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一种乳酸菌真空冷冻干燥的方法

申请号 CN202311399794.9 申请日 2023-10-26 公开(公告)号 CN117431163A 公开(公告)日 2024-01-23
申请人 善恩康生物科技(苏州)有限公司; 发明人 马新; 喻扬; 郁雪平;
摘要 本 发明 属于 微 生物 技术领域,具体涉及一种乳酸菌 真空 冷冻干燥 的方法。所述方法包括以下步骤:将乳酸菌或其培养物接种到培养基培养,以得到 种子 液;将种子液接种到含有抗冻因子的培养基中进行培养,当残糖浓度为4‑6g/L时降温至5‑8℃,低温培养2‑4h后离心收集菌泥;向菌泥中加入冻冻保护剂后进行真空冷冻干燥,得到乳酸菌冻干粉;所述抗冻因子包含番茄汁和 氨 基酸。本发明提供的真空冷冻干燥方法不仅明显提高了乳酸菌冻干粉中的活菌数,还显著延长了保存期限,在改善乳酸菌制品的品质和保存、运输中具有重要的应用价值。
权利要求

1.一种乳酸菌真空冷冻干燥的方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:
(1)将乳酸菌或其培养物接种到培养基培养,以得到种子液;
(2)将种子液接种到含有抗冻因子的培养基中进行培养,当残糖浓度为4‑6g/L时降温至5‑8℃,低温培养2‑4h后离心收集菌泥;
(3)向菌泥中加入冻冻保护剂后进行真空冷冻干燥,得到乳酸菌冻干粉;
所述抗冻因子包含番茄汁和基酸。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述氨基酸为苏氨酸、酪氨酸和脯氨酸。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于,所述抗冻因子至少包含20g/L番茄汁;
优选地,所述抗冻因子包含20‑30g/L番茄汁。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,所述抗冻因子至少包含2g/L苏氨酸,2g/L酪氨酸和2g/L脯氨酸;
优选地,所述抗冻因子包含2‑4g/L苏氨酸,2‑4g/L酪氨酸和2‑4g/L脯氨酸。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,所述冷冻保护剂包含脱脂乳,麦芽糊精和甘露醇。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,所述冷冻保护剂包含80‑100g/L脱脂乳,
20‑30g/L麦芽糊精和10‑12g/L甘露醇。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,所述乳酸菌包括植物乳植杆菌、鼠李糖乳酪杆菌、副干酪乳酪杆菌、发酵乳杆菌、动物双歧杆菌乳亚种、瑞士乳杆菌、格氏乳杆菌、凝结芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌、乳酸乳杆菌、保加利亚乳杆、乳酸链球菌、乳酪链球菌、嗜热乳链球菌、双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、青春双歧杆菌、长双歧杆菌或短双歧杆菌。
8.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,步骤(3)中所述真空冷冻干燥的条件为:
‑30~‑40℃预冻1‑5h后,转移入真空冷冻干燥机中,于温度为‑56~‑60℃,真空度为2‑
8Pa的条件下冻干20‑60h。
9.根据权利要求1‑8中任一所述的方法得到的乳酸菌冻干粉。
10.根据权利要求9所述的乳酸菌冻干粉在制备益生菌产品中的应用,其特征在于,所述益生菌产品包括巴氏杀菌乳、高温杀菌乳、调制乳、灭菌乳、发酵乳、炼乳、奶油、稀奶油、无奶油、特色乳制品、浓缩乳、植物蛋白饮料、复合蛋白饮料、咖啡饮料、植物饮料、味饮料、运动饮料、营养素饮料、能量饮料、电解质饮料、全脂乳粉、脱脂乳粉、部分脱脂乳粉、调制乳粉、乳清粉、干酪、再制干酪、糕、雪泥、棍、食用冰、甜味冰、冰淇淋

说明书全文

一种乳酸菌真空冷冻干燥的方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域,具体涉及一种乳酸菌真空冷冻干燥的方法。

背景技术

[0002] 近年来,随着微生态学研究不断深入和人们保健意识的增强,乳酸菌得到广泛研究和开发,目前已被用于保健食品、医药和食品等行业中。由于其较难长期保存,乳酸菌的贮藏成了难点。
[0003] 冷冻干燥是将被干燥物料中的冻成,然后使冰升华而除去水的一种干燥方法,由于真空冷冻干燥保藏法对细胞损伤小,特别适用于菌种保存,且保护剂使用会进一步减少损伤,因此冷冻干燥成为乳酸菌发酵剂工业化生产的主要方式之一。但微生物细胞在真空冷冻干燥过程中极易造成冷冻伤害,其中主要为干燥伤害及冷冻伤害,主要是在真空冷冻过程中,细胞内的胞液的浓缩或冰晶的成长极易造成细胞伤害,所以采用某些物质作保护剂,使细胞在冷冻干燥过程中损伤减小是十分必要的。不同的保护剂对不同菌种的保护效果是不同的。
[0004] 中国专利申请202211215540.2公开了一种乳酸菌冻干保护剂及其制备方法和应用,所述乳酸菌冻干保护剂包括如下组分:海藻糖5‑15份;低聚糖2‑5份;小分子多元醇1‑5份;甘露糖2‑5份;游离基酸0.1‑1份;乳清粉0.5‑3份。该申请通过海藻糖保护蛋白分子不变性失活,低聚糖促进菌体繁殖,小分子多元醇能够维持蛋白质的三级结构稳定性,甘露糖促进菌群生长,游离氨基酸能够维持菌体pH值相对稳定,防止菌体生物活下降,乳清粉能够用于稳定细胞膜成分,减少细胞损伤。
[0005] 中国专利申请202310278894.X公开了用于凝结芽孢杆菌的冻干保护剂、冻干粉及制备方法,所述冻干保护剂按重量份计包括以下成分:脱脂奶粉13%、低聚果糖9%、麦芽糊精5.5%、葡萄糖16%、谷氨酸1%、亮氨酸1%、磷酸氢二0.8%、磷酸二氢钾1.1%,所述凝结芽孢杆菌冻干粉的制备方法为:先将凝结芽孢杆菌制备成菌泥,再向菌泥中添加冻干保护剂进行冷冻干燥,通过解析干燥即可制得凝结芽孢杆菌冻干粉;该申请通过冻干保护剂和冻干工艺优化协同提高了凝结芽孢杆菌的存活率。
[0006] 目前本领域乳酸菌冷冻干燥工艺的改进更多在于提高菌粉中的活菌数或发酵活力,鲜有涉及提高保存时间,而乳酸菌的保存同样重要。因此,本领域需要可以既提高菌粉中的活菌数,也能延长保存时间的真空冷冻干燥方法。

发明内容

[0007] 为了克服现有技术缺陷,本发明提出了以下技术方案:
[0008] 在一个方面,本发明提供了一种乳酸菌真空冷冻干燥的方法,所述方法包括以下步骤:
[0009] (1)将乳酸菌或其培养物接种到培养基培养,以得到种子液;
[0010] (2)将种子液接种到含有抗冻因子的培养基中进行培养,当残糖浓度为4‑6g/L时降温至5‑8℃,低温培养2‑4h后离心收集菌泥;
[0011] (3)向菌泥中加入冻冻保护剂后进行真空冷冻干燥,得到乳酸菌冻干粉;
[0012] 所述抗冻因子包含番茄汁和氨基酸。
[0013] 在一些实施方式中,所述氨基酸为苏氨酸、酪氨酸和脯氨酸。
[0014] 在一些实施方式中,所述抗冻因子至少包含20g/L番茄汁。
[0015] 在一些实施方式中,所述抗冻因子至少包含2g/L苏氨酸,2g/L酪氨酸和2g/L脯氨酸。
[0016] 在一些实施方式中,所述抗冻因子包含20‑30g/L番茄汁。
[0017] 在一些实施方式中,所述抗冻因子包含2‑4g/L苏氨酸,2‑4g/L酪氨酸和2‑4g/L脯氨酸。
[0018] 在一些优选的实施方式中,所述抗冻因子包含20‑30g/L番茄汁,2‑4g/L苏氨酸,2‑4g/L酪氨酸和2‑4g/L脯氨酸。
[0019] 在一些实施方式中,所述冷冻保护剂还包含脱脂乳,麦芽糊精,甘露醇。
[0020] 在一些优选的实施方式中,所述冷冻保护剂包含80‑100g/L脱脂乳,20‑30g/L麦芽糊精,10‑12g/L甘露醇。
[0021] 在一些实施方式中,所述乳酸菌包括,但不限于植物乳植杆菌、鼠李糖乳酪杆菌、副干酪乳酪杆菌、发酵乳杆菌、动物双歧杆菌乳亚种、瑞士乳杆菌、格氏乳杆菌、凝结芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌、乳酸乳杆菌、保加利亚乳杆、乳酸链球菌、乳酪链球菌、嗜热乳链球菌、双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、青春双歧杆菌、长双歧杆菌或短双歧杆菌。
[0022] 在一些实施方式中,步骤(3)中所述真空冷冻干燥的条件为:
[0023] ‑30~‑40℃预冻1‑5h后,转移入真空冷冻干燥机中,于温度为‑56~‑60℃,真空度为2‑8Pa的条件下冻干20‑60h。
[0024] 在另一方面,本发明提供了前述任一方法所得的乳酸菌冻干粉。
[0025] 在又一方面,本发明提供了前述任一乳酸菌冻干粉在制备益生菌产品中的应用。
[0026] 在一些实施方式中,所述益生菌产品包括,但不限于巴氏杀菌乳、高温杀菌乳、调制乳、灭菌乳、发酵乳、炼乳、奶油、稀奶油、无水奶油、特色乳制品、浓缩乳、植物蛋白饮料、复合蛋白饮料、咖啡饮料、植物饮料、味饮料、运动饮料、营养素饮料、能量饮料、电解质饮料、全脂乳粉、脱脂乳粉、部分脱脂乳粉、调制乳粉、乳清粉、干酪、再制干酪、糕、雪泥、冰棍、食用冰、甜味冰、冰淇淋等。
[0027] 本发明首次发现添加抗冻因子后培养过程中进行5‑8℃低温发酵显著提高了乳酸菌的冻干存活率以及保存稳定性,其中冻干存活率最高可达95.0%,室温保存6个月后存活率高达96%。可见,本发明提供的真空冷冻干燥方法不仅明显提高了乳酸菌冻干粉中的活菌数,还显著延长了保存期限,在改善乳酸菌制品的品质和保存、运输中具有重要的应用价值。

具体实施方式

[0028] 除非另有定义,否则本发明使用的所有技术术语和科技术语都具有如在本发明所属领域中通常使用的相同含义。出于解释本说明书的目的,将应用以下定义,并且在适当时,以单数形式使用的术语也将包括复数形式,反之亦然。
[0029] 除非上下文另有明确说明,否则本文所用的表述“一种”和“一个”包括复数指代。例如,提及“一个细胞”包括多个这样的细胞及本领域技术人员可知晓的等同物等等。
[0030] 本文所用的术语“约”表示其后的数值的±20%的范围。在一些实施方式中,术语“约”表示其后的数值的±10%的范围。在一些实施方式中,术语“约”表示其后的数值的±5%的范围。
[0031] 本文所使用的数值范围应被理解为已经列举了对该范围内的所有数字。例如,1至20的范围应当理解为包括来自下组的任何数字、数字组合或子范围:1、2、3、4、5、6、7、8、9、
10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。
[0032] 本文所用的术语“包括(comprises)”或“包含(comprising)”是指“包括但不限于”。该术语旨在是开放式的,以指定任何所述特征、要素、整数、步骤或组件的存在,但不排除一个或多个其他特征、要素,整数、步骤、组件或其组的存在或添加。因此,术语“包含”包括更具限制性的术语“由……组成”和“基本上由……组成”。在一个实施方式中,在整个申请中特别是在权利要求书中使用的术语“包含”可以被术语“由……组成”代替。
[0033] 本文所用的术语“任选”、“任一”、“任意”或“任一项”意味着随后所描述地事件或环境可以但不必发生,该说明包括该事件或环境发生或不发生地场合。本发明所用,“一个”和“一种”在本发明中用来指的一个或多于一个的语法对象。
[0034] 本文所用的术语“和/或”应理解为意指可选项中的任一项或可选项中的任意两项或更多项的组合。
[0035] 本发明涉及的材料和菌株:
[0036] MRS培养基:胰蛋白胨15.0g,肉膏8.0g,酵母膏3.0g,柠檬酸钠2.0g,葡萄糖20.0g,KH2PO4 2.0g,乙酸钠5g,吐温‑80 1.0mL,七水硫酸镁0.40g,硫酸锰0.20g。加入蒸馏水定容至1000mL。
[0037] 植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)CQPC02,保藏编号为CGMCC No.14491,保藏时间为2017年8月4日,保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。该菌株公开于CN116042490A。
[0038] 鼠李糖乳酪杆菌(Lacticaseibacillus rhamnosus),保藏编号为CGMCC No.26437,保藏时间为2023年01月09日,保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。该菌株公开于CN116676240A。
[0039] 副干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)3Q225,保藏编号为CGMCC No.26439,保藏时间为2023年01月09日,保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。该菌株公开于CN116590204A。
[0040] 发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)CQPC04,保藏编号为CGMCC No.14493,保藏时间为2017年08月04日,保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。该菌株公开于CN109481476A。
[0041] ·菌体生物量的计数方法:
[0042] 发酵液计数,取发酵液进行稀释;
[0043] 冻干菌粉计数,取3g菌粉溶解到27g无菌生理盐水中。取0.5mL上述菌液稀释到4.5mL的无菌生理盐水中,以10倍为梯度依次稀释,选取3个适当的稀释梯度,吸取0.1mL稀释液注入无菌培养皿中,注入20mL左右的计数培养基混匀,等培养基凝固,再注入10mL计数‑5 ‑6 ‑7
培养基进行覆盖。37℃±1℃厌培养48h计数菌落数目。发酵液分别取10 ,10 和10 CFU/‑7 ‑8 ‑9
mL梯度的稀释液进行平板计数。冻干菌粉分别取10 ,10 和10 CFU/mL梯度的稀释液进行平板计数。取菌落数在30‑300个范围内的平板进行计数。
[0044] ·冻干存活率的计算:
[0045] 向菌粉中加入与冻干前等体积的生理盐水进行复水,采用稀释涂布平板法计算活菌数,除以冻干前的活菌数,计算其冻干存活率:
[0046] 冻干后的活菌数/冻干前的活菌数×100%。
[0047] ·保存稳定性中菌粉活菌存活率的测定:
[0048] 存活率=保存6个月后的菌粉活菌数/冻干后的菌粉活菌数×100%。
[0049] 为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合实施例,对本发明进行进一步的详细说明。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所有试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购的常规产品。为了更好地说明本发明,在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明,并不用于构成对本发明的任何限制。此外,在以下说明中,省略了对公知结构和技术的描述,以避免不必要地混淆本发明的概念。这样的结构和技术在许多出版物,例如《分子克隆实验指南(第四版)》(冷泉港实验室科学出版社)、Ausubel,F.M等人,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Assoc.和Wiley‑lnterscience的出版中也进行了描述。
[0050] 实施例1植物乳植杆菌CQPC02冻干菌粉的制备
[0051] 将从‑80℃取出预先冻存的植物乳植杆菌CQPC02,用接种环挑取少量菌液于MRS固体培养基中划线,将平板置于37℃恒温培养箱中培养24h,挑取单菌落,接种于5mL MRS液体培养基中,在恒温37℃培养箱中静置厌氧活化培养20h,按照5%(v/v)接种量将活化后的植物乳植物杆菌的菌液接种于摇瓶中,在恒温37℃摇床中扩大培养10h,用于发酵罐培养的种子液。
[0052] 将种子液以5%的接种量分别接种到装有15L的液体MRS培养基(包含抗冻因子)的发酵罐中,培养基初始pH为6.5。发酵温度恒温37℃,搅拌转速80rpm,通过NaOH保持发酵液恒定pH。恒温37℃培养至残糖浓度为4‑6g/L时,同时开通冷水降低发酵罐的温度至5℃,低温发酵培养2‑4h。其中抗冻因子的组分:20g/L番茄汁,2g/L苏氨酸,2g/L酪氨酸,2g/L脯氨酸。
[0053] 低温发酵结束后,将植物乳植杆菌发酵液在4000rpm条件下离心,收集菌体沉淀,得到菌泥。使用PBS缓冲液洗涤菌泥后,再次4000rpm离心收集菌泥。向菌泥中加入冻干保护剂溶液(菌泥:冻干保护剂=1:2(w/v)),转移至容器中进行冷冻干燥。
[0054] 冻干保护剂的组分:100g/L脱脂乳,30g/L麦芽糊精,10g/L甘露醇。使用无菌水定容至100mL。
[0055] 冷冻干燥参数:‑30~‑40℃的冰箱中预冻1‑5h后,转移入真空冷冻干燥机中,于温度为‑56~‑60℃,真空度为2‑8Pa的条件下冻干20‑60h。
[0056] 实施例2鼠李糖乳酪杆菌冻干菌粉的制备
[0057] 本实施例采用的鼠李糖乳酪杆菌(Lacticaseibacillus rhamnosus)的保藏编号为CGMCCNo.26437。
[0058] 本实施例与实施例1的区别在于,恒温37℃培养至残糖浓度为4‑6g/L时,同时开通冷水降低发酵罐的温度至6℃;其中抗冻因子的组分:30g/L番茄汁,4g/L苏氨酸,4g/L酪氨酸,4g/L脯氨酸;冻干保护剂的组分:80g/L脱脂乳,20g/L麦芽糊精,12g/L甘露醇。使用无菌水定容至100mL。
[0059] 实施例3副干酪乳酪杆菌3Q225冻干菌粉的制备
[0060] 本实施例与实施例1的区别在于,恒温37℃培养至残糖浓度为4‑6g/L时,同时开通冷水降低发酵罐的温度至7℃。
[0061] 实施例4发酵乳杆菌冻干菌粉的制备
[0062] 本实施例采用的发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)的保藏编号为CGMCC No.14493。
[0063] 本实施例与实施例1的区别在于,恒温37℃培养至残糖浓度为4‑6g/L时,同时开通冷水降低发酵罐的温度至8℃。
[0064] 对比例1
[0065] 本对比例作为对照组,与实施例1的区别在于,不添加抗冻因子,不进行降温,不添加抗冻保护剂,其他工艺不变。
[0066] 对比例2
[0067] 本对比例与实施例1的区别在于,恒温37℃培养至残糖浓度为4‑6g/L时不进行降温,其他工艺不变。
[0068] 对比例3
[0069] 本对比例与实施例1的区别在于,不添加抗冻因子,其他工艺不变,其他工艺不变。
[0070] 对比例4
[0071] 本对比例与实施例1的区别在于,恒温37℃培养至残糖浓度为4‑6g/L时,降温至10℃,其他工艺不变。
[0072] 对比例5
[0073] 本对比例与实施例1的区别在于,恒温37℃培养至残糖浓度为4‑6g/L时,降温至20℃,其他工艺不变。
[0074] 对比例6
[0075] 本对比例与实施例1的区别在于,抗冻因子中不添加番茄汁,其他工艺不变。
[0076] 对比例7
[0077] 本对比例与实施例1的区别在于,抗冻因子中将番茄汁替换为玉米汁,其他工艺不变。
[0078] 对比例8
[0079] 本对比例与实施例1的区别在于,抗冻因子中不添加苏氨酸,酪氨酸,脯氨酸,其他工艺不变。
[0080] 对比例9
[0081] 本对比例与实施例1的区别在于,抗冻因子中将苏氨酸、酪氨酸和脯氨酸,替换为天冬氨酸、甲硫氨酸和甘氨酸,其他工艺不变。
[0082] 冻干存活率结果如表1所示。
[0083] 表1各组乳酸菌冻干前的活菌数及冻干存活率
[0084]
[0085] 从表1的结果看,与对照组相比,本发明提供的乳酸菌真空冷冻干燥方法显著提高了冻干保护率。在与调整工艺组比较中发现,发酵培养中降低温度至5℃与不降温相比,冻干存活率提高了39.8%;发酵培养中降低温度至5℃与降低温度至20℃相比,冻干存活率提高了约28.2%;培养基中添加抗冻因子与不添加相比,冻干存活率提高了56.7%。
[0086] 将实施例1‑4、对比例1‑9制备的菌粉在无菌干燥的环境中,将每0.2‑0.3g菌粉密封真空封装于箔袋中,在室温25℃中分别放置6个月后检测活菌数。贮藏效果检测结果如表2。
[0087] 表2冻干乳酸菌菌粉的保存稳定性
[0088]
[0089]
[0090] 从表2的结果看,与对照组相比,本发明提供的乳酸菌真空冷冻干燥方法显著提高了乳酸菌菌粉的储存稳定性。在与调整工艺组比较中发现,发酵培养中降低温度至5℃与不降温相比,在保存6个月后冻干存活率提高了33.9%;培养基中添加抗冻因子与不添加相比,冻干存活率提高了58.1%。
[0091] 本发明出乎意料地发现在乳酸菌发酵培养过程中进行5‑8℃低温发酵可一定程度改善乳酸菌的冻干存活率和保存稳定性,但由于培养温度较低,对乳酸菌的生长造成了影响(对比例3),导致冻干存活率和保存稳定性略低于培养过程中进行10‑20℃低温发酵(对比例4和5)。因此,发明人经过大量的筛选,选择在发酵培养基中添加抗冻因子以改善乳酸菌抗冻性能,结果显示添加番茄汁和苏氨酸,酪氨酸,脯氨酸可以显著增强乳酸菌抗冻性能,使其平稳度过低温发酵阶段。在发酵培养基中添加抗冻因子后,乳酸菌的冻干存活率提高了56.7%,保存稳定性也得到改善,保存6个月后的存活率提高了58.1%。与培养过程中进行10‑20℃低温发酵相比,在添加抗冻因子后培养过程中进行5‑8℃低温发酵显著提高了乳酸菌的冻干存活率以及保存稳定性。
[0092] 最后应当说明的是,以上内容仅用以说明本发明的技术方案,而非对本发明保护范围的限制,本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换,均不脱离本发明技术方案的实质和范围。