，并用灭菌PBS冲洗。对胸腺、脾进行称重测定，乳腺分为两份，一份放入4％多聚甲醛固定液固定，一份‑80℃冰箱中保存待用。 [0128] 乳腺中TNF‑α、IL‑6的检测：严格按照ELISA试剂盒说明书进行操作，检测小鼠乳腺血清中TNF‑α、IL‑6的含量，结果如表5，具体步骤如下： [0129] 血浆中TNF‑α、IL‑6含量测定釆用ELISA法，用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入样本，再和HRP标记的羊抗鼠抗体结合，形成抗体－抗原－酶标抗体复合物。经过彻底洗涤后加入底物，底物在HRP酶的催化下转化成蓝色，加入酸终止反应，在酸的作用下最终变成黄色，颜色的深浅和样品中的含量呈正比。用酶标仪在450nm 波长下测定其OD值，通过标准曲线方程计算出样品中TNF‑α含量和IL‑6含量，具体操作严格按照试剂盒说明书进行，简述之： [0130] 1.标准品的加样：设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL。 [0131] 2.加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μL，然后再加待测样品10μL(样品最终稀释度为5倍)。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。 [0132] 3.加酶：每孔加入酶标试剂100μL，空白孔除外。 [0133] 4.温育：用封板膜封板后置37℃温育60min。 [0134] 5.配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用。 [0135] 6.洗搽：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30s后弃去，如此重复5次，拍干。 [0136] 7.显色：每孔先加入显色剂A 50μL，再加入显色剂B 50μL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15min。 [0137] 8.终止：每孔加终止液50μL，终止反应(此时蓝色立转黄色)。 [0138] 9.测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。测定应在加终止液后15min以内进行。根据吸光度及标准曲线测定样品中TNF‑α、IL‑6的含量。 [0139] 表5小鼠乳腺血清中TNF‑α、IL‑6的含量(pg/mL) [0140] TNF‑α TNF‑α 空白对照组 408 89 模型组 628 150 阳性对照组 430 102 空白样品组 591 127 组合A 406 99 组合B 432 108 组合C 425 101 组合D 353 69 组合E 395 88 组合F 382 82 组合G 312 60 组合H 447 115 组合I 459 124 组合J 362 72 [0141] 由表5可得，组合G的TNF‑α、IL‑6含量最低，其减轻乳腺炎的炎症效果最好，再结合表4的结果确定最佳的益生菌组合为长双歧杆菌W68：两歧双歧杆菌Y22：嗜酸乳杆菌K43：干酪乳杆菌K35：罗伊氏乳杆菌K07＝10：10：30：20：30。 [0142] 五、人群功效验证 [0143] 招募16名女性志愿者，志愿者均患有乳腺炎症患者、阴道炎症患者等疾病，年龄范围22～60岁。 [0144] 纳入标准：全部志愿者均符合《妇科学》(第8版)中相关诊断标准。患者对此次研究知情同意，签订研究意向书，研究经过医学伦理委员会审核。 [0145] 排除标准：患者存在精神障碍；患者不配合研究；患者存在其他严重性胃肠道疾病；患者存在明显药物过敏史。 [0146] 将志愿者分成2组，每组8人，记为A、B组，安排志愿者分别食用益生菌粉(采用表3的益生菌组合7制成的益生菌粉)以及表4的益生菌发酵制品7，即A组食用益生菌粉，B组食用益生菌发酵制品7，并记录私处炎症治愈时间和乳腺炎症治愈时间，结果如表6(该组志愿者治愈时间的平均值)。肠道舒适评价，结果如表7。 [0147] 益生菌粉的制备： [0148] 1)将长双歧杆菌W68菌粉、两歧双歧杆菌Y22菌粉、嗜酸乳杆菌K43菌粉、干酪乳杆菌K35菌粉、罗伊氏乳杆菌K07菌粉分别按表3(组合7)的比例进行称样，制成益生菌组合物； [0149] 2)称取益生菌组合物10～20份，低聚果糖80～90份，混合均匀后分装成2g/袋，即得益生菌粉。 [0150] 食用方式： [0151] 1)益生菌发酵制品7：将益生菌发酵制品7置于37℃、约150mL的温水中搅匀溶解后服用。饭后半小时服用，每日1‑2次，每次1块。 [0152] 2)益生菌粉：将益生菌粉置于37℃、约150mL的温水中搅匀溶解后服用。饭后半小时服用，每日1‑2次，每次1袋。 [0153] 私处炎症治愈标准：试用期间，志愿者连续3天白带分泌正常，且私处无瘙痒、疼痛、异味、溃疡等不适症状，即表示治愈。 [0154] 乳腺炎症治愈标准：试用期间，志愿者连续3天乳汁分泌正常、乳房组织颜色正常、内外无疼痛感，即表示治愈。 [0155] 肠道舒适度标准：试用期间，志愿者连续3天正常、按时排便，粪便为香蕉便，肠内无胀气、肠鸣、疼痛感等不适症状，判定为有明显改善。 [0156] 表6人群病症治愈时间/d [0157] A组 B组私处炎症 15 11 乳腺炎症 18 12 [0158] 表7肠道舒适度评价 [0159] A组 B组有明显改善有明显改善 [0160] 由表6和表7可得，样品A组和B组均对女性私处炎症和乳腺炎症均有明显改善，此外，对于肠道舒适度也有明显改善。 [0161] 上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。