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一种具有解酒护肝功效的益生菌发酵剂及其应用
申请号	CN202311255212.X	申请日	2023-09-27	公开(公告)号	CN117487690A	公开(公告)日	2024-02-02
申请人	宁波大学;			发明人	曾小群; 孙小茜; 潘道东; 吴振; 杜启伟; 张涛;
摘要	本发明公开了一种具有解酒护肝功效的益生菌发酵剂及其应用，特点是包括保藏编号为CGMCC No：27226的鼠李糖乳杆菌MC‑1菌株、保藏编号为CGMCC No：27227的鼠李糖乳杆菌SSN‑13菌株和保藏编号为CGMCC No：27225的发酵粘液乳杆菌G‑1‑46菌株中的至少一种，将鼠李糖乳杆菌MC‑1、鼠李糖乳杆菌SSN‑13和发酵粘液乳杆菌G‑1‑46的乳酸菌培养物按体积比1：1：2的比例混合的益生菌发酵剂按体积比4％的比例接种于中药提取液制备发酵中药饮和固体微生态制剂，优点是能提高乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的酶活，降低血清中乙醇、乙醛及ALT和AST的水平，提高抗氧化酶活性。
权利要求	1.一种具有解酒护肝功效的益生菌发酵剂，其特征在于：所述的益生菌发酵剂包括鼠李糖乳杆菌(Lacticaseibacillus rhamnosus)MC‑1菌株、鼠李糖乳杆菌 (Lacticaseibacillus rhamnosus)SSN‑13菌株和发酵粘液乳杆菌 (Limosilactobacillus fermentum)G‑1‑46菌株中的至少一种，其中所述的鼠李糖乳杆菌MC‑1菌株保藏编号为CGMCC No：27226，所述的鼠李糖乳杆菌(Lacticaseibacillus rhamnosus)SSN‑13菌株保藏编号为CGMCC No：27227，所述的发酵粘液乳杆菌G‑1‑46菌株保藏编号为CGMCC No：27225。 2.根据权利要求1所述的一种具有解酒护肝功效的益生菌发酵剂，其特征在于所述的益生菌发酵剂制备方法如下：将所述的鼠李糖乳杆菌MC‑1、所述的鼠李糖乳杆菌SSN‑13和所述的发酵粘液乳杆菌G‑1‑46分别按体积比5％的比例接种于发酵培养基，于37℃培养 18h，得到乳酸菌培养物，将鼠李糖乳杆菌MC‑1、鼠李糖乳杆菌SSN‑13和发酵粘液乳杆菌G‑ 1‑46的乳酸菌培养物按体积比1：1：2的比例混合即可。 3.根据权利要求2所述的一种具有解酒护肝功效的益生菌发酵剂，其特征在于：所述的发酵培养基为将MRS培养基用1L蒸馏水溶解，121℃灭菌15min即可，所述的MRS培养基的配方为蛋白胨10克，牛肉膏10克，酵母提取物5克，柠檬酸二铵2克，乙酸钠5克，葡萄糖20克，吐温80毫升，硫酸镁0.5克，硫酸锰0.25克和琼脂粉15克。 4.一种利用权利要求1或2所述的益生菌发酵剂制备具有解酒护肝功能的发酵中药饮，其特征在于包括以下步骤： (1)中药提取液制备：称取葛花15‑20g、枳椇子20‑25g、白术6g、黄芪6g、枸杞6g、干姜 6g、茯苓4.5g、泽泻6g、人参4.5g、木香3g、青皮3g和陈皮4.5g，用破壁机将药材进行充分粉碎，过80目筛；加入中药材粉末10倍体积的超纯水浸透中药材粉末，煎煮1h，纱布过滤除去大颗粒物后，进行两次离心取上清液，121℃灭菌15min，得到中药提取液； (2)发酵：将益生菌发酵剂按体积比4％的比例接种于步骤(1)得到的中药提取液，37℃发酵48h，得到具有解酒护肝功能的发酵中药饮。 5.一种利用权利要求1或2所述的益生菌发酵剂制备具有解酒护肝功能的固体微生态制剂，其特征在于包括以下步骤： (1)中药提取液制备：称取葛花15‑20g、枳椇子20‑25g、白术6g、黄芪6g、枸杞6g、干姜 6g、茯苓4.5g、泽泻6g、人参4.5g、木香3g、青皮3g和陈皮4.5g，用破壁机将药材进行充分粉碎，过80目筛；加入中药材粉末10倍体积的超纯水浸透中药材粉末，煎煮1h，纱布过滤除去大颗粒物后，进行两次离心取上清液，121℃灭菌15min，得到中药提取液； (2)发酵：将益生菌发酵剂按体积比4％的比例接种于步骤(1)得到的中药提取液，37℃发酵48h，得到发酵中药饮； (3)发酵中药冻干粉的制备：取步骤(2)得到的发酵中药饮，在3000rpm、4℃的条件下离心15min，取上清放入‑80℃冰箱过夜预冻，将预冻好的样品于‑49℃，9Pa 冷冻干燥48h，即得到发酵中药冻干粉； (4)乳酸菌冻干粉的制备：取步骤(3)中去除上清后得到的乳酸菌沉淀，采用无菌PBS缓 7 9 冲液将菌体浓度调节至1×10～1×10CFU/mL后，于8000rpm、4℃的条件下离心15min，取沉淀加入与发酵中药饮等体积的冻干保护剂，混匀放入‑80℃冰箱过夜预冻，将预冻好的样品于‑49℃，9Pa冷冻干燥48h，即得到乳酸菌冻干粉； (5)固体微生态制剂的制备将步骤(3)制备得到的发酵中药冻干粉与步骤(4)制备得到的乳酸菌冻干粉等质量混合，即得到具有解酒护肝功能的固体微生态制剂。 6.根据权利要求5所述的一种具有解酒护肝功能的固体微生态制剂的制备方法，其特征在于：所述的冻干保护剂配方为118.2g/L海藻糖、17.1g/L L‑半胱氨酸、10.3g/L山梨醇、 1.7g/L乙酸钠和120g/L脱脂奶粉。
说明书全文	一种具有解酒护肝功效的益生菌发酵剂及其应用技术领域 [0001] 本发明涉及一种益生菌发酵剂，尤其是涉及一种具有解酒护肝功效的益生菌发酵剂及其应用。背景技术 [0002] 长期饮酒会加重人体肝脏负担，引起精神障碍、胃溃疡以及脂肪肝、酒精性肝炎、肝硬化等多种急慢性疾病。长期饮酒的患者中，约57.5％的病人有脂肪肝，15％的患者有肝硬化。一些消化系统的肿瘤如胃癌、食管癌、肝癌的发病率上升也和酒精中毒有着密切的关系。 [0003] 人体对于乙醇的直接排出能力相对较弱，通过汗液、尿液等途径直接排出体外的仅占2％～10％，绝大多数都依靠肝脏进行代谢，主要有三种途径，包括：乙醇脱氢酶系统、微粒体乙醇氧化酶系统和过氧化氢酶系统，经过上述途径可以将乙醇氧化为乙醛，再经乙醛脱氢酶氧化成乙酸，最终通过三羧酸循环代谢出体外。此过程可产生大量的NADH和乙醛，共价地结合肝细胞膜蛋白质、CYP2E1、球蛋白和微粒体蛋白等多种蛋白质，形成乙醛蛋白加合物，影响体内酶活性，引发脂肪代谢紊乱，加剧肝脏脂肪变性速及程度并导致免疫应答发生异常。近年来，随着人们物质生活水平的提高，人们对自身健康也日益重视，为了能有效减少酒源性疾病的发生，减轻酒精对肝脏的损伤，亟需开发一种以药食同源类植物为原料的，具有解酒护肝功能的混合固体微生态制剂。发明内容 [0004] 本发明所要解决的技术问题是提供一种能提高乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的酶活，降低血清中乙醇、乙醛及ALT和AST的水平，提高抗氧化酶活性的具有解酒护肝功效的益生菌发酵剂及其应用。 [0005] 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种具有解酒护肝功效的益生菌发酵剂，所述的益生菌发酵剂包括鼠李糖乳杆菌(Lacticaseibacillusrhamnosus)MC‑1菌株、鼠李糖乳杆菌(Lacticaseibacillus rhamnosus)SSN‑13菌株和发酵粘液乳杆菌(Limosilactobacillusfermentum)G‑1‑46菌株中的至少一种，其中所述的鼠李糖乳杆菌MC‑1菌株保藏编号为CGMCC No：27226，所述的鼠李糖乳杆菌(Lacticaseibacillus rhamnosus)SSN‑13菌株保藏编号为CGMCC No：27227，所述的发酵粘液乳杆菌G‑1‑46菌株保藏编号为CGMCC No：27225。 [0006] 进一步，所述的益生菌发酵剂制备方法如下：将所述的鼠李糖乳杆菌MC‑1、所述的鼠李糖乳杆菌SSN‑13和所述的发酵粘液乳杆菌G‑1‑46分别按体积比5％的比例接种于发酵培养基，于37℃培养18h，得到乳酸菌培养物，将鼠李糖乳杆菌MC‑1、鼠李糖乳杆菌SSN‑13和发酵粘液乳杆菌G‑1‑46的乳酸菌培养物按体积比1：1：2的比例混合即可。 [0007] 进一步，所述的发酵培养基为将MRS培养基用1L蒸馏水溶解，121℃灭菌15min即可，所述的MRS培养基的配方为蛋白胨10克，牛肉膏10克，酵母提取物5克，柠檬酸二铵2克，乙酸钠5克，葡萄糖20克，吐温80毫升，硫酸镁0.5克，硫酸锰0.25克和琼脂粉15克。 [0008] 上述益生菌发酵剂制备具有解酒护肝功能的发酵中药饮，包括以下步骤：(1)中药提取液制备：称取葛花15‑20g、枳椇子20‑25g、白术6g、黄芪6g、枸杞6g、干姜6g、茯苓4.5g、泽泻6g、人参4.5g、木香3g、青皮3g和陈皮4.5g，用破壁机将药材进行充分粉碎，过80目筛；加入中药材粉末10倍体积的超纯水浸透中药材粉末，煎煮1h，纱布过滤除去大颗粒物后，进行两次离心取上清液，121℃灭菌15min，得到中药提取液； (2)发酵：将益生菌发酵剂按体积比4％的比例接种于步骤(1)得到的中药提取液， 37℃发酵48h，得到具有解酒护肝功能的发酵中药饮。 [0009] 上述益生菌发酵剂制备具有解酒护肝功能的固体微生态制剂，包括以下步骤：(1)中药提取液制备：称取葛花15‑20g、枳椇子20‑25g、白术6g、黄芪6g、枸杞6g、干姜6g、茯苓4.5g、泽泻6g、人参4.5g、木香3g、青皮3g和陈皮4.5g，用破壁机将药材进行充分粉碎，过80目筛；加入中药材粉末10倍体积的超纯水浸透中药材粉末，煎煮1h，纱布过滤除去大颗粒物后，进行两次离心取上清液，121℃灭菌15min，得到中药提取液； (2)发酵：将益生菌发酵剂按体积比4％的比例接种于步骤(1)得到的中药提取液， 37℃发酵48h，得到发酵中药饮； (3)发酵中药冻干粉的制备：取步骤(2)得到的发酵中药饮，在3000rpm、4℃的条件下离心15min，取上清放入‑80℃冰箱过夜预冻，将预冻好的样品于‑49℃，9Pa 冷冻干燥48h，即得到发酵中药冻干粉； (4)乳酸菌冻干粉的制备：取步骤(3)中去除上清后得到的乳酸菌沉淀，采用无菌 7 9 PBS缓冲液将菌体浓度调节至1×10 ～1×10 CFU/mL后，于8000rpm、4℃的条件下离心 15min，取沉淀加入与发酵中药饮等体积的冻干保护剂，混匀放入‑80℃冰箱过夜预冻，将预冻好的样品于‑49℃，9Pa冷冻干燥48h，即得到乳酸菌冻干粉； (5)固体微生态制剂的制备将步骤(3)制备得到的发酵中药冻干粉与步骤(4)制备得到的乳酸菌冻干粉等质量混合，即得到具有解酒护肝功能的固体微生态制剂。 [0010] 进一步，所述的冻干保护剂配方为118.2g/L海藻糖、17.1g/L L‑半胱氨酸、10.3g/L山梨醇、1.7g/L乙酸钠和120g/L脱脂奶粉。 [0011] 与现有技术相比，本发明的优点在于：一种具有解酒护肝功效的益生菌发酵剂及其应用，利用益生菌发酵剂获得的发酵中药饮以及固体微生态制剂配伍科学合理，能充分利用其各药味功能，能有效激活小鼠肝脏中乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的酶活，降低血清中乙醇、乙醛及ALT和AST的水平，提高抗氧化酶活性，对急性及慢性肝损伤模型的小鼠肝脏具有明显的保护作用，弥补了市场上快速解酒、长效护肝的解酒产品的空白。 [0012] 上述鼠李糖乳杆菌(Lacticaseibacillus rhamnosus)MC‑1菌株，保藏编号为CGMCC No：27226，于2023年04月27日于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。 [0013] 上述鼠李糖乳杆菌(Lacticaseibacillus rhamnosus)SSN‑13菌株，保藏编号为CGMCC No：27227，于2023年04月27日于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。 [0014] 上述发酵粘液乳杆菌(Limosilactobacillusfermentum)G‑1‑46菌株，保藏编号为CGMCC No：27225，于2023年04月27日于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。附图说明 [0015] 图1为乳酸菌IC和CFE对羟自由基的清除率，注：乳酸菌完整细胞悬液IC的显著性差异用小写英文表示；乳酸菌无细胞提取物CFE的显著性差异用大写英文表示；图2为乳酸菌IC和CFE对DPPH自由基的清除率图3为乳酸菌IC和CFE对ABTS自由基的清除率图4为MC‑1生长曲线和产酸曲线；图5为SSN‑13生长曲线和产酸曲线；图6为G‑1‑46生长曲线和产酸曲线；图7为模拟人工胃液和肠液中乳酸菌的存活率；图8为菌株G‑1‑46、MC‑1和SSN‑1316S rDNA的PCR产物电泳，注：M：marker；Line1: G‑1‑14的PCR产物；Line2:MC‑1的PCR产物；Line3:SSN‑13的PCR产物；图9为菌株G‑1‑46的系统发育树；图10为食用发酵中药饮小鼠急性醉酒模型组的肝脏进行HE染色；图11为食用发酵中药饮小鼠慢性醉酒模型组的肝脏进行HE染色；图12为食用固体微生态制剂小鼠急性醉酒模型组的肝脏进行HE染色；图13为食用固体微生态制剂小鼠慢性醉酒模型组的肝脏进行HE染色；图14为小鼠肠道微生物在属水平上的物种相对丰度柱形图，注：CG组表示空白组； AG组表示模型组；LG组表示低浓度组；MG组表示中浓度组；MG组表示高浓度组。具体实施方式 [0016] 以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。 [0017] 一、实验方法1、培养基及溶液配制发酵培养基：将采购的MRS培养基(MRS培养基配方为蛋白胨10克，牛肉膏10克，酵母提取物5克，柠檬酸二铵2克，乙酸钠5克，葡萄糖20克，吐温80毫升，硫酸镁0.5克，硫酸锰 0.25克和琼脂粉15克)用1L蒸馏水溶解，121℃灭菌15min。 [0018] 固体培养基：在发酵培养基中添加琼脂15.0g，121℃灭菌15min。 [0019] CaCO3培养基：在上述固体MRS培养基的基础上添加20.0g的CaCO3，121℃灭菌15min。液体筛选培养基：待发酵培养基灭菌完成后，冷却至室温，在无菌条件下加入10％(v/v)的无水乙醇，备用。 [0020] 人工胃液：准确称取4.822g NaCl粉末和3g胃蛋白酶，加入1L蒸馏水进行溶解，并用稀盐酸将溶液的pH值调至2，使用0.22μm的滤膜过滤，保证溶液的无菌状态。 [0021] 人工肠液：称取4.822g NaCl、7.233g牛胆汁盐和3g胰蛋白酶，加入1L蒸馏水溶解，用NaOH将溶液的pH值调整至8，在无菌条件下，用0.22μm的滤膜过滤。 [0022] 2、菌株的活化和保藏选取2mL在‑80℃冰箱中保藏的菌株，接种于50mL发酵培养基，37℃培养12h，即为种子液。将种子液进行涂布培养，观察菌落形态并倒置于‑4℃冰箱中备用。 [0023] 3、耐乙醇能力测定空白组取1mL种子液接种于50mL发酵培养基，37℃培养12h，测定菌液在600nm处的吸光度值Ac。实验组与空白组操作相同，但将种子液接种于50mL液体筛选培养基，吸光度值记为Ai。通过比较吸光度值，确定对乙醇有较好耐受性的菌株。计算公式如下： [0024] 4、乳酸菌菌液的制备乳酸菌培养：将对乙醇耐受的乳酸菌种子液，接种于发酵培养基，37℃培养18h，并活化三代，得到乳酸菌培养物。 [0025] 乳酸菌完整细胞悬液(Intact cell,IC)：取乳酸菌培养物，4000rpm、4℃离心8 15min，去上清，用无菌PBS洗涤两次后重新将细胞进行悬浮，并调整菌体浓度至1×10CFU/mL。 [0026] 乳酸菌无细胞提取物(Cell‑free extract,CFE)：将得到的乳酸菌完整细胞悬液，在200W的条件下冰浴，超声处理5s、间隔5s，共连续超声破碎15min。然后在4℃、8000rpm离心15min，收集上清液即为乳酸菌菌液CFE。 [0027] 5、清除羟自由基能力(·OH)测定乳酸菌对·OH自由基的清除率按公式(2)计算：其中Ai为样品组吸光度，Ac为空白组吸光度。 [0028] [0029] 6、清除DPPH自由基能力测定乳酸菌对DPPH自由基的清除率按公式(3)计算，Ai为样品组吸光度，Ac为空白组吸光度。 [0030] [0031] 7、清除ABTS自由基能力测定乳酸菌对ABTS自由基的清除率按公式(4)计算，其中Ai为样品组吸光度，Ac为空白组吸光度。 [0032] [0033] 8、耐消化能力测定8 取20mL培养18h的乳酸菌培养基，将菌体浓度调整至1×10CFU/mL，将10mL调整好菌体浓度的菌液离心(4℃、6000rpm、15min)，去上清，向菌体中加入10mL人工胃液，置于37℃、120rpm的摇床中孵育2h。孵育完成后取1mL含胃液的菌液进行标准稀释并涂布于MRS固体培养基上。离心剩余含胃液的菌液(4℃、6000rpm、15min)，向获得的菌体中加入9mL人工肠液，在37℃、120rpm的摇床中培养4h，稀释并涂布于MRS固体培养基上。对照组则是将调整好菌体浓度但未经人工胃液和人工肠液消化过的菌液，置于37℃、120rpm的摇床中孵育，并分别在孵育2h和6h后，取菌液进行稀释和涂布。将涂布完成培养基，在37℃的条件下培养，记菌落数。乳酸菌耐酸和耐胆盐的能力均按公式(5)和(6)计算：其中Ax为在人工胃液中孵育2h后菌液所含活菌数；Ao为未在人工胃液中孵育2h的菌液所含活菌数；Ay为在人工肠液中孵育4h后菌液所含活菌数；Ai为未在人工肠液中孵育 4h的菌液所含活菌数。 [0034] 9、生长曲线和产酸曲线的测定将种子液活化三代后，按2％(v/v)的接种量进行接种、培养，每隔2h，测定发酵液的pH值和600nm处的吸光度值。每次测定前都将培养液充分摇匀，并测定三个重复。 [0035] 10、乳酸菌的16S r DNA鉴定和进化分析(1)DNA的提取取新鲜菌液，8000rpm离心1min，获得菌体，用试剂盒提取菌株的总DNA。 [0036] (2)PCR扩增及产物检测采用通用引物对16S r RNA基因进行扩增，引物序列如下：上游引物27F：5′‑AGAGTTTGATCCTGGCTCAG‑3′；下游引物1495R：5′‑CTACGGCTACCTTGTTACGA‑3′； PCR循环参数为：94℃参预变性5min、94℃变性1min、64℃退火1min、72℃延伸 2min、4℃末端延伸10min，34个循环。取扩增好的PCR产物进行核酸电泳，产物送往生工生物工程股份有限公司检测基因序列。 [0037] (3)系统发育树将获得的菌株序列在NCBI网站进行16S rDNA基因片段比对，提取相似度高的菌株 16SrDNA基因序列，利用软件MEGAX 64构建系统发育树。 [0038] (4)数据处理和统计学分析每个实验重复3次，使用GraphPad Prism 9.4.0和SPSS19.0对实验数据进行统计分析并绘制图案，实验结果呈现平均值±标准差(mean±SEM)的形式。多组数据用One‑Way ANOVA单因素方差分析法进行显著性分析。 [0039] 二、菌株的筛选1、乳酸菌筛选从宁波大学畜产品加工实验室菌株保藏库中随机挑选了100株乳酸菌菌株进行乙醇耐受性实验，最终获得10株对乙醇具有较好耐受性的菌株，观察其菌落形态，结果如表1所示。 [0040] 表1实验菌株的乙醇耐受性和菌落形态2、清除·OH能力的测定羟基自由基是一种活性氧，被广泛认为是一类毒性很强的自由基，与相邻分子通过扩散控制的方式进行反应，特异性低，能极快速地与生物体中所含的DNA、磷脂以及蛋白质等活性物质发生化学反应，破坏细胞和组织的正常结构和功能。并且酒精进入人体后，通过体内中各类代谢酶的氧化，迅速提高机体中羟基自由基的水平，影响机体的健康水平。 [0041] 实验分别检测了乳酸菌完整细胞悬液IC和乳酸菌无细胞提取物CFE对羟基自由基的清楚能力。结果如图1所示。以上10株乳酸菌菌株的IC和CFE均能在一定程度上清除羟基自由基。其中IC组中的G‑1‑46有最强的羟基自由基清除能力，而菌株SSN‑1和45‑5的CFE有较好的羟基自由基清除能力。 [0042] 3、清除DPPH能力测定10株乳酸菌IC和CFE对DPPH自由基的清除率测定如图2所示。菌株B‑1‑12的IC有最强的DPPH自由基的清除率能力，同时菌株B‑1‑12和菌株G‑1‑46的CFE对DPPH自由基的清除率能力显著高于其他组别(p＜0.05)。 [0043] 4、清除ABTS能力测定10株乳酸菌IC和CFE清除ABTS自由基的能力如图3所示。菌株SSN‑13的IC对ABTS自由基的清除率显著高于其他组别(p＜0.05)，菌株MC‑1的CFE对ABTS自由基的清除率显著高于其他组别(p＜0.05)，且所有菌株IC清除能力均高于CFE。 [0044] 5、生长曲线和产酸曲线综合比较不同乳酸菌对上述三种自由基的清楚能力，最终选择使用从发酵乳中筛选出的菌株MC‑1、SSN‑13和从3岁女童肠道中筛选出的菌株G‑1‑46进行后续的实验。 [0045] 具有潜在益生特性乳酸菌菌株MC‑1、SSN‑13和G‑1‑46的生长曲线分别见图4、图5和图6。由图4和图5可以看出，菌株MC‑1和SSN‑13从0h到3h范围内，其OD600值变化不大，曲线较为平坦，pH值基本无变化。3h到11h，两株乳酸菌的OD600值呈快速上升趋势，同时菌液的pH值也快速下降。11h到24h，OD600数值变化缓慢，pH值稳定下降。由图6可知，菌株G‑1‑46从0h到2h范围内，其OD600值和pH值变化不大。2h到8h，菌株的OD600值快速上升，同时菌液的pH值也迅速下降。8h之后，OD600数值平稳增加，而pH值基本稳定，有略微下降。 [0046] 6、耐消化实验结果若要保证微生态功能制剂具有解酒护肝功能，就需要有足够数量的活菌通过胃部消化进入肠道。由图7可知，上述三株乳酸菌对人工胃液和人工肠液均有较好的耐受性，在人工胃液处理2h后，菌株活菌数均有所下降，其中筛选自健康人体肠道的G‑1‑46菌株有最好的人工胃液耐受性，存活率达到95.83％，MC‑1和SSN‑13对于人工胃液的耐受性相似，分别为80.73％和77.43％。经过耐受模拟人工胃液试验后进行模拟人工肠液耐受性试验，数据如图7所示，与模拟人工胃液试验结果相似，G‑1‑46同样有最好的人工肠液耐受性，存活率达到86.72％，MC‑1存活率最低为60.13％，SSN‑13的存活率是67.58％。 [0047] 7、乳酸菌菌株鉴定结果(1)乳酸菌分离株16S rDNA的扩增 PCR扩增产物的凝胶电泳结果，如图8所示，产物无降解、无拖尾现象，完整性好，达到送测要求。图片中左侧为DNAmarker，最大8000bp，其余三列从左至右分别为菌株G‑1‑46、MC‑1和SSN‑13。 [0048] (2)系统发育树及同源性分析菌株MC‑1、SSN‑13和G‑1‑46的系统发育树见图9，从图中可以看出菌株MC‑1和SSN‑ 13为鼠李糖乳杆菌(Lacticaseibacillus rhamnosus)，G‑1‑46则为发酵粘液乳杆菌(Limosilactobacillusfermentum)。 [0049] 综上所述，从宁波学菌种库中随机挑选100株乳酸菌进行筛选，获得10株对高浓度乙醇有显著耐受性的乳酸菌菌株。在此基础上利用多种体外抗氧化能力的检测指标，包括清除羟基自由基、DPPH自由基和ABTS自由基的水平，确定了3株有优良抗氧化性能的乳酸菌菌株，分别为MC‑1、SSN‑13和G‑1‑46。 [0050] 上述3种菌株对人工胃液和人工肠液均有出色的耐受能力，其中菌株G‑1‑46的耐受能力最好，实验结束后存活率达到86.72％，菌株MC‑1的SSN‑13存活率分别为60.13％和67.58％。生长曲线和产酸曲线表明，3种菌株均能迅速生长稳定产酸，2h后即可进入指数生长期且稳定期时间长，具有良好的生长稳定性。通过16S rDNA测序鉴定，确定菌株MC‑1和SSN‑13为鼠李糖乳杆菌(Lacticaseibacillus rhamnosus)，G‑1‑46则为发酵粘液乳杆菌(Limosilactobacillusfermentum)。 [0051] 上述鼠李糖乳杆菌(Lacticaseibacillus rhamnosus)MC‑1菌株，保藏编号为CGMCC No：27226，于2023年04月27日于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。 [0052] 上述鼠李糖乳杆菌(Lacticaseibacillus rhamnosus)SSN‑13菌株，保藏编号为CGMCC No：27227，于2023年04月27日于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。 [0053] 上述发酵粘液乳杆菌(Limosilactobacillusfermentum)G‑1‑46菌株，保藏编号为CGMCC No：27225，于2023年04月27日于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。 [0054] 三、菌株最优配比确定不同发酵菌种及配比对发酵中药饮产品总抗氧化能力的影响中药提取液制备：称取葛花15g、枳椇子20g、白术6g、黄芪6g、枸杞6g、干姜6g、茯苓 4.5g、泽泻6g、人参4.5g、木香3g、青皮3g和陈皮4.5g，用破壁机将药材进行充分粉碎，过80目筛；加入中药材粉末10倍体积的超纯水浸透中药材粉末，煎煮1h，纱布过滤除去大颗粒物后，进行两次离心取上清液，121℃灭菌15min，得到中药提取液。 [0055] 单菌发酵实验：取冷却后的中药提取液，以体积比4％的接种量分别接种MC‑1、SSN‑13及G‑1‑46乳酸菌培养物，37℃静置发酵24h。发酵结束后，将发酵液混匀，测定总抗氧化能力。各乳酸菌培养物制备方法为：取1mL活化后的鼠李糖乳杆菌MC‑1、鼠李糖乳杆菌SSN‑13和发酵粘液乳杆菌G‑1‑46分别接种于20mL发酵培养基，37℃培养18h，得到乳酸菌培养物。 [0056] 混合发酵实验：取冷却后的中药提取液，以4％的接种量分别接种MC‑1、SSN‑13及G‑1‑46乳酸菌培养物的混合物，混合比例见表2所示，于37℃静置发酵24h，发酵结束后，将发酵液混匀，测定总抗氧化能力。 [0057] 表2发酵菌株及其混合比例 [0058] 取发酵完成的新鲜发酵中药饮，立即使用试剂盒测定溶液的总抗氧化值，实验过程严格遵循试剂盒要求，并绘制测定总抗氧化能力的标准曲线。利用菌株MC‑1、SSN‑13和G‑1‑46进行单菌及混菌发酵，在相同的发酵条件下其抗氧化能力如表3所示，表3不同发酵菌种及其配比对总抗氧化能力的影响由上述表3可知，所有实验菌株发酵均可提高中药提取液的总抗氧化值。但是，当菌株MC‑1、SSN‑13和G‑1‑46按体积比为1:1:2的比例混合后，以体积百分数4％的接种量，37℃静置发酵24h，其总抗氧化能力最强，比未发酵的中药提取液提高了39％。因此，选择用菌株MC‑1、SSN‑13和G‑1‑46发酵培养物按体积比为1:1:2混合的菌悬液作为益生菌发酵剂进行后续实验。 [0059] 四、产品应用例一1、具体实施例实施例1 一种解酒护肝的发酵中药饮的制备方法，包括以下步骤： 1、中药提取液制备：称取葛花15g、枳椇子20g、白术6g、黄芪6g、枸杞6g、干姜6g、茯苓4.5g、泽泻6g、人参4.5g、木香3g、青皮3g和陈皮4.5g，用破壁机将药材进行充分粉碎，过 80目筛；加入中药材粉末10倍体积的超纯水浸透中药材粉末，煎煮1h，纱布过滤除去大颗粒物后，进行两次离心取上清液，121℃灭菌15min，得到中药提取液； 2、发酵：将益生菌发酵剂按体积比4％的比例接种于步骤1得到的中药提取液，37℃发酵48h，得到发酵中药饮。 [0060] 实施例2同上述实施例1，其区别在于中药提取液制备步骤中：称取葛花20g、枳椇子15g、白术6g、黄芪6g、枸杞6g、干姜6g、茯苓4.5g、泽泻6g、人参4.5g、木香3g、青皮3g、陈皮4.5g。 [0061] 实施例3同上述实施例1，其区别在于中药提取液制备步骤中：称取葛花18g、枳椇子25g、白术6g、黄芪6g、枸杞6g、干姜6g、茯苓4.5g、泽泻6g、人参4.5g、木香3g、青皮3g、陈皮4.5g。 [0062] 2、发酵对中药提取物活性物的影响1)实验方案：利用非靶代谢组学分析中药提取物发酵前后(中药提取液和发酵中药饮)的差异代谢物； 2)实验结果：总共鉴定出93种显著变化的差异代谢物，包含11种糖类、27种有机酸、10种氨基酸、4种酚类物质、9种酮类物质、9种醛类物质、9种核苷、6种糖苷以及维生素、无机盐等，如表4所示。表4发酵前后显著变化的差异代谢物名称差异倍数流速(m/z) VIP值肉桂酸甲酯 4.309 163.075 1.607 缬胺酸 1.933 118.086 2.795 鸟氨酸 32.021 133.097 2.130 门冬氨酸 1.461 132.030 1.058 鹰嘴豆芽素A 1.859 283.061 1.414 由表4可知，发酵液中肉桂酸甲酯(Methyl cinnamate)、鹰嘴豆芽素A(biochanin A)、鸟氨酸(L‑ornithine)、门冬氨酸(D‑Aspartic acid)和缬胺酸(Valine)等物质的含量显著上升。biochaninA是一种氧化甲基化异黄酮化合物，发酵后含量显著增加。鹰嘴豆芽素A的分子结构与动物雌激素相似，因此能与雌激素受体竞争性结合，发挥类似雌激素的作用。鹰嘴豆芽素A能上调小鼠肝脏中胆固醇7α‑羟化酶(CYP7A1)和低密度脂蛋白受体(LDLR)的表达、同时抑制固醇调节元件结合蛋白(SREBP)‑1c的产生和过氧化物酶体增殖激活受体(PPAR)‑γ的激活，促进胆固醇的吸收和排泄，从而调节肝脏脂质代谢。鹰嘴豆芽素A还能调节NfκB通路和Nrf2通路，抑制炎性体的激活。在ALD患者中，血氨升高是肝细胞功能障碍的特征，会进一步加重肝细胞损伤。L‑鸟氨酸能降低肝脏中的氨水平，从而有效抑制ALT和AST等肝损伤指标，此外还能减轻中心叶细胞死亡、肝细胞扩张、炎症细胞浸润和坏死。缬氨酸能改善肠绒毛形态，增强肠道屏障，减少盲肠中致病菌的数量，从而有效减少LPS的渗漏。此外，该溶液富含肉桂酸甲酯，可提高小鼠肝脏、十二指肠和结肠的抗氧化能力，减少酒精对肝脏的损害。 [0063] 3、上发酵中药饮对小鼠急性醉酒模型的解酒护肝作用1)实验材料：SPF级健康、雄性C57BL/6N小鼠，体重约为20.00±2g/只。由宁波大学实验动物中心提供。 [0064] 2)实验方案：取小鼠30只，随机均分成6组：空白组、模型组、阳性组、实验组。整个实验过程主要可分为两个阶段：干预期(Day 1‑8)和造模期(Day 8‑9)。在干预期(Day 1‑8)，空白组与模型组小鼠灌胃无菌PBS，阳性组灌胃水飞蓟素100mg/(kg bw)，实验组灌胃发酵中药饮。每日固定时间灌胃1次，每次每只小鼠均灌胃15mL/kg的相应溶液，连续7d。实验第8天即为造模期，首先，每组灌胃相应溶液，1h后除空白组，其余各组均灌胃50％(v/v)酒精15mL/kg，连续3次，每次间隔12h。末次酒精灌胃后，小鼠禁食不禁水1.5h，称取小鼠体重并采集相应血清和肝脏样本。利用试剂盒，测定小鼠血清中乙醇、乙醛含量、丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)水平，以及肝脏中乙醇脱氢酶(ADH)、乙醛脱氢酶(ALDH)的酶活，并对小鼠肝脏进行HE染色。 [0065] 3)实验结果：小鼠肝脏进行HE染色如下图10所示，结果图10可知，空白组小鼠的肝细胞有完整结构、排列紧致，无明显炎症细胞及其他组织学异常。而MG组小鼠有严重的肝损伤特征，但经过解酒护肝中药饮处理后，小鼠肝细胞较完整且沿肝索整齐排列，虽有部分脂滴和核溶解现象，但绝大部分肝细胞的细胞核仍清晰可见。检测结果如下表5所示，表5解酒护肝中药饮对急性醉酒小鼠模型的影响注：，显著差异(P＜0.05)；，极显著差异(P＜0.01)。 [0066] 血液中乙醇的含量可以反映酒精中毒严重程度。在一定程度上，ALD和ALDH酶的活性与酒精的代谢速率密切相关，由表5可知，在小鼠饮酒后，血清中乙醇含量显著升高，而经过解酒护肝中药处理后，小鼠血清中乙醇含量显著下降。乙醛对人体有很强的毒害作用，能破坏细胞的功能性和完整性，引发肝脏炎症反应，活化肝星状细胞，刺激生成胶原蛋白，加速慢性肝损伤和肝纤维化发展，同时因饮酒而导致的情绪烦躁、思绪混乱以及肢体不受控等都主要由乙醛导致。由表5可知，经过解酒护肝中药处理后可显著降低小鼠血清中乙醛的含量，达到解酒护肝的功效。 [0067] 急性酒精性肝损伤小鼠血清中ALT和AST的水平，如表5所示。与空白组相比，模型组小鼠血清中ALT和AST水平显著升高，同时与模型组相比，经过发酵中药饮处理后小鼠血清中ALT、AST水平均显著下降，这表明使用发酵中药饮处理急性酒精性肝损伤小鼠，能减轻因酒精而造成的肝损伤，对小鼠肝脏有一定的保护作用。 [0068] 4、发酵中药饮对小鼠慢性醉酒模型的解酒护肝作用1)实验材料：SPF级健康、雄性C57BL/6N小鼠，体重约为20.00±2g/只。由宁波大学实验动物中心提供。 [0069] 2)实验方案：小鼠20只，随机均分成4组：空白组、模型组、阳性组、实验组，共实验8周。实验第一周，为使小鼠适应液体食物，每组小鼠均被喂食不含酒精的Lieber DeCarli液体饲料，第二周开始，除空白组外，其余各组分别喂食含乙醇的Lieber DeCarli液体饲料，饲料中的乙醇浓度每三天增加1％，直至饲料中乙醇浓度达到3.73％，既第1‑3天喂食含1％乙醇的Lieber DeCarli液体饲料，第4‑6天喂食含2％乙醇的Lieber DeCarli液体饲料，第6‑8天喂食含3％乙醇的Lieber DeCarli液体饲料，第9天开始喂食含3.73％乙醇的Lieber DeCarli液体饲料直至试验结束。实验期间，每日固定时间对每组小鼠进行灌胃，灌胃条件与急性肝损伤模型相同。小鼠末次灌胃后，禁食不禁水12h，采集小鼠的血清和肝脏样本。利用试剂盒，测定小鼠血清中丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)水平，肝脏中乙醇脱氢酶(ADH)、乙醛脱氢酶(ALDH)，并对小鼠肝脏进行HE染色。 [0070] 3)实验结果：小鼠肝脏进行HE染色如下图11所示；由图11可知，模型组小鼠肝细胞边界混乱、广泛水肿、排列松散，有大量炎性细胞浸润，与血清和肝脏匀浆相关指标结果一致。但是经过解酒护肝中药饮处理过后，小鼠肝细胞水肿现象减轻、完整性增强，细胞核清晰可见，肝索结构更为清晰。检测结果如下表6所示，表6解酒护肝中药饮对慢性醉酒小鼠模型的影响组别空白组模型组阳性组实验组 * ADH(U/g) 2.58±0.48 5.78±0.88 7.62±0.87 6.81±0.67 ** * ALDH(U/g) 4.73±0.48 3.03±0.69 5.56±0.79 5.54±0.70 ALT(U/L) 19.04±2.98 39.00±4.71 24.98±2.71 24.91±3.38 * AST(U/L) 35.31±2.35 56.34±6.82 39.77±2.62 47.88±3.18 注：，显著差异(P＜0.05)；，极显著差异(P＜0.01)。 [0071] 由表6可知，经发酵中药饮处理后，能显著提升慢性肝损伤小鼠的的乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的活性，减轻酒精对肝脏造成的损伤。并且可以降低小鼠血清中ALT、AST水平，上述数据证明解酒护肝中药饮能减轻因酒精而造成的慢性肝损伤，对小鼠肝脏有保护作用。 [0072] 五、产品应用例二1、具体实施例实施例1 一种具有解酒护肝功效的固体微生态制剂的制备方法，包括以下步骤： 1、中药提取液制备：称取葛花15g、枳椇子20g、白术6g、黄芪6g、枸杞6g、干姜6g、茯苓4.5g、泽泻6g、人参4.5g、木香3g、青皮3g和陈皮4.5g，用破壁机将药材进行充分粉碎，过 80目筛；加入中药材粉末10倍体积的超纯水浸透中药材粉末，煎煮1h，纱布过滤除去大颗粒物后，进行两次离心取上清液，121℃灭菌15min，得到中药提取液； 2、发酵：将益生菌发酵剂按体积比4％的比例接种于步骤1得到的中药提取液，37℃发酵48h，得到发酵中药饮； 3、发酵中药冻干粉的制备：取步骤2得到的发酵中药饮，在3000rpm、4℃的条件下离心15min，取上清放入‑80℃冰箱过夜预冻，将预冻好的样品于‑49℃，9Pa冷冻干燥48h，即为发酵中药冻干粉； 4、乳酸菌冻干粉的制备：取步骤3中去除上清后得到的乳酸菌沉淀，使用无菌PBS 8 缓冲液将菌体浓度分别调节至1×10 CFU/mL后，于8000rpm、4℃的条件下离心15min，取沉淀加入与发酵中药饮等体积的冻干保护剂，混匀放入‑80℃冰箱过夜预冻，将预冻好的样品于‑49℃，9Pa冷冻干燥48h，取出样品，即为乳酸菌冻干粉。其中冻干保护剂配方为118.2g/L海藻糖、17.1g/L L‑半胱氨酸、10.3g/L山梨醇、1.7g/L乙酸钠和120g/L脱脂奶粉5； 5、固体微生态制剂的制备将步骤3得到的发酵中药冻干粉与步骤4得到的乳酸菌冻干粉等质量混合后，即得到具有解酒护肝功效的固体微生态制剂，命名为固体微生态制剂中浓度组。 [0073] 实施例2同上述实施例1，其区别在于：步骤4中取乳酸菌沉淀使用无菌PBS缓冲液将菌体浓 7 度分别调节至1×10CFU/mL，将最终制备得到的固体微生态制剂命名为固体微生态制剂低浓度组。 [0074] 实施例3同上述实施例1，其区别在于：步骤4中取乳酸菌沉淀使用无菌PBS缓冲液将菌体浓 9 度分别调节至1×10CFU/mL，将最终制备得到的固体微生态制剂命名为固体微生态制剂高浓度组。 [0075] 实施例5同上述实施例1，其区别在于中药提取液制备步骤中：称取葛花20g、枳椇子15g、白术6g、黄芪6g、枸杞6g、干姜6g、茯苓4.5g、泽泻6g、人参4.5g、木香3g、青皮3g、陈皮4.5g。 [0076] 实施例6同上述实施例1，其区别在于中药提取液制备步骤中：称取葛花18g、枳椇子25g、白术6g、黄芪6g、枸杞6g、干姜6g、茯苓4.5g、泽泻6g、人参4.5g、木香3g、青皮3g、陈皮4.5g。 [0077] 2、固体微生态制剂对小鼠急性醉酒模型的解酒护肝作用1)实验材料：SPF级健康、雄性C57BL/6N小鼠，体重约为20.00±2g/只。由宁波大学实验动物中心提供。 [0078] 2)实验方案：取小鼠25只，随机均分成5组：空白组、模型组、低浓度组、中浓度组和高浓度组。整个实验过程主要可分为两个阶段：干预期(Day 1‑7)和造模期(Day8)。在干预期(Day 1‑7)，空白组与模型组小鼠灌胃无菌PBS，阳性组灌胃水飞蓟素(100mg/(kg bw))，低浓度组、中浓度组和高浓度组则分别为低、中、高浓度的固体微生态制剂。每日固定时间灌胃1次，每次每只小鼠均灌胃15mL/kg的相应溶液，连续7d。实验第8天即为造模期，首先，每组灌胃相应溶液，1h后除空白组，其余各组均灌胃50％(v/v)酒精15mL/kg，小鼠禁食不禁水1.5h。称取小鼠体重并采集相应血清和肝脏样本。利用试剂盒，测定小鼠血清中乙醇、乙醛含量、丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)水平，以及肝脏中乙醇脱氢酶(ADH)、乙醛脱氢酶(ALDH)水平，并对小鼠肝组织进行HE染色。 [0079] 3)实验结果：小鼠肝脏进行HE染色如下图12所示，由图12可知，空白组组小鼠肝细胞结构完整，细胞核清晰。模型组组小鼠肝细胞结构混乱，发生肿胀，胞排列不整齐，间隙内存在油脂脂滴。而经过低、中和高浓度固体微生态制剂处理后，肝脏细胞形态趋于正常，细胞间隙内油脂脂滴减少，证明上述固体微生态制剂处理能有效缓解酒精对肝脏造成的急性损伤。检测结果如下表7所示表7固体微生态制剂对急性醉酒小鼠模型的影响组别空白组模型组低浓度组中浓度组高浓度组 * * * * 乙醇(mg/mL) 0.02±0.00 4.67±0.47 3.83±0.22 3.34±0.36 3.19±0.52 ** * * * 乙醛(μg/mL) 2.88±0.34 91.44±6.45 81.38±3.68 81.62±5.51 74.75±4.86ADH(U/mg) 8.36±0.31** 6.62±0.79 16.64±0.69 17.88±0.53* 21.02±0.63ALDH(U/mg) 5.35±0.22 4.73±0.34 8.65±0.66* 11.73±0.58* 11.56±0.83*** * * * ALT(U/L) 16.41±3.36 46.13±4.73 36.52±6.14 38.73±5.22 33.63±6.89 ** * * * AST(U/L) 33.27±3.96 60.10±5.23 48.63±7.64 46.41±8.41 44.63±8.86 注：，显著差异(P＜0.05)；，极显著差异(P＜0.01)；*。 [0080] 血液中乙醇的含量可以反映酒精中毒严重程度。在一定程度上，ALD和ALDH酶的活性与酒精的代谢速率密切相关，由表7可知，在小鼠饮酒后，血清中乙醇含量显著升高，而经过固体微生态制剂处理后，小鼠血清中乙醇含量和乙醛含量显著下降，达到解酒护肝的功效。 [0081] 急性酒精性肝损伤小鼠血清中ALT和AST的水平，如表7所示。与空白组相比，模型组小鼠血清中ALT和AST水平显著升高，同时与模型组相比，经过固体微生态制剂处理后小鼠血清中ALT、AST水平均显著下降，这表明使用固体微生态制剂处理急性酒精性肝损伤小鼠，能减轻因酒精而造成的肝损伤，对小鼠肝脏有一定的保护作用。 [0082] 3、固体微生态制剂对小鼠慢性醉酒模型的解酒护肝作用1)实验材料：SPF级健康、雄性C57BL/6N小鼠，体重约为20.00±2g/只。由宁波大学实验动物中心提供。 [0083] 2)实验方案：小鼠20只，随机均分成4组，分组情况与急性肝损伤模型相同，共实验8周。实验第一周，为使小鼠适应液体食物，每组小鼠均被喂食不含酒精的Lieber DeCarli液体饲料，第二周开始，除空白外，其余各组分别喂食含乙醇的Lieber DeCarli液体饲料，饲料中的乙醇浓度每三天增加1wt％，直至饲料中乙醇浓度达到3.73％，直至试验结束。实验期间，每日固定时间对每组小鼠进行灌胃，灌胃条件与急性肝损伤模型相同。小鼠末次灌胃后，禁食不禁水12h，采集小鼠的血清和肝脏样本。利用试剂盒，测定小鼠血清中丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)水平，肝脏中乙醇脱氢酶(ADH)、乙醛脱氢酶(ALDH)、丙二醛、肿瘤坏死因子‑α(TNF‑α)，并对小鼠肝组织进行HE染色。对小鼠肠道菌群进行16Sr RNA测序分析，探讨解酒护肝固体微生态制剂对小鼠肠道菌群的影响。 [0084] 3)实验结果：小鼠肝脏进行HE染色如下图13所示，由图13可知，空白组小鼠的肝细胞的细胞核清晰且位于细胞中央，细胞排列紧致，组织无水肿，模型组小鼠有严重的肝损伤特征，其而经过固体微生态制剂小鼠的肝损伤程度明显减轻，肝细胞水肿现象减轻、完整性更好，细胞核清晰可见。检测结果如下表8所示，表8解酒护肝固体微生态制剂对慢性醉酒小鼠模型的影响注：，显著差异(P＜0.05)；**，极显著差异(P＜0.01)。 [0085] 由表8可知，经解酒护肝固体微生态制剂处理后，能显著提升慢性肝损伤小鼠的乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的活性，减轻酒精对肝脏造成的损伤。并且可以降低小鼠血清中ALT、AST水平，表明解酒护肝中药饮能减轻因酒精而造成的慢性肝损伤，此外解酒护肝固体微生态制剂还可以降低小鼠的氧化应激水平和炎症水平，对小鼠肝脏有出色的保护作用。 [0086] 经过解酒护肝固体微生态制剂处理后，从小鼠肠道微生物在属水平上的物种相对丰度柱形图，如图14所示。解酒护肝固体微生态制剂可增加小鼠肠道中产短链脂肪酸和丁酸盐的菌如：Pabacteroides、Alloprevotella、Paenalcaligenes、Monoglobus和Dubosiella等多种有益菌的含量，提高小鼠菌群的多样性，促进肠道中有益菌的定植。 [0087] 上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。