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一种用于预防和干预关节炎的鼠李糖乳杆菌AFY05及其应用
申请号	CN202311484563.8	申请日	2023-11-09	公开(公告)号	CN117645946A	公开(公告)日	2024-03-05
申请人	重庆第二师范学院;			发明人	赵欣;
摘要	本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种鼠李糖乳杆菌AFY05及其在制备痛风产品中的应用，该鼠李糖乳酪杆菌(Lacticaseibacillusrhamnosus)AFY05保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.27365。本发明所提供的鼠李糖乳酪杆菌(Lacticaseibacillusrhamnosus)AFY05对痛风性关节炎具有良好的干预效果，是一种有效的预防和干预关节炎的益生菌。
权利要求	1.一株鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)AFY05，其保藏号为CGMCC NO.27365。 2.权利要求1所述的鼠李糖乳酪杆菌AFY05在制备预防和干预关节炎的药物的应用。 3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述关节炎疾病选自骨关节炎、感染性关节炎、类风湿性关节炎、痛风性关节炎和单纯滑膜炎。 4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述关节炎疾病为痛风性关节炎。 5.权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)AFY05在制备药物中的应用，其特征在于，所述药物用于抑制或减缓踝关节水肿、提高痛阈值、抑制踝关节炎症和氧化损伤。 8 6.根据权利要求2‑5任一项所述的应用，其特征在于，所述药物每天的给药剂量为10 ‑ 9 10CFU/kg.bw。 9 7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药物每天的给药剂量为10CFU/kg.bw。 8.一种药物，其特征在于，所述药物包括权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)AFY05。 9.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)AFY05以及药学上可接受的载体。 10.根据权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为口服剂型。 11.根据权利要求9或10所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括鼠李糖乳杆菌CCFM1131。 12.根据权利要求9或10所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括鼠李糖乳杆菌Probio‑M9。
说明书全文	一种用于预防和干预关节炎的鼠李糖乳杆菌AFY05及其应用技术领域 [0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于预防和干预关节炎的鼠李糖乳杆菌及其应用。背景技术 [0002] 痛风(Gout)性关节炎是一种反复发作的关节炎症，主要原因是血中尿酸含量过高(高尿酸血症)而导致尿酸盐结晶沉积在关节内的疾病。尿酸是细胞中核酸(核糖核酸RNA和脱氧核糖核酸DNA)分解的副产物，血液中的高尿酸含量可导致关节中尿酸水平升高，进而导致在关节组织和关节液(称为“滑液”)内形成尿酸结晶。该疾病对肾脏和泌尿系统造成不同程度的损害，影响正常排尿功能，可能导致疾病发展。在某些情况下，患者可能因为肾功能衰竭而死亡。 [0003] 在治疗通风性关节炎方面，主要有以下方法：(1)使用药物缓解由炎症导致的疼痛和肿胀休息；(2)夹板固定疼痛关节，冰敷；(3)调整饮食和减轻体重，以降低尿酸水平并防止进一步发作；(4)使用药物预防由结晶导致的炎症，以防止发作降低尿酸水平和溶解结晶的药物(可参见默沙东诊疗手册，家庭版/骨、关节及肌肉疾病/痛风和焦磷酸钙性关节炎/痛风)。采用夹板等物理方式治疗仅是缓解疼痛，并不能实现有效机体治疗；控制饮食的过程很痛苦，且难以坚持；采用的药物例如非甾体类抗炎药能够短暂缓解，但是可能会对肾脏产生影响，秋水仙碱是治疗通风性关节炎的传统药物，但其副作用明显，例如会导致腹泻，对体温、呼吸中枢、血管、血压等存在不良影响。 [0004] 通过挖掘益生菌的潜在治疗前景得到重视，在国内也有临床研究采用双歧杆菌四联活 [0005] 菌片用于类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)的辅助治疗(高举梅，等，双歧杆菌四联活菌片对类风湿关节炎患者TNF‑α和脂联素水平的影响[J].泰山医学院学报，2017，38(07):761‑764.)。但对于痛风性关节炎，现有技术也已有将鼠李糖乳杆菌菌株用于痛风治疗的案例，例如ZL202210368569.8中，将其与干酪乳杆菌、乳双歧杆菌、植物乳杆菌混合制备复合型益生菌组合物，用于制备治疗糖尿病及降低尿酸含量；ZL202111480237.0中，采用发酵乳杆菌制备防治高尿酸血症的组合物；ZL202011488400.3和ZL202011486857.0中记载了能够用于缓解治疗通风的鼠李糖乳杆菌。但以上各种乳杆菌均具有多样性特征，对于具有通风治疗价值的菌株的挖掘仍然是具有潜在价值和前景。发明内容 [0006] 为找出具有潜在应用价值的菌株，应用于痛风性关节炎预防和治疗，本公开提供了一株新的鼠李糖乳杆菌及其组合物、应用。 [0007] 在一个方面，本公开提供了一株鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)AFY05，其保藏号为CGMCC NO.27365，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。 [0008] 在一个具体实施方式中，所述的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)AFY05的16srDNA的序列如SEQ ID NO.1所示或与SEQ ID No:1所述的序列的相似度≥85％，或≥90％，或≥99.9％。 [0009] 在另一个方面，本公开提供了第一方面所述的鼠李糖乳酪杆菌AFY05在制备预防和干预关节炎的药物的应用。 [0010] 在一个具体实施方式中，所述关节炎疾病选自骨关节炎、感染性关节炎、类风湿性关节炎、痛风性关节炎和单纯滑膜炎。 [0011] 在一个具体实施方式中，所述关节炎疾病为痛风性关节炎。 [0012] 在一个具体实施方式中，所述药物用于抑制或减缓踝关节水肿、提高痛阈值、抑制踝关节炎症和氧化损伤。 [0013] 在一个具体实施方式中，所述药物每天的给药剂量为108 ‑109CFU/kg.bw。 [0014] 在一个具体实施方式中，所述药物每天的给药剂量为109CFU/kg.bw。 [0015] 在一个具体实施方式中，所述组合物包括食品上可接受的载体或药学上可接受的载体。 [0016] 在一个具体实施方式中，所述组合物包括有效量的第一方面所述的鼠李糖乳酪杆菌AFY05和/或其代谢产物。 [0017] 在另一个方面，本公开还提供了一种药物，所述药物包括第一方面所述的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)AFY05。 [0018] 在一个具体实施方式中，所述药物的形态包括液体、固态和半液体。 [0019] 在一个具体实施方式中，所述药物采用口服方式施用。 [0020] 在另一个方面，本公开提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括第一方面所述的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)AFY05以及药学上可接受的载体。 [0021] 在一个具体实施方式中，所述药学上可接受的载体包括但不限于：填充剂、润湿剂、崩解剂、粘合剂或润滑剂中的一种或多种。 [0022] 在一个具体实施方式中，所述药物组合物为口服剂型。 [0023] 在一个具体实施方式中，所述药物组合物还包括鼠李糖乳杆菌CCFM1131。 [0024] 在一个具体实施方式中，所述药物组合物还包括鼠李糖乳杆菌Probio‑M9。 [0025] 本发明的有益效果： [0026] 1、本公开的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)AFY05能够显著缓解痛风导致的裸关节水肿，特别是高浓度情况下，其缓解效果最佳。 [0027] 2、本公开的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)AFY05能够显著提高痛风的痛阈值。 [0028] 3、本公开的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)AFY05能够显著降低关节炎踝关节组织的MPO酶活力和MDA水平，提高SOD酶活力和GSH水平。 [0029] 4、本公开的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)AFY05能够显著抑制踝关节的炎症和氧化损伤。 [0030] 5、通过实验找出本公开的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)AFY05与现有技术中的益生菌能够形成组合物，取得了更优的技术效果。附图说明 [0031] 图1示出了不同模型组小鼠踝关节部位组织石蜡包埋、切片后进行苏木精‑伊红(H&E)染色的图片。 [0032] 图2示出了各个模型组采用不同处理后踝关节组织的ERK1/2、COX‑2、PGE2、IL‑6、IFN‑γ和TNF‑αmRNA表达情况，以及Cu/Zn‑SOD、Mn‑SOD和CAT的mRNA表达情况。具体实施方式 [0033] 生物材料保藏 [0034] 鼠李糖乳酪杆菌AFY05，分类命名为Lacticaseibacillusrhamnosus，已于2023年5月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为GDMCC No：27365。 [0035] 实施例1鼠李糖乳酪杆菌AFY05的获得 [0036] 1、实验材料获取 [0037] 采自新疆阿勒泰地区切木尔切克镇自然发酵的牦牛酸奶,吸取40mL自然发酵酸奶放入无菌离心管中，置于食品采样箱内，放于实验室4℃冰箱保存备用。 [0038] 2、鼠李糖乳酪杆菌AFY05的分离鉴定 [0039] (1)分别取1mL自然发酵酸奶样品，采用无菌生理盐水将酸奶样品进行梯度稀释，‑1 ‑2 ‑3 ‑4 ‑5 ‑6 ‑7 ‑4 ‑5 ‑6分别获得10 、10 、10 、10 、10 、10 、10 ，之后取10 、10 、10 3个梯度的菌液100μL进行平板涂布，37℃培养24‑48h，观察并记录菌落形态。挑取平板上不同形态的菌落进行划线分离，经37℃培养48h后，再次挑取平板上不同形态的单菌落进行划线分离，如此重复2至3次，直至得到形态一致的纯单菌落，置于甘油管中‑20℃保藏。 [0040] (2)将目标菌株接种于MRS肉汤中，37℃条件下培养18‑24h，采用细菌基因组DNA提取试剂盒进行DNA提取，之后采用以下体系进行扩增：上游引物27F(SEQ ID NO.2)1μL、下游引物1495R(SEQ ID NO.3)1μL，2×Taq plus Buffer 12.5μL、模板DNA 1μL，用无菌dd H2O将体系补足至25μL。扩增条件为：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，共29个循环，最后72℃延伸5min。 [0041] 另外以无菌超纯水替代模板DNA设置PCR扩增体系，同样进行PCR扩增，将其作为阴性对照。 [0042] (3)取步骤(2)所获得的扩增产物5μL进行琼脂糖凝胶电泳检测，并将PCR产物送测(深圳华大基因股份有限公司有限公司)鉴定，得到的菌株基因序列SEQ ID NO.1所示。通过对比发现，其与Gene Bank数据库中已知基因组序列(Gene Bank ID，CP053619.1)相同。 [0043] 实施例2乳酸菌体外抗性检测 [0044] 1、在MRS‑THIO培养基(含0.2％巯基乙酸钠的MRS肉汤)中添加猪胆盐(终浓度为0.3％)，121℃灭菌15min，将活化好的5mL菌种以2％(v/v)的接种量分别接入不含胆盐(0.0％)的MRS‑THIO培养基和含0.3％胆盐的MRS‑THIO培养基中，以空白培养基(未接菌的MRS‑THIO培养基)为对照，37℃培养24h后，分别测定上述不同浓度培养基的OD600nm值，按公式(1)计算菌株对胆盐的耐受力： [0045] [0046] 2、人工胃液耐受性试验 [0047] 配制人工胃液由0.2％ NaCl和0.35％胃蛋白酶组成的人工胃液，按照对应的质量体积比分别称取试验所需NaCl和胃蛋白酶进行配制，用1mol/L的HCl将配制好的人工胃液pH调整为3.0，再用0.22μm的滤膜过滤除菌备用。 [0048] 在超净工作台中吸取5mL培养好的含菌培养基于10mL无菌离心管中，经3000r/min离心10min，弃去上层培养基并收集菌体，加入等体积(5mL)无菌生理盐水混匀制成菌悬液，然后取1mL菌悬液与9mL pH 3.0的人工胃液混匀，此时取1mL上述混合液作为人工胃液处理0h的样品，剩余9mL混合液置于恒温水浴摇床(37℃，150r/min)中培养3h。0h和3h的样品分别经10倍梯度稀释，选择合适梯度采用平板涂布的方法测定活菌数，在MRS固体培养基上37℃培养48h，按公式2计算存活率(％)。 [0049] [0050] 测定结果如下： [0051] 表1 [0052] [0053] 鼠李糖乳酪杆菌AFY05体外抗性结果见表1，在pH 3.0人工胃液中的存活率超过了98％；在0.3％胆盐均能生长，存活率超过了71.02％，这说明菌株具有较强的耐受胆盐能力。 [0054] 实施例3动物体内实验测试 [0055] 所有实验实施了三次平行测定，计算了平均值作为结果，并计算出标准偏差。实验结果以平均值±标准偏差的形式表示。同时，使用单因素方差分析测试各组数据之间是否有显著差异(p<0.05)。 [0056] 1、材料与试剂 [0057] SPF级6周龄雄性BALB/c小鼠(购于上海斯莱克实验动物有限责任公司)，生产许可证号为SCXK(沪)2022‑0004。本动物实验经重庆第二师范学院儿童健康与健康发展协同创新中心动物实验伦理委员会批准实施，批准号为2022070035B。 [0058] 尿酸钠盐(2,6,8‑三羟基嘌呤)、硫酸氨基葡萄糖(购于Sigma公司)；苏木精‑伊红染色试剂盒(上海碧云天生物科技有限公司)；IL‑6、IL‑10、IL‑1β、TNF‑αELISA试剂盒、实时定量检测试剂盒与反转录试剂盒(Thermo Fisher公司)；骨髓过氧化物酶(MPO)、超氧化物歧化酶(SOD)、还原型谷胱甘肽(GSH)活性检测试剂盒、丙二醛(MDA)含量测定试剂盒(购于南京建成科技有限公司)；其余试剂均为常规国产分析纯试剂。DB026智能热板仪(购于北京智鼠多宝生物科技有限责公司)；BX43 显微镜(购于奥林巴斯公司)；Nicolet Evolution 300紫外分光光度计、StoponePlus实时荧光定量PCR仪(购于赛默飞世尔公司)。 [0059] 2、动物实验及结果分析 [0060] 将BALB/c小鼠被随机分为5组，分别为正常组、模型组、硫酸氨基葡萄糖(阳性对照)组、鼠李糖乳酪杆菌AFY05低浓度实验(AFY05‑L)组、鼠李糖乳酪杆菌AFY05高浓度实验(AFY05‑H)组，每组10只。 [0061] 为验证鼠李糖乳酪杆菌AFY05与现有技术中所用的鼠李糖乳酪杆菌的差异，还购买了以下菌株进行比较，将其作为对比组： [0062] 鼠李糖乳杆菌CCFM1131，购自江南大学食品生物技术中心菌种保藏中心CCFM‑JU，该菌株记载于ZL202011488400.3； [0063] 鼠李糖乳杆菌Probio‑M9(Lactobacillus rhamnosus)购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，微生物保藏编号为CGMCCNo.18639； [0064] 正常组和模型组小鼠每日按0.1mL/10g.bw剂量灌胃蒸馏水，硫酸氨基葡萄糖组小8 鼠按195mg/kg.bw剂量灌胃硫酸氨基葡萄糖；AFY05‑L和AFY05‑H组小鼠分别按10 CFU/ 9 kg.bw和10CFU/kg.bw灌胃AFY05实验菌，持续7d。CCFM1131组和Probio‑M9组小鼠分别按 9 10CFU/kg.bw灌胃鼠李糖乳杆菌CCFM1131和鼠李糖乳杆菌Probio‑M9，也持续7d。 [0065] 然后所有实验小鼠被异氟烷麻醉后，正常组小鼠的右爪胫跗关节(踝关节)内被注射50μL的PBS溶液。将尿酸钠盐50mg加入PBS缓冲液1mL中配置成混悬液，除模型组外其余小鼠右爪胫跗关节(踝关节)内被注射50μL混悬液诱导痛风性关节炎。小鼠苏醒后，继续按前7d灌胃样品的剂量继续灌胃对应样品7d。 [0066] (1)热板法测定疼痛阈值 [0067] 实验最后一天采用热板法利用热刺激来在小鼠体内产生疼痛感。小鼠被放置在55℃的热板上,以刺激其足部产生疼痛反应，观察记录小鼠舔脚的时间来作为疼痛反应的指标。将5组小鼠分别置于热板上，分别观察每只小鼠舔右足的时间。 [0068] 表2各组小鼠痛阈的情况 [0069] [0070] a‑b，相同小写字母表示对应两组之间没有显著差异，不同小写字母表示对应两组之间有显著差异(p<0.05)。 [0071] 由上表数据分析可知，正常组小鼠的痛阈值(时间)最长，而模型组小鼠最短。相较于模型组，硫酸氨基葡萄糖和AFY05菌能够显著(p<0.05)提高小鼠的痛阈值，且高浓度AFY05菌提升痛阈值的效果强于硫酸氨基葡萄糖和低浓度的AFY05菌，CCFM1131和Probio‑M9处理组，虽然痛阈值有所延长，但效果不及AFY05菌处理组。 [0072] (2)小鼠关节水肿的评价 [0073] 热板测定小鼠痛阈值后所有小鼠休息6h，然后采用颈椎脱臼法处死小鼠，然后使用数字卡尺进行右足踝部直径的测量，来评估踝部水肿的程度。 [0074] 由下表检测结果，可知模型组的踝关节肿胀程度最大，硫酸氨基葡萄糖和AFY05菌能够显著(p<0.05)减轻关节炎造成的轻踝关节肿胀程度，且高浓度AFY05菌的效果最好；CCFM1131菌和Probio‑M9菌也能够有效减轻轻踝关节肿胀程度，但效果比AFY05‑L组稍差。 [0075] 表3各组小鼠踝关节水肿程度 [0076] [0077] [0078] a‑b，相同小写字母表示对应两组之间没有显著差异，不同小写字母表示对应两组之间有显著差异(p<0.05)。 [0079] (3)小鼠踝关节组织氧化状态测定 [0080] 称量0.1g小鼠右足踝关节组织，并将其加入到0.9mL生理盐水中进行混合。随后，将混合后的组织样本以4000rpm的转速进行离心，离心时间为10min，以获取上清液。接下来，使用MPO、SOD、GSH和MDA检测试剂盒来测定组织匀浆上清液中的相关指标。具体分析结果如下表所示： [0081] 表4小鼠踝关节组织的MPO、SOD、GSH酶活力和MDA水平 [0082] [0083] a‑f，相同小写字母表示对应两组之间没有显著差异，不同小写字母表示对应两组之间有显著差异(p<0.05)。 [0084] 通过上表分析可知，正常组小鼠踝关节组织的MPO酶活力和MDA水平最低，而SOD酶活力和GSH水平最高。模型组小鼠显示出了相反的趋势，踝关节组织的MPO酶活力和MDA水平最高，而SOD酶活力和GSH水平最低。经过硫酸氨基葡萄糖和AFY05菌灌胃，关节炎小鼠踝关节组织的MPO酶活力和MDA水平下降，而SOD酶活力和GSH水平增加，且高浓度AFY05菌的效果最为明显。而作为对照的CCFM1131、Probio‑M9也有相应的效果，经上述两者处理后的小鼠踝关节组织的MPO酶活力和MDA水平也存在下降，但效果比AFY05处理组稍差，SOD酶活力和GSH水平增加也不及AFY05处理组。 [0085] 对血清和组织的观察发现AFY05菌可以抑制踝关节的炎症和氧化损伤。 [0086] (4)小鼠血清炎症细胞因子测定 [0087] 采用眼眶取血法手机小鼠全血，取出的小鼠全血样本在4℃下以4000rpm的转速离心10min获到上层血清。采用IL‑6、IL‑10、IL‑1β、TNF‑αELISA试剂盒测定血清相关炎症指标。 [0088] 表5小鼠血清的IL‑6、IL‑10、IL‑1β、TNF‑α的细胞因子水平 [0089] [0090] a‑d，相同小写字母表示对应两组之间没有显著差异，不同小写字母表示对应两组之间有显著差异(p<0.05)。 [0091] 由上表可知正常组小鼠血清的IL‑6、IL‑1β、TNF‑α的细胞因子水平最低，诱导关节炎小鼠(模型组)踝关节组织的IL‑6、IL‑1β、TNF‑α的细胞因子水平显著上升(p<0.05)，硫酸氨基葡萄糖和AFY05菌可以抑制IL‑6、IL‑1β、TNF‑α细胞因子水平的上升，且高浓度AFY05菌(AFY05‑H)的抑制效果最好。同时，正常组小鼠的IL‑10细胞因子水平最高，模型组最低；相比模型组，AFY05菌和硫酸氨基葡萄糖能够提升小鼠血清的IL‑10水平，且AFY05‑H效果最好。而作为对照的CCFM1131、Probio‑M9也有相应的改善效果，但各项改善效果指标稍差。 [0092] (5)小鼠组织病理学观察 [0093] 取出正常组、模型组、硫酸氨基葡萄糖组、AFY05‑L组、AFY05‑H组、CCFM1131、Probio‑M9小鼠踝关节部位组织然后用10％多聚甲醛固定，再用由浓盐酸、福尔马林和蒸馏水混合成的脱钙固定液(10:9:81)进行脱钙20d。经过以上程序处理的踝关节组织样品经过石蜡包埋、切片，并进行了苏木精‑伊红(H&E)染色，之后使用光学显微镜观察组织进行病理学变化的分析。具体情况请参见附图1，分析可知，正常组(1a)踝关节切片中没有明显炎症细胞浸润，模型组(1b)踝关节切片中存在明显增加的炎症细胞浸润，硫酸氨基葡萄糖(1c)和AFY05‑L组(1d)、AFY05‑H组(1e)的处理使得炎症水平得到显著控制，炎症细胞浸润也有所降低，随着AFY05‑H(1e)的处理的要优于抑制效果硫酸氨基葡萄糖(1c)和AFY05‑L组(1d)；CCFM1131(1f)对照组的处理也对炎症水平有所控制，但抑制效果明显低于AFY05‑H(1e)组，而Probio‑M9(1g)的处理对炎症水平的控制不明显。 [0094] (6)小鼠踝关节组织中mRNA表达的测定 [0095] 称量1g的踝关节组织，将踝关节组织置于容器中，加入9mL生理盐水，进行均匀混合。然后，加入1mL的RNAzol溶液，用于提取小鼠踝关节组织中的RNA。使用超微分光光度法测定在260nm和280nm处的吸光度值，以计算RNA的纯度和浓度，并将RNA的浓度调整为1μg/μL。然后，将经过反转录的cDNA生成，配制含有1μLcDNA的反应体系。其他试剂包括10μL SYBR Green PCR Master Mix，7μL无菌蒸馏水，上下游各1μL引物(表1)溶液。将混合溶液放入定量PCR仪中进行反应，反应条件为95℃持续60s；95℃持续15s，进行40个循环；55℃持续30s；72℃持续35s；95℃持续30s；55℃持续35s。最后1以GAPDH作为内参，按照2‑ΔΔCt法对待测基因进行分析。 [0096] 表6实验中使用的引物序列 [0097] [0098] [0099] 测定结果可参见附图2。可知模型组小鼠踝关节组织的ERK1/2、COX‑2、PGE2、IL‑6、IFN‑γ和TNF‑αmRNA表达最强，而正常组小鼠相应表达最弱。硫酸氨基葡萄糖和AFY05菌可以下调关节炎小鼠踝关节组织的ERK1/2、COX‑2、PGE2、IL‑6、IFN‑γ和TNF‑α表达，对照CCFM1131和Probio‑M9组的处理也能够下调，ERK1/2、COX‑2、PGE2、IL‑6、IFN‑γ和TNF‑α表达，但效果稍差，AFY05菌下调ERK1/2、COX‑2和PGE2表达的能力最强。同时，正常组小鼠踝关节组织显示出最强的Cu/Zn‑SOD、Mn‑SOD和CAT的mRNA表达，这些表达在模型组中表现得最弱，相对模型组，AFY05菌可以上调Cu/Zn‑SOD、Mn‑SOD和CAT的表达，且AFY05‑H组的表达强度强于AFY05‑L组和硫酸氨基葡萄糖组；对照CCFM1131和Probio‑M9组也能够上调Cu/Zn‑SOD、Mn‑SOD和CAT的表达量，但效果也稍差于AFY05菌处理组。 [0100] 实施例3益生菌组合物的制备及效果检测 [0101] 通过对AFY05‑L组、AFY05‑H组、CCFM1131组、Probio‑M9组的实验对比，发明人找出了效果较好的AFY05‑H组，为进一步找出最佳治疗方案，对上述益生菌进行了组合实验，实验分为AFY05‑H+CCFM1131组、AFY05‑H+Probio‑M9组，并进行了关节水肿评价、踝关节组织氧化状态测定、血清炎症细胞因子测定实验，实验方式与实施例2相同，具体结果如下： [0102] 表7益生菌组合物配比及效果检测结果 [0103] [0104] [0105] 从上述测定结果可知，将AFY05‑H与CCFM1131或Probio‑M9进行组合使用，能够起到更好的效果，尤其是将AFY05‑H与Probio‑M9组合使用，能够起到最优效果。 [0106] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。 [0107] 序列表 [0108] [0109] [0110] [0111]