[0001] 本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株适用于鹰嘴豆发酵的副干酪乳酪杆菌FMBL L23249 FJX及其应用。

[0002] 鹰嘴豆(Cicer arietinum L.)是一种高营养价值的豆类，是新疆木垒县的特色农产品，它含有多种生物活性物质。例如，鹰嘴豆中含有5.89～10.1％左右的低聚半乳糖，是天然益生元的良好来源，可以刺激益生菌的生长繁殖和激活代谢功能；鹰嘴豆蛋白具有高生物利用度、低致敏性等特点，经过微生物蛋白酶水解后形成的鹰嘴豆多肽，其中一些具有良好抗菌功能；鹰嘴豆还含有多种维生素和矿物质，可以满足人体每日的营养需求。利用益生菌发酵鹰嘴豆浸提液，不仅可以增强益生菌的活性，而且在鹰嘴豆乳本身的营养物质和活性成分的基础上，进一步的增加益生菌代谢产生的后生元和活性物质，同时还可以赋予其独特的风味，改善鹰嘴豆中不利风味。例如，发明专利CN102613381A公开了可以利用益生菌和鹰嘴豆发酵益生肽；发明专利CN115191559A公开了一种鹰嘴豆豆浆发酵饮料的制备方法，制备得到的鹰嘴豆豆浆发酵饮料抗氧化能力DPPH自由基清除能力、ABTS+自由基清除能力显著提升，而功能性指标有升有降，蛋白质以及脂肪指标下降，适应更多人群例如肥胖、高血压、高血脂和高血糖类人群饮用。但是益生菌利用鹰嘴豆浸提液中发酵的能力存在菌株特异性，不同菌株之间利用鹰嘴豆浸提液的能力存在差异。

[0003] 副干酪乳酪杆菌是一类对人体具有有益活性的微生物。副干酪乳酪杆菌可以在人体肠道内定植，促进肠道内的菌群平衡，释放活性物质影响人体的生理代谢，有益宿主健康。越来越多的证据表明，副干酪乳酪杆菌发酵植源性食品所产生的代谢产物如短链脂肪酸、细菌素、维生素、三甲胺等，能够触发机体的益生效应。

[0004] 发明人在研究过程中意外的发现了一株适用于鹰嘴豆发酵的副干酪乳酪杆菌FMBL L23249 FJX，所述的副干酪乳酪杆菌FMBL L23249 FJX能高效利用鹰嘴豆浸提液实现快速增殖，更适合鹰嘴豆浸提液的体系。所述的副干酪乳酪杆菌FMBL L23249 FJX在发酵12h后活菌数达到9.17±0.01lg(CFU/mL)，在4℃贮藏21d后副干酪乳酪杆菌FMBL L23249 FJX在鹰嘴豆浸提液中的活菌数还能保持在8.32±0.03lg(CFU/mL)以上，可以用于制备鹰嘴豆酸奶，具有广阔的应用前景。

[0005] 本发明的首要目的是提供一株适用于鹰嘴豆发酵的副干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)FMBL L23249 FJX，所述菌株于2023年6月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20231097。

[0006] 本发明的第二目的是提供一种菌剂，含有所述的副干酪乳酪杆菌FMBL L23249 FJX或其发酵液。

[0007] 本发明的第三目的是提供一种发酵物，包含所述的副干酪乳酪杆菌FMBL L23249 FJX。

[0008] 本发明的第四目的是提供所述的副干酪乳酪杆菌FMBL L23249 FJX、所述的菌剂或所述的发酵物在制备发酵食品、保健品或膳食补充剂中的应用。

[0009] 优选的，所述的发酵食品为发酵乳制品或植物基发酵饮品。

[0010] 优选的，所述的发酵乳制品为发酵乳、含有活性益生菌的发酵乳饮料或非活性发酵乳饮料。

[0011] 优选的，所述的发酵乳为酸乳或奶酪。

[0012] 本发明的第五目的是提供一种乳制品，使用所述的副干酪乳酪杆菌FMBL L23249 FJX、所述的菌剂或所述的发酵物制备获得。

[0013] 优选的，所述的乳制品为大豆酸奶、豌豆酸奶、鹰嘴豆酸奶、芸豆酸奶或黑豆酸奶。

[0014] 优选的，所述的乳制品为鹰嘴豆酸奶。

[0015] 本发明的有益效果是：本发明提供了一株适用于鹰嘴豆发酵的副干酪乳酪杆菌FMBL L23249 FJX，所述的副干酪乳酪杆菌FMBL L23249 FJX在发酵8h，活菌数就可以达到8.79±0.01lg(CFU/mL)，发酵12h后就可以平衡在9.17±0.01lg(CFU/mL)；能高效利用鹰嘴豆浸提液实现快速增殖。在发酵16h后，pH值为3.76，可滴定酸度为56T°；更适合鹰嘴豆浸提液的体系。所述的副干酪乳酪杆菌FMBL L23249 FJX在发酵12h后活菌数可以达到9.17±
0.01lg(CFU/mL)，在4℃贮藏21d后副干酪乳酪杆菌FMBL L23249 FJX在鹰嘴豆浸提液中的活菌数还能保持在8.32±0.03lg(CFU/mL)以上，可以用于制备鹰嘴豆酸奶，具有广阔的应用前景。

[0016] 下面通过几个实施例详细说明本发明的具体实施方式从而对本发明进行进一步的阐述，但不对本发明的权利要求做任何限定。

[0017] 下述实施案例中的鹰嘴豆市售购得。

[0018] 副干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillusparacasei)CGMCC1.2345购自中国普通微生物菌种保藏管理中心；副干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillusparacasei)FMBL L23249 FJX及其他对照菌株，由石河子大学食品学院食品微生物与生物技术研究中心科研人员分离自健康人群粪便，并保藏于实验室。

[0019] 以下实施例中，所述的LAMVAB琼脂培养基配方如下：蛋白胨10.0g，牛肉膏8.0g，酵母提取物4.0g，葡萄糖20.0g，吐温80 1.0mL，K2HPO42.0 g，乙酸钠5.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，MgSO4·7H2O 0.2g，MnSO4·4H2O 0.05g，溴甲酚绿0.05g，琼脂18.0g，L‑半胱氨酸盐酸盐0.5g，盐酸万古霉素20.0mg，pH5.0。

[0020] 实施例一、菌株分离及鉴定

[0021] 无菌收集健康人群新鲜粪便20‑50g至无菌粪便采集管，‑18～‑15℃车载冰箱储存12h内运回实验室进行处理。无菌称取1.0g粪便至9.0mL生理盐水中，依次进行梯度稀释。移取0.1mL粪便样品稀释液均匀涂布至LAMVAB琼脂培养基上，37℃厌氧培养24‑36h。根据菌落特征，随机挑取菌落周围有黄色或淡黄色透明圈的不同菌落30‑50个，通过3次转接平板划线的方法进行纯化。结合革兰氏染色和过氧化氢接触酶实验初步筛选革兰氏阳性，接触酶阴性，细胞形态为杆状的菌株，进行富集，制备菌悬液。

[0022] 将菌株菌悬液利用细菌基因组DNA快速提取试剂盒提取菌株DNA，并用groEL基因引物：

[0023] GroEL‑Lac‑F：5＇‑GCY GGT GCWAAC CCN GTT GG‑3＇

[0024] GroEL‑Lac‑R：5＇‑AAN GTN CCV CGVATC TTG TT‑3＇

[0025] 进行扩增，扩增产物质检后送至苏州金唯智生物科技有限公司测序。将获得的序列提交到GenBank数据库中进行BLAST在线比对。

[0026] 经分离、鉴定，得到一株编号为FMBL L23249 FJX的菌株，隶属于副干酪乳酪杆菌，拉丁名：Lacticaseibacillusparacasei，将其命名为副干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillusparacasei)FMBL L23249 FJX于2023年6月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M 20231097，保藏地址：中国武汉武汉大学，电话：027‑
68754052，传真：027‑68754833。

[0027] 以下实施例中，将副干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillusparacasei)FMBL L23249 FJX简写为副干酪乳酪杆菌FMBL L23249 FJX。

[0028] 实施例二、鹰嘴豆浸提液的制备

[0029] 所述鹰嘴豆浸提液的制备方法如下：

[0030] (1)称取100g鹰嘴豆，确保无病虫害及机械损伤，用流动清水反复浸洗以洗净表面的污泥、杂质，沥干备用。

[0031] (2)将上述清洗后的鹰嘴豆加入300ml饮用水室温浸泡12h,使鹰嘴豆颗粒自然膨大，处于半萌发状态，然后过滤弃泡豆水，将半萌发的鹰嘴豆沥干备用。

[0032] (3)将半萌发的鹰嘴豆加入600ml的60℃饮用水和0.45％的α‑淀粉酶(1000u/g)，研磨8min，60℃酶解24min。

[0033] (4)将酶解完成后的鹰嘴豆匀浆煮沸5min，冷却后过100目滤布，分装，得到鹰嘴豆浸提液。

[0034] (5)将上述(4)中得到的鹰嘴豆浸提液至于105℃，灭菌10min，待冷却至室温后至于4℃冰箱备用。

[0035] 实施例三、副干酪乳酪杆菌FMBL L23249 FJX的活菌数

[0036] 将副干酪乳酪杆菌FMBL L23249 FJX和其他对照菌株活化，扩大培养2‑3代后将种子液离心，去除上清发酵液，菌泥用无菌生理盐水洗涤后重悬于无菌生理盐水中，于无菌条7
件下按照终浓度为1.0×10CFU/mL的接种量接种至鹰嘴豆浸提液中，将接好种的鹰嘴豆浸提液中置于37℃的恒温培养箱中进行发酵。分别于发酵8h、10h、12h、16h从鹰嘴豆浸提液中取样1mL用于活菌计数。具体数据见表1和表2。

[0037] 表1实验组和对照组菌株的组成

[0038]组别 菌株名称
实施组1 副干酪乳酪杆菌FMBLL23249FJX
对照组1 副干酪乳酪杆菌CGMCC1.2345
对照组2 副干酪乳酪杆菌FMBLL23601
对照组3 副干酪乳酪杆菌FMBLL23602
对照组4 副干酪乳酪杆菌FMBLL23603
对照组5 副干酪乳酪杆菌FMBLL23604
对照组6 副干酪乳酪杆菌FMBLL23605
对照组7 副干酪乳酪杆菌FMBLL23606
对照组8 副干酪乳酪杆菌FMBLL23607
对照组9 副干酪乳酪杆菌FMBLL23608
对照组10 副干酪乳酪杆菌FMBLL23609
对照组11 副干酪乳酪杆菌FMBLL23610
对照组12 副干酪乳酪杆菌FMBLL23611
对照组13 副干酪乳酪杆菌FMBLL23612
对照组14 副干酪乳酪杆菌FMBLL23614
对照组15 副干酪乳酪杆菌FMBLL23615

[0039] 表2副干酪乳酪杆菌FMBL L23249 FJX发酵鹰嘴豆浸提液过程中活菌数变化(lg(CFU/mL))

[0040] 组别 0h 8h 10h 12h 16hd c b a a
实施组1 6.99±0.01 8.79±0.01 9.08±0.01 9.17±0.01 9.17±0.01
c b a a a
对照组1 7.01±0.01 8.57±0.01 8.65±0.01 8.63±0.02 8.65±0.01
b a a a a
对照组2 7.00±0.01 8.34±0.04 8.38±0.03 8.36±0.01 8.34±0.01
d c b a a
对照组3 6.99±0.01 8.00±0.03 8.26±0.01 8.40±0.04 8.39±0.01
d c b a a
对照组4 7.00±0.02 7.91±0.02 8.08±0.01 8.18±0.02 8.18±0.01
d c b a a
对照组5 7.00±0.01 8.24±0.02 8.42±0.02 8.53±0.04 8.51±0.03
d c b a a
对照组6 6.99±0.01 8.11±0.01 8.27±0.01 8.37±0.05 8.37±0.07
d c b a ab
对照组7 7.00±0.00 8.56±0.03 8.62±0.01 8.66±0.01 8.65±0.01
d c b a a
对照组8 7.02±0.02 8.57±0.02 8.73±0.02 8.81±0.02 8.81±0.01
c b a a a
对照组9 6.99±0.02 8.33±0.03 8.52±0.03 8.57±0.04 8.56±0.03
d c b a a
对照组10 6.99±0.02 8.18±0.01 8.27±0.01 8.36±0.03 8.38±0.06
d c b a a
对照组11 7.01±0.01 8,20±0.01 8.38±0.03 8.58±0.09 8.47±0.02
d a c b b
对照组12 6.99±0.01 8.81±0.02 7.91±0.01 7.99±0.01 8.01±0.01
c a b b b
对照组13 6.99±0.01 8.80±0.02 8.02±0.02 7.95±0.01 7.95±0.01
b a a a a
对照组14 6.97±0.02 8.04±0.04 8.14±0.01 8.14±0.01 8.11±0.03
c b a a a
对照组15 7.00±0.01 8.43±0.03 8.54±0.03 8.57±0.02 8.56±0.04

[0041] 注：同一行、同一列的不同字母表示之间具有显著性差异

[0042] 由表2可知副干酪乳酪杆菌FMBL L23249 FJX在发酵8h，活菌数就可以达到8.79±0.01lg(CFU/mL)，发酵12h后就可以平衡在9.17±0.01lg(CFU/mL)。而其他对照组副干酪乳酪杆菌在发酵16h后，对照组8的副干酪乳酪杆菌的活菌数最高，却只能达到8.81±0.01lg(CFU/mL)，因此副干酪乳酪杆菌FMBL L23249 FJX能高效利用鹰嘴豆浸提液实现快速增殖。

[0043] 实施例四、副干酪乳酪杆菌FMBLL23249 FJX pH值和可滴定酸度

[0044] 将副干酪乳酪杆菌FMBL L23249 FJX和对照菌株活化，扩大培养2‑3代后将种子液离心去除上清发酵液，菌泥用无菌生理盐水洗涤后重悬于无菌生理盐水中，于无菌条件下7
按照终浓度为1.0×10CFU/mL的接种量接种至鹰嘴豆浸提液中，将接好种的鹰嘴豆浸提液中置于37℃的恒温培养箱中进行发酵。分别于发酵8h、10h、12h、16h从鹰嘴豆浸提液中取样
10mL用于测定pH值和可滴定酸度。结果见表3和表4。

[0045] 表3 16h内副干酪乳酪杆菌FMBL L23249 FJX发酵鹰嘴豆浸提液过程中pH值和可滴定酸度的变化

[0046]

[0047] 注：同一行的不同字母具有显著性差异

[0048] 表416h内副干酪乳酪杆菌CGMCC1.2345发酵鹰嘴豆浸提液过程中pH值和可滴定酸度的变化

[0049]

[0050] 注：同一行的不同字母具有显著性差异

[0051] 由表3和表4对比可知，副干酪乳酪杆菌FMBL L23249 FJX在发酵16h后，pH值为3.76，可滴定酸度为56T°；而副干酪乳酪杆菌CGMCC 1.2345在发酵16h后pH值为3.93，可滴定酸度为42T°。均符合发酵饮料的酸度要求，且在同一范围可滴定酸度内，副干酪乳酪杆菌FMBL L23249 FJX的活菌数远高于副干酪乳酪杆菌CGMCC 1.2345；结合实施例2可知副干酪乳酪杆菌FMBL L23249 FJX更适合鹰嘴豆浸提液的体系。

[0052] 实施例五、副干酪乳酪杆菌FMBLL23249 FJX贮藏期活菌数和pH值变化[0053] 将副干酪乳酪杆菌FMBL L23249 FJX和对照菌株副干酪乳酪杆菌CGMCC1.2345活化，扩大培养2‑3代后将种子液离心去除上清发酵液，菌泥用无菌生理盐水洗涤后重悬于无7
菌生理盐水中，于无菌条件下按照终浓度为1.0×10 CFU/mL的接种量接种至鹰嘴豆浸提液中，将接好种的鹰嘴豆浸提液中置于37℃的恒温培养箱中进行发酵。分别于发酵12h、7d、
14d、21d从鹰嘴豆浸提液中取样10mL用于活菌计数和pH值测定。

[0054] 表5副干酪乳酪杆菌FMBL L23249 FJX发酵的鹰嘴豆浸提液在贮藏期活菌数和pH值变化

[0055]

[0056] 注：同一行的不同字母具有显著性差异

[0057] 表6副干酪乳酪杆菌CGMCC 1.2345发酵的鹰嘴豆浸提液在贮藏期活菌数和pH值变化

[0058]

[0059] 注：同一行的不同字母具有显著性差异

[0060] 由表5和表6对比可知，本发明所提供的制备方法，副干酪乳酪杆菌FMBL L23249 FJX发酵鹰嘴豆浸提液在发酵12h后活菌数可以达到9.17±0.01lg(CFU/mL)，在4℃贮藏21d后副干酪乳酪杆菌FMBL L23249 FJX在鹰嘴豆浸提液中的活菌数还能保持在8.32±0.03lg(CFU/mL)以上；而对照组所制备的副干酪乳酪杆菌CGMCC 1.2345在发酵12h后活菌数只有8.63±0.02lg(CFU/mL)，在4℃贮藏21d后副干酪乳酪杆菌CGMCC1.2345在鹰嘴豆浸提液中的活菌数只能保持在7.74±0.02lg(CFU/mL)。在发酵12h和4℃贮藏21d后，副干酪乳酪杆菌CGMCC1.2345的活菌数显著低于副干酪乳酪杆菌FMBL L23249 FJX。因此，副干酪乳酪杆菌FMBL L23249 FJX更适合制备鹰嘴豆酸奶。

[0061] 综上所述，本发明提供了一株适用于鹰嘴豆发酵的副干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)FMBL L23249 FJX，在发酵8h，活菌数就可以达到8.79±0.01lg(CFU/mL)，发酵12h后就可以平衡在9.17±0.01lg(CFU/mL)；能高效利用鹰嘴豆浸提液实现快速增殖。在发酵16h后，pH值为3.76，可滴定酸度为56T°；更适合鹰嘴豆浸提液的体系。所述的副干酪乳酪杆菌FMBL L23249 FJX在发酵12h后活菌数可以达到9.17±0.01lg(CFU/mL)，在4℃贮藏21d后副干酪乳酪杆菌FMBL L23249 FJX在鹰嘴豆浸提液中的活菌数还能保持在8.32±0.03lg(CFU/mL)以上，可以用于制备鹰嘴豆酸奶，具有广阔的应用前景。