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可缓解溃疡性结肠炎的黏膜粘液乳杆菌及其胞外多糖的应用
申请号 CN202311333945.0 申请日 2023-10-16 公开(公告)号 CN117467720A 公开(公告)日 2024-01-30
申请人 江南大学; 发明人 杨波; 李慧臻; 陈海琴; 刘小鸣; 李海涛; 陈卫; 赵建新; 张灏;
摘要 本 发明 公开了可缓解溃疡性结肠炎的黏膜粘液乳杆菌及其胞外多糖的应用，属于 生物 技术领域。本发明提供了黏膜粘液乳杆菌(Limosilactobacillus mucosae)CCFM1273及其产生的胞外多糖在 预防 / 治疗 溃疡性结肠炎方面的新用途，能够降低体重减少和 疾病 活动指数，减少结肠缩短，改善结肠病理损伤，改善结肠屏障，抑制结肠 炎症 ，以及缓解结肠 氧 化应激，从而缓解溃疡性结肠炎。本发明的黏膜粘液乳杆菌CCFM1273及其产生的胞外多糖可用于制备食品、药物或保健品，具有广阔的市场前景。
权利要求

1.一种黏膜粘液乳杆菌来源的胞外多糖，其特征在于，所述黏膜粘液乳杆菌为黏膜粘液乳杆菌(Limosilactobacillus mucosae)CCFM1273，保藏编号为GDMCC No：62775。
2.含有权利要求1所述黏膜粘液乳杆菌和/或其胞外多糖的组合物。
3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述组合物为食品、药物或保健品。
4.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述组合物是黏膜粘液乳杆菌CCFM1273的细胞培养物。
5.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述黏膜粘液乳杆菌CCFM1273的活菌数
9 9
不低于5×10CFU/g或5×10CFU/mL。
6.根据权利要求3～5任一所述的组合物，其特征在于，所述药物含有所述黏膜粘液乳杆菌和/或其胞外多糖，以及药物载体和/或药用辅料。
7.一种制备权利要求1所述胞外多糖的方法，其特征在于，所述方法包括：培养所述黏膜粘液乳杆菌CCFM1273，得到发酵液，然后分离发酵液中的胞外多糖。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述胞外多糖还经过分离纯化。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述方法还对处理后的胞外多糖进行冷冻干燥。
10.黏膜粘液乳杆菌CCFM1273和/或其胞外多糖在预防和/或治疗结肠炎中的应用。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述结肠炎是溃疡性结肠炎。
12.根据权利要求10或11所述的应用，其特征在于，所述应用包括但不限于如下至少一种作用：
(1)降低结肠炎个体的体重减少和DAI，缓解结肠缩短；
(2)减轻结肠组织病理损伤，修复结肠黏液层，提高结肠中黏蛋白2的含量和杯状细胞的数量，减少结肠上皮细胞凋亡；
(3)提高结肠紧密连接蛋白ZO‑1、Occludin和Claudin‑1的蛋白含量；
(4)减少结肠组织中肿瘤坏死因子‑α和白介素‑6的蛋白含量，提高结肠组织中白介素‑
10和白介素‑22的蛋白含量；
(5)降低结肠组织中髓过氧化物酶含量；
(6)提高结肠组织中总超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶的活性以及总抗氧化能力，减少结肠组织中丙二醛含量。
13.权利要求1所述的胞外多糖在制备发酵乳中的应用。
14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述应用是将所述黏膜粘液乳杆菌CCFM1273产的胞外多糖加入至生牛乳中，再进行发酵。
说明书全文

可缓解溃疡性结肠炎的黏膜粘液乳杆菌及其胞外多糖的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及可缓解溃疡性结肠炎的黏膜粘液乳杆菌及其胞外多糖的应用，属于生物技术领域。

背景技术

[0002] 炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)是一种慢性肠道疾病，通常分为两种亚型：溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)和克罗恩病(crohn’s disease，CD)。尽管IBD一度被认为主要是西方国家的疾病，但它在非西方国家的发病率正在迅速增加，如东南亚、南美洲、东欧和非洲。
[0003] UC是发生于结肠和直肠的慢性炎症，具体表现为浅表黏膜炎症以连续的方式向结肠近端延伸，可导致溃疡和出血等。虽然UC确切的发病机理仍不清楚，但是，近年来的研究表明，UC主要由环境、遗传和微生物的复杂相互作用和免疫反应失调导致。UC的发病高峰期为15‑45岁，其典型的临床表现为体重减轻、便血和腹泻，有时伴有腹痛。大约20％的UC患者在病程中至少经历一次严重急性发作，通常需要住院治疗；此外，UC可能引发许多并发症，包括结肠穿孔，脱水，皮肤、眼睛或关节部分发生炎症和骨质疏松症等，这大大降低了患者的生活质量。UC还可能增加血栓风险以及患结肠癌的风险。
[0004] 目前，UC常用的治疗药物有5‑氨基水杨酸、糖皮质激素、免疫抑制剂和生物制剂，但是，这些药物通常会产生强烈的副作用，而且，生物制剂的有效性较低，并容易产生耐药性。因此，尽管有多种可用的治疗选择，但在疗效和安全性方面仍未满足需求，急需开发安全有效地缓解UC的产品。随着科技的发展，人们希望使用功能性食品或者膳食补充剂等非药物来缓解UC，因此，益生菌进入人们的视野。
[0005] 2001年，联合国粮农组织和世界卫生组织指出，益生菌是活的微生物，当给予足够的数量时，能够给宿主带来健康益处。乳杆菌是最常见的益生菌之一，在各类食品中的使用历史悠久。近年来，大量的研究表明，乳杆菌具有多种益生功能，包括缓解糖尿病、抗氧化、降血脂和免疫调节等。乳杆菌能够发挥众多的益生功能，很大程度上是因为其产生的代谢产物，其中，胞外多糖就是重要的、具有生物活性的代谢产物之一。因此，乳杆菌及其产生的胞外多糖的益生功能受到广泛关注。综上，开发用于缓解UC的乳杆菌及胞外多糖具有重要意义。

发明内容

[0006] 本发明提供了一株黏膜粘液乳杆菌以及其来源的胞外多糖；所述黏膜粘液乳杆菌为黏膜粘液乳杆菌(Limosilactobacillus mucosae)CCFM1273，所述黏膜粘液乳杆菌(Limosilactobacillus mucosae)CCFM1273保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：62775，保藏日期为2022年9月8日，已公开于公开号为CN115449496A的专利申请文件中。
[0007] 在一种实施方式中，所述胞外多糖浓度为10mg/mL时粘度(25℃，100r/min)为2.28±0.29cP，pH(25℃)为3.60±0.02。
[0008] 本发明还提供了含有所述黏膜粘液乳杆菌和/或其胞外多糖的组合物。
[0009] 在一种实施方式中，所述组合物包括但不限于食品、药物或保健品。
[0010] 在一种实施方式中，所述组合物是黏膜粘液乳杆菌CCFM1273的细胞培养物。
[0011] 在一种实施方式中，所述细胞培养物含有黏膜粘液乳杆菌CCFM1273细胞和黏膜粘液乳杆菌CCFM1273代谢产生的胞外多糖。
[0012] 在一种实施方式中，所述黏膜粘液乳杆菌CCFM1273的活菌数不低于5×109CFU/g。
[0013] 在一种实施方式中，所述组合物的形态包括菌液或冻干粉。
[0014] 在一种实施方式中，所述冻干粉制作方法为：将黏膜粘液乳杆菌CCFM1273在MRS固体培养基上培养48‑72h，挑取单菌落进入MRS液体培养基中于37℃下培养24h，随后再传代培养两次，每次于37℃下培养24h，将发酵液离心得到菌泥，将菌泥用无菌生理盐水洗涤三遍后，再向菌泥中添加冻干保护剂后重悬菌泥，并真空冷冻干燥制得。
[0015] 在一种实施方式中，所述离心是在6000‑8000r离心10‑15min。
[0016] 在一种实施方式中，所述冻干保护剂的成分包括120‑140g/L脱脂乳粉、10‑30g海藻糖、10‑30g蔗糖。
[0017] 在一种实施方式中，所述冻干保护剂的添加量为菌泥重量的2‑4倍。
[0018] 在一种实施方式中，所述药物含有所述黏膜粘液乳杆菌和/或其胞外多糖，以及药物载体和/或药用辅料。
[0019] 在一种实施方式中，所述药物的剂型包括但不限于片剂、胶囊、锭剂或液体形式。
[0020] 在一种实施方式中，所述药物载体为通常用于制备药物制剂，包括但不限于：乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、海藻酸盐、明胶、钙、硅酸盐、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁或矿物油。
[0021] 在一种实施方式中，所述药用辅料包括但不限于润滑剂、润湿剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、悬浮剂或防腐剂。
[0022] 本发明提供了所述胞外多糖的制备方法，所述制备方法包括：培养所述黏膜粘液乳杆菌CCFM1273，得到发酵液，然后分离发酵液中的胞外多糖。
[0023] 在一种实施方式中，所述方法是将黏膜粘液乳杆菌CCFM1273在MRS固体培养基上培养48‑72h，挑取单菌落进入MRS液体培养基中，于37℃条件下培养24h后，再传代培养2次，培养时间分别为24h和36h，之后将发酵液沸水浴10min，冷却至室温后，离心弃去菌体，得到发酵上清液。
[0024] 在一种实施方式中，所述传代培养的接种量均为2％(v/v)。
[0025] 在一种实施方式中，所述胞外多糖还经过分离纯化。
[0026] 在一种实施方式中，所述分离纯化的方法包括：将发酵上清液通过三氯乙酸除蛋白，乙醇沉淀多糖，离心收集多糖，复溶多糖后透析除杂处理。
[0027] 在一种实施方式中，所述方法还对处理后的多糖进行冷冻干燥。
[0028] 在一种实施方式中，所述三氯乙酸除蛋白，具体为：向发酵上清液中加入80％(w/v)的三氯乙酸至终浓度为4％(w/v)，搅拌均匀后于4℃下静置过夜，随后离心除去蛋白。
[0029] 在一种实施方式中，所述乙醇沉淀多糖，具体为：将发酵上清液于旋转蒸发仪中浓缩至原体积的1/3‑1/5，之后加入3倍体积的预冷无水乙醇，搅拌均匀后于4℃静置24h，离心收集沉淀。
[0030] 在一种实施方式中，所述胞外多糖提取过程中的离心条件为9000g、30min和4℃。
[0031] 在一种实施方式中，所述复溶多糖后透析除杂，具体为：用适当的去离子水溶解沉淀，在4℃下于透析袋(14000Da)中透析72h，每6‑8h换一次水。
[0032] 本发明还提供了所述黏膜粘液乳杆菌CCFM1273和/或其胞外多糖在预防和/或治疗结肠炎中的应用。
[0033] 在一种实施方式中，所述结肠炎是溃疡性结肠炎。
[0034] 在一种实施方式中，所述应用包括但不限于如下至少一种作用：
[0035] (1)降低结肠炎个体的体重减少和DAI，缓解结肠缩短；
[0036] (2)减轻结肠组织病理损伤，修复结肠黏液层，提高结肠中黏蛋白2(mucin 2，MUC2)的含量和杯状细胞的数量，减少结肠上皮细胞凋亡；
[0037] (3)提高结肠紧密连接蛋白ZO‑1、Occludin和Claudin‑1的蛋白含量；
[0038] (4)减少结肠组织中肿瘤坏死因子‑α(tumor necrosis factor‑α，TNF‑α)和白介素‑6(interleukin‑6，IL‑6)的蛋白含量，提高结肠组织中白介素‑10(interleukin‑10，IL‑10)和白介素‑22(interleukin‑22，IL‑22)的蛋白含量；
[0039] (5)降低结肠组织中髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)含量；
[0040] (6)提高结肠组织中总超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase，T‑SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH‑Px)的活性以及总抗氧化能力(total antioxidant capacity，T‑AOC)，减少结肠组织中丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量。
[0041] 本发明还提供了所述胞外多糖在制备发酵乳中的应用。
[0042] 在一种实施方式中，所述应用是将所述黏膜粘液乳杆菌CCFM1273产的胞外多糖加入至生牛乳中，再进行发酵。
[0043] 在一种实施方式中，所述发酵是接种商业发酵剂后于42℃恒温发酵4‑6h。
[0044] 有益效果：
[0045] 1、本发明所提供的黏膜粘液乳杆菌(Limosilactobacillus mucosae)CCFM1273分离自牛的粪便，该菌株及其胞外多糖，相对于治疗溃疡性结肠炎的传统药物具有一定的优势，并且该菌株及其胞外多糖可添加到食品、药品和保健品等，具有广阔的市场前景。
[0046] 2、本发明提供了黏膜粘液乳杆菌CCFM1273在预防/治疗结肠炎中的新用途，能够显著降低葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium，DSS)诱导的结肠炎小鼠的体重减少和DAI，且显著减少了结肠缩短。
[0047] 3、本发明提供了黏膜粘液乳杆菌CCFM1273来源的胞外多糖在预防/治疗结肠炎中的新用途，具体包括：
[0048] (1)可使葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium，DSS)诱导的结肠炎小鼠的结肠组织病理损伤显著减轻；
[0049] (2)能够显著降低DSS诱导的结肠炎小鼠的体重减少，且显著减少了结肠缩短；
[0050] (3)能够显著减轻DSS诱导的结肠炎小鼠的结肠组织病理损伤，使其结肠黏液层得到显著修复，结肠中MUC2的含量和杯状细胞的数量显著增加，结肠上皮细胞凋亡也显著减少；
[0051] (4)使DSS诱导的结肠炎小鼠结肠紧密连接蛋白ZO‑1、Occludin和Claudin‑1的蛋白含量显著升高；
[0052] (5)使DSS诱导的结肠炎小鼠结肠组织中TNF‑α和IL‑6的蛋白含量显著下降，IL‑10和IL‑22的蛋白含量显著上升，MPO的含量显著降低；
[0053] (6)使DSS诱导的结肠炎小鼠结肠组织中T‑SOD和GSH‑Px的活性显著升高，T‑AOC也显著提升，MDA的含量显著减少。附图说明
[0054] 图1：不同组别小鼠DSS造模期间的体重变化(黏膜粘液乳杆菌CCFM1273干预)。
[0055] 图2：不同组别小鼠的DAI(黏膜粘液乳杆菌CCFM1273干预)。
[0056] 图3：不同组别小鼠结肠长度(黏膜粘液乳杆菌CCFM1273干预)。
[0057] 图4：不同组别小鼠结肠组织HE染色图(黏膜粘液乳杆菌CCFM1273干预)。
[0058] 图5：不同组别小鼠结肠组织病理评分(黏膜粘液乳杆菌CCFM1273干预)。
[0059] 图6：黏膜粘液乳杆菌(Limosilactobacillus mucosae)CCFM1273胞外多糖照片。
[0060] 图7：不同组别小鼠DSS造模期间的体重变化(胞外多糖干预)。
[0061] 图8：不同组别小鼠的DAI(胞外多糖干预)。
[0062] 图9：不同组别小鼠结肠长度(胞外多糖干预)。
[0063] 图10：不同组别小鼠结肠形态(胞外多糖干预)。
[0064] 图11：不同组别小鼠结肠组织HE染色图(胞外多糖干预)。
[0065] 图12：不同组别小鼠结肠组织病理评分(胞外多糖干预)。
[0066] 图13：不同组别小鼠结肠组织阿利新蓝(AB)染色图。
[0067] 图14：不同组别小鼠结肠组织中MUC2的免疫荧光染色图。
[0068] 图15：不同组别小鼠结肠组织中MUC2的蛋白表达量。
[0069] 图16：不同组别小鼠结肠组织过碘酸雪夫(PAS)染色图。
[0070] 图17：不同组别小鼠结肠组织中杯状细胞的数量。
[0071] 图18：不同组别小鼠结肠组织的TUNEL染色图。
[0072] 图19：不同组别小鼠结肠组织紧密连接蛋白的免疫荧光染色图。
[0073] 图20：不同组别小鼠结肠组织中TNF‑α的蛋白表达量。
[0074] 图21：不同组别小鼠结肠组织中IL‑6的蛋白表达量。
[0075] 图22：不同组别小鼠结肠组织中IL‑10的蛋白表达量。
[0076] 图23：不同组别小鼠结肠组织中IL‑22的蛋白表达量。
[0077] 图24：不同组别小鼠结肠组织中MPO的蛋白表达量。
[0078] 图25：不同组别小鼠结肠组织中T‑SOD的活性。
[0079] 图26：不同组别小鼠结肠组织中GSH‑Px的活性。
[0080] 图27：不同组别小鼠结肠组织中的T‑AOC。
[0081] 图28：不同组别小鼠结肠组织中MDA的蛋白表达量。
[0082] 图1‑28中，“*”表示与DSS组具有显著性差异，“**”表示与DSS组具有极显著性差异。

具体实施方式

[0083] 技术术语：
[0084] 本发明涉及的“培养物”是指一定时间、一定空间内微生物的细胞群或生长物，特别是指经人工接种和培养后，生长有微生物(如本发明所述黏膜粘液乳杆菌CCFM1273)的液体或固体培养产物，例如微生物的斜面培养物、发酵产物等。
[0085] 本发明涉及的“菌悬液”是指将微生物(如本发明所述黏膜粘液乳杆菌CCFM1273)细胞分散于溶剂(例如水)中所得的悬浮液。
[0086] 本发明涉及的“预防”是指在疾病发作之前，通过治疗以避免、最小化或令疾病难于发作或发展，包括预防结肠炎，和/或抑制结肠炎的发展或延迟结肠炎的发作。
[0087] 本发明涉及的“治疗”是指在疾病发作之后预防、治愈、逆转、减弱、减轻、最小化、抑制、制止和/或停止疾病的一种或多种临床症状；包括抑制结肠炎的所有行为，和/或减轻结肠炎的病理状况。
[0088] 本发明涉及的“组合物”包括以食品、药物或保健品；其中，所述药品可以根据本发明所属领域的技术人员采用现有技术中的任意方法使用药学上可接受的载体和/或赋形剂来配制；所述制剂可以以在油或水介质中的溶液、悬浮液或乳液的形式提供，或者以提取物、散剂、颗粒剂、片剂或胶囊的形式提供，还可以含有分散剂或稳定剂。
[0089] 动物及试剂：
[0090] 下述实施例中涉及的菌株黏膜粘液乳杆菌(Limosilactobacillus mucosae)CCFM1273已公开于公开号为CN115449496A的专利申请文件中；下述实施例中涉及的小鼠为8周龄雄性无特定病原体(specific pathogen free，SPF)的C57BL/6J小鼠，购自浙江维通利华实验动物技术有限公司；下述实施例中涉及的酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒购自R&D Systems公司、杭州联科生物技术股份有限公司和南京森贝伽生物科技有限公司；下述实施例中涉及的生化试剂盒购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司；下述实施例中涉及的BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物技术有限公司；下述实施例中涉及的无水乙醇、三氯乙酸、苯酚、硫酸和二甲苯购自国药集团化学试剂有限公司；下述实施例中涉及的葡聚糖硫酸钠(DSS)购自MP Biomedicals公司；下述实施例中涉及的HE染液、阿利新蓝染液、过碘酸雪夫染液、TUNEL染液、MUC2一抗、ZO‑1一抗、Occludin一抗和Claudin‑1一抗购自武汉赛维尔生物科技有限公司。
[0091] 培养基：
[0092] MRS液体培养基：胰蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L、无水乙酸钠2g/L、酵母粉5g/L、七水硫酸镁0.1g/L、一水硫酸锰0.05g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、磷酸氢二钾2g/L、吐温80 1mL/L。
[0093] MRS固体培养基：胰蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L、无水乙酸钠2g/L、酵母粉5g/L、七水硫酸镁0.1g/L、一水硫酸锰0.05g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、磷酸氢二钾2g/L、吐温80 1mL/L、琼脂15g/L。
[0094] 检测方法：
[0095] 疾病活动指数(disease activity index，DAI)的检测方法：
[0096] DAI评分参照Praveschotinunt等人的评分系统，包括体重下降、粪便形状和便血情况三个方面(具体评分标准如表1所示)。造模期间，每天测量小鼠体重、观察粪便形状和检测便血情况，根据表1进行评分，DAI为三者分数之和，即DAI＝体重下降分数+粪便形状分数+便血情况分数。便血情况用珠海贝索生物技术有限公司的便隐血试剂盒测定，具体操作按照说明书进行，若粪便肉眼可见有红褐色或鲜红色血液，则为肉眼血便。体重下降分为五个等级：0％、1‑5％、6‑10％、11‑15％和>15％；粪便性状分为四个等级：正常、松散、不成形和稀便；便血情况分为四个等级：隐血阴性、少量血、大量血和肉眼血便。
[0097] 表1疾病活动指数评分标准
[0098]
[0099] 结肠长度的检测方法：
[0100] 小鼠处死后，取整段结肠(盲肠末端至肛门)，测量长度。
[0101] 结肠组织病理学的检测方法(HE染色)：
[0102] 取材：取0.5‑1cm远端结肠于4％多聚甲醛溶液中固定24h以上后，将组织从固定液取出，在通风橱内用手术刀将目的部位组织修平整，将修切好的组织和对应的标签放于脱水盒内。
[0103] 脱水浸蜡：将脱水盒放进脱水机内依次梯度酒精进行脱水。75％乙醇4h，85％乙醇2h，90％乙醇2h，95％乙醇1h，无水乙醇I 30min，无水乙醇II 30min，醇苯5‑10min，二甲苯I 
5‑10min，二甲苯II 5‑10min，65℃融化石蜡I1h，65℃融化石蜡II 1h，65℃融化石蜡III 
1h。
[0104] 包埋：将浸好蜡的组织于包埋机内进行包埋。先将融化的蜡放入包埋框，待蜡凝固之前将组织从脱水盒内取出按照包埋面的要求放入包埋框并贴上对应的标签。于‑20℃冻台冷却，蜡凝固后将蜡块从包埋框中取出并修整蜡块。
[0105] 切片：将修整好的蜡块，放入‑20℃冻台冷却，再将冷却的蜡块置于石蜡切片机切片，厚度为4μm。切片漂浮于摊片机40℃温水上，将组织展平，用载玻片将组织捞起，60℃烘箱内烤片，水烤干、蜡烤化后取出常温保存备用。
[0106] 石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ20min，二甲苯Ⅱ20min，无水乙醇Ⅰ5min，无水乙醇Ⅱ5min，75％乙醇5min，自来水冲洗。
[0107] 苏木素染色：切片放入苏木素染液3‑5min，自来水冲洗，分化液分化，自来水冲洗，返蓝液返蓝，流水冲洗。
[0108] 伊红染色：切片依次放入85％、95％的梯度乙醇脱水各5min，置入伊红染液中染色5min。
[0109] 脱水封片：切片依次放入无水乙醇I 5min，无水乙醇II 5min，无水乙醇Ⅲ5min，二甲Ⅰ5min，二甲苯Ⅱ5min透明，中性树胶封片。
[0110] 扫片：用Pannoramic MIDI数字切片扫描仪扫描制作好的结肠组织HE染色切片，并采用Dieleman的评分系统对各组结肠组织HE染色切片进行组织损伤评分，组织损伤评分包括炎症程度、病变深度、隐窝破坏和病变范围四个方面(具体标准见表2)。
[0111] 表2组织损伤评分标准
[0112]
[0113] 结肠组织黏液层和杯状细胞的检测方法(阿利新蓝染色和过碘酸雪夫染色)：
[0114] 阿利新蓝(AB)染色：
[0115] 取材、脱水浸蜡、包埋、切片和石蜡切片脱蜡至水与HE染色中的步骤相同。
[0116] 阿利新蓝染色：切片放入阿利新蓝染液A中染色10‑15min，自来水冲洗。
[0117] 染核：切片放入阿利新蓝染色液B浸染3min，自来水冲洗。
[0118] 脱水封片和扫片与HE染色中的步骤相同。
[0119] 过碘酸雪夫(PAS)染色：
[0120] 取材、脱水浸蜡、包埋、切片和石蜡切片脱蜡至水与HE染色中的步骤相同。
[0121] 切片入PAS染色液B中染色10‑15min，自来水冲洗，蒸馏水洗两遍；
[0122] 切片入PAS染色液A浸染25‑30min，避光，流水冲洗5min；
[0123] 切片入PAS染色液C染30s，自来水冲洗，盐酸水溶液分化，自来水冲洗，氨水返蓝，流水冲洗。
[0124] 脱水封片和扫片与HE染色中的步骤相同。
[0125] 结肠上皮细胞凋亡的检测方法(TUNEL染色)：
[0126] 取材、脱水浸蜡、包埋和切片与HE染色中的步骤相同。
[0127] 石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ10min，二甲苯Ⅱ10min，二甲苯Ⅱ10min，无水乙醇Ⅰ5min，无水乙醇Ⅱ5min，无水乙醇III 5min，蒸馏水洗。
[0128] 蛋白酶K修复：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈(防止液体流走)，在圈内滴加蛋白酶K工作液覆盖组织，37℃孵育22min，将玻片置于PBS(pH 7.4)中，在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。(蛋白酶K工作液配置方法，原液：PBS＝1：9)
[0129] 破膜：切片稍甩干后，在圈内滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育20min，将玻片置于PBS(pH 7.4)中，在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。(破膜液为0.1％triton，配置方法，triron原液：PBS＝1：1000)
[0130] 室温平衡：切片稍甩干后，在圈内滴加buffer覆盖组织，buffer常温孵育10min。
[0131] 加反应液：按片子数量和组织大小取TUNEL试剂盒内适量TDT酶、dUTP和buffer，按1：5：50比例混合，加到圈内覆盖组织，切片平放于湿盒内，37℃孵育2h，湿盒内加少量水保持湿度。
[0132] DAPI复染细胞核：切片用PBS(pH 7.4)洗涤3次，每次5min，去除PBS后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。
[0133] 封片：玻片置于PBS(pH 7.4)中，在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min，切片稍甩干，用抗荧光淬灭封片剂封片。
[0134] 扫片：用Pannoramic MIDI数字切片扫描仪扫描制作好的结肠组织TUNEL染色切片。
[0135] MUC2和结肠紧密连接蛋白分布的检测方法(免疫荧光染色)：
[0136] 取材、脱水浸蜡、包埋和切片与HE染色中的步骤相同。
[0137] 石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入环保型脱蜡液Ⅰ10min，环保型脱蜡液Ⅱ10min，环保型脱蜡液Ⅲ10min，无水乙醇Ⅰ5min，无水乙醇Ⅱ5min，无水乙醇Ⅲ5min，蒸馏水冲洗。
[0138] 抗原修复：组织切片置于盛满EDTA抗原修复缓冲液(pH 8.0)的修复盒中，于微波炉内进行抗原修复，中火8min至沸，停火8min，再转中低火7min，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS(pH 7.4)中，在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
[0139] 画圈血清封闭：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈(防止抗体流走)，甩干PBS，滴加BSA，封闭30min。
[0140] 加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加按一定比例配好的一抗(PBS稀释)，切片平放于湿盒内4℃孵育过夜(湿盒内加少量水防止抗体蒸发)。
[0141] 加二抗：玻片置于PBS(pH 7.4)中，在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后，在圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，避光室温孵育50min。
[0142] DAPI复染细胞核：玻片置于PBS(pH 7.4)中，在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。
[0143] 淬灭组织自发荧光：玻片置于PBS(pH 7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。在圈内加入自发荧光淬灭剂5min，流水冲洗10min。
[0144] 封片：切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。
[0145] 镜检拍照：切片于荧光显微镜下观察并采集图像。(DAPI紫外激发波长330‑380nm，发射波长420nm，发蓝光；FITC激发波长465‑495nm，发射波长515‑555nm，发绿光)。
[0146] 结肠组织相关指标的测定：
[0147] 将结肠组织按1：9的重量体积比加入预冷的PBS，利用高通量组织研磨仪破碎结肠组织得到匀浆，然后5000g、4℃离心10min，收集上清，得到结肠组织匀浆上清液；结肠组织匀浆上清液中总蛋白的浓度利用BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物技术有限公司)测定，单位为mg/mL。
[0148] 结肠组织匀浆上清液中的MUC2、TNF‑α、IL‑6、IL‑10、IL‑22、MPO和MDA通过ELISA试剂盒(R&D Systems公司、杭州联科生物技术股份有限公司和南京森贝伽生物科技有限公司)检测，其中，MUC2、TNF‑α、IL‑6、IL‑10和IL‑22单位为pg/mg蛋白，MPO单位为ng/mg蛋白，MDA单位为nmol/mg蛋白。
[0149] 结肠组织匀浆上清液中的T‑SOD、GSH‑Px和T‑AOC通过生化试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司)检测，T‑SOD、GSH‑Px和T‑AOC单位为U/mg蛋白。
[0150] 实施例1：黏膜粘液乳杆菌(Limosilactobacillus mucosae)CCFM1273菌悬液的制备
[0151] (1)从甘油管中蘸取黏膜粘液乳杆菌(Limosilactobacillus mucosae)CCFM1273的菌液在MRS固体培养基上划线，37℃条件下培养48h‑72h，得到单菌落；挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃条件下培养24h。
[0152] (2)将步骤(1)得到菌液按照2％(v/v)的接种量接种至MRS液体培养基中，37℃培养24h，按照上述操作再传代培养一次后，将发酵液离心收集菌体，用生理盐水洗涤菌体3次后，再次离心得到菌泥，加入30％甘油(所用30％甘油的体积为菌泥重量的2倍)后混匀，分装后冻入‑80℃，灌胃前离心除去甘油，用无菌生理盐水洗涤3遍菌体，之后用无菌生理盐水重悬菌体。
[0153] 实施例2：黏膜粘液乳杆菌(Limosilactobacillus mucosae)CCFM1273对DSS诱导溃疡性结肠炎小鼠症状的缓解作用
[0154] (1)配制2.5％的DSS溶液：将葡聚糖硫酸钠(DSS)用灭菌水配成浓度为2.5％(w/v)9
的DSS溶液，按照实施例1的方法制备菌浓为5×10CFU/mL的菌悬液。
[0155] (2)将24只8周龄SPF级雄性C57BL/6J小鼠，随机分为3组，每组8只，3组分别为：空白对照组(Control)、造模组(DSS)、和黏膜粘液乳杆菌(Limosilactobacillus mucosae)CCFM1273干预组(CCFM1273)，具体实验方案如表3所示。
[0156] 表3实验小鼠处理方案
[0157]
[0158] (3)造模期间，称量各组小鼠体重，观察并记录各组小鼠DAI。实验结束时，麻醉后处死小鼠，取整段结肠(盲肠末端至肛门)，测量结肠长度。
[0159] 实验结束时，DSS组小鼠体重降低了17.87％，而CCFM1273干预组小鼠体重仅降低了9.17％，因此，CCFM1273干预组小鼠的体重降低显著低于DSS组(图1)。
[0160] 实验结束时，DSS组小鼠的DAI升高至7.63，而CCFM1273干预将小鼠的DAI降低至4.75，因此，CCFM1273干预组小鼠的DAI指数显著低于DSS组(图2)。
[0161] 实验结束时，Control组小鼠结肠长度为6.66cm，DSS组小鼠的结肠长度仅为5.41cm，而CCFM1273干预显著增加了结肠长度，达到6.54cm(图3)。
[0162] 以上结果表明，黏膜粘液乳杆菌(Limosilactobacillus mucosae)CCFM1273对DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠具有较好的缓解效果。
[0163] 实施例3：黏膜粘液乳杆菌(Limosilactobacillus mucosae)CCFM1273改善溃疡性结肠炎小鼠的病理损伤
[0164] 具体实施方式同实施例2中的步骤(1)‑(2)。
[0165] 实验结束时，处死小鼠，取远端结肠组织0.5‑1cm，放入4％多聚甲醛进行固定，随后进行脱水浸蜡、包埋、切片和HE染色，扫片后观察不同组别小鼠结肠组织的病理损伤。
[0166] 由图4可以看出，Control组结肠组织的肌层结构清晰，肌纤维排列整齐，固有层内有大量肠腺，呈直管状，排列密集，含大量杯状细胞，未见明显的坏死及炎性细胞浸润；DSS组结肠组织可见大面积的黏膜层溃疡，黏膜上皮及肠腺坏死，结构消失，杯状细胞减少，大量结缔组织增生替代原有的结构，并伴有大量的淋巴细胞浸润，偶见肠腺异型性扩张；CCFM1273干预明显抑制了DSS诱导的结肠病理损伤，与Control组相似。
[0167] 组织病理学评分按照表2中的细则进行。结果显示，DSS的组织病理学评分高达10.63，而CCFM1273干预组的评分显著低于DSS组，为6.13(图5)。
[0168] 以上结果表明，黏膜粘液乳杆菌(Limosilactobacillus mucosae)CCFM1273能够改善溃疡性结肠炎小鼠的病理损伤。
[0169] 实施例4：黏膜粘液乳杆菌(Limosilactobacillus mucosae)CCFM1273产的胞外多糖的提取与测定
[0170] 挑取黏膜粘液乳杆菌(Limosilactobacillus mucosae)CCFM1273的单菌落至MRS液体培养基中，于37℃下培养24h后，再以2％的接种量接种至MRS液体培养基中，于37℃下培养24h，最后以2％(v/v)的接种量再次接种于MRS液体培养基中，37℃培养36h后，发酵液经沸水浴10min，灭活降解多糖的酶，冷却至室温后，离心(9000g，30min，4℃)除去菌体，加入80％(w/v)的三氯乙酸(TCA)至终浓度为4％(w/v)，搅拌均匀后于4℃下静置过夜，随后再次离心(9000g，30min，4℃)除去蛋白，然后将发酵液于旋转蒸发仪中浓缩至原体积的1/5左右，之后加入3倍体积的预冷无水乙醇，搅拌均匀后于4℃静置24h，离心(9000g，30min，4℃)收集沉淀，用适当的去离子水溶解，在4℃下于透析袋(14000Da)中透析72h，每8h换一次水，之后冷冻干燥得到胞外多糖(图6)。
[0171] 胞外多糖含量采用苯酚硫酸法测定。结果显示，黏膜粘液乳杆菌CCFM1273发酵液中胞外多糖含量为211.74±7.73mg/L。对胞外多糖的特性进行分析，结果显示，黏膜粘液乳杆菌CCFM1273胞外多糖水溶液(10mg/mL)的粘度(25℃，100r/min)为2.28±0.29cP；黏膜粘液乳杆菌CCFM1273胞外多糖水溶液(10mg/mL)的pH(25℃)为3.60±0.02。
[0172] 实施例5：黏膜粘液乳杆菌(Limosilactobacillus mucosae)CCFM1273产的胞外多糖对DSS诱导溃疡性结肠炎小鼠症状的缓解作用
[0173] 步骤如下：
[0174] (1)配制2.5％的DSS溶液：将葡聚糖硫酸钠(DSS)用灭菌水配成浓度为2.5％(w/v)的DSS溶液。
[0175] (2)将24只8周龄SPF级雄性C57BL/6J小鼠，随机分为3组，每组8只，3组分别为：空白对照组(Control)、造模组(DSS)、黏膜粘液乳杆菌(Limosilactobacillus mucosae)CCFM1273胞外多糖干预组(CCFM1273 EPS)，具体实验方案如表4所示。
[0176] 表4实验小鼠处理方案
[0177]
[0178] (3)造模期间，称量各组小鼠体重，观察并记录各组小鼠DAI。实验结束时，麻醉后处死小鼠，取整段结肠(盲肠末端至肛门)，测量结肠长度并拍照。
[0179] 实验结束时，DSS组小鼠体重降低了17.68％，而CCFM1273 EPS干预组小鼠体重仅降低了9.12％，因此，CCFM1273 EPS干预组小鼠的体重降低显著低于DSS组(图7)。
[0180] 实验结束时，DSS组小鼠的DAI升高至8.25，而CCFM1273 EPS干预组小鼠的DAI降低至4.75，因此，CCFM1273 EPS干预组小鼠的DAI指数显著低于DSS组(图8)。
[0181] 实验结束时，Control组小鼠结肠长度为6.75cm，DSS组小鼠的结肠长度仅为4.33cm，而灌胃CCFM1273 EPS后，显著增加了结肠长度，达到5.20cm(图9)，各组小鼠典型的结肠照片见图10。
[0182] 因此，本发明中，黏膜粘液乳杆菌(Limosilactobacillus mucosae)CCFM1273产的胞外多糖对DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠具有较好的缓解效果。
[0183] 实施例6：黏膜粘液乳杆菌(Limosilactobacillus mucosae)CCFM1273产的胞外多糖改善溃疡性结肠炎小鼠的病理损伤
[0184] 具体实施方式同实施例5中的步骤(1)‑(2)。
[0185] 实验结束时，处死小鼠，取远端结肠组织0.5‑1cm，放入4％多聚甲醛进行固定，随后进行脱水浸蜡、包埋、切片和HE染色，扫片后观察不同组别小鼠结肠组织的病理损伤。
[0186] 由图11可以看出，Control组结肠组织各层结构清晰，黏膜上皮完整，肠腺数量丰富，排列紧密，肌层肌细胞形态正常，未见明显异常；DSS组可见大范围溃疡，黏膜上皮坏死脱落，肠腺结构消失，成纤维细胞增生，伴大量的炎性细胞浸润，少量细胞坏死，胞核溶解，呈嗜酸性均质状，损伤侵及黏膜下层，黏膜下层水肿，结缔组织排列疏松，伴有炎性细胞浸润，肠腔内大量炎性渗出物，少量肠腺扩张；CCFM1273 EPS干预后，少量黏膜上皮细胞坏死脱落，固有层可见少量的炎性细胞分布。
[0187] 组织病理学评分按照表2中的细则进行。结果显示，DSS组的组织病理学评分达到11.5分，而CCFM1273 EPS干预后，其评分为5.25分，显著低于DSS组(图12)。
[0188] 因此，本发明中，黏膜粘液乳杆菌(Limosilactobacillus mucosae)CCFM1273产的胞外多糖能够改善溃疡性结肠炎小鼠的病理损伤。
[0189] 实施例7：黏膜粘液乳杆菌(Limosilactobacillus mucosae)CCFM1273产的胞外多糖对溃疡性结肠炎小鼠结肠粘液层的保护作用
[0190] 具体实施方式同实施例5中的步骤(1)‑(2)。
[0191] 实验结束时，处死小鼠，取远端结肠组织0.5‑1cm，放入4％多聚甲醛进行固定，随后进行脱水浸蜡、包埋、切片和阿利新蓝染色，扫片后观察不同组别小鼠结肠组织的黏液层分布(图13)；而且，还进行脱水浸蜡、包埋、切片、MUC2一抗和二抗添加及DAPI复染细胞核，镜检拍照后观察不同组别小鼠结肠组织中的MUC2分布(图14)；并且用ELISA试剂盒测定了结肠组织中MUC2的蛋白表达量(图15)。
[0192] 实验结束时，处死小鼠，取远端结肠组织0.5‑1cm，放入4％多聚甲醛进行固定，随后进行脱水浸蜡、包埋、切片和过碘酸雪夫染色，扫片后观察不同组别小鼠结肠组织的杯状细胞分布(图16)，并测定杯状细胞的数量(图17)。
[0193] 如图13所示，DSS组小鼠结肠的黏液层受损，而CCFM1273 EPS抑制了小鼠结肠的黏液层受损；由图14和图15可知，DSS组小鼠结肠中的MUC2分布减少，测得其MUC2的蛋白表达量为34.55pg/mg蛋白，而CCFM1273 EPS组小鼠结肠中的MUC2分布未见明显减少，其MUC2的蛋白表达量为55.43pg/mg蛋白，接近于Control组(61.39pg/mg蛋白)。
[0194] 如图16和图17所示，DSS处理后，小鼠结肠中的杯状细胞分布明显减少，仅有1.38个/隐窝，而CCFM1273 EPS干预显著抑制了杯状细胞的丢失，杯状细胞有6.13个/隐窝。
[0195] 因此，本发明中，黏膜粘液乳杆菌(Limosilactobacillus mucosae)CCFM1273产的胞外多糖对溃疡性结肠炎小鼠结肠粘液层具有显著的保护作用。
[0196] 实施例8：黏膜粘液乳杆菌(Limosilactobacillus mucosae)CCFM1273产的胞外多糖对溃疡性结肠炎小鼠结肠上皮屏障的保护作用
[0197] 具体实施方式同实施例5中的步骤(1)‑(2)。
[0198] 实验结束时，处死小鼠，取远端结肠组织0.5‑1cm，放入4％多聚甲醛进行固定，随后进行脱水浸蜡、包埋、切片和TUNEL染色，扫片后观察不同组别小鼠的结肠上皮细胞凋亡情况(见图18)。
[0199] 实验结束时，处死小鼠，取远端结肠组织0.5‑1cm，放入4％多聚甲醛进行固定，随后进行脱水浸蜡、包埋、切片、一抗和二抗添加及DAPI复染细胞核，镜检拍照后观察不同组别小鼠结肠组织的三种紧密连接蛋白(ZO‑1、Occludin和Claudin‑1)的分布(见图19)。
[0200] 如图18所示，相比于Control组，DSS组小鼠的结肠上皮细胞凋亡数量显著增加，而灌胃CCFM1273 EPS后，相比于DSS组，小鼠的结肠上皮细胞凋亡数量显著减少。
[0201] 如图19所示，DSS处理后，破坏了小鼠结肠的紧密连接蛋白，结肠组织中ZO‑1、Occludin和Claudin‑1的分布显著减少，而CCFM1273 EPS干预显著增加了小鼠结肠中ZO‑1、Occludin和Claudin‑1的分布。
[0202] 因此，本发明中，黏膜粘液乳杆菌(Limosilactobacillus mucosae)CCFM1273产的胞外多糖干预后显著减少了小鼠结肠上皮细胞凋亡，增加了紧密连接蛋白的分布，改善了结肠屏障。
[0203] 实施例9：黏膜粘液乳杆菌(Limosilactobacillus mucosae)CCFM1273产的胞外多糖对溃疡性结肠炎小鼠结肠炎症的缓解作用
[0204] 具体实施方式同实施例5中的步骤(1)‑(2)；
[0205] 实验结束时，取一部分结肠组织，按照ELISA试剂盒说明书测定结肠组织匀浆上清中的炎症指标，包括TNF‑α、IL‑6、IL‑10、IL‑22和MPO。
[0206] 如图20、21、22和23所示，DSS组小鼠结肠组织中的TNF‑α和IL‑6的含量显著增加至63.94pg/mg蛋白和61.93pg/mg蛋白，而IL‑10和IL‑22的含量显著减少至23.82pg/mg蛋白和
9.34pg/mg蛋白；而CCFM1273 EPS干预显著降低小鼠结肠组织中TNF‑α和IL‑6的含量至
36.27pg/mg蛋白和35.78pg/mg蛋白，显著提升IL‑10和IL‑22的含量至41.62pg/mg蛋白和
19.20pg/mg蛋白，接近Control组水平。
[0207] 如图24所示，DSS处理后，显著增加了小鼠结肠组织中MPO的含量，达到了23.84ng/mg蛋白，而CCFM1273 EPS干预显著降低了MPO的含量，为11.14ng/mg蛋白。
[0208] 因此，黏膜粘液乳杆菌(Limosilactobacillus mucosae)CCFM1273产的胞外多糖干预后显著减轻了小鼠的炎症。
[0209] 实施例10：黏膜粘液乳杆菌(Limosilactobacillus mucosae)CCFM1273产的胞外多糖对溃疡性结肠炎小鼠结肠氧化应激的缓解作用
[0210] 具体实施方式同实施例5中的步骤(1)‑(2)；
[0211] 实验结束时，取一部分结肠组织，按照生化试剂盒说明书测定结肠组织匀浆上清中的氧化应激相关指标，包括T‑SOD、GSH‑Px、T‑AOC和MDA。
[0212] 由图25、26和27可知，DSS处理后，小鼠结肠组织中的T‑SOD、GSH‑Px和T‑AOC活性分别显著降低至117.44U/mg蛋白、2218.06U/mg蛋白和0.78U/mg，而灌胃CCFM1273 EPS后，T‑SOD、CAT和T‑AOC活性分别升高至173.80U/mg蛋白、3208.73U/mg蛋白和1.44U/mg蛋白。
[0213] 由图28可知，DSS处理后，小鼠结肠组织中MDA的含量显著升高至2.49nmol/mg蛋白，而CCFM1273 EPS干预后，MDA的含量降低至1.66nmol/mg蛋白。
[0214] 因此，黏膜粘液乳杆菌(Limosilactobacillus mucosae)CCFM1273产的胞外多糖干预后显著缓解了肠道的氧化应激。
[0215] 实施例11：含黏膜粘液乳杆菌(Limosilactobacillus mucosae)CCFM1273产的胞外多糖的发酵乳的制备
[0216] 选用新鲜生牛乳，加入5％的白砂糖(5g/100mL)，加入按照实施例4的方法制备的黏膜粘液乳杆菌(Limosilactobacillus mucosae)CCFM1273的胞外多糖(终浓度200mg/100mL)，于65℃条件下搅拌至完全溶解，于95℃条件下灭菌10min后，立即冷却至42℃，加入商业发酵剂(获取途径如科汉森、丹尼斯克、帝斯曼等)，于42℃恒温箱中发酵4‑6h，凝乳后即可停止发酵，置于4℃中后熟12h。
[0217] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

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