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首页 / 专利分类库 / 生物化学；啤酒；烈性酒；果汁酒；醋；微生物学；酶学；突变或遗传工程 / 与涉及微生物的C12C至C12Q小类相关的引得表 / 微生物 / .细菌或放线菌目 / ..乳杆菌属 / 具有抗炎和免疫调节功能的罗伊氏粘液乳杆菌AUc2301及其应用

具有抗炎和免疫调节功能的罗伊氏粘液乳杆菌AUc2301及其应用
申请号 CN202311600783.2 申请日 2023-11-28 公开(公告)号 CN117625463A 公开(公告)日 2024-03-01
申请人 澳优乳业(中国)有限公司; 发明人 潘丽娜; 卢月媚; 康文丽; 吴艳阳; 赵玲艳; 汪家琦; 邓放明; 李威;
摘要 本 发明 提供具有抗炎和免疫调节功能的罗伊氏粘液乳杆菌AUc2301及其应用，所述罗伊氏粘液乳杆菌分类学命名为罗伊氏粘液乳杆菌(Limosilactobacillus reuteri)AUc2301，保藏于中国 微 生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号为CGMCC No.28630。本发明通过实验发现所述菌株AUc2301具有耐酸、耐胆盐、抑菌、调节免疫活性和抗炎的功能。
权利要求

1.一种罗伊氏粘液乳杆菌(Limosilactobacillus reuteri)菌株AUc2301，其特征在于，所述罗伊氏粘液乳杆菌菌株AUc2301保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.28630。
2.一种微生物制剂，其特征在于，包括如权利要求1所述的罗伊氏粘液乳杆菌(Limosilactobacillus reuteri)菌株AUc2301。
3.如权利要求1所述的罗伊氏粘液乳杆菌菌株AUc2301或如权利要求2所述的微生物制剂在制备具有如下功效的产品中的应用：
耐酸；和/或
耐胆盐；和/或
抑菌；和/或
调节免疫活性；和/或
抗炎。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述调节免疫活性包括促进健康细胞释放免疫细胞因子，所述免疫细胞因子包括：IL‑6、IL‑1β、TNF‑α和NO；和/或所述抗炎包括抑制炎症细胞中炎症因子的释放，所述炎症因子包括：IL‑6、IL‑1β、TNF‑α、NO、PGE2。
5.一种发酵制品，其特征在于，所述发酵制品经由如权利要求1所述的罗伊氏粘液乳杆菌菌株AUc2301或如权利要求2所述的微生物制剂制得。
6.一种食品，其特征在于，所述食品中包括：
如权利要求1所述的罗伊氏粘液乳杆菌菌株AUc2301、如权利要求2所述的微生物制剂和如权利要求5所述的发酵制品中的至少一种；
以及可接受的辅料；
所述食品包括营养保健品、乳饮料、食品级活菌制剂、奶粉和米粉中的至少一种。
7.一种宠物食品，其特征在于，所述宠物食品中包括：
如权利要求1所述的罗伊氏粘液乳杆菌菌株AUc2301、如权利要求2所述的微生物制剂和如权利要求5所述的发酵制品中的至少一种；
以及可接受的辅料。
8.一种饲料，其特征在于，所述饲料中包括：
如权利要求1所述的罗伊氏粘液乳杆菌菌株AUc2301、如权利要求2所述的微生物制剂和如权利要求5所述的发酵制品中的至少一种；
以及可接受的辅料。
9.一种药品，其特征在于，所述药品中包括：
如权利要求1所述的罗伊氏粘液乳杆菌菌株AUc2301、如权利要求2所述的微生物制剂和如权利要求5所述的发酵制品中的至少一种；
以及可接受的辅料。
10.一种化妆品，其特征在于，所述化妆品中包括：
如权利要求1所述的AUc2301、如权利要求2所述的微生物制剂和如权利要求5所述的发酵制品中的至少一种；
以及可接受的辅料。
说明书全文

具有抗炎和免疫调节功能的罗伊氏粘液乳杆菌AUc2301及其

应用

技术领域

[0001] 本发明涉及微生物技术领域，具体涉及具有抗炎和免疫调节功能的罗伊氏粘液乳杆菌AUc2301及其应用。

背景技术

[0002] 现代人由于身体劳累、运动不足、工作压力、饮食作息不规律等会导致机体免疫力下降，表现出一种亚健康状态，免疫力低下会使机体容易受病原菌等有害物质入侵，导致感冒及其它疾病的发生，免疫系统对于机体防御病原体是至关重要的，但免疫系统又会受到不健康的生活习惯、病原体和抗原等许多因素的影响。免疫调节剂是通过增加、减少或修改机体的免疫反应来改变先天免疫和获得性免疫体系的一类物质，由于该系列药物的毒副作用和高成本限制了其使用。同时大多数免疫调节药物多不适用于作为预防性药物使用。提高免疫力的有效途径是注意饮食均衡，合理搭配各种营养成分，以及摄入微生态制剂、发酵乳制品等营养保健品。
[0003] 乳酸菌是机体先天性免疫系统的重要组成成分，是机体维持免疫机能稳定状态不可缺少的部分，在维持宿主微生态平衡以及提高机体免疫系统功能方面起着至关重要的作用，其使用价值日益受到人们的重视。因此有必要充分利用我国广阔的乳酸菌菌种资源，筛选得到具有自主知识产权的菌株和相关产品。

发明内容

[0004] 有鉴于此，本发明提供了罗伊氏粘液乳杆菌AUc2301及其应用，其保藏编号为CGMCC No.28630。本发明通过实验发现所述罗伊氏粘液乳杆菌AUc2301具有耐酸、耐胆盐、抑菌、调节免疫活性和抗炎的功能。
[0005] 为解决背景技术中提出的技术问题，本发明采用以下技术方案：
[0006] 第一方面，本发明中提供了一种罗伊氏粘液乳杆菌(Limosilactobacillus reuteri)菌株AUc2301，所述罗伊氏粘液乳杆菌菌株AUc2301保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.28630。
[0007] 第二方面，本发明中提供了一种微生物制剂，包括如上所述的罗伊氏粘液乳杆菌(Limosilactobacillus reuteri)AUc2301。
[0008] 第三方面，如上所述的罗伊氏粘液乳杆菌(Limosilactobacillus reuteri)AUc2301或所述微生物制剂在制备具有如下功效的产品中的应用：
[0009] 耐酸；和/或
[0010] 耐胆盐；和/或
[0011] 抑菌；和/或
[0012] 调节免疫活性；和/或
[0013] 抗炎。
[0014] 进一步地，所述耐酸的pH值包括2.0‑4.0；和/或
[0015] 所述耐胆盐包括耐0.1‑0.4％牛胆盐；和/或
[0016] 所述抑菌在于抑制革兰氏阴性菌；和/或
[0017] 所述调节免疫活性包括促进健康细胞释放免疫细胞因子；和/或
[0018] 所述抗炎包括抑制炎症细胞中炎症因子的释放。
[0019] 进一步地，所述促进健康细胞释放免疫细胞因子中的免疫细胞因子包括：IL‑6、IL‑1β、TNF‑α和NO；和/或
[0020] 所述抑制炎症细胞中炎症因子的释放中的炎症因子包括：IL‑6、IL‑1β、TNF‑α、NO、PGE2。
[0021] 第四方面，本发明提供了一种发酵制品，所述发酵制品经由如上所述的AUc2301或所述的微生物制剂发酵制得。
[0022] 第五方面，本发明提供了一种食品，所述食品中包括：
[0023] 如上所述的AUc2301、所述的微生物制剂和如所述的发酵制品中的至少一种；以及可接受的辅料；
[0024] 所述食品包括营养保健品、乳饮料、食品级活菌制剂、奶粉和米粉中的至少一种。
[0025] 第六方面，本发明提供了一种宠物食品，所述宠物食品中包括：
[0026] 如上所述的AUc2301、所述的微生物制剂和如所述的发酵制品中的至少一种；以及可接受的辅料。
[0027] 第七方面，本发明提供了一种饲料，所述饲料中包括：
[0028] 如上所述的AUc2301、所述的微生物制剂和如所述的发酵制品中的至少一种；以及可接受的辅料。
[0029] 第八方面，本发明提供了一种药品，所述药品中包括：
[0030] 如上所述的AUc2301、所述的微生物制剂和如所述的发酵制品中的至少一种；以及可接受的辅料。
[0031] 进一步地，所述药品的药物剂型为粉剂、片剂、丸剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、乳剂、混悬剂或油剂。
[0032] 第九方面，本发明提供了一种化妆品，所述化妆品中包括：
[0033] 如上所述的AUc2301、所述的微生物制剂和如所述的发酵制品中的至少一种；
[0034] 以及可接受的辅料。
[0035] 本发明的上述技术方案的有益效果如下：
[0036] 本发明提供了一种罗伊氏粘液乳杆菌及其应用，所述罗伊氏粘液乳杆菌分类学命名为罗伊氏粘液乳杆菌(Limosilactobacillus reuteri)AUc2301，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号为CGMCCNo.28630。
[0037] 本发明中提供的罗伊氏粘液乳杆菌AUc2301至少具有以下性能：
[0038] (1)AUc2301具有较好的耐酸能力，在pH 2.5的酸性MRS培养基中，培养2h，存活率能达到58％；
[0039] (2)AUc2301具有较好的耐受胆盐的能力，在含0.3％牛胆盐的生理盐水中培养2h后，存活率能达到52％；
[0040] (3)AUc2301具有抑菌活性；
[0041] (4)AUc2301对大部分青霉素、头孢噻吩、庆大霉素、氨苄西林等药物敏感，但对万古霉素、恩诺沙星和环丙沙星等药物都耐受或者中介，表现出一定的耐药性；
[0042] (5)AUc2301能促进RAW264.7细胞增殖；能促进RAW264.7细胞吞噬活性；能显著提高RAW264.7细胞免疫细胞因子IL‑6、IL‑1β、TNF‑α和NO的释放；能显著抑制LPS诱导的RAW264.7中COX‑2蛋白的表达；能显著抑制LPS诱导的RAW264.7中PGE2的释放；AUc2301能通过NF‑κB信号通道显著抑制LPS诱导的RAW264.7中IL‑6、IL‑1β、TNF‑α和NO炎症因子的释放，表明AUc2301具有调节免疫活性和抗炎的功能。
[0043] 生物材料保藏
[0044] 生物材料：菌株AUc2301，分类命名：罗伊氏乳杆菌(Limosilactobacillus reuteri)，于2023年10月16日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.28630。附图说明
[0045] 图1为AUc2301对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞中COX‑2的影响；
[0046] 图2为AUc2301对NF‑κB信号通道蛋白表达的影响。

具体实施方式

[0047] 本发明公开了菌株AUc2301及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0048] 第一方面，本发明中提供了本发明中提供了一种罗伊氏粘液乳杆菌(Limosilactobacillus reuteri)菌株AUc2301，所述罗伊氏粘液乳杆菌菌株AUc2301保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.28630。
[0049] 本发明方案中菌株AUc2301，分类命名：罗伊氏乳杆菌(Limosilactobacillus reuteri)，于2023年10月16日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.28630。
[0050] 第二方面，本发明中提供了一种微生物制剂，包括如上所述的罗伊氏粘液乳杆菌(Limosilactobacillus reuteri)AUc2301。
[0051] 第三方面，如上所述的罗伊氏粘液乳杆菌(Limosilactobacillus reuteri)AUc2301或所述微生物制剂在制备具有如下功效的产品中的应用：
[0052] 耐酸；和/或
[0053] 耐胆盐；和/或
[0054] 抑菌；和/或
[0055] 调节免疫活性；和/或
[0056] 抗炎。
[0057] 根据本发明的一些实施例，所述耐酸的pH值包括2.0‑4.0；所述耐胆盐包括耐0.1‑0.4％牛胆盐；所述抑菌在于抑制革兰氏阴性菌；所述调节免疫活性包括促进健康细胞释放免疫细胞因子；所述抗炎包括抑制炎症细胞中炎症因子的释放。
[0058] 进一步地，所述促进健康细胞释放免疫细胞因子中的免疫细胞因子包括：IL‑6、IL‑1β、TNF‑α和NO；所述抑制炎症细胞中炎症因子的释放中的炎症因子包括：IL‑6、IL‑1β、TNF‑α、NO、PGE2。
[0059] 第四方面，本发明提供了一种发酵制品，所述发酵制品经由如上所述的AUc2301或所述的微生物制剂发酵制得。
[0060] 第五方面，本发明提供了一种食品，所述食品中包括：
[0061] 如上所述的AUc2301、所述的微生物制剂和如所述的发酵制品中的至少一种；以及可接受的辅料；
[0062] 所述食品包括营养保健品、乳饮料、食品级活菌制剂、奶粉和米粉中的至少一种。
[0063] 第六方面，本发明提供了一种宠物食品，所述宠物食品中包括：
[0064] 如上所述的AUc2301、所述的微生物制剂和如所述的发酵制品中的至少一种；以及可接受的辅料。
[0065] 第七方面，本发明提供了一种饲料，所述饲料中包括：
[0066] 如上所述的AUc2301、所述的微生物制剂和如所述的发酵制品中的至少一种；以及可接受的辅料。
[0067] 第八方面，本发明提供了一种药品，所述药品中包括：如上所述的AUc2301、所述的微生物制剂和如所述的发酵制品中的至少一种；以及可接受的辅料。
[0068] 根据本发明的一些实施例，所述药品的药物剂型为粉剂、片剂、丸剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、乳剂、混悬剂或油剂。
[0069] 第九方面，本发明提供了一种化妆品，所述化妆品中包括：如上所述的AUc2301、所述的微生物制剂和如所述的发酵制品中的至少一种；以及可接受的辅料。
[0070] 本发明中的试验均进行三次平行取平均值±标准差，采用Excel、IBM  SPSS Statistics 26软件进行数据分析处理。
[0071] 本发明采用CCK‑8法从包括84株乳酸菌的菌株库中筛选调节免疫活性的乳酸菌。所述CCK‑8法按照CCK‑8试剂盒的操作说明书进行，所述CCK‑8试剂盒购买自碧云天生物科技有限公司。所述菌株库中的菌株的来源为：从全国各地不同年龄、不同品种健康猫采集猫粪便34份。将粪便样品采用无菌生理盐水稀释后，将样品中的固体残渣用无菌纱布过滤除去后，取滤液用无菌生理盐水按10‑1、10‑2、10‑3、10‑4、10‑5、10‑6进行倍比稀释，从各稀释液中吸取200μL稀释后的样品，涂布于的MRS固体平板(含2％CaCO3)上，各个样品做三次重复，后将平板置于37℃培养箱24～48h。挑选具有明显溶钙环且具乳酸菌典型形态的单菌落，经纯化后接种于MRS肉汤培养基中，置于冰箱4℃下保存待用。其中AUc2301能促进免疫细胞增殖；中性红实验验证菌株AUc2301能提高巨噬细胞的吞噬活性：进一步ELASA实验发现AUc2301不仅能提高RAW264.7细胞中细胞因子的释放还能抑制LPS诱导的RAW264.7细胞中炎症因子和炎症介质的过度释放，AUc2301的活菌对指示菌仍然有抑菌作用。通过形态学观察和16S rRNA基因序列分析，菌株AUc2301鉴定为罗伊氏粘液乳杆菌。
[0072] 菌株AUc2301的16S rRNA基因序列如SEQ ID No.1，将该序列在NCBI中进行核酸序列比对，结果显示菌株为罗伊氏粘液乳杆菌，命名为罗伊氏粘液乳杆菌(Limosilactobacillus reuteri)AUc2301。
[0073] 菌株AUc2301具有如下功能：
[0074] (1)AUc2301具有较好的耐酸能力；
[0075] (2)AUc2301具有较好的耐受胆盐的能力；
[0076] (3)AUc2301具有抑菌活性；
[0077] (4)AUc2301对大部分青霉素、头孢噻吩、庆大霉素、氨苄西林等药物敏感，但对万古霉素、恩诺沙星和环丙沙星等药物都耐受或者中介，表现出一定的耐药性；
[0078] (5)AUc2301能促进RAW264.7细胞增殖；
[0079] (6)AUc2301能促进RAW264.7细胞吞噬活性；
[0080] (7)AUc2301能显著提高RAW264.7细胞释放免疫细胞因子IL‑6、IL‑1β、TNF‑α和NO；
[0081] (8)AUc2301能通过NF‑κB信号通道显著抑制LPS诱导的RAW264.7中IL‑6、IL‑1β、TNF‑α和NO炎症因子的释放。加菌实验组与模型组相比炎症因子含量均有所下降，且菌的OD值在0.8时以上抑制炎症因子分泌效果较好。表明AUc2301具有抗炎能力；
[0082] (9)AUc2301能显著抑制LPS诱导的RAW264.7中COX‑2蛋白的表达；
[0083] (10)AUc2301能显著抑制LPS诱导的RAW264.7中PGE2的释放。
[0084] 如无特殊说明，本发明所用原料及试剂均可由市场购得。
[0085] 下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0086] 实施例1乳杆菌AUc2301耐酸耐胆盐实验
[0087] MRS肉汤培养基的pH值分别用0.1moI/L的HCl调节至2.0、2.5和3.0，121℃灭菌8
20min。无菌条件下接种乳杆菌菌株，初始活菌数为1×10CFU/mL，37℃培养箱中恒温培养。
于0h和2h取样涂布平板统计活菌数，计算存活率。
[0088] MRS肉汤培养基胆盐质量分数通过牛胆盐将其调整为0.3％，无菌条件下接种乳酸8
菌菌株，初始活菌数为1×10CFU/mL，37℃培养箱中恒温培养。于0h和2h取样涂布平板统计活菌数，计算存活率，存活率的计算公式如下所示：
[0089] 存活率计算公式＝2h活菌数/0h活菌数*100％。
[0090] 结果分析：
[0091] 表1中记载了罗伊氏粘液乳杆菌AUc2301对pH 2.5MRS培养基耐受能力的数据。从表1中的存活率可以看出，菌株AUc2301在pH 2.5的酸性MRS培养基中，培养2h，存活率仍可以达到58％，说明菌株AUc2301具有较好的耐酸能力。
[0092] 表1
[0093]
[0094] 表2中记载了罗伊氏粘液乳杆菌AUc2301对0.3％牛胆盐溶液耐受能力的数据，从表2中的存活率可以看出，菌株AUc2301在含0.3％牛胆盐的生理盐水中培养2h后，存活率达到52％，说明菌株AUc2301具有较好的耐受胆盐的能力。
[0095] 表2
[0096]
[0097] 实施例2乳杆菌AUc2301抑菌实验
[0098] 首先用无菌生理盐水将活化后培养24h的大肠杆菌Escherichia  coli(ATCC33760)、志贺氏菌Shigella Castellani(ATCC25957)、沙门氏菌Salmonella
5
(CGMCC1.1869)(购自青岛海博生物科技有限公司)的菌悬液稀释至浓度为10CFU/mL，然后用无菌棉签涂布于BHI固体培养基上，菌液干燥后将牛津杯置于平板上。将待测的乳杆菌AUc2301培养24h，8000RPM离心10min取上清液200μL，加至指示板上的牛津杯中，将平板于4℃冰箱静置4～6h，待上清液完全扩散至琼脂后将其移入37℃培养箱，每菌株设置3个重复，对照孔采用等量MRS液体空白培养基。于培养至12h后，将平板从37℃培养箱中取出，通过无菌镊子将牛津杯取下，以游标卡尺测量其抑菌直径，以抑菌圈直径≥13mm为标准筛选菌株。
[0099] 结果分析
[0100] 表3中记载了以上几种不同的指示菌的抑菌圈直径，如表3所示，菌株AUc2301抑制大肠杆菌、志贺氏菌、沙门氏菌有较好的效果。
[0101] 表3菌株AUc2301对指示菌的抑菌作用
[0102]
[0103] 实施例3乳杆菌AUc2301药敏性试验
[0104] 将纯化培养后的乳杆菌AUc2301菌液浓度调整为108CFU/mL，用涡旋混匀器混匀后将菌液涂布MRS固体培养基，待菌液吸收后放置药敏纸片(恩诺沙星、环丙沙星、青霉素、头孢噻吩、庆大霉素、万古霉素及氨苄西林)，37℃培养24h。每组重复3次，测量记录抑菌直径。最终判定方法参照《CLSI抗菌药物敏感性试验实施标准(2019)》中的规定：抑菌圈直径≥
20mm表示敏感，抑菌圈直径为15mm≤直径≤19mm表示中度敏感，抑菌圈直径≤14mm表示耐受。
[0105] 乳杆菌AUc2301对抗生素的耐药性的实验结果如表4所示。由表4结果分析：菌株AUc2301对氨苄西林、青霉素、头孢噻吩、庆大霉素药物敏感，但对恩诺沙星、环丙沙星、万古霉素等药物都耐受或者中介，表现出一定的耐药性。
[0106] 表4
[0107]抗生素 耐药性
氨苄西林 S
青霉素 S
头孢噻吩 S
恩诺沙星 I
万古霉素 R
庆大霉素 S
环丙沙星 I
[0108] 注：R：耐药；I：中介；S：敏感
[0109] 实施例4菌株AUc2301对巨噬细胞增殖影响实验
[0110] 细菌悬液的制备：将菌株从菌种库取出，接种于MRS培养基中，37℃恒温培养24h，传代活化三次，4℃、10000r/min条件下离心15min，去除上清液，菌泥，生理盐水清洗菌泥，稀释，利用酶标仪调节菌悬液于0.8，制得细菌悬液，现配现用。商业菌株鼠李糖乳杆菌(LGG)Lactobacillus rhamnosus GG作为阳性对照组。
[0111] 巨噬细胞的培养及处理：RAW264.7细胞以10％胎牛血清(FBS)+DMEM高糖培养基在37℃5％ CO2的条件中培养。消化时去培养基，加2mL PBS润洗后弃去，随后加入1mL胰酶，消化60s后吸去加入适量培养基，将细胞从壁面吹下制成悬液，移取悬液至新的容器中。待细胞稳定长满细胞瓶后，接入适宜孔板长至90％。采用CCK‑8法，取200μL对数生长期细胞接种
4
于96孔板中，其中每个孔中的细胞数为2×10个，放置于培养箱中37℃预培养24小时。移96孔板中的旧培养基，替换为新鲜的无血清培养基，放置于培养箱中37℃预培养2.5h。加入OD600nm值为0.8的菌悬液于96孔板中，37℃培养箱继续培养12h。根据CCK‑8试剂盒(碧云天生物科技有限公司)提供方法进行实验，反应结束后各孔加入20μL CCK‑8溶液处理3h。使用酶标仪在450nm测定各个样品的吸光度，并计算存活率。
[0112] 结果与分析
[0113] 菌株AUc2301促进免疫细胞增殖结果见表5。如表5所示，与空白对照组对比，AUc2301在光密度为0.8时较对照组显著提高了RAW264.7巨噬细胞的增殖能力(p<0.05)，同时，AUc2301在OD值为0.8时对RAW264.7巨噬细胞无细胞毒性。
[0114] 表5
[0115]组别 细胞存活率(％)
a
AUc2301 132.32±10.54
b
LGG 129.06±3.45
空白对照组 100％
[0116] 注：表中结果均进行三次平行取平均值±标准差。
[0117] 实施例5 AUc2301对免疫细胞吞噬活性的影响
[0118] 设阴性对照组、阳性对照组和实验组，按照实施例4中的方法处理巨噬细胞RAW264.7，培养12h后，加0.072％中性红液100μL/孔，继续培养30min后弃去中性红，PBS洗涤2次，每孔加入细胞裂解液(乙醇∶乙酸＝1∶1，V/V)100μL，放置4℃冰箱过夜，细胞完全溶解后，采用酶标仪测定波长540nm处的光密度值，计算吞噬活性，
[0119] 其计算公式如下：
[0120] 吞噬活性＝As/Ac×100％
[0121] 式中：As为阴性对照组的OD540nm值；Ac为实验组的OD540nm值。
[0122] 如表6所示，与对照组相比，当AUc2301处理细胞时，吞噬活性比空白对照组高出1.2倍，且高于菌株LGG，表明菌株AUc2301能够提高巨噬细胞的吞噬活性。
[0123] 表6菌株AUc2301对巨噬细胞吞噬活性的影响
[0124] 组别 细胞吞噬活性(％)a
AUc2301 122.45±13.57
b
LGG 117.78±7.22
空白对照组 100％
[0125] 实施例6 AUc2301对巨噬细胞中NO、IL‑6、IL‑1β和TNF‑α释放的影响[0126] 将巨噬细胞RAW264.7接种于24孔板，每孔细胞悬液(细胞浓度为5×105个/mL)1mL，37℃、5％ CO2条件下培养24h，细胞贴壁生长，弃培养液，设阴性对照组(只有细胞)、阳性对照组(LGG+细胞)和实验组(菌株AUc2301+细胞)，每组6个副孔，于37℃、5％ CO2条件下培养12h。培养液于4℃、3 000r/min条件下离心10min，收集细胞上清液，采用试剂盒(厦门仑昌硕生物科技有限公司)测定共培养上清液中NO、IL‑6、IL‑1β和TNF‑α的含量。
[0127] 结果与讨论
[0128] 表7中记载了性对照组(只有细胞)、阳性对照组(LGG+细胞)和实验组(菌株AUc2301+细胞)对巨噬细胞释放细胞因子的影响。如表7所示，与LGG处理组相比，菌株AUc2301的干预显著提高了IL‑6、IL‑1β和TNF‑α的水平。与空白对照组相比，当AUc2301处理细胞时，IL‑6、IL‑1β、TNF‑α和NO的释放量分别约为空白对照组2倍、4倍、2倍和5倍。
[0129] 表7
[0130]
[0131] 实施例7 AUc2301抗炎能力评价
[0132] AUc2301对细胞因子和前列腺E2的影响：将巨噬细胞RAW264.7接种于24孔板，每孔5
细胞悬液(细胞浓度为5×10个/mL)1mL，37℃、5％ CO2条件下培养24h，细胞贴壁生长，弃培养液，设阴性对照组(只有细胞)、造模组(细胞+LPS)阳性对照组(LGG+细胞+LPS)和实验组(菌株AUc2301+细胞+LPS)，每组6个副孔，于37℃、5％ CO2条件下培养12h。培养液于4℃、3 
000r/min条件下离心10min，收集细胞上清液，采用试剂盒(厦门仑昌硕生物科技有限公司)测定共培养上清液中NO、IL‑6、IL‑1β和TNF‑α、PGE2的含量。
[0133] AUc2301对LPS诱导的巨噬细胞中COX‑2表达的影响：将巨噬细胞RAW 264.7在6孔5 9
板中以1.0×10细胞/mL的密度培养，并用选择的菌悬液(10CFU/mL)处理，有或没有脂多糖(2.5μg/mL)。孵育16小时后，小心移出上清液，细胞在含有1％蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物的放射免疫沉淀分析缓冲液中裂解，含有1％蛋白磷酸酶抑制剂混合物，在4℃下以8000×g离心20分钟，测定细胞裂解物中的蛋白质浓度。通过十二烷基硫酸钠‑聚丙烯酰胺凝胶电泳分离等量的蛋白质(15g)。将分离的蛋白质转移到聚偏氟乙烯膜上，随后在室温下用含有
0.5％ Tween‑20和5％脱脂奶粉的Tris‑缓冲盐水(10mmol/L Tris‑Cl，pH7.4)封闭1小时。
印迹用相应的一抗(NF‑κB和IκBα蛋白质磷酸化的抗体)，在4℃过夜探测。用一抗体孵育后，用1:2000稀释作为二级抗体孵育膜。使用增强化学发光(ECL)检测系统检测免疫反应带。
[0134] AUc2301对LPS诱导的巨噬细胞中NO、IL‑6、IL‑1β和TNF‑α释放的影响：将巨噬细胞5
RAW264.7接种于24孔板，每孔细胞悬液(细胞浓度为5×10个/mL)1mL，37℃、5％ CO2条件下培养24h，细胞贴壁生长，弃培养液，设阴性对照组(只有细胞)、阳性对照组(LGG+细胞)和实验组(菌株AUc2301+细胞)，每组6个副孔，于37℃、5％ CO2条件下培养12h。培养液于4℃、3 
000r/min条件下离心10min，收集细胞上清液，采用试剂盒(厦门仑昌硕生物科技有限公司)测定共培养上清液中NO、IL‑6、IL‑1β和TNF‑α的含量。
[0135] 结果与讨论
[0136] 结果如表8所示：结果显示AUc2301能显著抑制IL‑6、IL‑1β、TNF‑α、NO、PGE2等细胞因子的释放。AUc2301实验组与模型组相比炎症因子含量有所下降。表明AUc2301具有抗炎能力。进一步地，为了研究菌株AUc2301是否参与调控与PGE2产生相关的COX‑2蛋白，本发明中还使用Western blot分析检测了它们的表达。如图1所示，LPS刺激后COX‑2蛋白表达水平显著高于对照组(P<0.05)。经AUc2301预处理后，COX‑2蛋白的表达逐渐降低(P<0.05)。这些结果表明，AUc2301通过下调COX‑2蛋白的表达来抑制PGE2的产生。
[0137] 表8
[0138]
[0139] 实施例8蛋白质印迹技术探究AUc2301炎症机制
[0140] 炎症反应的特点是协调激活各种信号通路，调节常驻组织细胞和从血液中招募的白细胞中促炎和抗炎介质的表达，其中NF‑κB作为经典的炎症信号通路具有三种激活方式，但是都依赖激酶。一种途径由促炎细胞因子(如TNF‑α)所触发，当TNF‑α与TNF受体1(TNF Receptor 1，TNFR1)相结合时，受体会释放死亡结构域沉默子(Silencer Of Death Domains，SODD)并触发类似于转接器的TNF受体相关死亡域蛋白(TNF Receptor Associated Death Domain protein，TRADD)、受体介导蛋白(Receptor Interacting Protein，RIP)、TNF受体相关因子(TNF Receptor Associated Factor，TRAF)向膜的顺序进行募集，TRAF2会将IKK复合体招募至TNFR1信号复合体处，然后RIP和TRAF2进入细胞质膜。
随后是IκB激酶(Inhibitor of nuclear factor kappa‑B Kinase，IKK)复合物的招募和激活，该复合物包括支架蛋白NF‑κB必需调节剂、IKKα和IKkkβ激酶，一旦激活，IKK复合物将Ser32和Ser36上的IκBα(inhibitor of kappab kinase alpha)磷酸化，随后通过蛋白酶体途径泛素化和降解，最后异二聚体p50–p65被释放并迁移到细胞核，在那里它与特定的κB位点结合并激活多种NF‑κB(nuclear factor kappa‑B)靶基因(其中包括TNF‑α、IL‑6)，这是NF‑κB的经典激活途径。我们可以通过检测NF‑κB和IκBα蛋白质磷酸化的变化，从而推测NF‑κB是否被激活，从而促进炎症因子的释放。
[0141] 我们将巨噬细胞RAW 264.7在6孔板中以1.0×105细胞/mL的密度培养，并用选择的菌悬液(OD600nm＝0.8)处理，有或没有脂多糖(2.5μg/mL)。孵育16小时后，小心移出上清液，细胞在含有1％蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物的放射免疫沉淀分析缓冲液中裂解，含有1％蛋白磷酸酶抑制剂混合物，在4℃下以8000×g离心20分钟，测定细胞裂解物中的蛋白质浓度。通过十二烷基硫酸钠‑聚丙烯酰胺凝胶电泳分离等量的蛋白质(15g)。将分离的蛋白质转移到聚偏氟乙烯膜上，随后在室温下用含有0.5％ Tween‑20和5％脱脂奶粉的Tris‑缓冲盐水(10mmol/L Tris‑Cl，pH 7.4)封闭1小时。印迹用相应的一抗(NF‑κB和IκBα蛋白质磷酸化的抗体)，在4℃过夜探测。用一抗体孵育后，用1:2000稀释作为二级抗体孵育膜。使用增强化学发光(ECL)检测系统检测免疫反应带。
[0142] 结果如图2所示，结果显示LPS促进NF‑κB和IκBα蛋白质磷酸化，而菌株AUc2301和LPS共处理NF‑κB和IκBα蛋白质磷酸化水平下降。结果表明菌株AUc2301通过NF‑κB信号通道抑制炎症因子的释放。
[0143] 以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

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