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一种鸡源唾液乳杆菌及其应用
申请号	CN202311774637.1	申请日	2023-12-22	公开(公告)号	CN117736923A	公开(公告)日	2024-03-22
申请人	石河子大学;			发明人	张鹏; 付陈飞; 院江; 刘保仓; 曹正宇; 牛玉杰; 张建强; 陈程;
摘要	本发明提供了一种鸡源唾液乳杆菌，鸡源唾液乳杆菌命名为Lactobacillus salivarius L.S.I‑001，保藏编号为CCTCC NO:M 20232295，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2023年11月21日；16SrDNA序列为如SEQ ID NO:1所示。还提供了应用，用于制备对大肠杆菌Escherichia coli、沙门氏菌Salmonella或/和金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus的抑制作用的药物。本发明该鸡源唾液乳杆菌可用于制备抑制大肠杆菌、沙门氏菌或/和金黄色葡萄球菌的药物。
权利要求	1.一种鸡源唾液乳杆菌，其特征在于，所述鸡源唾液乳杆菌命名为Lactobacillus salivarius L.S.I‑001，保藏编号为CCTCC NO:M 20232295，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2023年11月21日；所述鸡源唾液乳杆菌的 16SrDNA序列为如SEQ ID NO:1所示。 2.一种如权利要求1所述的鸡源唾液乳杆菌的应用，其特征在于，所述鸡源唾液乳杆菌用于制备对大肠杆菌Escherichia coli、沙门氏菌Salmonella或/和金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus的抑制作用的药物。
说明书全文	一种鸡源唾液乳杆菌及其应用技术领域 [0001] 本发明属于唾液乳杆菌技术领域，具体涉及一种鸡源唾液乳杆菌及其应用。背景技术 [0002] 工业化的养殖技术、食品加工逐渐普及，随之而来的是食品添加剂、化学防腐剂等的大量使用，使人体产生过敏反应和菌群失调；抗生素的滥用以及动物源食品中的药物残留导致耐药菌株的不断产生；上述现象严重威胁了食品安全、畜牧生产及公共健康。因此，需找安全，高效、绿色的天然抗生素替代品成为发展食品工业、畜牧养殖业、保障人类公共健康的时代趋势。乳酸菌作为被公认为是安全的食品级微生物，自古以来就与食品发酵及保存相关联，如今，它们更是最重要的工业微生物类。目前这些乳酸菌大多分离自发酵食品以及环境。同时，乳酸菌是健康机体的肠道优势菌群，能够联合肠黏膜形成生物屏障，阻止外源致病菌入侵机体，同时分泌抑菌代谢物，保障动物正常的生理机能。 [0003] 乳酸菌的抑菌机理主要表现在以下几个方面:(1)是乳酸菌产生乙酸、乳酸和丙酸等有机酸，使环境保持酸性，抑制不耐酸有害菌的生长繁殖；(2)是乳酸菌产生抗生素或细菌素的蛋白质类物质，对有害菌有抑制或杀灭功能；(3)是乳酸菌产生的过氧化氢能激活过氧化氢酶一硫氰酸系统，抑制或杀灭有害菌；(4)是乳酸菌通过拮抗作用与有害菌竞争营养物质，从而达到抑菌作用。 [0004] 唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)属于厚壁菌门、乳酸杆菌目、乳杆菌属中的一种可在好氧或厌氧环境下生长的兼性异质发酸性乳酸菌。唾液乳杆菌是人体和动物口腔或肠道中天然菌群的重要组成，是维持动物和人体口腔、肠道菌群平衡的关键菌群。唾液乳杆菌具有良好的益生菌属性，如菌体的自聚性和高表面疏水性，使其能够很好的定植于动物或人体肠道表面，从而更有利于发挥免疫作用。 [0005] 目前，随着乳酸菌代谢产物研究的不断深入，乳酸菌代谢产生的抑菌活性物质被广泛证实具有很好地抗菌活性，动物肠道内的唾液乳杆菌在适宜条件下能够产生多种不同类型的细菌素类抑菌物质，同时乳酸菌菌株本身还可以通过与病原菌竞争生长空间达到拮抗抑菌效果。 [0006] 唾液乳杆菌具有安全性、耐药性、益生功能和产细菌素能力等多方面的益生潜力，通过研究其所产生的细菌素稳定性、抗菌活性、抑菌机制及抗生物被膜活性等多种特征，可为食品发酵、食品防腐、畜牧生产等领域提供重要的理论依据。发明内容 [0007] 本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种鸡源唾液乳杆菌及其应用，该鸡源唾液乳杆菌可用于制备抑制大肠杆菌、沙门氏菌或/和金黄色葡萄球菌的药物。 [0008] 为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种鸡源唾液乳杆菌，所述鸡源唾液乳杆菌命名为Lactobacillus salivarius L.S.I‑001，保藏编号为CCTCC NO:M 20232295，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为中国.武汉.武汉大学，保藏日期为 2023年11月21日；所述鸡源唾液乳杆菌的16SrDNA序列为如SEQ ID NO:1所示。 [0009] 本发明还提供了上述的鸡源唾液乳杆菌的应用，所述鸡源唾液乳杆菌用于制备对大肠杆菌(Escherichia coli)、沙门氏菌(Salmonella)或/和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的抑制作用的药物。 [0010] 本发明与现有技术相比具有以下优点： [0011] 本发明中的鸡源唾液乳杆菌对大肠杆菌(Escherichia coli)、沙门氏菌(Salmonella)或/和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的抑制作用，可以用于制备用于相关抗菌性药物。 [0012] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。附图说明 [0013] 图1是本发明的实施例1的鸡源唾液乳杆菌菌落形态图。 [0014] 图2是本发明的实施例1的鸡源唾液乳杆菌革兰氏染色结果图。 [0015] 图3是本发明的实施例1的鸡源唾液乳杆菌的菌株进化树。 [0016] 图4是本发明的实施例1的鸡源唾液乳杆菌的生长曲线。 [0017] 图5是本发明的实施例1的鸡源唾液乳杆菌的产酸速率曲线。 [0018] 图6是本发明的实施例1的鸡源唾液乳杆菌对大肠杆菌的抑菌性。 [0019] 图7是本发明的实施例1的鸡源唾液乳杆菌对沙门氏菌的抑菌性。 [0020] 图8是本发明的实施例1的鸡源唾液乳杆菌对金黄色葡萄球菌的抑菌性。具体实施方式 [0021] 实施例1 [0022] 本实施例的鸡源唾液乳杆菌，所述鸡源唾液乳杆菌命名为Lactobacillus salivarius L.S.I‑001，保藏编号为CCTCC NO:M 20232295，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2023年11月21日；所述鸡源唾液乳杆菌的16SrDNA序列为如SEQ ID NO:1所示；所述鸡源唾液乳杆菌的16SrDNA序列为如SEQ ID NO:1所示。 [0023] 本实施例还提供了上述的鸡源唾液乳杆菌的应用，所述鸡源唾液乳杆菌用于制备对大肠杆菌(Escherichia coli)、沙门氏菌(Salmonella)或/和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的抑制作用的药物。 [0024] (一)鸡源唾液乳杆菌的分离鉴定 [0025] 材料与设备： [0026] 菌种来源：本实验例中所分离菌种来源于2月龄黄羽肉鸡回肠肠道，黄羽肉鸡来自石河子大学动物科技学院实验站。 [0027] MRS琼脂培养基购自青岛海博生物，称取66.2g，加热溶解于1000ml蒸馏水中，121℃高压灭菌15分钟即得。 [0028] MRS肉汤培养基购自青岛海博生物，称取52.24g，加热溶解于1000ml蒸馏水中，118℃高压灭菌15分钟即得。 [0029] LB肉汤培养基购自青岛海博生物，称取25.0g，加热溶解于1000ml蒸馏水中，121℃高压灭菌15分钟即得。 [0030] 2.5L圆底立式厌氧培养袋、2.5L微需氧产气包、氧气指示剂均购自青岛海博生物，须配套使用。 [0031] 实验方法： [0032] 唾液乳杆菌的分离：将2月龄黄羽肉鸡采用急性失血法处死，剖开腹腔，暴露肠道，分离出回肠并结扎回肠部分，取回肠部分新鲜的内容物。取0.1g新鲜内容物，将回肠内容物溶解于无菌生理盐水中，3000rpm离心2min去除内容物中未消化的石子等杂质，取上清液l mL于121℃高压蒸汽灭菌的LB液体培养基中，随后将该液体培养基放入厌氧袋中，37℃培养箱中培养24h。用酒精灯火焰灼烧接种环，待接种环冷却后，蘸取LB培养液中的细菌于MRS固体培养基上平板划线，培养过夜。挑出生长旺盛的单菌落后于新的MRS液体培养基中进行单菌落扩增培养。用酒精灯火焰灼烧接种环，待接种环冷却后，蘸取MRS液体培养基中的菌液平板画线，将画好的平板放入厌氧袋中，37℃培养过夜，通过平板画线反复分离纯化，之后通过革兰氏染色法镜检进行初步判定。 [0033] 菌落形态为圆形或椭圆形，表面粗糙，自然光下呈乳白色或淡黄色，如图1所示，具有整齐的边缘，菌落成熟后的直径为2mm左右。 [0034] 该菌株经革兰氏染色后呈现蓝紫色，表明该菌株为革兰氏阳性菌。革兰氏染色结果如图2所示。 [0035] 菌种活化鉴定及保藏:将纯化后初步判定为乳杆菌的单菌落，接种到5ml的MRS液体培养基，37℃厌氧培养24h。活化后保种，16SrDNA测序，序列上传NCBI blast进行比对，应用软件MEGA7做菌株进化树，如图3所示。取500uL菌液加入500uL灭菌50％甘油后于‑80℃保藏菌株。 [0036] 所述鸡源唾液乳杆菌命名为Lactobacillus salivarius L.S.I‑001，保藏编号为CCTCC NO:M 20232295，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2023年11月21日；所述鸡源唾液乳杆菌的16SrDNA序列为如SEQ ID NO:1所示。 [0037] 唾液乳杆菌的扩增培养：将保藏在‑80℃甘油管中的唾液乳杆菌菌株，于MRS固体培养基平板上划线活化，37℃厌氧培养24h后，挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃厌氧培养24h后即得扩增菌液。 [0038] (二)唾液乳杆菌的生理特征 [0039] 菌株生长曲线测定方法：将筛选到的菌株挑取单克隆菌落，接种于MRS液体培养基，过夜培养后按1％的量接种，37℃厌氧恒温培养，前6h每隔0.5h取样，以后每隔1h取样，测D600值，统计24h。以D600为纵坐标，时间为横坐标，绘制菌株的生长曲线，如图4所示。 [0040] 耐酸性试验：取5份5mL MRS液体培养基，分别用1mol mL的盐酸调节pH为2、2.5、3，3.5，对照组培养基不加盐酸。挑取乳酸菌单克隆菌落，接种于MRS肉汤过夜培养，取200pL菌液接种于上述不同pH的培养基中，37℃厌氧培养3h，取100uL，用灭菌0.01mol/L 磷酸盐缓冲‑6 液(PBS)稀释到10 ，取100uL涂板，培养24h，记录菌落数，相应pH生长的菌落数除以对照组菌落数即为存活率。 [0041] 实验结果： [0042] 菌株耐酸性试验结果 [0043] [0044] 耐胆盐试验：用相同方法，接种待测菌株于含有胆盐质量分数分别为0.05％、0.10％、0.15％、0.20％的MRS液体培养基，培养后涂板记录相应菌落数。 [0045] 实验结果： [0046] 耐胆盐试验结果 [0047] [0048] 产酸含量测定:将培养24h的菌悬液以2.0％的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃恒温厌氧培养。分别于0、2、4、6、8、10、12、14、24h利用pH计测定培养液pH值，根据测定结果绘制产酸速率曲线，如图5所示。 [0049] (三)唾液乳杆菌对大肠杆菌(Escherichia coli)的抑菌能力测定 [0050] 首先将唾液乳杆菌从‑80℃冰箱取出，于MRS固体培养基平板画线后，37℃厌氧培养12h后挑取单菌落于MRS液体培养基中，37℃，200rpm/min摇床培养24h，随后将培养24h的菌悬液离心取上清液备用。取100uL活化好的大肠杆菌菌悬液均匀涂布于LB平板上，然后用直径7mm的无菌打孔器打孔，火焰下封板，待凝固后往孔中加入50uL菌体离心上清液，平板正置放入37℃培养箱中，设置空白对照组(培养基)、菌液上清组，24h后测定抑菌圈直径大小。 [0051] 实验结果：唾液乳杆菌对大肠杆菌具有较好的抑菌性，抑菌圈直径为11.124±0.8mm，如图6所示。 [0052] (四)唾液乳杆菌对沙门氏菌(Salmonella)的抑菌能力测定 [0053] 首先将唾液乳杆菌从‑80℃冰箱取出，于MRS固体培养基平板画线后，37℃厌氧培养12h后挑取单菌落于MRS液体培养基中，37℃，200rpm/min摇床培养24h，随后将培养24h的菌悬液离心取上清液备用。取100uL活化好的沙门氏菌菌悬液均匀涂布于LB平板上，然后用直径7mm的无菌打孔器打孔，火焰下封板，待凝固后往孔中加入50uL菌体离心上清液，平板正置放入37℃培养箱中，设置空白对照组(培养基)、菌液上清组，24h后测定抑菌圈直径大小。 [0054] 实验结果：唾液乳杆菌对沙门氏菌具有较好的抑菌性，抑菌圈直径为10.863±0.8mm，如图7所示。 [0055] (五)唾液乳杆菌对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的抑菌能力测定[0056] 首先将唾液乳杆菌从‑80℃冰箱取出，于MRS固体培养基平板画线后，37℃厌氧培养12h后挑取单菌落于MRS液体培养基中，37℃，200rpm/min摇床培养24h，随后将培养24h的菌悬液离心取上清液备用。取100uL活化好的金黄色葡萄球菌菌悬液均匀涂布于LB平板上，然后用直径7mm的无菌打孔器打孔，火焰下封板，待凝固后往孔中加入50uL菌体离心上清液，平板正置放入37℃培养箱中，设置空白对照组(培养基)、菌液上清组，24h后测定抑菌圈直径大小。 [0057] 实验结果：唾液乳杆菌对金黄色葡萄球菌具有较好的抑菌性，抑菌圈直径为10.142±0.8mm，如图8所示。 [0058] 综上，本实施例中的鸡源唾液乳杆菌Lactobacillus salivarius L.S.I‑001对大肠杆菌(Escherichia coli)、沙门氏菌(Salmonella)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的具有抑制作用，能用于制备抗菌性药物。 [0059] 以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制。凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。