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格氏乳杆菌B1-26及其应用
申请号	CN202311695608.6	申请日	2023-12-12	公开(公告)号	CN117384804A	公开(公告)日	2024-01-12
申请人	北京三元食品股份有限公司;			发明人	陈历俊; 刘璐; 李先平; 赵军英; 乔为仓;
摘要	本发明提供了一种格氏乳杆菌B1‑26及其应用，涉及微生物技术领域。该格氏乳杆菌（Lactobacillus gasseri）B1‑26保藏编号为CGMCC NO.19749。该菌株来源于人乳，具有预防、缓解和/或治疗便秘的功能，可应用于制备食品、保健品或药品，以促进胃肠蠕动，增加排便量。
权利要求	1.一株格氏乳杆菌（Lactobacillus gasseri）B1‑26，保藏编号为：CGMCC NO. 19749。 2. 菌剂，其特征在于，所述菌剂包含权利要求1所述的格氏乳杆菌（Lactobacillus gasseri）B1‑26。 3. 发酵方法，其特征在于，包括使用包含权利要求1所述的格氏乳杆菌（Lactobacillus gasseri）B1‑26的发酵剂发酵底物；或，使用包含权利要求2所述菌剂的发酵剂发酵底物。 4. 权利要求1所述的格氏乳杆菌（Lactobacillus gasseri）B1‑26，或权利要求2所述的菌剂，或权利要求3所述的发酵方法在制备用于预防、缓解和/或治疗便秘的产品中的应用。 5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述用于预防、缓解和/或治疗便秘的产品包括食品、保健品和药品。 6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述食品包括乳制品。 7.根据权利要求4 6任一项所述的应用，其特征在于，所述用于预防、缓解和/或治疗便~ 秘包括用于促进胃肠蠕动。 8.根据权利要求4 6任一项所述的应用，其特征在于，所述用于预防、缓解和/或治疗便~ 秘包括增加受试者排便量。 9. 用于预防、缓解和/或治疗便秘的产品，其特征在于，所述产品包含权利要求1所述的格氏乳杆菌（Lactobacillus gasseri）B1‑26或权利要求2所述的菌剂；或，采用权利要求 3所述的发酵方法制备得到；或，包含采用权利要求3所述的发酵方法制备得到的发酵产物。 10.根据权利要求9所述的用于预防、缓解和/或治疗便秘的产品，其特征在于，所述产品包括食品、保健品和药品。
说明书全文	格氏乳杆菌B1‑26及其应用技术领域 [0001] 本发明涉及微生物技术领域，尤其是涉及一种格氏乳杆菌B1‑26及其应用。背景技术 [0002] 便秘是指以排便次数减少，同时伴排便困难，粪便硬结为特征的临床疾病，长期的便秘会导致痔疮、肛裂及直肠炎等疾病的发生。便秘是影响儿童健康成长的重要因素之一，婴幼儿便秘严重会导致发育不良，生长发育迟缓和免疫力下降等问题。临床上治疗便秘的药物主要包括刺激性泻药、润滑性泻剂和高渗性泻剂等，缺少适合缓解婴幼儿便秘问题的产品。 [0003] 益生菌定植在人体肠道内，通过发挥其益生特性来调节肠道菌群平衡、促进机体对营养物质吸收、缓解炎症、降低代谢性疾病发病率等多种功能，提高机体免疫力。母乳作为婴儿成长初期必不可少的营养来源，对婴儿的成长发育起着至关重要的作用。母乳中存在益生菌已被大量研究证实。因此，从母乳中发掘更多的益生菌，有助于开发出可用于婴幼儿食品的益生菌，缓解婴幼儿便秘问题。 [0004] 有鉴于此，特提出本发明。发明内容 [0005] 本发明的目的在于提供一株格氏乳杆菌（Lactobacillus gasseri）B1‑26，保藏编号为：CGMCC NO. 19749，该菌株来源于人乳，具有缓解便秘的功能。基于该菌株的特征，本发明的另一目的还在于提供包含其的产品以及应用。 [0006] 为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：第一方面，提供了一株格氏乳杆菌（Lactobacillus gasseri）B1‑26，保藏编号为： CGMCC NO. 19749。 [0007] 第二方面，提供了一种菌剂，该菌剂包含第一方面的格氏乳杆菌（Lactobacillus gasseri）B1‑26。 [0008] 第三方面，提供了一种发酵方法，该发酵方法包括使用包含第一方面的格氏乳杆菌（Lactobacillus gasseri）B1‑26的发酵剂发酵底物；或，使用包含第二方面的菌剂的发酵剂发酵底物。 [0009] 第四方面，提供了第一方面的格氏乳杆菌（Lactobacillus gasseri）B1‑26，或第二方面的菌剂，或第三方面的发酵方法在制备用于预防、缓解和/或治疗便秘的产品中的应用。 [0010] 可选的实施方式中，所述用于预防、缓解和/或治疗便秘的产品包括食品、保健品和药品。 [0011] 可选的实施方式中，所述用于预防、缓解和/或治疗便秘的食品包括乳制品。 [0012] 可选的实施方式中，所述用于预防、缓解和/或治疗便秘包括用于促进胃肠蠕动。 [0013] 可选的实施方式中，所述用于预防、缓解和/或治疗便秘包括增加受试者排便量。 [0014] 第五方面，还提供了一种用于预防、缓解和/或治疗便秘的产品，所述产品包含第一方面的格氏乳杆菌（Lactobacillus gasseri）B1‑26或第二方面的菌剂；或，采用第三方面的发酵方法制备得到；或，包含采用第三方面的发酵方法制备得到的发酵产物。 [0015] 可选的实施方式中，用于预防、缓解和/或治疗便秘的产品包括食品、保健品和药品。 [0016] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明提供的格氏乳杆菌（Lactobacillus gasseri）B1‑26分离自新鲜母乳，实验证实其能够促进胃肠蠕动，增加受试者排便量。本发明发现的格氏乳杆菌B1‑26具有潜在的开发功能性食品、保健品和药品的潜力。格氏乳杆菌B1‑26或包含其的菌剂，或利用其的发酵方法，能够应用于制备食品、保健品或药品，含有格氏乳杆菌B1‑26或包含其的菌剂，或其发酵产物的产品，具有预防、缓解和/或治疗便秘的功能。附图说明 [0017] 为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。 [0018] 图1为格氏乳杆菌B1‑26的测序结果NR数据库注释；图2为格氏乳杆菌B1‑26菌落形态；图3为格氏乳杆菌B1‑26 显微镜检形态；图4为实施例2各实验组小鼠肠道推进率实验结果；图5为实施例2各实验组小鼠粪便粒数统计结果；图6为实施例2各实验组小鼠粪便重量统计结果。具体实施方式 [0019] 下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。 [0020] 根据本发明的一个方面，本发明提供了一株格氏乳杆菌（Lactobacillus gasseri）B1‑26。 [0021] 本发明菌株的保藏日期为2020年04月27日，保藏编号为：CGMCC NO. 19749。分类命名为：格氏乳杆菌（Lactobacillus gasseri），保藏单位名称为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。 [0022] 本文中，格氏乳杆菌（Lactobacillus gasseri）B1‑26，也记载为格氏乳杆菌B1‑26、B1‑26和母乳源格氏乳杆菌B1‑26，上述几种菌株名称可任意互相替换使用。 [0023] 本发明提供的格氏乳杆菌B1‑26分离自人类新鲜母乳，在含有1%CaCO3的MRS固体培养基培养48h后，具有明显透明圈，圆形，表面光滑，边缘整齐，呈白色或乳白色，革兰氏阳性菌；16sRNA如SEQ ID NO.1所示；对格氏乳杆菌B1‑26测序结果进行NR（Non‑Redundant Protein Database）数据库注释，93.61%的基因符合格氏乳杆菌属，结合菌落形态，鉴定为格氏乳杆菌（Lactobacillus gasseri）。并经体外实验证明格氏乳杆菌B1‑26能够促进小鼠肠道蠕动，增加便秘模型小鼠的排便量，具有缓解便秘的作用。 [0024] 第二方面，还提供了一种菌剂，该菌剂包含第一方面的格氏乳杆菌B1‑26。可以理解的是，由于本发明提供的菌剂包含格氏乳杆菌B1‑26，因此该菌剂具有格氏乳杆菌B1‑26的所有性能以及有益效果。所述菌剂优选以格氏乳杆菌B1‑26作为主要的活性成分；可选地，所述菌剂还可以包含一种或多种用于和格氏乳杆菌B1‑26配合使用的微生物，包括但不限于长双歧杆菌、短双歧杆菌、卵形双歧杆菌、嗜热双歧杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、副干酪乳杆菌、嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌、詹氏乳杆菌、拉曼乳杆菌、动物双歧杆菌、乳双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、发酵乳杆菌、瑞士乳杆菌、婴儿双歧杆菌和两歧双歧杆菌中的一种或多种。 [0025] 可选的实施方式中，所述菌剂还可以包括任意的可接受的辅料，所述可接受的辅料指的是不影响菌剂中的活性成分的生理功能，同时对菌剂起辅助作用的成分，包括但不限于pH调节剂、乳化剂、崩解剂、填充剂、溶剂、润湿剂、稳定剂、分散剂和保湿剂中的一种或者多种；可选地，辅料也可以包括用于维持菌剂中菌株活性的营养物质，包括但不限于糖类物质、盐类、酵母提取物和牛肉膏等；可选地，所述辅料还可以包括用于吸附微生物的载体，包括但不限于蒙脱石、高岭土、白碳、海泡石、秸秆粉、淀粉、玉米粉、聚乙烯醇和聚乙二醇和轻质碳酸钙中的一种或者多种。 [0026] 第三方面，还提供了一种发酵方法，该发酵方法包括使用包含第一方面的格氏乳杆菌B1‑26的发酵剂发酵底物；或，使用包含第二方面菌剂的发酵剂发酵底物。 [0027] 可选的实施方式中，所述发酵方法的发酵底物包括乳，所述乳的来源包括但不限于人、牛、羊、马或骆驼等。 [0028] 第四方面，还提供了第一方面的格氏乳杆菌B1‑26，或第二方面的菌剂，或第三方面的发酵方法在制备用于预防、缓解和/或治疗便秘的产品中的应用。示例性的用于预防、缓解和/或治疗便秘的产品包括但不限于食品、保健品和药品。 [0029] 可选的实施方式中，用于预防、缓解和/或治疗便秘包括用于促进胃肠蠕动。经实验证实，格氏乳杆菌B1‑26干预后能促进便秘模型小鼠小肠蠕动。 [0030] 可选的实施方式中，用于预防、缓解和/或治疗便秘包括增加受试者排便量。经实验证实，格氏乳杆菌B1‑26干预后能提高便秘模型小鼠粪便粒数和粪便重量。 [0031] 可选的实施方式中，用于预防、缓解和/或治疗便秘的产品的受试者包括哺乳动物，所述哺乳动物包括但不限于人、猪、牛、马、猴、大鼠、小鼠、豚鼠、羊、绵羊或山羊。所述受试者可以为便秘患者，也可以为经人工造模得到的具有便秘症状的动物模型。 [0032] 第五方面，还提供了一种用于预防、缓解和/或治疗便秘的产品，所述产品包含第一方面的格氏乳杆菌B1‑26或第二方面的菌剂；或，采用第三方面的发酵方法制备得到；或，包含采用第三方面的发酵方法制备得到的发酵产物。示例性的用于预防、缓解和/或治疗便秘的产品包括但不限于食品、保健品和药品。 [0033] 可选的实施方式中，前述第四和第五方面中，格氏乳杆菌B1‑26或包含其的菌剂是用于预防、缓解和/或治疗便秘的产品的主要功能成分，例如是保健品或药品的主要功能成分。 [0034] 可选的实施方式中，前述第四和第五方面中，格氏乳杆菌B1‑26或包含其的菌剂作为发酵剂制备用于预防、缓解和/或治疗便秘的产品，例如作为发酵食品的发酵剂或添加剂。 [0035] 可选的实施方式中，前述第四和第五方面中，第三方面的发酵方法用于制备预防、缓解和/或治疗便秘的产品或其部分原料，例如用于制备发酵食品，或制备食品、保健品或药品中的部分需经发酵的原料。 [0036] 可选的实施方式中，前述第四和第五方面中，所述用于预防、缓解和/或治疗便秘的产品是食品，该食品包含格氏乳杆菌B1‑26或包含其的菌剂；或，该食品由含有上述格氏乳杆菌B1‑26的发酵剂发酵制备得到；或，该食品由含有格氏乳杆菌B1‑26的菌剂的发酵剂发酵得到；或，该食品采用前述发酵方法制备得到；或，包含采用前述发酵方法制备得到的发酵产物。所述食品任选地为非发酵食品或发酵食品，本发明对此不做限制；所述食品包括但不限于发酵乳、奶酪、含益生菌的饮品或风味乳，或以这些食品为部分或全部原料的食品，或这些食品经进一步加工的食品。可以理解的是，所述食品中还可以包含本领域可接受的任选的成分，包括但不限于其他可食用部分、调味剂和食品添加剂等，本发明对此不做限制。 [0037] 可选的实施方式中，前述第四和第五方面中，所述食品包括乳制品。乳制品中乳的来源包括但不限于人、牛、羊、马或骆驼等。 [0038] 可选的实施方式中，前述第四和第五方面中，所述食品、保健品和药品包括适用于婴幼儿的食品、保健品和药品。由于格氏乳杆菌B1‑26来源于母乳，因此优选将格氏乳杆菌B1‑26应用于制备婴幼儿产品。 [0039] 可选的实施方式中，前述第四和第五方面中，所述保健品或药品中还可以包含本领域可接受的任选的成分，包括但不限于保健品或药品领域任选的辅料，例如可以为但不限于为溶剂、崩解剂、填充剂、稳定剂、助悬剂、pH调节剂、增稠剂、稀释剂、空心胶囊、基质和药物载中的一种或多种；还任选的包括但不限于辅助治疗成分、矿物质、微量元素和氨基酸中的一种或多种。 [0040] 下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。 [0041] 实验仪器和试剂信息如下：手术剪、眼科镊、直尺、注射器、天平、活性炭粉、阿拉伯树胶 20200103； MRS固体培养基购自北京陆桥技术股份有限公司，货号为CM188； MRS肉汤培养基购自北京陆桥技术股份有限公司，货号为CM187；盐酸洛哌丁胺：西安杨森制药有限公司，货号LFJ8473。 [0042] 实验动物：选用维通利华昆明种雄性小鼠，体重18‑22g，SPF级雄性昆明小鼠120只。 [0043] 阳性对照副干酪乳菌：保藏编号为GDMCC No.60960，参见CN114032193A（申请号CN202111331927.X，发明名称“一种副干酪乳杆菌207‑27及其应用”的中国专利申请）。 [0044] 阳性对照短双歧杆菌：保藏编号为GDMCC No.60962，参见CN111944727A（申请号CN202010858666.6，发明名称“一种短双歧杆菌207‑1及其应用”的中国专利申请）。 [0045] 实施例1乳源格氏乳杆菌B1‑26的分离、鉴定：选择新鲜母乳样品，用灭过菌的PBS缓冲液（购自广州洁特生物过滤股份有限公司）进行梯度稀释后，涂布于含有1%CaCO3的MRS固体培养基上，于37℃厌氧培养箱中培养 48h，挑取具有明显透明圈的呈白色或乳白色的单菌落进行革兰氏染色并镜检，选择杆状且为革兰氏阳性菌的菌株，从众多菌株中选择长势较好的菌株，于37℃厌氧培养箱中进行富集培养；筛选得到一株格氏乳杆菌；将菌液与灭过菌的30%甘油按照1:1的比例进行混合后于‑80℃的冰箱保存待用。 [0046] 对筛选出来的菌株进行全基因测序分析，采用Pacbio（10Kb SMRT Bell文库）和Illumina PE150（350bp小片段文库）测序平台对其进行全基因组测序。 [0047] 对测序结果进行NR（Non‑Redundant Protein Database）数据库注释（用于物种信息鉴定，可做为物种分类用），结果如图1所示。 [0048] 由图1结果可知，93.61%的基因符合格氏乳杆菌属，因此，结合筛选出菌株的形态特征，将该菌株鉴定为格氏乳杆菌，命名为B1‑26。 [0049] 格氏乳杆菌B1‑26的菌落形态为：在含有1%CaCO3的MRS固体培养基培养48h后，具有明显透明圈，圆形，表面光滑，边缘整齐，呈白色或乳白色，革兰氏阳性菌；16sRNA如SEQ ID NO.1所示；菌落形态如图2所示，显微镜检形态如图3所示。 [0050] 实施例2小鼠便秘实验，实验分组如表1所示：表1 实验分组（1）小肠运动实验： 7天的适应性饲养后，各组小鼠禁食不禁水16小时。 [0051] 模型对照组和三个剂量组灌胃给予盐酸洛哌丁胺（2 4mg /kg BW），空白对照组给~蒸馏水。 [0052] 给盐酸洛哌丁胺后0.5小时后，剂量组分别给予含相应受试样品的墨汁（含5%的活性炭粉、10%阿拉伯树胶），阴性和模型对照组给墨汁灌胃。 [0053] 25分钟后立即脱颈椎处死动物，打开腹腔分离肠系膜，剪取上端自幽门、下端至回盲部的肠管，置于托盘上，轻轻将小肠拉成直线，测量肠管长度为“小肠总长度”，从幽门至墨汁前沿为“墨汁推进长度”。按下式计算墨汁推进率：（2）排便时间、粪便粒数和粪便重量的测定： 7天的适应性饲养后，各组小鼠禁食不禁水16小时。 [0054] 模型对照组和三个剂量组灌胃给予盐酸洛哌丁胺（4 7mg /kg BW），空白对照组给~蒸馏水。 [0055] 给盐酸洛哌丁胺后0.5小时后，阴性和模型对照组给墨汁灌胃，剂量组分别给予含相应受试样品的墨汁（含5%的活性炭粉、10%阿拉伯树胶），动物均单笼饲养，正常饮水进食。 [0056] 从灌墨汁开始，记录每只动物首粒排黑便时间、5或6小时内排黑便粒数及重量。 [0057] 结果如图，由推进率（图4），粪便重量（图5）和粪便颗粒（图6）可知，高剂量组和模型组比较都有统计学差异；说明格氏乳杆菌B1‑26对于治疗便秘是有效的；高剂量组和阳性对照组比没有统计学差异，说明格氏乳杆菌B1‑26和阳性对照功效相当。 [0058] 最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。