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通过ARTP诱变和适应性进化获得的耐高温鼠李糖乳杆菌及其应用

申请号 CN202311530700.7 申请日 2023-11-16 公开(公告)号 CN117568215A 公开(公告)日 2024-02-20
申请人 中南大学; 澳优乳业(中国)有限公司; 发明人 周洪波; 潘丽娜; 刘雯娴; 康文丽; 徐丽婷; 王玉光; 汪家琦; 唐溶雪; 陈祝; 程海娜;
摘要 本 发明 涉及 微 生物 技术领域,具体涉及通过ARTP诱变和适应性进化获得的耐高温鼠李糖乳杆菌及其应用。本发明通过诱变和适应性进化,获得一株耐高温的鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus,其与野生型菌株相比较,在不损失益生性能的同时可在50℃下生长繁殖,并具很强的抗 氧 化能 力 ,将其用于益生产品的制备,可有效降低制备过程活菌数的损失,降低生产成本,提高益生性能,实现降本增效的目的,在工业化生产中具有广泛的应用前景。
权利要求

1.保藏编号为CGMCC No.21815的鼠李糖乳杆菌。
2.菌群,其特征在于,包括权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌。
3.菌剂,其特征在于,包括权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌或权利要求2所述的菌群。
4.根据权利要求3所述的菌剂,其特征在于,剂型包括颗粒、液体和/或干粉中的至少一种。
5.培养权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌或权利要求2所述的菌群或权利要求3所述的菌剂获得的发酵产物。
6.如下I)~IV)所示中的至少一种在制备发酵产品和/或益生产品中的应用:
I)、权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌;
II)、权利要求2所述的菌群;
III)、权利要求3所述的菌剂;
IV)、权利要求5所述的发酵产物。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,所述益生包括抗化、调节肠道菌群、促细胞增殖和/或增强细胞抗炎能中的至少一种。
8.根据权利要求6或7所述的应用,其特征在于,所述抗氧化包括清除DPPH自由基和/或ABTS自由基。
9.益生产品或发酵制品,其特征在于,原料包括如下i)~iv)所示中的至少一种:
i)、权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌;
ii)、权利要求2所述的菌群;
iii)、权利要求3所述的菌剂;
iv)、权利要求5或6所述的发酵产物。
10.权利要求1所述的保藏编号为CGMCC No.21815的鼠李糖乳杆菌的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
步骤1、对鼠李糖乳杆菌野生菌株进行ARTP诱变;
步骤2、对诱变获得的菌株进行富集和传代驯化,获得所述保藏编号为CGMCC No.21815的鼠李糖乳杆菌;
所述ARTP诱变的条件为:功率120W,距离2mm,气体流量10SLM,诱变时间45s;
所述富集的温度为37℃;
所述传代驯化的培养基为MRS培养基,传代驯化时培养转速为160rpm;
所述传代驯化的初始温度为37℃,结束温度为50℃,每传一代温度升高0.5~1℃。

说明书全文

通过ARTP诱变和适应性进化获得的耐高温鼠李糖乳杆菌及其

应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域,具体涉及通过ARTP诱变和适应性进化获得的耐高温鼠李糖乳杆菌及其应用。

背景技术

[0002] 鼠李糖乳杆菌是一种益生菌,其通过定殖在人体内,改变宿主某一部位菌群组成的一类对宿主有益的活性微生物。它们的突出特点是,能够黏附在宿主肠道上皮细胞上并减少致病菌的黏附,同时其存在能够抑制致病菌的生长繁殖。研究表明,足量的益生菌可以增强胃肠道功能和稳定性,增强免疫系统,降低血液胆固醇等的险。由于缺少自主知识产权的菌株以及性质优良的菌株,我国益生菌产业长期受制于国外。如何保障我国菌种资源的安全和种类多样性、突破国外商业化益生菌菌种的限制,是有待解决的重要问题。
[0003] 鼠李糖乳杆菌在制造和随后的应用过程中会受到各种不利刺激。比如在制造工艺期间,菌体可能会暴露于不同温度下,面临渗透压、气浓度和分含量等的外界条件改变。这些可能进一步导致菌株的致死性损伤。这意味着益生菌的丰度/活菌数在制造过程中逐渐减少。细胞数量的减少导致了发酵的降低和益生性能的下降。因此,挖掘性能稳定且优异的鼠李糖乳杆菌菌株,在工业化生产等领域具有重要的研究意义。

发明内容

[0004] 有鉴于此,本发明要解决的技术问题在于提供通过ARTP诱变和适应性进化获得的耐高温鼠李糖乳杆菌及其应用。
[0005] 本发明提供了保藏编号为CGMCC No.21815的鼠李糖乳杆菌。
[0006] 本发明通过诱变,获得一株耐高温的鼠李糖乳杆菌,其能在50℃保持较好的生长,胃环境耐受性和胆盐的耐受性也并无降低,除此,与野生型菌株及现有的鼠李糖乳杆菌相比较,其抗氧化能力突出,具有较强的DPPH自由基和ABTS自由基清除能力,试验结果表明,发酵24h的菌体对DPPH自由基和ABTS自由基清除能力在90%以上。
[0007] 并且,本发明所述的鼠李糖乳杆菌,是诱变获得的兼具强的益生能力且能在50℃生长的菌株,与其他诱变菌株相比,优势明显;如在本发明的一些具体的实施例中,通过传代驯化获得的第19代和第20代均可在50℃生长,但获得的第20代的生存能力更强。
[0008] 本发明提供了菌群,其包括本发明所述的鼠李糖乳杆菌。
[0009] 本发明提供了菌剂,其包括本发明所述的鼠李糖乳杆菌或本发明所述的菌群。
[0010] 进一步的,本发明所述的菌剂,其剂型包括颗粒、液体和/或干粉中的至少一种。
[0011] 本发明提供了所述的鼠李糖乳杆菌或所述的菌群或所述的菌剂的发酵产物。
[0012] 进一步的,本发明所述的发酵产物包括乳酸,酯类物质和/或芳香化合物等。
[0013] 本发明提供了如下I)~IV)所示中的至少一种在制备发酵产品和/或益生产品中的应用:
[0014] I)、本发明所述的鼠李糖乳杆菌;
[0015] II)、本发明所述的菌群;
[0016] III)、本发明所述的菌剂;
[0017] IV)、本发明所述的发酵产物。
[0018] 进一步的,本发明所述的应用中,所述益生包括抗氧化、调节肠道菌群、促细胞增殖和/或增强细胞抗炎能力中的至少一种;在本发明的具体实施例中,所述益生包括抗氧化,所述抗氧化包括清除DPPH自由基和/或ABTS自由基。
[0019] 本发明中,所述发酵产品包括干酪、酸奶、果汁、果汁饮料等。
[0020] 本发明提供了发酵产品和/或益生产品的制备方法,其为利用本发明所述的鼠李糖乳杆菌、本发明所述的菌群或本发明所述的菌剂中的至少一种进行发酵。
[0021] 本发明提供了发酵产品,其由本发明所述的鼠李糖乳杆菌、本发明所述的菌群或本发明所述的菌剂中的至少一种发酵获得。
[0022] 本发明提供了益生产品或发酵制品,其原料包括如下i)~iv)所示中的至少一种:
[0023] i)、本发明所述的鼠李糖乳杆菌;
[0024] ii)、本发明所述的菌群;
[0025] iii)、本发明所述的菌剂;
[0026] iv)、本发明所述的发酵产物。
[0027] 本发明提供了提高免疫力的方法,其为使用本发明所述的益生产品。
[0028] 本发明提供了所述的保藏编号为CGMCC No.21815的鼠李糖乳杆菌的制备方法,包括如下步骤:
[0029] 步骤1、对鼠李糖乳杆菌野生菌株进行ARTP诱变;
[0030] 步骤2、对诱变获得的菌株进行富集和传代驯化,获得所述保藏编号为CGMCC No.21815的鼠李糖乳杆菌;
[0031] 所述ARTP诱变的条件为:功率120W,距离2mm,气体流量10SLM,诱变时间45s;
[0032] 所述富集的温度为37℃;
[0033] 所述传代驯化的培养基为MRS培养基,传代驯化时培养转速为160rpm;
[0034] 所述传代驯化的初始温度为37℃,结束温度为50℃,每传一代温度升高0.5~1℃;
[0035] 所述传代驯化允许进入下一代的标准为:每一代的最终OD值≥野生型37℃下的最终OD值的70%。
[0036] 所述野生型37℃下的最终OD值为1.2~1.6。
[0037] 在本发明的具体实施例中,驯化进入下一代时,所述野生型37℃下的最终OD值以1.4计。
[0038] 本发明通过诱变和适应性进化,获得一株耐高温的鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus,其与野生型菌株相比较,在不损失益生性能的同时可在50℃下生长繁殖,并具很强的抗氧化能力,将其用于益生产品的制备,可有效降低制备过程活菌数的损失,降低生产成本,提高益生性能,实现降本增效的目的,在工业化生产中具有广泛的应用前景。附图说明
[0039] 图1示野生型与突变株37℃下生长情况;
[0040] 图2示野生型与突变株50℃下生长情况;
[0041] 图3示突变株50℃生长特性稳定遗传;
[0042] 图4示野生型与突变株50~75℃热处理情况;
[0043] 图5示突变株的益生特性无损失。
[0044] 生物保藏说明
[0045] 生物材料AUH2101,分类命名:鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus,于2021年02月05日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所,保藏编号为CGMCC No.21815。

具体实施方式

[0046] 本发明提供了通过ARTP诱变和适应性进化获得的耐高温鼠李糖乳杆菌及其应用,本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。
[0047] 本发明采用的试剂耗材皆为普通市售品,皆可于市场购得。
[0048] 下面结合实施例,进一步阐述本发明:
[0049] 实施例1突变菌株及其性能
[0050] 一、获得了一个突变菌株Mut
[0051] 1、突变株的获取及性能检测
[0052] 对野生鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)菌株进行ARTP诱变,得到的突变菌群先在37℃下进行富集,然后不断进行传代以进行适应性进化。传代使用MRS培养基(成分/L:蛋白胨10g,肉膏10g,酵母粉5g,K2HPO42g,柠檬酸二铵2g,乙酸钠5g,葡萄糖20g,吐温80 1mL,MgSO4·7H2O 0.58g,MnSO4·4H2O 0.25g),转速160rpm。用OD600(细胞密度)来衡量,培养周期为24h。每一代的最终OD值接近(≥70%)野生型在37℃下的最终OD,则认为这一代适应性进化成功,可以开始下一轮,传代情况如表1,每传一代升高0.5~1℃。
[0053] 本发明诱变的原始菌株是鼠李糖乳杆菌,其最适生长温度为37℃,诱变得到的突变菌株命名为Mut,相较于野生型WT,突变体在37℃下的生长速率和细胞密度没有受到影响(如图1所示),且突变菌株Mut能够耐受50℃,并基本维持较好的细胞密度,而野生型无法在50℃下生长(如图2所示)。
[0054] 表1中的19代和20代菌株均可以在50℃下生存。然而,第20代菌株显然比第19代菌株的生存效果更好。通过ARTP和实验室适应性进化可以得到一些能够耐高温的菌株(如第19代),但第20代菌株,即保藏菌株的效果最佳。
[0055] 突变体连续传代培养20代,突变体的生长特性没有发生改变。这表明其耐受高温性能能够稳定遗传,20代传代情况如图3。
[0056] 表1.突变菌株诱变传代情况
[0057]
[0058] 2、对更高温度的耐受能力检测
[0059] 首先在37℃下培养菌株WT和Mut约24h,以达到OD的最大值。此时计算其活菌数都9
在10CFU/mL。然后将菌液加入已经预热的MRS培养基中热处理1分钟。控制体系中的OD值都在0.5~0.6的范围。然后迅速冷却至室温,使用涂布法检测其活菌数,热处理温度设置为50~75℃,结果如图4所示。
[0060] 结果表明,突变体Mut能够在50~75℃下热处理1min后保持约55%以上的活菌数。而野生型WT在大于60℃的温度下已经几乎失去活性。
[0061] 二、野生型和突变体部分益生性能比较
[0062] 胃环境耐受性实验:将PBS(pH 7.4)缓冲液用0.1mol/L HCl调节pH为2.0、2.5、3.0、3.5,加入3g/L的胃蛋白酶溶解后用0.22μm的无菌滤膜进行过滤,溶液需现用现配。将原始菌株WT和突变体菌株Mut活化3次,以2%的接种量接种于10mL的MRS液体中,37℃培养
24h后,离心收集菌体,用灭菌的PBS缓冲液将菌体洗涤两次后再将菌体重悬,在9.0mL的pH 
2.0、2.5、3.0、3.5人工胃液中分别加入1.0mL的菌悬液,37℃培养3h,取0h和3h的培养液用无菌生理盐水按1:10的梯度进行稀释,平板计数法测定活菌数,计算其存活率(%),每组重复3次。
[0063] 胆盐的耐受性:在配制好的MRS培养基中分别加入0.1%、0.2%、0.3%的牛胆盐,菌悬液的制备同上,取0h和3h的培养液用无菌生理盐水按1:10的梯度进行稀释涂平板,计算出菌株在不同浓度胆盐中的存活率。
[0064] 存活率计算如下:
[0065] 存活率=(A1/A0)×100%
[0066] 注:中A0为未经处理的菌落总数,A1为处理后的菌落总数。
[0067] 结果如图5所示,野生型和突变体的基本益生性能没有显著差异,表明突变体没有牺牲作为益生菌的特性。对于工业生产来说,益生菌产品需要在产品制造中耐受更高的热处理温度,以保证其出厂活菌数量和质量,因此本发明菌株用于益生产品中,可保持更高的益生活性,具有更广泛的应用潜力和更优秀的益生性能。
[0068] 实施例2其他性能
[0069] 一、突变体Mut对DPPH自由基清除率
[0070] DPPH(1‑二苯基‑2‑三硝基苯肼)是一种很稳定的氮中心自由基,其与自由基清除剂结合,以此广泛用于定量测定生物试样、纯化合物、提取物的体外抗氧化能力。
[0071] 培养野生型WT和突变体Mut菌株,并于不同时间下取样,收集菌体,用无菌生理盐水洗去培养基,再将其重悬,用于评估其自由基清除效果。
[0072] DPPH标准溶液配制:称取0.02g DPPH以60%的乙醇溶解,定容至250mL,配置成0.2mM的DPPH标准溶液。
[0073] 吸取150μL DPPH溶液加入150μL适当稀释的样品,充分混合后,室温避光孵育30min,然后检测517nm下的吸光值。分别记录吸光度A1、A2、A3,计算DPPH清除率(%),结果如表3。
[0074] DPPH清除率(%)=[A3‑(A1‑A2)]/A3×100%
[0075] A1:不加60%乙醇的体系的吸光值
[0076] A2:不加DPPH的体系的吸光值
[0077] A3:不加样品的体系的吸光值
[0078] 表3.DPPH清除率(%)
[0079]发酵时间 WT Mut
12h 52.45% 68.41%
24h 65.02% 92.25%
[0080] 二、突变体Mut对ABTS自由基清除率的实验
[0081] ABTS(2,2'‑联氮‑双‑3‑乙基苯并噻唑啉‑6‑磺酸),可用于评价物质抗氧化能力。
[0082] 培养野生型WT和突变体Mut菌株,并于不同时间下取样,收集菌体,用无菌生理盐水洗去培养基,再将其重悬,用于评估其自由基清除效果。
[0083] ABTS标准溶液配制:用去离子水配制为7mM的ABTS溶液,再加入过硫酸,配制为2.45mM的过硫酸钾溶液,置于室温下避光静置过夜。
[0084] 吸取150μL ABTS溶液加入150μL适当稀释的样品,充分混合后,室温避光孵育6min,然后检测405nm下的吸光值。分别记录吸光度A1、A2、A3,计算ABTS清除率(%),结果如表3所示。
[0085] ABTS清除率(%)=[A3‑(A1‑A2)]/A3×100%
[0086] A1:不加过硫酸钾的体系的吸光值
[0087] A2:不加ABTS的体系的吸光值
[0088] A3:不加样品的体系的吸光值
[0089] 表3.ABTS清除率(%)
[0090] 发酵时间 WT Mut12h 49.58% 72.54%
24h 52.97% 91.36%
[0091] 以上仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。