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一种改良罗伊氏菌培养基、同一体功能化罗伊氏活菌家畜添加剂及应用
申请号	CN202311601632.9	申请日	2023-11-28	公开(公告)号	CN117511815A	公开(公告)日	2024-02-06
申请人	西藏爱牧科技发展有限公司;			发明人	田发益; 扎西; 武俊喜; 刘贵芳; 陈永旭;
摘要	本发明公开了一种改良罗伊氏菌培养基、同一体功能化罗伊氏活菌家畜添加剂及应用，涉及微生物及生物化学技术领域。本发明的改良罗伊氏菌培养基，所述培养基为液体培养基，包括以下配方的组分：食用红糖20.3g/L、葡萄糖 10.5g/L、麦芽糖5.0g/L、蜂蜜5.0mL/L、酵母浸粉38.2g/L、大豆蛋白胨114.7g/L、乙酸钠8.5g/L、缓冲液4.4g/L、大量元素0.13g/L、甘油1.5mL/L、扩散剂1.5g/L、无机硒100μg/L。本发明还制备了一种集益生菌、富有机硒、富罗伊氏菌素于一体的家畜生长添加剂。本发明制备的添加剂产品中罗伊氏菌素在保存第1d含量最高，达到25.62mM，之后发生缩合反应，15d后缩合反应达到平衡，最终浓度维持在3mM左右。并对已发明的产品进行牦牛饲喂试验，取得良好的效果。
权利要求	1.一种改良罗伊氏菌培养基，其特征在于：所述培养基为液体培养基，每升所述液体培养基中包括以下配方的组分：食用红糖20.3g/L、葡萄糖10.5g/L、麦芽糖5.0g/L、蜂蜜5.0mL/L、酵母浸粉38.2g/L、大豆蛋白胨114.7g/L、乙酸钠8.5g/L、缓冲液4.4g/L、大量元素0.13g/L、甘油1.5mL/L、扩散剂 1.5g/L、无机硒100μg/L。 2.根据权利要求1所述的改良罗伊氏菌培养基，其特征在于：所述缓冲液由2.2g/L柠檬酸氢二铵和2.2g/L磷酸氢二钾组成；所述大量元素由0.1g/L硫酸镁、0.03g/L硫酸锰组成；所述扩散剂为吐温‑80。 3.一种富硒罗伊氏活菌的制备方法，其特征在于：所述方法具体包括如下步骤：按比例将罗伊氏菌种子液接种到改良罗伊氏菌培养基中，搅拌均匀后，转移至37℃恒温条件下半需氧培养发酵48h；然后将所得发酵液离心、沉淀活菌液，去除培养基；再用PBS缓冲液溶解、离心，留沉淀活菌，重复多次，得到纯化富硒罗伊氏活菌。 4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述纯化富硒罗伊氏活菌中的活菌数 9 为9.8×10CFU/mL，菌体干物质量达到4.7g/L。 5.权利要求3或4所述方法制备得到的纯化富硒罗伊氏活菌。 6.权利要求3或4所述方法制备得到的纯化富硒罗伊氏活菌在制备同一体功能化罗伊氏活菌家畜添加剂中的应用。 7.一种同一体功能化罗伊氏活菌家畜添加剂，其特征在于：包括权利要求3或4所述方法制备得到的纯化富硒罗伊氏活菌。 8.权利要求7所述的一种同一体功能化罗伊氏活菌家畜添加剂的制备方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：按配比将所述纯化富硒罗伊氏活菌与菌体保存液混匀，分装，得到所述的同一体功能化罗伊氏活菌家畜添加剂，然后在4℃条件保存。 9.权利要求3或4所述方法制备得到的纯化富硒罗伊氏活菌或权利要求7所述同一体功能化罗伊氏活菌家畜添加剂在畜禽养殖、制备抗生素替代品、制备抗肠道疾病畜禽产品以及制备畜禽用免疫增强药物方面的应用。 10.一种抗生素替代品、抗肠道疾病畜禽产品或畜禽用免疫增强药物，其特征在于：包括权利要求3或4所述方法制备得到的纯化富硒罗伊氏活菌或权利要求7所述同一体功能化罗伊氏活菌家畜添加剂。
说明书全文	一种改良罗伊氏菌培养基、同一体功能化罗伊氏活菌家畜添加剂及应用技术领域 [0001] 本发明涉及微生物及生物化学技术领域，具体涉及一种改良罗伊氏菌培养基、同一体功能化罗伊氏活菌家畜添加剂及应用。背景技术 [0002] 家畜集约化养殖过程中，国家明文规定禁止添加任何抗生素。但在实际养殖过程中，普遍存在添加抗生素的现象。其后果是大多数微生物产生耐药性，家畜发病后出现无药可治的现象，微生物的耐药性也影响人的健康。我国是土壤硒大面积缺乏的国家之一。因土壤本底硒的缺乏，在植物和动物性产品中，硒含量也较低。硒又是人体中不可或缺的微量元素，可减缓人的衰老，提高机体免疫力的作用。同时，在消化道食糜和代谢物中，每毫升含上亿，甚至达几十亿的微生物，这些庞杂的微生态平衡状态不仅影响家畜抵抗致病菌的增殖，而且对家畜育肥，提高生产性能具有特别重要的功能。这是本发明需要解决这些问题的立足点。 [0003] 对我国二十多个省市地区进行调查，发现高达72％的国土属缺硒地区，其中30％是严重缺硒地区。但家畜单纯补无机硒极易引起中毒，且硒的利用率低。经研究，牛羊对无机硒的最高耐受量为2mg/kg DM。 [0004] 有机硒在生物体内以硒酶和硒蛋白的形式存在。饲补有机硒不会引发家畜硒中毒的症状发生。据现有研究结果发现硒蛋白分7个类别，30种硒蛋白，分别是谷胱甘肽过氧化物酶有5种(GSH‑PX1、GSH‑PX2、GSH‑PX3、GSH‑PX4、GSH‑PX6)、硫氧还蛋白还原酶3种(TXNRD1、TXNRD2、TXNRD3)、5‑脱碘酶有3种(DIO1、DIO2、DIO3)、蛋氨酸‑R‑亚砜还原酶2种(MSRB1、MSRB1)、硒蛋白12种(SELENOE、‑H、‑I、‑K、‑M、‑N、‑O、‑P、‑S、‑‑T、‑V、‑W)、硒磷酸合成酶2种(SEPHS1、SEPHS2)、谷胱甘肽过氧化物酶3种(GPX5、GPX7、GPX8)等。此外，硒还以硒多糖、硒氨基酸、硒核酸、硒类脂(硒磷脂)及其衍生物形式存在于生物体内。 [0005] 罗伊氏菌属乳杆菌属(Lactobacillus)，是一种革兰氏阳性益生菌，也是人和家畜消化道的一种正常栖息菌。一般情况下，罗伊氏菌不仅可促进消化，也可抑制致病菌的增殖，改善消化道微环境，有利于家畜的健康。同时，罗伊氏菌是一种高效无机硒利用菌，对无机硒的耐受量较高。罗伊氏菌在增殖过程中，还可以产生罗伊氏菌素，罗伊氏菌素是一种β‑羟基丙醛，具有广谱抗真菌和细菌的作用，当罗伊氏菌素达到20mM时，可抑制除自身外的几乎常见的大部分真菌和细菌。研究表明，罗伊氏菌素还具有预防直肠癌的功能。 [0006] 但是，现有关于罗伊氏菌的报道资料中，罗伊氏菌最高有机硒转化量和罗伊菌素最高产生量均较低，并且现有技术也没有开发出将罗伊氏菌、富有机硒和罗伊氏菌素集一体的功能性产品。 [0007] 基于上述理由，特提出本申请。发明内容 [0008] 基于上述理由，针对现有技术中存在的问题或缺陷，本发明的目的在于提供一种改良罗伊氏菌培养基、同一体功能化罗伊氏活菌家畜添加剂及应用，解决或至少部分解决现有技术中存在的上述技术缺陷：本发明用于解决改善消化道微环境、治病、补硒于一体的技术，还解决了家畜养殖过程中滥用抗用生素的问题，解决了因无机硒补饲引起的中毒性问题，改善了消化道微环境，提高家畜生产性能和肉产品附加值等的技术问题。 [0009] 为了实现本发明的上述第一个目的，本发明采用的技术方案如下： [0010] 一种改良罗伊氏菌培养基，所述培养基为液体培养基，每升所述液体培养基中包括以下配方的组分： [0011] 食用红糖20.3g/L、葡萄糖10.5g/L、麦芽糖5.0g/L、蜂蜜5.0mL/L、酵母浸粉38.2g/L、大豆蛋白胨114.7g/L、乙酸钠8.5g/L、缓冲液4.4g/L、大量元素0.13g/L、甘油1.5mL/L、扩散剂1.5g/L、无机硒100μg/L。 [0012] 具体地，上述技术方案，所述改良罗伊氏菌培养基中包括基本养分、缓冲液、大量元素、扩散剂、临界无机硒五部分组成。其中：所述配方中采用的甘油主要有两方面的作用：一方面，为罗伊氏菌提供所需营养物质；另一方面，作为扩散剂和/或诱发剂。 [0013] 进一步地，上述技术方案，所述改良罗伊氏菌培养基的干物质量为209.73g/L。 [0014] 进一步地，上述技术方案，所述缓冲液包括柠檬酸氢二铵和磷酸氢二钾。在本发明的一个优选实施例中，所述缓冲液由2.2g/L柠檬酸氢二铵和2.2g/L磷酸氢二钾组成。 [0015] 进一步地，上述技术方案，所述大量元素包括硫酸镁和硫酸锰。在本发明的一个优选实施例中，所述大量元素由0.1g/L硫酸镁、0.03g/L硫酸锰组成。 [0016] 进一步地，上述技术方案，在本发明的一个优选实施例中，所述扩散剂为吐温‑80。 [0017] 进一步地，上述技术方案，在本发明的一个优选实施例中，所述无机硒为亚硒酸钠。 [0018] 具体地，上述技术方案，所述改良罗伊氏菌培养基中亚硒酸钠含量达到100μg/L时，亚硒酸钠对罗伊氏菌的毒性达到临界值，且无机硒转化为硒蛋白的转化率也达到最高，即每g罗伊氏菌最高硒转化量达到4.40mg/g。 [0019] 本发明的第二个目的在于提供一种富硒罗伊氏活菌的制备方法，所述方法具体包括如下步骤： [0020] 按比例将罗伊氏菌种子液接种到改良罗伊氏菌培养基中，搅拌均匀后，转移至37℃恒温条件下半需氧培养发酵48h；然后将所得发酵液离心、沉淀活菌液，去除培养基；再用PBS缓冲液溶解、离心，留沉淀活菌，重复多次，得到纯化富硒罗伊氏活菌。 [0021] 进一步地，上述技术方案，所述罗伊氏菌种子液按照5％(V/V)的接种量接种到改良罗伊氏菌培养基中。 [0022] 进一步地，上述技术方案，所得纯化富硒罗伊氏活菌中的罗伊氏活菌数为9.8×9 10CFU/mL，菌体干物质量达到4.7g/L。 [0023] 本发明的第三个目的在于提供上述所述方法制备得到的纯化富硒罗伊氏活菌。 [0024] 本发明的第四个目的在于提供上述所述纯化富硒罗伊氏活菌在制备同一体功能化罗伊氏活菌家畜添加剂中的应用。 [0025] 本发明的第五个目的在于提供一种同一体功能化罗伊氏活菌家畜添加剂，包括上述所述纯化富硒罗伊氏活菌。 [0026] 本发明的第六个目的在于提供上述所述同一体功能化罗伊氏活菌家畜添加剂的制备方法，所述方法包括如下步骤：按配比将所述纯化的富硒罗伊氏活菌与菌体保存液混匀，分装，得到所述的同一体功能化罗伊氏活菌家畜添加剂，然后在4℃条件下保存。 [0027] 进一步地，上述技术方案，在本发明的一个优选实施例中，所述纯化的富硒罗伊氏活菌与菌体保存液的重量比为1.2:8.8(W:W)。 [0028] 进一步地，上述技术方案，在本发明的一个优选实施例中，所述菌体保存液的配方如下： [0029] 每1升的菌体保存液成分为：缓冲液：K2HPO4 12.6g、KH2PO4 3.6g；等渗溶液渗透压成分：柠檬酸钠0.98g、MgSO4·7H2O 0.18g；罗伊氏菌素诱发剂和防冻剂：甘油88g。 [0030] 本发明的第七个目的在于提供上述所述纯化富硒罗伊氏活菌或同一体功能化罗伊氏活菌家畜添加剂在畜禽养殖、制备抗生素替代品、制备抗肠道疾病畜禽产品以及制备畜禽用免疫增强药物等方面的应用。 [0031] 本发明的第八个目的在于提供一种抗生素替代品、抗肠道疾病畜禽产品或畜禽用免疫增强药物，包括本发明上述所述纯化富硒罗伊氏活菌、或同一体功能化罗伊氏活菌家畜添加剂。 [0032] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果： [0033] (1)本发明通过改良罗伊氏菌培养基，研究罗伊氏菌最高有机硒转化量、罗伊活菌保存液、罗伊菌素最高产生量等变化规律，解决了罗伊氏活菌高得率、富有机硒、富罗伊氏菌素的一种同一体功能化罗伊氏菌素家畜添加剂的制备和生产流程，此流程解决了罗伊氏菌从单一功能到集多功能，可规模化生产的理论和流程。 [0034] (2)本发明制备了一种集益生菌、富有机硒、富罗伊氏菌素于一体的家畜生长添加剂。本发明特点在于操作简单，制备的添加剂无任何毒副作用，所抗微生物也不会产生耐药性，所添加药品无任何致病风险或饲用添加剂违禁品。 [0035] (3)本发明从最大量提高产菌量、有机硒转化量和自然产罗伊氏菌素最高量25.62mM(30mM时将抑制自身菌生长，Valentine等)，并对已发明的产品进行牦牛饲喂试验，取得良好的效果。附图说明 [0036] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。 [0037] 图1为实施例2中硒测定标准曲线图； [0038] 图2为实施例2中罗伊氏菌素的标准曲线图； [0039] 图3为实施例2中罗伊氏菌素含量与保存天数的关系曲线图； [0040] 图4中(a)和(b)为实施例2中制备得到的富硒罗伊氏活菌液的产品实物图； [0041] 图5为应用实施例2中的富硒罗伊氏菌“草饼干”实物图。具体实施方式 [0042] 本发明提供了一种改良罗伊氏菌培养基、同一体功能化罗伊氏活菌家畜添加剂及应用，涉及微生物学及生物化学等领域。①本发明采用的罗伊氏菌属乳杆菌属 (Lactobacillus)，(购自上海酶联生物科技有限公司，编号ATCC 23272)是一种革兰氏阳性益生菌，可改善家畜消化道菌群微环境的作用。罗伊氏菌在单位体积内增殖的最大条件在于培养基的养分、菌体代谢产物的自身抑制、液体增菌液的渗透压及缓冲液的缓冲能力。本发明采用改良培养基，在临界无机硒环境下菌体得率达到4.7g/L。②硒是生物体一种重要的痕量元素，可提高动物的免疫力，提高畜产品的附加值。单质硒或无机硒化合物毒性极高，在动物体内转化率低，饲料添加存在一定风险性。本发明通过试验，使无机硒最大可能转化为菌体硒蛋白或其他硒化合物，提高硒的利用率和硒产品的安全性。试验选用罗伊氏菌对亚硒酸钠的最高耐受量100μg/mL，经过37℃环境下培养48h，每g罗伊氏菌最高硒转化量达4.40mg/g。③罗伊氏菌产生的罗伊氏菌素具有广谱抗菌性。本发明通过添加罗伊氏菌素诱发剂，使富硒罗伊氏菌产生罗伊氏菌素。经测定，本发明制备的添加剂产品中罗伊氏菌素在保存第1d含量最高，达到25.62mM，之后发生缩合反应，15d后缩合反应达到平衡，最终浓度维持在3mM左右。需要强调的是，罗伊氏菌素在25.62mM条件下，除过本菌外，基本可抑制几乎常见的大部分真菌和细菌的增殖。④100mL终产品中加活菌保护液，含罗伊氏活菌12±0.5mg/瓶(100mL菌体干物质)，罗伊氏菌素达到189.79mg/100mL。4℃环境下保存3个月，活菌率达80％。经100mL富硒罗伊氏菌/头·d的终产品进行牦牛饲喂3个月，试验牦牛增重和生长良好，也无任何消化道疾病发生。此产品无任何毒副作用，所抗微生物也不会产生耐药性，所添加药品无任何致病风险或饲用添加剂违禁品。 [0043] 下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。 [0044] 为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。 [0045] 本发明中所采用的设备和原料等均可从市场购得，或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法 [0046] 本发明下述实施例或应用实施例中采用的罗伊氏菌为现有菌种，购自上海酶联生物科技有限公司，编号ATCC 23272。 [0047] 本发明下述实施例或应用实施例中采用的MRS固体培养基的具体配方组分参照海博生物网(http://www.hopebiol.com/asphtml/product747.htm)，具体成分如下(g/L)：蛋白胨10.0，牛肉浸粉8.0，酵母浸粉4.0，葡萄糖20.0，磷酸氢二钾2.0，柠檬酸氢二铵2.0，乙酸钠5.0，硫酸镁0.2，硫酸锰0.04，琼脂14.0，吐温80 1.0，25℃pH值6.5±0.2。 [0048] 本发明下述实施例或应用实施例中采用的PBS缓冲液的具体配方组分如下： [0049] 氯化钠9.4g/L，氯化钾0.224g/L，磷酸二氢钠1.137g/L，磷酸氢二钠0.12g/L，pH7.3 25℃。加热溶解于1000mL蒸馏水中分装，121℃高压灭菌15min，备用。 [0050] 本发明下述实施例或应用实施例中改良罗伊氏菌培养基中各成分均购自青岛海博生物技术有限公司。 [0051] 实施例1 [0052] 本实施例提供一种改良罗伊氏菌培养基，具体配方筛选方法如下： [0053] 罗伊氏菌的基础培养基为MRS，对MRS中主要糖分和蛋白成分进行正交设计(参见表1和表2)，以100mL为培养量，将罗伊氏菌种子液按照5％(V/V)的接种量接种到改良罗伊氏菌培养基中，按下表1称样、灭菌、37℃、48h培养，培养结束后，5000rpm，15min离心。所得沉淀用PBS缓冲液搅拌溶解，再按5000rpm，15min离心，去除杂质，重复操作3次。所获纯化富硒罗伊氏活菌，经80℃干燥，称重计算。经试验13号和14号中罗伊氏菌产量最高，从培养基价值考虑，选取14号为基本优化培养基。最后选择食用红糖20.3g/L、葡萄糖10.5g/L、麦芽糖5.0g/L、天然蜂蜜5.0mL/L、酵母浸粉38.2g/L、大豆蛋白胨114.7g/L。乙酸钠8.5g/L；柠檬酸氢二铵2.2g/L、磷酸氢二钾2.2g/L、硫酸镁0.1g/L、硫酸锰0.03g/L、吐温‑80 1.5g/L。 1.5mL/L甘油、100μg/L亚硒酸钠由硒试验结果确定含量。 [0054] 表1罗伊氏菌培养基主要养分L25(46)正交设计含量值 [0055] [0056] 表2罗伊氏菌培养基主要养分L25(46)正交设计试验结果 [0057] [0058] [0059] 培养基中甘油的筛选。 [0060] 利用上述培养基，培养基中甘油的添加量为1mL/L、1.2mL/L、1.5mL/L、1.8mL/L、2.0mL/L、2.2mL/L、2.5mL/L，分别进行诱导罗伊氏菌素产生量的试验，当甘油在1.5mL/L以上时，产生的罗伊菌素均在25.62±0.36mM左右。选甘油最低诱导产生量1.5mL/L为培养基基础成分。 [0061] 培养基中的无机盐，如乙酸钠8.5g/L；柠檬酸氢二铵2.2g/L、磷酸氢二钾2.2g/L、硫酸镁0.1g/L、硫酸锰0.03g/L、吐温‑80 1.5g/L，含量参照MRS培养中的成分进行设计。 [0062] 实施例2 [0063] 本实施例的目的在于确定影响罗伊氏菌培养过程的毒性临界值和有机硒的最高得率的亚硒酸钠浓度，选择最佳培养条件。 [0064] 测定方法及过程如下： [0065] 1.富有机硒罗伊氏菌的提取 [0066] 按照实施例1中的培养基成分和添加罗伊氏菌种量，37℃、半需氧条件下培养发酵48h，培养结束后，离心5000r/min 15min，弃上清液；PBS液洗涤，再离心；重复3次。 [0067] 2.富有机硒罗伊氏菌干物质的消煮 [0068] 所得离心沉淀，80℃干燥，称重。干燥物加2mL浓硝酸，3滴高氯酸，75℃(硝酸沸点是83℃)消煮24h。适量蒸馏水洗入50mL容量瓶中，调pH至中性，定溶到50mL。 [0069] 3.标准曲线的配制 [0070] 标样：6μg/mL亚硒酸钠的标准溶液(0.006g定容到1000mL)；5g/100mL EDTA‑2Na；0.5％ DAB(3,3’‑二氨基联苯胺(硒试剂))。 [0071] 4.显色 [0072] ①取5mL消煮物放在50mL容量瓶中； [0073] ②加EDTA 1mL，掩蔽铁等金属离子； [0074] ③加浓甲酸0.5mL或1M HCl调pH 2～3； [0075] ④加0.5％ DAB溶液4mL，置于暗处反应30～50min； [0076] ⑤用1M NaOH调到中性； [0077] ⑥准确加入5mL或10mL 甲苯(依颜色深浅而定)，摇晃萃取硒(IV)‑硒试剂络合物，分液漏斗分取甲苯萃取液； [0078] ⑦标样取0，1，2，3，4，5mL，分别补水5、4、3、2、1、0mL，其他步骤同②③④⑤⑥方法，其浓度分别为1.2，2.4，3.6，4.8，6.0μg/5mL。 [0079] 5.测定 [0080] 在420nm 波长下测定结果。样品含量计算＝分取倍数×测定值。 [0081] 6.标准曲线 [0082] 表3硒标准曲线浓度与OD值 [0083] [0084] 表4罗伊氏菌转化的有机硒含量测定值 [0085] [0086] 通过试验，选定最高临界亚硒酸钠浓度100μg/mL作为有机硒的转化浓度。 [0087] 本实施例的菌体保存液的配方。菌体保存液基础数据来源于广东环凯微生物科技有限公司。具体配方如下：每1L的成分为：缓冲液：K2HPO4 12.6g、KH2PO43.6g；等渗溶液渗透压成分：柠檬酸钠0.98g、MgSO4·7H2O 0.18g；罗伊氏菌素诱发剂和防冻剂：甘油88g。90d后，通过接种MRS固体培养基培养与比对计数结果，活体菌数达到80％。 [0088] 本实施例还提供了一种纯化富硒罗伊氏活菌液的制备方法，所述方法具体包括如下步骤： [0089] 将罗伊氏菌种子液按照5％(V/V)的接种量接种到改良罗伊氏菌培养基中，搅拌均匀后，转移至37℃恒温条件下半需氧培养发酵48h；然后将所得发酵液离心、除杂，得到纯化富硒罗伊氏活菌液。 [0090] 上述所述离心具体是用贝克曼大容量高速离心机(JXN‑26)5000rpm，15min离心。所得沉淀用PBS缓冲液搅拌溶解，再按5000rpm，15min离心，去除杂质，重复操作3次。100mL活菌保护液含罗伊氏活菌12±0.5mg/瓶(100mL菌体干物质)，无菌封装，4℃条件下保存。所述终产品按不同保存时间测定罗伊氏菌素含量及变化规律。 [0091] 罗伊氏菌素的测定方法参照TALARICO等使用丙烯醛色氨酸比色法测定，并对测定方法进行改良。 [0092] 1.标准曲线和样品的测定方法 [0093] ①丙烯醛溶液 [0094] 取分析纯丙烯醛33.708mL溶于1L的酒精中(或3.3708mL溶于100mL酒精中)，即为0.5M。再取1mL 0.5M的丙烯醛加入99mL酒精，稀释100倍，即配成丙烯醛终浓度为5mM的母液。 [0095] ②以0.1M的盐酸溶解色氨酸，配置终浓度为0.01M的色氨酸溶液。 [0096] ③待测样品经10000rpm 5min离心，取上清液，再经0.22μm超滤膜过滤，所得无菌罗伊氏菌素液。 [0097] ④取0.5mL待测液，再加入2.5mL色氨酸溶液，1mL无水乙醇和6mL浓盐酸(约12M)混合后，37℃静置20min，测定560nm处的吸光度，绘制标准曲线。 [0098] ⑤以同一检测流程测定20倍稀释条件下样品中的罗伊氏菌素。 [0099] 表5罗伊氏菌素的标准曲线组成 [0100] [0101] [0102] 2.测定不同保存期产品中罗伊氏菌素的含量结果 [0103] 表6不同保存期罗伊氏菌素的含量变化 [0104] [0105] 表6中为不同保存期终产品中罗伊氏菌素含量的动态变化值。经测定，保存1d的成品中，罗伊氏菌素含量最高，达到25.62mM。终产品中因低温和贫营养化，活罗伊氏菌的增殖减缓或停滞，新产生的罗伊氏菌素量也随之减少，但自然状态下的罗伊氏菌素具羟基和醛基结构，极易发生缩合反应，保存15d后降至3mM左右，基本达到稳定值，不会再发生大的变化。需要强调的是如果使用此产品进行治病或改善消化道微环境，保存第1d，其功能达到最大化，可抑制除自身外的所有常见细菌、真菌的增殖，抑菌试验结果见下表7(资料来源：[1]Valentine C,Christophe L,Sabine V,et al.Inhibitory activity spectrum of reuterin produced by Lactobacillus reuteri against intestinal bacteria[J].BMC Microbiology,2007,7:101.[2]Allison V, F,Gomaa A,et al.Quantitative antifungal activity of reuterin against food isolates of yeasts and moulds and its potential application in yogurt[J].International Journal of Food Microbiology,2019,289:182‑188.)。 [0106] 表7罗伊氏菌素的抑菌资料来源 [0107] [0108] [0109] [0110] 实施例3 [0111] 本实施例的一种同一体功能化罗伊氏活菌家畜添加剂的制备方法，包括以下步骤： [0112] 步骤1，准确称取6倍(6L)的下列培养基养分，食用红糖20.3g/L、葡萄糖10.5g/L、麦芽糖5.0g/L、蜂蜜5.0mL/L、酵母浸粉38.2g/L、大豆蛋白胨114.7g/L、乙酸钠8.5g/L、柠檬酸氢二铵2.2g/L、磷酸氢二钾2.2g/L、硫酸镁0.1g/L、硫酸锰0.03g/L、1.5mL/L甘油、吐温‑80 1.5g/L，加入蒸馏水5L于10L 铝锅中，煮沸溶解各培养基成分。待培养基中各养分完全溶解后，再加入1L蒸馏水，均等地分装于12个500mL的三角瓶中，加透气硅胶隔菌塞121℃灭菌 15min。 [0113] 步骤2，12个灭菌的三角瓶凉至常温，再加入无菌水配制的亚硒酸钠母液5mL，其中母液中亚硒酸钠的浓度为10mg/L，使培养基中亚硒酸钠的含量在100μg/L。特别强调地是亚硒酸钠不能在高温灭菌前期加入，因为亚硒酸钠在高温环境中，混合的养分可使亚硒酸钠部分还原为单质硒，形成红色沉淀，影响罗伊氏菌对硒的转化和利用。 [0114] 步骤3，上述加入完成的12个三角瓶，放置大型恒温摇床130rpm，37℃条件下半需氧培养48h。 [0115] 步骤4，上述培养完成的12个三角瓶，分装于贝克曼大容量高速离心机(JXN‑26)专用离心试剂瓶中，5000rpm，15min离心。所得沉淀用PBS缓冲液搅拌溶解，再按5000rpm，15min离心，去除杂质，重复操作3次。所获离心纯化富硒罗伊氏活菌用保存液搅拌合并。 [0116] 步骤5，上述罗伊氏活菌种保存液组成如下，每1L由缓冲液：K2HPO4 12.6g、KH2PO4 3.6g；等渗溶液渗透压成分：柠檬酸钠0.98g、MgSO4·7H2O 0.18g；罗伊氏菌素诱发剂和防冻剂：甘油88g组成。 [0117] 步骤6，上述离心纯化的沉淀菌体用罗伊氏菌种保存液500mL搅拌溶解，合并后再加入500mL菌种保存液(每1L菌种保存液的成分为：缓冲液：K2HPO4 12.6g、KH2PO4 3.6g；等渗溶液渗透压成分：柠檬酸钠0.98g、MgSO4·7H2O 0.18g；罗伊氏菌素诱发剂和防冻剂：甘油 88g。)，分装于10个100mL的灭菌终产品包装瓶中，置4℃冰箱保存。 [0118] 步骤7，上述生产的富硒罗伊氏活菌产品，在不同的保存时间段分取1mL，其中10μL8 6 4 用于10 、10 、10 倍比稀释，分别接种MRS固体培养基培养计数，计算活菌率。经测定3个月后，活菌率达80％。且由于罗伊氏菌素的存在，没有任何杂菌产生。0.99mL用于离心、PBS洗涤、用0.22μm超滤膜超滤，测定罗伊氏菌素产生的变化规律，经测定保存第1d含量最高，达到25.62mM，达到自然状态下罗伊氏菌产生罗伊氏菌素的最高值(30mM时抑制自身菌活性)， 15d后缩合反应达到平衡状态，最终浓度维持在3mM左右。 [0119] 应用实施例1 [0120] 本应用实施例是将上述实施例2制备得到的纯化富硒罗伊氏活菌用于牦牛养殖，具体应用方法如下： [0121] 试验在拉萨市林周县松盘乡，林周县格桑塘现代农牧产业示范园进行，自2023年3月30日开始，在园区内开展牦牛舍饲短期育肥试验，试验分为2组，每组100头母牦牛，分别饲喂全价“草饼干”并喷洒富硒罗伊氏活菌产品，并设对照组。试验组每头每天按8Kg左右的“草饼干”进行饲喂，饲喂前“草饼干”上用洒水壶喷洒100mL/头·d罗伊氏活菌进行饲喂。对照组只饲喂“草饼干”，不喷洒罗伊氏活菌。牦牛于2023年4月28日和2023年5月29日称重， 100头牦牛60d饲喂喷洒富硒罗伊氏活菌产品“草饼干”平均增重31.73Kg/头；平均增重 0.53Kg/头·d；对照组牦牛60d饲喂全混合饲料平均增重20.41Kg/头；平均增重0.34Kg/ 头·d。 [0122] 应用实施例2 [0123] 本应用实施例是将上述实施例2制备得到的纯化富硒罗伊氏活菌用于生产富硒罗伊氏菌“草饼干”，具体生产方法如下： [0124] TMR“草饼干”的加工及生产工艺是由发明人于2018年创新的一种反刍家畜新的饲喂方法。它包含饲草粉碎，粉碎饲草(或秸秆)羊饲料要求2cm～3cm长，牛饲料要求3cm～ 5cm。全价精料的配合比例，利用牛羊饲料配比软件，按牛或羊代谢比例进行配合。TMR“草饼干”的加工与生产工艺，要求粗饲料与精饲料均匀混合后，采用生物燃料秸秆压块机替代饲料成型压块机对上述牛或羊全价TMR配合饲料进行压块生产。成型的TMR“草饼干”规格为 32mm×32mm，紧实度通过压制过程中调草洒水量来控制，要求干燥后不能太硬实，用手易搓碎，同时要求草块成型固化。“草饼干”在饲喂过程中，可直接投饲，也可喷洒水，软化后饲喂。经试验，均不会影响家畜的采食，同时也不会造成家畜的反刍障碍，育肥效果显著。 [0125] 尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。 [0126] 显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。