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一种抑制白色念珠菌的发酵乳杆菌及应用
申请号	CN202311562847.4	申请日	2023-11-22	公开(公告)号	CN117736909A	公开(公告)日	2024-03-22
申请人	天津科技大学;			发明人	何红鹏; 赵凤; 伊丽姆努尔·吐送托乎提; 王梦雪; 刘于菏; 郑萌萌; 孙小强; 张同存;
摘要	本发明涉及一种抑制白色念珠菌的发酵乳杆菌，名称为：发酵乳杆菌TJ2301，分类名称：发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum，保藏编号：CGMCC No.28287，保藏日期：2023年8月29日，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院生物研究所。本发酵乳杆菌能够显著抑制致病菌，如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的生长。本发酵乳杆菌的发酵上清液能够抑制白色念珠菌菌丝、菌膜的形成，本发酵乳杆菌还能够降低与菌丝相形成有关基因的表达量以及黏附、侵袭有关基因的表达量，能够较好的预防和治疗白色念珠菌感染导致的炎性病变。
权利要求	1.一种抑制白色念珠菌的发酵乳杆菌，其特征在于：所述发酵乳杆菌的名称为：发酵乳杆菌TJ2301，分类名称为：发酵乳杆菌Lactobacillusfermentum，保藏编号为：CGMCC No.28287，保藏日期：2023年8月29日，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院生物研究所。 2.根据权利要求1所述的发酵乳杆菌，其特征在于：所述发酵乳杆菌来源于健康女性阴道分泌物。 3.根据权利要求1所述的发酵乳杆菌，其特征在于：所述发酵乳杆菌在固体平板上菌落呈白色，圆形，表面光滑湿润，边缘整齐、凸起的菌落，在37℃恒温厌氧条件下，在MRS培养基中培养12h达到对数末期。 4.根据权利要求1所述的发酵乳杆菌，其特征在于：所述发酵乳杆菌能够显著抑制条件致病菌，即白色念珠菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的生长。 5.根据权利要求1所述的发酵乳杆菌，其特征在于：所述发酵乳杆菌的发酵液上清能够抑制白色念珠菌的生长。 6.根据权利要求1所述的发酵乳杆菌，其特征在于：所述发酵乳杆菌的发酵液上清能够抑制白色念珠菌菌丝的形成。 7.根据权利要求1所述的发酵乳杆菌，其特征在于：所述发酵乳杆菌的发酵液上清能够抑制白色念珠菌菌膜的形成。 8.根据权利要求1所述的发酵乳杆菌，其特征在于：所述发酵乳杆菌能够降低与菌丝相形成有关的基因HWP1、ECE1、ALS3的表达量，以及降低侵袭有关的基因SAP2、SAP5、PLB1的表达量。 9.如权利要求4至8任一项所述的发酵乳杆菌在治疗感染性疾病、特别是白色念珠菌所致感染性疾病中的应用。
说明书全文	一种抑制白色念珠菌的发酵乳杆菌及应用技术领域 [0001] 本发明属于微生物技术领域，涉及发酵乳杆菌及其在白色念珠菌(又称白假丝酵母菌)感染所致疾病预防和治疗中的应用。背景技术 [0002] 乳酸杆菌作为一种广泛分布的益生菌，在食品工业、健康医疗、农业、生态保护等多个领域获得广泛的应用。乳酸杆菌可以通过分泌的乳酸、产生抗菌物质、竞争性抑制、激活免疫系统等机制来抑制病原体的生长和感染，对维持人体健康具有重要作用。此外，多项临床研究证实了乳酸杆菌具有改善肠道相关疾病、代谢类疾病、免疫相关疾病和神经性疾病等功能。 [0003] 发酵乳杆菌是乳酸菌的一种，为革兰氏阳性菌，与其他乳酸菌的区别在于发酵乳杆菌能发酵多种糖，产酸能力强。此外，发酵乳杆菌还可以维持人体菌群平衡，对人体内致病菌有抑制作用。 [0004] 念珠菌病是由于念珠菌导致的感染，该感染大多数是由于白色念珠菌(Candida albicans)和光滑念珠菌(C.glabrata)感染所致。白色念珠菌又称白假丝酵母菌，是一种常见的真菌，在正常情况下，它并不会引起人体健康问题。然而，当人体免疫系统受损或其他因素导致菌群失衡时，白色念珠菌可能会过度生长，引发感染。它会以生物膜的方式寄生于人类，导致人类患有口腔、胃肠道及外阴阴道等人体器官和部位的感染性疾病。另外，白色念珠菌病还可以从局部感染传播导致具有严重并发症的全身感染，在免疫功能受损的人群中，可以发生全身性疾病如念珠菌血症，严重的感染可能导致器官功能衰竭和休克等严重并发症。据报道，乳杆菌可通过细胞之间的直接接触及其分泌的代谢物抑制白念珠菌黏附，抑制芽管、菌丝及生物膜的形成等，对抗白念珠菌感染。 [0005] 因此，筛选具有针对念珠菌病有效治疗的乳酸杆菌以避免这种严重的病症具有非常重要的现实意义。 [0006] 通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。发明内容 [0007] 本发明目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种发酵乳杆菌及应用。 [0008] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是： [0009] 一种发酵乳杆菌，所述发酵乳杆菌的名称为：发酵乳杆菌TJ2301，分类名称为：发酵乳杆菌Lactobacillusfermentum，保藏编号为：CGMCC No.28287，保藏日期：2023年8月29日，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院生物研究所。 [0010] 进一步地，所述发酵乳杆菌TJ2301来源于健康女性阴道分泌物中。 [0011] 进一步地，所述发酵乳杆菌TJ2301在固体平板上菌落呈白色，圆形，表面光滑湿润，边缘整齐、凸起的菌落，在37℃恒温厌氧的条件下，在MRS培养基中培养12h达到对数末期。 [0012] 进一步地，所述发酵乳杆菌TJ2301在抑制条件致病菌，如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌以及白色念珠菌方面中的应用。 [0013] 如上所述的发酵乳杆菌TJ2301在预防和治疗白色念珠菌感染所致疾病方面的应用。 [0014] 本发明取得的优点和积极效果为： [0015] 1、本发明发酵乳杆菌LactobacillusfermentumTJ2301能够显著抑制致病菌，如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌以及白色念珠菌的生长。 [0016] 2、本发明发酵乳杆菌LactobacillusfermentumTJ2301的发酵液上清能够抑制白色念珠菌菌丝、菌膜的形成。 [0017] 3、本发明发酵乳杆菌LactobacillusfermentumTJ2301能够抑制白色念珠菌毒力基因的表达。 [0018] 4、本发明发酵乳杆菌LactobacillusfermentumTJ2301具有较好的改善白色念珠菌感染所致炎症的作用。附图说明 [0019] 图1为本发明中发酵乳杆菌TJ2301的革兰氏染色形态图； [0020] 图2为本发明中发酵乳杆菌TJ2301对大肠杆菌的抑菌； [0021] 图3为本发明中发酵乳杆菌TJ2301对白色念珠菌的抑菌； [0022] 图4为本发明中发酵乳杆菌TJ2301的发酵上清液对白色念珠菌的抑菌； [0023] 图5为本发明中发酵乳杆菌TJ2301的发酵上清液对白色念珠菌菌丝形成的抑制，图(a)为白色念珠菌、图(b)为白色念珠菌+发酵乳杆菌TJ2301的发酵上清液； [0024] 图6为本发明中发酵乳杆菌TJ2301的发酵上清液对白色念珠菌菌膜形成的抑制。具体实施方式 [0025] 下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。 [0026] 本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。 [0027] 一种发酵乳杆菌，所述发酵乳杆菌的名称为：发酵乳杆菌TJ2301，分类名称为：发酵乳杆菌Lactobacillusfermentum，保藏编号为：CGMCC No.28287，保藏日期：2023年8月29日，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院生物研究所。 [0028] 较优地，所述发酵乳杆菌TJ2301来源于健康女性阴道分泌物中。 [0029] 较优地，所述发酵乳杆菌TJ2301在固体平板上菌落呈白色，圆形，表面光滑湿润，边缘整齐、凸起的菌落，在37℃恒温厌氧的条件下，在MRS培养基中培养12h达到对数末期。 [0030] 较优地，所述发酵乳杆菌TJ2301能够显著抑制条件致病菌的生长。 [0031] 如上所述的发酵乳杆菌TJ2301在条件致病菌，如白色念珠菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌抑菌方面中的应用。 [0032] 如上所述的发酵乳杆菌TJ2301在预防和治疗白色念珠菌感染方面中的应用。 [0033] 具体地，相关制备及检测实施例如下： [0034] 实施例1：菌株的筛选与鉴定 [0035] (1)菌株的分离纯化 [0036] 所述发酵乳杆菌TJ2301筛选于健康女性阴道分泌物中，用无菌的PBS缓冲液稀释阴道分泌物，在MRS液体培养基扩增后涂布在MRS固体培养基，在厌氧条件下37℃培养箱培养48h，培养后挑取分离良好的单菌落，采用三区划线的方法纯化菌株。经多次纯化后的菌株用革兰氏染色法染色，显微镜下观察菌体形态、颜色、分布等特征。该株菌为革兰氏染色阳性的杆菌，见图1。 [0037] (2)菌株的培养 [0038] 将分离得到的菌株接入MRS肉汤培养基中，于厌氧培养箱，37℃厌氧培养48h后，观察菌落形态呈白色，圆形，表面光滑湿润，边缘整齐、中间呈凸起状。 [0039] (3)菌株的鉴定 [0040] 将分离得到的菌株接种至MRS肉汤培养基中进行培养。再通过提基因组试剂盒提取基因组DNA，然后进行PCR扩增16S rDNA，PCR产物送公司进行测序。将测序结果在NC BI中进行核酸序列比对，得到1株发酵乳杆菌，命名为发酵乳杆菌TJ2301。 [0041] 实施例2：发酵乳杆菌TJ2301对大肠杆菌的抑菌能力 [0042] (1)将乳酸菌按2％的接种量活化两次，同时将大肠杆菌按2％的接种量活化两次，用生理盐水将两种菌稀释，使得OD值数值相当。 [0043] (2)取100μL大肠杆菌加入3mL MRS肉汤培养基中作为对照，分别取100μL大肠杆菌与发酵乳杆菌加入到同一MRS肉汤培养基中共同培养作为实验组，培养条件为有氧条件下37℃12h。 [0044] (3)将培养12h的菌液用生理盐水分别稀释为10‑4，取稀释后的菌液100μL涂布于麦康凯琼脂培养基，倒置于37℃培养箱培养24h，乳酸菌为不能在麦康凯琼脂培养基生长，在麦康凯琼脂培养基生长的为大肠杆菌，进行菌落计数。 [0045] 结果如图2所示：与对照相比，经过发酵乳杆菌处理的大肠杆菌菌落数明显减少。由此可知，发酵乳杆菌TJ2301对大肠杆菌抑菌能力较好。 [0046] 实施例3：发酵乳杆菌TJ2301对金黄色葡萄球菌的抑菌能力 [0047] (1)将乳酸菌按2％的接种量活化两次，同时将金黄色葡萄球菌按2％的接种量活化两次，用生理盐水将两种菌稀释，使得OD值数值相当。 [0048] (2)取100μL金黄色葡萄球菌加入3mL MRS肉汤培养基中作为对照，分别取100μL金黄色葡萄球菌与发酵乳杆菌加入到同一MRS肉汤培养基中共同培养作为实验组，培养条件为有氧条件下37℃12h。 [0049] (3)将培养12h的菌液用生理盐水分别稀释为10‑4，取稀释后的菌液100μL涂布于LB固体培养基中，倒置于37℃培养箱培养48h，根据乳酸菌和金黄色葡萄球菌的颜色和形态进行分辨及菌落计数。 [0050] 结果显示：与对照相比，经过发酵乳杆菌处理的金黄色葡萄球菌菌落数较少。由此可知，发酵乳杆菌TJ2301对金黄色葡萄球菌抑菌能力较好。 [0051] 实施例4：发酵乳杆菌TJ2301对白色念珠菌的抑菌能力 [0052] (1)将乳酸菌按2％的接种量活化两次，同时将白色念球菌按2％的接种量活化两次，用生理盐水将两种菌稀释，使得OD值数值相当。 [0053] (2)取100μL白色念珠菌加入3mL MRS肉汤培养基中作为对照，分别取100μL白色念珠菌与发酵乳杆菌加入到同一MRS肉汤培养基中共同培养作为实验组，培养条件为有氧条件下37℃12h。 [0054] (3)将培养12h的菌液用生理盐水分别稀释为10‑4，取稀释后的菌液100μL涂布于沙氏琼脂培养基，倒置于30℃培养箱培养48h，乳酸菌在30℃生长缓慢而白色念珠菌生长较快，根据菌落颜色、形态和大小进行分辨及菌落计数。 [0055] 结果如图3所示：与对照相比，经过发酵乳杆菌处理的白色念珠菌菌落数较少。由此可知，发酵乳杆菌TJ2301对白色念珠菌抑菌能力较好。 [0056] 实施例5：发酵乳杆菌TJ2301的发酵上清液对白色念珠菌的抑菌能力[0057] (1)将发酵乳杆菌按2％的接种量活化两次，达到对数末期，将发酵乳杆菌在4℃离心机8000rpm的条件下离心30min，取上清后过膜除菌。 [0058] (2)取100μl沙氏培养基、100μl MRS培养基、50μl(3.5×106CFU/mL)白色念珠菌悬6 液作为对照，同时取100μl沙氏培养基、100μl发酵乳杆菌TJ2301上清、50μl(3.5×10CFU/mL)白色念珠菌悬液为实验组，对照组与实验组分别设有3个平行，于96孔板30℃培养24h，在600nm进行OD值的测量。 [0059] 结果如图4所示：与对照相比，经过发酵乳杆菌上清处理的白色念珠菌OD值较低。由此可知，发酵乳杆菌TJ2301的发酵液上清对白色念珠菌抑菌能力较好。 [0060] 实施例6：发酵乳杆菌TJ2301的发酵上清液对白色念珠菌菌丝形成抑制能力[0061] (1)将白色念球菌按2％的接种量活化两次，达到对数末期，取对数末期的白色念珠菌离心，弃上清，用生理盐水漂洗，最后用pH为中性的培养基吹悬，调整浓度为3.5×5 10CFU/mL。 [0062] (2)取200μl(3.5×105CFU/mL)白色念珠菌悬液、700μl沙氏培养基(pH7.2)和90μl5 血清作为对照组，于24孔板复孔两个；同时取200μl(3.5×10CFU/mL)白色念珠菌悬液、500μl沙氏培养基(pH7.2)、200μl发酵乳杆菌TJ2301上清以及90μl血清为实验组，于24孔板复孔两个，放置于37℃培养箱3h后在10×10倍显微镜下观察菌丝的形成情况。 [0063] 结果如图5所示：与对照相比，经过发酵乳杆菌上清处理的白色念珠菌不形成菌丝。由此可知，发酵乳杆菌TJ2301的发酵液上清对白色念珠菌菌丝抑制能力较好。 [0064] 实施例7：发酵乳杆菌TJ2301的发酵上清液对白色念珠菌菌膜形成抑制能力[0065] 将实施例6中的24孔板观察后继续放入37℃培养箱中培养，48h后取出吸去上清，用PBS轻轻漂洗一遍，随后用0.1％(w/v)的结晶紫水溶液染色30min，吸去结晶紫溶液，用PBS漂洗一遍，在室温下干燥，最后用30％(v/v)乙酸溶解，在595nm处测量吸光度。 [0066] 结果如图6所示：与对照相比，经过发酵乳杆菌上清处理的白色念珠菌形成的菌膜量有所下降。由此可知，发酵乳杆菌TJ2301的发酵液上清对白色念珠菌菌膜抑制能力较好。 [0067] 实施例8：发酵乳杆菌TJ2301对白色念珠菌致病基因表达的抑制能力[0068] (1)将白色念珠菌在沙氏培养基中30℃进行培养，生长到对数末期，用PBS洗涤两6 6 次，并用pH为中性的沙氏培养基重悬浓度为3.5×10CFU/mL，取200μL(3.5×10 CFU/mL)白色念珠菌细胞悬液、700μL pH为中性的沙氏培养基以及90μL血清在24孔培养板中混合为对 6 照；200μL(3.5×10CFU/mL)白色念珠菌细胞悬液、500μL pH为中性的沙氏培养基、200μL乳酸菌以及90μL血清为实验组，将板在37℃下孵育，48小时后进行RNA的提取。 [0069] (2)RNA的提取后逆转录成cDNA，进行PCR后，将PCR产物进行琼脂糖电泳,检测发酵乳杆菌TJ2301对白色念珠菌毒力基因表达的影响。 [0070] 结果显示：与对照相比，发酵乳杆菌能够降低与菌丝相形成相关基因HWP1、ECE1、ALS3的表达量，同时降低侵袭相关基因SAP2、SAP5、PLB1的表达量。 [0071] 实施例9：发酵乳杆菌TJ2301对白色念珠菌感染小鼠的治疗效果 [0072] (1)制备外阴阴道念珠菌病的小鼠模型：在感染前用0.05mL(2mg/mL)苯甲酸雌二7 醇进行皮下注射(1次/2天，3次)，随后给予50μL(10CFU/mL)白色念珠菌悬液连续感染4天。 [0073] (2)此后给予50μL(109CFU/mL)的发酵乳杆菌TJ2301治疗，空白组给予等量生理盐水，治疗途径为阴道灌注，持续治疗7天，收集阴道液进行革兰氏染色以及白色念珠菌培养，评估白色念珠菌感染的负担。 [0074] (3)治疗7天后，采用脊椎脱臼法处死，取阴道组织用多聚甲醛固定，随后进行脱水，包埋、切片等，再进行HE染色，并用ELISA法检测阴道灌洗液中炎症因子IL‑8水平。 [0075] 结果显示：发酵乳杆菌TJ2301治疗后阴道灌洗液革兰氏染色可检测到的菌丝量减少，在YPD固体培养基培养白色念珠菌菌落数明显减少，说明发酵乳杆菌TJ2301可抑制白色念珠菌的生长和菌丝形成。 [0076] HE染色结果显示，阴道炎模型组小鼠阴道黏膜角化层有不同程度脱落，可见中性粒细胞浸润，同时阴道灌洗液中炎症因子IL‑8水平上升。发酵乳杆菌TJ2301治疗组小鼠阴道黏膜完整性、中性粒细胞浸润情况以及IL‑8水平均有不同程度的恢复，证明发酵乳杆菌TJ2301减轻小鼠的阴道组织损伤，对白色念珠菌引起的阴道炎有治疗作用。尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。