[0001] 本发明涉及益生菌筛选与应用技术领域，具体涉及一株具有预防和辅助治疗女性阴道炎功效的鼠李糖乳酪杆菌。

[0002] 阴道炎作为妇女最常见的妇科疾病之一，大多数是由各类病原体所引发的炎症；根据国内研究显示，妇科门诊约30％的患者为各种类型的阴道炎，其中最多的为真菌感染，滴虫、细菌感染也较为多见。其中引起真菌感染的病原菌为白色念珠菌，因此霉菌性阴道炎又称为念珠菌性阴道炎，其主要表现特征为：外阴瘙痒、灼痛；尿频、尿痛；阴道有白色稠厚呈凝乳或豆渣样分泌物等。霉菌性阴道炎属于内源性感染，约75％的女性一生中至少患1次外阴阴道假丝酵母菌病，40％～50％的女性会再次复发；而5％～8％的女性1年内会发作4次或以上，严重影响女性的工作和生活。霉菌性阴道炎的治疗主要是以抗真菌药物为准，治愈率为80％～90％，但是周期比较长且容易复发。

[0003] 在正常情况下，女性阴道微生物以乳杆菌为优势菌。当阴道环境被改变时，阴道内在的一些条件致病微生物和外界的病原体就会趁虚而入，乳酸菌的优势地位丧失，多种阴道炎由此而发。益生菌是一类对宿主有益的微生物，联合国粮农组织(FAO)与世界卫生组织(WHO)共同定义为“以适当剂量服用时，对宿主(人或动物)健康有益的活体微生物制剂”。人体、动物体内有益的细菌主要有益生芽孢菌、丁酸梭菌、乳杆菌、双歧杆菌、放线菌等。乳酸菌是最常见的益生菌，已经被广泛应用并认为对人和动物是安全的。乳酸菌发酵糖类主要产物为乳酸，乳酸能够快速降低环境的pH,能够抑制其它病原细菌的生长，同时有些乳酸菌还能够产生过氧化氢或细菌素类抑菌物质，抑制病原菌的生长。对益生菌的研究，以前主要集中在肠道健康方面，现在越来越多的研究数据表明，益生菌在维持皮肤、口腔和女性健康方面也发挥着重要作用。

[0004] 本发明的目的是提供一株具有预防和辅助治疗女性阴道炎功效的鼠李糖乳酪杆菌(Lacticaseibacillus rhamnosus)及其应用，所提供的鼠李糖乳酪杆菌筛选自婴幼儿粪便。

[0005] 本发明所提供的鼠李糖乳酪杆菌(Lacticaseibacillus rhamnosus)，命名为鼠李糖乳酪杆菌VHProbi O07株，已于2023年4月24日保藏于中国武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M2023610。

[0006] 所述的鼠李糖乳酪杆菌VHProbi O07株，其16s rDNA序列为SEQ ID NO:1；

[0007] 所述的鼠李糖乳酪杆菌VHProbi O07株，其MALDI‑TOF‑MS指纹图谱如图1所示；

[0008] 所述的鼠李糖乳酪杆菌VHProbi O07株，其RAPD指纹图谱如图2所示；其rep‑PCR指纹图谱如图3所示。

[0009] 本发明所提供的鼠李糖乳酪杆菌VHProbi O07能够抑制白色念珠菌或加德纳氏菌的生长；

[0010] 本发明还提供所述的鼠李糖乳酪杆菌VHProbi O07株的一种用途，是在制备用于阴道炎的预防和辅助治疗的制品中的应用。

[0011] 本发明所提供的鼠李糖乳酪杆菌VHProbi O07株还可以用于制备具有抗氧化功能的制品中的应用；

[0012] 本发明所提供的鼠李糖乳酪杆菌VHProbi O07株还可以用于制备抗菌制品，所述的抗菌制品，是用于抑制大肠杆菌、肠炎沙门氏菌、痤疮丙酸杆菌或金黄色葡萄球菌的生长。

[0013] 本发明从婴幼儿粪便中筛选到一株鼠李糖乳酪杆菌VHProbi O07。所述鼠李糖乳酪杆菌VHProbi O07在液体混合培养条件下和平板上预培养条件下能够显著抑制白色念珠菌的生长，说明该菌株能够预防霉菌性阴道炎的发生，并可用于霉菌性阴道炎的后期辅助治疗；鼠李糖乳酪杆菌VHProbi O07的发酵液和上清液在平板上能够显著抑制加德纳氏菌的生长，混合培养条件下抑制加德纳氏菌的生长，说明该菌株可以用于细菌性阴道炎的预防和治疗，并且该菌对人阴道上皮细胞具有粘附作用，能够定植于阴道内，是一株女性阴道健康的潜在益生菌。所述鼠李糖乳酪杆菌VHProbi O07可制成菌剂、药物或是女性卫生产品，有助于缓解细菌性阴道炎和霉菌性阴道炎，保持女性阴道的健康。鼠李糖乳酪杆菌VHProbi O07还可以抑制痤疮丙酸杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和肠炎沙门氏菌，具有较广的抑菌谱。附图说明

[0014] 图1为鼠李糖乳酪杆菌VHProbi O07的MALDI‑TOF‑MS指纹图谱；

[0015] 图2为鼠李糖乳酪杆菌VHProbi O07的RAPD指纹图谱；

[0016] 图3为鼠李糖乳酪杆菌VHProbi O07的rep‑PCR指纹图谱。

[0017] 本发明提供一种能够抑制白色念珠菌的乳酸菌，同时该菌株也能够抑制细菌性阴道炎的加德纳氏菌和金黄色葡萄球菌，可以同时用于霉菌性阴道炎和细菌性阴道炎的预防和辅助治疗。所述菌株命名为鼠李糖乳酪杆菌VHProbi O07，已于2023年4月24日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M2023610。

[0018] 本发明提供的鼠李糖乳酪杆菌VHProbi O07能够在平板上抑制白色念珠菌的生长；在混合培养的条件下，抑制白色念珠菌的生长，抑制率为100％，该菌株可以用于霉菌性阴道炎的预防和辅助治疗。

[0019] 本发明提供的鼠李糖乳酪杆菌VHProbi O07的发酵液及上清液能够在平板上抑制加德纳氏菌的生长；在混合培养的条件下，其能够抑制加德纳氏菌的生长，抑制率为97.65％，可以用于细菌性阴道炎的预防和辅助治疗。

[0020] 本发明提供的鼠李糖乳酪杆菌VHProbi O07对常见抗生素敏感，生物安全性良好；能够耐受较高的盐度，最大耐受盐浓度为8％；能在45℃生长，具有一定的耐热性。

[0021] 本发明提供的鼠李糖乳酪杆菌VHProbi O07具有较强的疏水能力，体外细胞表面疏水性为11.77％；同时在细胞水平上对人阴道上皮细胞的粘附指数为0.01，表明该菌株对人阴道上皮细胞具有一定的粘附性，可以定植在阴道内。

[0022] 本发明提供的鼠李糖乳酪杆菌VHProbi O07具备较强的抗氧化功能，其中对DPPH自由基清除率为30.96％±0.50％，HRS自由基清除率为68.07％±2.16％；上清液抗脂质过氧化抑制率为50.71％±0.12％；菌体抗脂质过氧化抑制率为31.03％±0.17％。胞内溶解物的抗脂质过氧化抑制率为14.2％±0.37％。鼠李糖乳酪杆菌VHProbi O07可以用于制备具有清除自由基功能的制品中。

[0023] 本发明提供的鼠李糖乳酪杆菌VHProbi O07经过人工胃液和肠液后仍具有较高的存活率，还能够抑制大肠杆菌、肠炎沙门氏菌、痤疮丙酸杆菌或金黄色葡萄球菌的生长，说明该菌株有较广的抑菌谱，可应用于肠道和皮肤健康领域。

[0024] 下面结合实施例对本发明进行说明，在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

[0025] 实施例1鼠李糖乳酪杆菌VHProbi O07的分离筛选

[0026] 1.1菌株的初筛

[0027] 依据2019版《人类遗传资源库伦理规范》，与样本提供者签订项目承诺书和知情同意书后，按照生物样本库标准操作规范，搜集半年内未食用益生菌制剂的健康婴幼儿粪便；‑1 ‑2 ‑3
将粪便进行系列稀释，取10 、10 、10 三个稀释梯度的稀释液各100μL，分别涂布于MRS选择性培养基上，37℃厌氧培养48h；待平板长出单菌落后，通过镜检，挑选出形状为杆菌的乳酸菌，共23株，分别命名为O01，O02，……，O23。

[0028] 1.2抗白色念珠菌的菌株复筛

[0029] (1)准备MRS琼脂平板

[0030] 提前准备好MRS琼脂平板，晾干。

[0031] (2)待筛选菌株的预培养

[0032] 用移液枪取5μL新鲜菌液滴到MRS平板，每个菌株平行3份，待液滴晾干后放到培养箱倒置培养48小时，使其生长成3‑5cm菌落。

[0033] (3)抑菌试验

[0034] 在沙氏葡萄糖平板上划线活化白色念珠菌ATCC 10235，然后挑取单菌落到沙氏葡萄糖液体培养基中，37℃有氧培养24h，然后按照1％的比例转接到新的沙氏葡萄糖液体培养基中，37℃有氧培养24h，得到新鲜菌液。然后配制0.7％琼脂含量的沙氏葡萄糖半固体培养基，121℃高压灭菌后，等温度降到47℃的时候，按照体积比0.5％的比例加入白色念珠菌菌液，摇匀，然后取7mL倾倒在准备好的乳酸菌培养基平板上，待凝固后，放到37℃培养箱培养24‑48小时，观察乳酸菌周围是否有抑菌圈。

[0035] 本发明初筛获得的23株乳酸杆菌中，其中O07菌株对白色念珠菌的抑制作用最显著，抑菌圈直径达到1.8±0.1cm。

[0036] 实施例2O07菌株的鉴定

[0037] 2.1菌落形态鉴定

[0038] O07菌株的单菌落不透明，有光泽，菌落表面平整，显微镜下呈短杆状。

[0039] 2.2生理生化特性鉴定

[0040] 本实施例中接种液的准备如下：在无菌条件下，取适量新鲜菌液，5000rpm/min离心5min，用PBS缓冲液洗2次，再用同体积PBS缓冲液重悬后稀释50倍，作为接种液。

[0041] 2.2.1温度生长范围实验

[0042] 在无菌条件下，将接种液按10％的接种量接种到10mL MRS液体培养基中，不接菌的10mL MRS液体培养基作为对照，分别置于15℃恒温振荡培养箱培养7天和45℃恒温振荡培养箱培养2天，观察培养液是否变浑浊。

[0043] 结果显示：15℃恒温培养7天后，培养基变浑浊；45℃恒温培养2天后，培养基仍浑浊。从而说明，O07菌株在15℃和45℃条件下能生长。

[0044] 2.2.2碳源代谢实验

[0045] 利用API 50CHL试剂条测定O07菌株对49种碳源的代谢作用。

[0046] 在无菌条件下，取适量新鲜菌液，5000rpm离心5min，用pH7.0磷酸缓冲液洗涤2次，再用同体积缓冲液重悬后，制得菌悬液。新鲜菌悬液按照10％的添加量加到API试剂盒的培养基中，然后按照试剂盒的操作，把培养基加到试纸条的孔里面，石蜡封口，然后把试纸条放到一个盒子里面，盒子底物加大约10mL的无菌去离子水，盖上盖子，放置到37℃培养箱中培养24‑48h，观察颜色变化，若菌生长则颜色由蓝色变成黄色，不生长颜色维持不变。记录试验结果，上传到鉴定软件API web。

[0047] 结果显示，O07菌株能利用甘油、D‑阿拉伯糖、核糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、山梨糖、甘露糖醇、山梨糖醇、N‑乙酰氨基葡萄糖、苦杏仁苷、黄柏素、七叶苷、水杨苷、鼠李糖、肌醇、纤维二糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、松三糖、龙胆二糖、L‑岩藻糖、D‑塔格糖和葡萄糖酸盐；不能利用赤藓糖醇、L‑阿拉伯糖、D‑木糖、L‑木糖、D‑侧金盏花醇、卫矛醇、α‑甲基‑D‑葡萄糖苷、β‑甲基‑D‑木糖苷、α‑甲基‑甘露糖苷、蜜二糖、土伦糖、菊粉、棉子糖、淀粉、糖原、木糖醇、D‑来苏糖、D‑岩藻糖、D‑阿拉伯糖醇、L‑阿拉伯糖醇、2‑酮葡萄糖酸盐和5‑酮葡糖酸盐。

[0048] API鉴定结果为该菌株为鼠李糖乳酪杆菌，ID＝99.9％，T值＝0.59。

[0049] 2.2.3葡萄糖产酸产气试验

[0050] 本实施例中所用的培养基配方如下：

[0051] 蛋白胨0.5g；酵母提取物0.3g；吐温80 0.1mL；盐溶液A0.5mL；盐溶液B 0.5mL；乙酸钠0.5g；葡萄糖2.5g；2％溴甲酚绿(w/v)0.05mL；蒸馏水100mL；pH6.8～7.0。

[0052] 将配制好的培养基分装至含有倒置小试管的大试管中，3mL/管，121℃，高压灭菌15min。

[0053] 盐溶液A成分：KH2PO4 10g、K2HPO4 1.0g，溶于蒸馏水，定容至100mL。

[0054] 盐溶液B成分：MgSO4·7H2O 11.5g、MnSO4·2H2O 2.4g、FeSO4·7H2O 0.68g，溶于蒸馏水，定容至100mL。

[0055] 在无菌条件下，将接种液按10％的接种量接种培养基，不接菌的培养基作为对照，然后用2mL无菌液体石蜡封住顶部，置于37℃培养。连续培养6d，每天观察培养基颜色有无变化。

[0056] 结果显示：37℃培养6d后，培养基由绿色变为黄色，小倒管内无气体，说明O07菌株发酵葡萄糖产酸，不产气。

[0057] 将上述所有生理生化特性结果结合文献De Clerck E,et al.Systematic and applied microbiology,2004,27(1):50.公布的结果进行比对，可以得出结论：O07菌株为一株鼠李糖乳酪杆菌。

[0058] 2.3分子生物学鉴定

[0059] 挑取平板上O07菌株的单菌落于MRS肉汤培养基中，37℃培养24小时，然后取500ul发酵液，参照天根细菌基因组DNA提取试剂盒(目录号：DP302)操作得到该菌株的基因组，该基因组用于后面的分子生物学鉴定。

[0060] 1、16s rDNA基因序列鉴定

[0061] 16s rDNA基因扩增

[0062] 1)引物序列：

[0063] 27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCA；

[0064] 1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT。

[0065] 2)反应体系(50μL)

[0066] 表1 16s rDNA PCR扩增体系

[0067]

[0068] 3)电泳验证PCR产物核酸电泳结果为1500bp左右，符合要求。

[0069] 4)PCR产物测序

[0070] 测序结果显示O07菌株的16s rDNA序列为SEQ ID NO:1。将该序列在NCBI数据库中进行BALST比对，其与鼠李糖乳酪杆菌(Lacticaseibacillus rhamnosus)的相似性最高。因此，初步确定O07菌株为鼠李糖乳酪杆菌(Lacticaseibacillus rhamnosus)。

[0071] 16s rDNA序列如下所示：

[0072] tcagaaagatcattaatagacggcttcgctccctaaaagggttacgccaccggcttcgggtgttacaaactctcatggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggcgtgctgatccgcgattactagcgattccgacttcgtgtaggcgagttgcagcctacagtccgaactgagaatggctttaagagattagcttgacctcgcggtctcgcaactcgttgtaccatccattgtagcacgtgtggagcccaggtcataaggggcatgatgatttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtcttactagagtgcccawckaaatgytggccaaactagtcatcaaggkttgcgctcgctwgcgggactkaacc carcatsttcaytgacaygagtctagaccgacmaycatgcasacagcmtgtcattttrsccycgaagkgkaaasctgatctctcaggtgatcaaaaagatgtcaagacctggtaaagswtcttcgcgttgcttcgaaattaaascacatgctmcaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagtttcaacmttgcggtcgtactccccaggcggaatgcttaatgcgttagctgcggcactgaagggcggaaaccstccaacamctagcaattcatcgtttacggcatggactaccagggtatctaatcctgttcgctacccatgctttcgagcctcagcgtcagttacagaccagacagccgccttcgccactggtgttcttccatatwwctacgcatttcaccgctacacmwggagttccactgtcctcttctgcactcaagtttcccagtttccgatgcacttcctcggktaagccgagggctttcacatcagacttaaaaaaccgcctgcgctcgctttacgcccaataaatccggataacgcttkccacctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttarmcgtggskgtyctggkkgggatacmgtcacgcccgaccamcarktactctgscgamcatwcttytycwacaaacagagkgtktacgaccccgaaaracsttcttcaytytaygmggcgttgctcyatcwgactwgcrymmattktktgwagattccctactgctgcctcccgtaggagtttgggccgtgtctcagtcccaatgtggccgatcaacctctcagttcggctacgtatcattgccttggtgagccgttacctcaccaactagctaatacgccgcgggtccatccaaaagcgatagcttacgccatctttcagccaagaaccatgcggttcttggatttatgcggtattagcatctgtttccaaatgttatcccccacttaagggcaggttacccacgtgttactcacccgtccgccactcgttcaaaattaaatcaagatgcaagcacctttcaataatcagaactcgttcgacttgcatgtatagcactacccaatgccc。

[0073] 2、蛋白质谱鉴定

[0074] 用牙签沾取平板上O07菌株的单菌落于蛋白质谱板上，然后用牙签把菌泥涂布均匀在质谱板上的圆盘内，涂布菌泥不需要太厚，然后按照蛋白质谱试剂盒说明书要求加入1μL质谱样本预处理盒中的基质溶液覆盖样品，室温下自然晾干。晾干后的质谱板放置到Motitof蛋白质谱仪上进行鉴定。

[0075] 结果如图1所示，经过鉴定O07菌株为鼠李糖乳酪杆菌，匹配率为95％。

[0076] 3、RAPD指纹图谱鉴定

[0077] 1)引物序列：M13(5’‑GAGGGTGGCGGTTCT‑3’)。

[0078] 2)RAPD反应体系

[0079] 表2RAPD反应体系

[0080]

[0081]

[0082] 3)电泳

[0083] 制备1.5％的琼脂糖凝胶板，DL2000 DNA Marker作为结果对照，稳压100V电泳80min，最后利用凝胶成像系统检测电泳图，O07菌株的RAPD指纹图谱如图2所示。

[0084] 经查询，未找到与图2吻合的RAPD指纹图谱，从而说明O07菌株是一株新的鼠李糖乳酪杆菌菌株。

[0085] 4、rep‑PCR指纹图谱鉴定

[0086] 1)rep‑PCR引物

[0087] GTGGTGGTGGTGGTG。

[0088] 2)rep‑PCR的反应体系

[0089] 表3rep‑PCR的反应体系

[0090]

[0091] 3)电泳

[0092] DL2000 DNA Marker作为结果对照。电压100V，电泳时间80min检测扩增结果，O07菌株rep‑PCR指纹图谱如图3所示。

[0093] 经查询，未找到与图3吻合的rep‑PCR指纹图谱，从而说明O07菌株是一株新的鼠李糖乳酪杆菌菌株。

[0094] 2.4全基因组测序

[0095] 把O07菌株的菌液按照1％的体积比例接种到500mL MRS肉汤培养基中，37℃培养22h，然后8000rpm离心10min，收集菌体。菌体送到测序中心，得到该菌的全基因序列，基因序列上传至NCBI基因数据库，登录号为CP129029。鼠李糖乳酪杆菌VHProbi O07整个基因组长2942257bp，GC含量占46.74％，编码基因2707个。

[0096] 将O07菌株的菌落形态以及生理生化特性结果进行比对，并综合分子生物学的鉴定结果，确定O07菌株为一株新型的鼠李糖乳酪杆菌，并命名为鼠李糖乳酪杆菌VHProbi O07(Lacticaseibacillus rhamnosus VHProbi O07)。

[0097] 实施例3鼠李糖乳酪杆菌VHProbi O07盐度耐受性试验

[0098] 在无菌条件下，将接种液按10％的接种量接种到盐浓度分别为1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％的5mL MRS液体培养基中，不接菌的5mL MRS液体培养基作为对照，置于37℃恒温振荡培养，观察培养基是否变浑浊。

[0099] 结果显示：鼠李糖乳酪杆菌VHProbi O07在1％～8％盐浓度下生长，鼠李糖乳酪杆菌VHProbi O07的最大耐受盐浓度为8％。

[0100] 实施例4鼠李糖乳酪杆菌VHProbi O07的抗生素耐受性试验

[0101] 1、抗生素配制：氨苄青霉素、克林霉素、红霉素、链霉素、四环素、庆大霉素均配制成2048μg/mL的贮存液，‑20℃保存备用。使用时将贮存液用MRS液体培养基进行2倍系列梯度稀释成使用液，梯度稀释浓度为1～1024μg/mL共11个梯度。

[0102] 2、接种液的准备：取适量鼠李糖乳酪杆菌VHProbi O07新鲜菌液(24～48h，40℃培养)，5000rpm离心5min，用无菌生理盐水洗一次，再用同体积生理盐水重悬后稀释50倍，作为接种液。

[0103] 3、微量肉汤稀释法测定抗生素对鼠李糖乳酪杆菌VHProbi O07的最小抑菌浓度MIC。

[0104] (1)96孔板第1列次加入不含抗生素的MRS液体培养基，作为阴性对照，向第2～12列依次加入190μL含不同浓度抗生素的MRS液体培养基，然后分别接种10μL上述接种液，做3个平行孔，并以1个孔不加菌液作为空白。

[0105] (2)加入50μL石蜡油覆盖防止水分蒸发。

[0106] (3)将96孔板于40℃振荡培养48h后取出，测定OD600值，用48h的结果统计抗生素对菌株的MIC值，结果见表5。

[0107] 表4鼠李糖乳酪杆菌VHProbi O07的抗生素MIC值

[0108]

[0109]

[0110] 注：MIC单位μg/mL

[0111] 从表4的结果可以看出，本发明提供的鼠李糖乳酪杆菌VHProbi O07对红霉素、氨苄西林，四环素和克林霉素等常见抗生素敏感，对链霉素和庆大霉素略敏感，整体生物安全性良好。

[0112] 实施例5鼠李糖乳酪杆菌VHProbi O07抗氧化功能测定

[0113] 1、菌株清除DPPH和羟基自由基(HRS)能力测定

[0114] 1)菌悬液制备

[0115] 将生长状态优良的鼠李糖乳酪杆菌VHProbi O07单菌落接种于3mL的MRS液体培养基中，37℃条件下培养18‑20h，以此培养液为接种液，按照2％的接种量接种于50mL的MRS液体培养基中，静置培养18h，获得菌株的培养液。吸取1mL菌液收集菌体后用1mLPBS缓冲液洗涤菌体2遍后再加入2mLPBS溶液重悬菌体备用。

[0116] 2)菌株清除DPPH自由基能力的测定

[0117] 取1mL鼠李糖乳酪杆菌VHProbi O07菌悬液，加入1mL 0.4mM的现配的DPPH自由基溶液，混合均匀后然后置于室温温度下遮光反应30min，然后测定样品在波长517nm处的吸光度A样本，测3次平行。对照组样品为等体积PBS溶液和DPPH·乙醇混合液，同时以等体积PBS菌悬液和乙醇混合液空白调零。

[0118] 清除率按下列公式计算：

[0119] 清除率＝[1‑(A样品‑A空白)/A对照]×100％。

[0120] 结果显示：本发明提供的鼠李糖乳酪杆菌VHProbi O07对DPPH自由基的清除率高达30.96％±0.50％。

[0121] 3)菌株清除羟基自由基HRS能力的测定

[0122] 将100μL 5mM的水杨酸钠‑乙醇溶液，100μL 5mM的硫酸亚铁，500μL去离子水和200μL鼠李糖乳酪杆菌VHProbi O07菌悬液混匀后加入100μL过氧化氢溶液(3mM)，37℃水浴15min后在510nm波长处测量样品吸光度。

[0123] 羟自由基清除率按照下列公式进行计算：

[0124] 清除率＝(A样品‑A控制)/(A空白‑A控制)×100％。

[0125] 其中A控制为去离子水替代样品，A空白为去离子水替代样品和H2O2。

[0126] 结果显示：本发明提供的鼠李糖乳酪杆菌VHProbi O07对HRS自由基的清除率高达68.07％±2.16％。

[0127] 2、菌株抗脂质过氧化能力测定

[0128] 1)菌株培养及发酵上清液、菌体、胞内提取物的制备：

[0129] 将鼠李糖乳酪杆菌VHProbi O07在MRS液体培养基中37℃培养24h，传3代后，6000r/min，4℃离心10min，收集上清液即为发酵上清液。收集的菌体用PBS缓冲液(pH 7.4)于6000r/min离心10min，洗涤3次。将菌体重悬于PBS缓冲液，调整菌体浓度为1.0×
9
10cells/mL，获得菌悬液。

[0130] 2)亚油酸乳化液的制备：0.1mL亚油酸，0.2mL Tween20，19.7mL去离子水。

[0131] 3)0.5mL的PBS溶液(pH 7.4)中加入1mL亚油酸的乳化液，1mLFeSO4(1％)，再加入0.5mL样品，37℃水浴1.5h，混合液加入0.2mL TCA(4％)，2mL TBA(0.8％)，100℃水浴
30min，迅速冷却，4000r/min离心15min，收集上清液在532nm下测吸光度即为A；对照组以
0.5mL蒸馏水代替样品即为A0。

[0132] 抑制率＝(A0－A)/A0×100％。

[0133] 结果显示：本发明提供的鼠李糖乳酪杆菌VHProbi O07的上清液抗脂质过氧化抑制率为50.71％±0.12％；菌体抗脂质过氧化抑制率为31.03％±0.17％。胞内溶解物的抗脂质过氧化抑制率为14.2％±0.37％。

[0134] 实施例6鼠李糖乳酪杆菌VHProbi O07的疏水性细胞表面测试

[0135] 1、待测菌液制备：挑取纯化好的鼠李糖乳酪杆菌VHProbi O07菌落接种于新配制的MRS液体培养基中，于40℃振荡培养24～48h。再按1％(V/V)的接种量接至MRS液体培养基中于40℃继续振荡培养24～48h后6000×g离心10min，收集菌体后用无菌生理盐水冲洗2次，再用灭菌0.1M KNO3 1mL溶液重悬菌体，作为待测菌液。

[0136] 2、表面疏水性测定：吸取50μL上述菌悬液加入2450μL的0.1M KNO3并记录OD600为A0,取1.5mL菌悬液与500μL二甲苯混匀后在室温下静置10min(此时形成两相体系)。将两相体系涡旋振荡2min后再静置20min,重新形成水相和有机相。小心吸取水相(不要吸到有机相)在600nm处测量吸光度A1。细胞疏水性按公式疏水性＝(A0‑A1)/A1×100％计算，测三次实验取平均值。

[0137] 结果显示：本发明提供的鼠李糖乳酪杆菌VHProbi O07细胞表面疏水性为11.77％。

[0138] 实施例7鼠李糖乳酪杆菌VHProbi O07对人工胃液和人工肠液的耐受性1、菌液制备：

[0139] 将冷冻保存的鼠李糖乳酪杆菌VHProbi O07菌株划线接种于MRS固体培养基中，37℃培养24～48h，再经MRS液体培养基传代培养1次后，以5％的接种量把鼠李糖乳酪杆菌VHProbi O07接种到新鲜的MRS液体培养基中40℃振荡培养24～48h，获得新鲜的菌液。

[0140] 2、人工胃液的配制

[0141] 分别称取蛋白胨5g、酵母提取物2.5g、葡萄糖1g和NaCl 2g，加入1000mL蒸馏水，用稀盐酸调pH3.0，然后115℃灭菌20min。然后使用前加入3.2g猪粘膜胃蛋白酶，摇匀溶解，置37℃水浴摇床温浴1h，以模拟人体温度。

[0142] 3、人工肠液的配制

[0143] 分别称取蛋白胨5g、酵母提取物2.5g、葡萄糖1g、KH2PO4 6.8g和牛胆盐3.0g，加入77mL 0.2mol/L的NaOH溶液，定容至1000mL，用稀盐酸或者氢氧化钠溶液调pH6.8±0.1，115℃灭菌20min。然后使用前加入1g胰酶，摇匀溶解，置37℃水浴摇床温浴1h，以模拟人体温度。

[0144] 4、试验方法

[0145] 取2mL新鲜菌液，5000rpm离心5min收集菌体，菌体用生理盐水洗涤3次，再用2mL生理盐水重悬，作为接种液。取1mL接种液，加入到9mL已温浴1h的人工胃液中，置于37℃水浴摇床以200rpm转速振荡2h，分别于0h和2h时取样1mL，检测活菌量。然后取1mL消化2h后的人工胃液，加入到24mL人工肠液中，置于37℃水浴摇床(200rpm)3h，取样1mL，检测活菌量。

[0146] 活菌计数方法按照国标《GB4789.35‑2016‑食品微生物检验乳酸菌检验》测定菌量，菌株经过人工胃液和人工肠液后的活菌量的Log(CFU/mL)如表5所示。

[0147] 表5人工胃肠道消化后的活菌量对数值

[0148]

[0149] 从表5可知，鼠李糖乳酪杆菌VHProbi O07经过人工胃液消化后，活菌量几乎没有下降；经过人工肠液消化后活菌量仅下降了1.91logCFU/mL，从而说明该菌株对胃肠液具有很强的耐受性，具有作为肠道益生菌的潜能。

[0150] 实施例8鼠李糖乳酪杆菌VHProbi O07的抑菌效果

[0151] 8.1鼠李糖乳酪杆菌VHProbi O07对加德纳氏菌的抑菌效果

[0152] 分别在血琼脂平板上划线活化两株阴道加德纳氏菌BNCC337545和BNCC354890，然后挑取单菌落到改良BHI肉汤培养基(BHI加5％的血清)中，37℃有氧培养24h，然后按照1％的比例转接到新的改良BHI肉汤培养基中，37℃有氧培养24h，得到新鲜菌液；将上述两株菌的新鲜菌液等体积混匀，即得到加德纳氏菌混合菌液。

[0153] 采用两株不同的阴道加德纳氏菌作为指示菌株，更能体现鼠李糖乳酪杆菌VHProbi O07对加德纳氏菌的抑菌能力。

[0154] 1、抑菌圈实验

[0155] 提前准备哥伦比亚血平板，然后取50μL加德纳氏菌混合菌液涂布到血平板上，放上牛津杯，在孔里分别加入100μL鼠李糖乳酪杆菌VHProbi O07的发酵菌液和上清液，37℃培养48h，观察有无抑菌圈。

[0156] 结果表明，鼠李糖乳酪杆菌VHProbi O07发酵液对阴道加德纳氏菌的抑菌直径为1.62±0.03cm，上清液的抑菌直径为1.27±0.06cm。

[0157] 2、共培养条件下的抑菌实验

[0158] 实验分为2组，分别为实验组和对照组。

[0159] 取100μL鼠李糖乳酪杆菌菌液和100μL加德纳菌混合菌液接种于装有5mL改良BHI液体培养基的试管中，震荡均匀，将试管在37℃培养箱培养24h，得到实验组培养液；

[0160] 取100μL MRS液体培养基和100μL加德纳氏菌菌液接种于装有5mL改良BHI培养基的试管中，震荡均匀，将试管在37℃培养箱培养24h，得到对照组培养液。

[0161] 将各组培养液用灭菌的PBS缓冲液梯度稀释后用移液器吸取100μL涂布于哥伦比亚血琼脂固体培养基，于37℃培养箱倒置培养48h后进行平板计数，获得各组培养液中加德纳氏菌的菌落数。

[0162] 结果显示，对照组培养液中的加德纳氏菌的菌浓度为2.15×109CFU/mL；实验组培7
养液中的加德纳氏菌菌浓度为5.05×10CFU/mL。从而说明，鼠李糖乳酪杆菌VHProbi O07能够在共培养条件下显著抑制加德纳氏菌的生长，抑制率达到98％，取得了意料不到的技术效果。

[0163] 8.2鼠李糖乳酪杆菌VHProbi O07对白色念珠菌的抑菌效果

[0164] 实验分为2组，分别为实验组和对照组。

[0165] 取50μL鼠李糖乳酪杆菌VHProbi O07菌液和50μL白色念珠菌菌液接种于装有5mLMRS液体培养基的试管中，震荡均匀，将试管在37℃培养箱培养24h，得到实验组培养液；

[0166] 取50μL MRS液体培养基和50μL白色念珠菌菌液接种于装有5mL MRS液体培养基的试管中，震荡均匀，将试管在37℃培养箱培养24h，得到对照组培养液。

[0167] 将各组培养液用灭菌的PBS缓冲液梯度稀释后用移液器吸取100μL涂布于沙氏葡萄糖固体培养基，于37℃培养箱倒置培养48h后进行平板计数，获得各组培养液中白色念珠菌的菌落数。

[0168] 结果显示：对照组培养液中的白色念珠菌菌浓度为5.05×106CFU/mL，实验组培养液中的白色念珠菌菌浓度为0CFU/mL，说明本发明提供的鼠李糖乳酪杆菌VHProbi O07对白色念珠菌具有显著的抑制效果，抑制率高达100％。

[0169] 8.3鼠李糖乳酪杆菌VHProbi O07对其他病原菌的抑菌效果

[0170] 按照实施例1中的牛津杯抑菌试验，分别检测鼠李糖乳酪杆菌VHProbi O07对痤疮丙酸杆菌、肠炎沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌四株病原菌的抑菌效。抑菌圈直径结果如表6所示。

[0171] 表6鼠李糖乳酪杆菌VHProbi O07对其他病原菌的抑菌直径

[0172]   大肠杆菌 肠炎沙门氏菌 金黄色葡萄球菌 痤疮丙酸杆菌直径(cm) 1.1±0.00 1.18±0.11 1.0±0.10 2.25±0.07

[0173] 从表6的结果可知，本发明提供的鼠李糖乳酪杆菌VHProbi O07能够显著抑制大肠杆菌、肠炎沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和痤疮丙酸杆菌，具有较广的抑菌谱，从而说明该菌株可应用于肠道和皮肤健康领域。

[0174] 实施例10鼠李糖乳酪杆菌VHProbi O07对人阴道上皮细胞的粘附性1、细胞预培养[0175] 将人阴道上皮细胞液氮中复苏，培养至所需量，待细胞密度生长至80％左右时，胰5
酶消化成单细胞悬液，血球计数板计数，细胞数为5×10cells/mL。然后取500μL细胞悬液
5
接种至24孔板，接种密度为2.5×10cells/孔，细胞过夜培养至完全贴壁后弃培养液，用新鲜培养液漂洗2次，备用。

[0176] 2、菌悬液制备

[0177] 将鼠李糖乳酪杆菌VHProbi O07新鲜菌液用pH7.0磷酸盐缓冲液洗涤两次，然后用含10％小牛血清的上皮专用培养液同体积重悬，调整吸光度，使OD600＝0.4‑0.5之间。

[0178] 3、细胞培养

[0179] 在已准备好的含人阴道上皮细胞的24孔板内加入菌悬液500μL，于二氧化碳培养箱中共生培养2h；用pH7.0磷酸盐缓冲液洗涤3次，去除未粘附的菌。

[0180] 4、计数

[0181] 加入300ul胰酶消化3分钟，再加入700ul细胞培养液终止消化，反复吹打，并将所得溶液收集至无菌EP管中，并将收集的溶液进行10倍，100倍，1000倍，10000倍梯度稀释，涂板计数。同时对空白组的细胞进行计数。根据以下公式计算供试菌株的粘附能力：

[0182] 粘附能力(CFU/cells)＝每个培养孔内粘附的细菌总数/每个培养孔的总细胞数。

[0183] 结果显示，鼠李糖乳酪杆菌VHProbi O07对人阴道上皮细胞具有一定的粘附性，可以有效定植在阴道中。

[0184] 综上，本发明提供的鼠李糖乳酪杆菌VHProbi O07在液体混合培养条件下和平板上预培养条件下能够显著抑制白色念珠菌的生长，说明该菌株能够预防霉菌性阴道炎的发生，并可用于霉菌性阴道炎的后期辅助治疗；鼠李糖乳酪杆菌VHProbi O07的发酵液和上清液在平板上能够抑制加德纳氏菌的生长，混合培养条件下显著抑制加德纳氏菌的生长，说明该菌株可以用于细菌性阴道炎的预防和治疗，并且该菌对人阴道上皮细胞具有粘附作用，能够定植于阴道内，是一株用于维护女性阴道健康的潜在益生菌。所述鼠李糖乳酪杆菌VHProbi O07可制成菌剂、药物或是女性卫生产品，将有助于缓解细菌性阴道炎和霉菌性阴道炎，保持女性阴道健康。鼠李糖乳酪杆菌VHProbi O07还可以抑制痤疮丙酸杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和肠炎沙门氏菌，具有较广的抑菌谱。鼠李糖乳酪杆菌VHProbi O07菌体具有较强的抗氧化能力和细胞疏水能力，经过人工胃液和肠液后仍具有较高的存活率，说明该菌株具有肠道益生菌的潜能，可以用于制备清除自由基或调节肠道功能的产品。