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一种特异性检测广西阿克曼菌菌株水平的引物和试剂盒及其应用
申请号	CN202410122959.6	申请日	2024-01-29	公开(公告)号	CN117802259A	公开(公告)日	2024-04-02
申请人	广西爱生生命科技有限公司;			发明人	芦志龙; 唐琴艳; 黄诗婷; 罗卫飞; 梁艳;
摘要	本发明提供了一种特异性检测广西阿克曼菌菌株水平的引物和试剂盒及其应用，属于分子检测技术领域。一种广西阿克曼菌菌株水平特异性检测引物，包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的广西阿克曼菌菌株N21116检测引物对和/或核苷酸序列如SEQ ID NO:11和12所示的广西阿克曼菌菌株N21169检测引物对。所述引物具有检测特异性强、灵敏度、检测方便快速的特点，可作为两种广西阿克曼菌的特异性引物，可应用在株型鉴定和污染排查方面。
权利要求	1.一种广西阿克曼菌菌株水平特异性检测引物，其特征在于，包括广西阿克曼菌菌株N21116检测引物对和/或广西阿克曼菌菌株N21169检测引物对；所述广西阿克曼菌菌株N21116检测引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的反向引物；所述广西阿克曼菌菌株N21169检测引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示的反向引物。 2.一种广西阿克曼菌菌株水平检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述引物和其它PCR检测试剂。 3.根据权利要求2所述试剂盒，其特征在于，所述其它PCR检测试剂包括2×PCR预混液。 4.根据权利要求2或3所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括DNA提取试剂和DNA分子标准品。 5.根据权利要求4所述试剂盒，其特征在于，所述DNA分子标准品包括广西阿克曼菌菌株N21116的DNA分子标准品和广西阿克曼菌菌株N21169的DNA分子标准品；所述广西阿克曼菌菌株N21116的DNA分子标准品的核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示；所述广西阿克曼菌菌株N21169的DNA分子标准品的核苷酸序列如SEQ ID NO:22所示。 6.权利要求1所述引物在制备广西阿克曼菌菌株水平检测试剂盒中的应用。 7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述广西阿克曼菌菌株包括N21116和/或N21169。 8.权利要求1所述引物在制备广西阿克曼菌发酵培养中污染排查检测试剂盒中的应用。 9.根据权利要求8所述应用，其特征在于，污染排查中污染微生物包括以下至少一项：厚壁菌门、放线菌门、变形菌、拟杆菌和非目标广西阿克曼菌菌株。 10.一种广西阿克曼菌株污染排查检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述引物或权利要求2～5任意一项所述试剂盒和污染微生物检测引物；所述污染微生物检测引物包括拟杆菌检测引物、厚壁菌门检测引物、放线菌门检测引物、Alpha变形菌门检测引物、gamma变形菌门检测引物。
说明书全文	一种特异性检测广西阿克曼菌菌株水平的引物和试剂盒及其应用技术领域 [0001] 本发明属于分子检测技术领域，具体涉及一种特异性检测广西阿克曼菌菌株水平的引物和试剂盒及其应用。背景技术 [0002] 阿克曼氏菌(Akkermansiamuciniphila)是一种常见的肠道菌群中的细菌，属于疣微菌门(Verrucomicrobia)。它是一种革兰氏阴性菌，以其对人类健康的积极影响而备受关注。它具有以下几个方面的功能和益处：1)黏液屏障维护；2)调节营养物质代谢；3)免疫调节及4)代谢调节。因此，阿克曼菌已成为下一代益生菌研究开发的热点。 [0003] 广西阿克曼菌(A.guangxiensis)是最近报道的一种新型阿克曼菌，同时CN116200312A 专利公开了两种广西阿克曼菌菌株，分别为广西阿克曼氏菌菌株N21116和N21169，保藏编号分别为：GDMCCNo:62888和GDMCCNo:62889。 [0004] 由于阿克曼菌为厌氧微生物，其培养过程中很容易因氧分控制不当造成污染。尤其在大规模发酵生产中，此类污染会造成严重的经济损失。广西阿克曼菌的不同菌株具有较大的益生特性差异，一旦混用将导致菌体产品无法达到预期的健康效益。然而目前缺乏一种在广西阿克曼菌菌株水平的鉴定方案。发明内容 [0005] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种特异性检测广西阿克曼菌菌株水平的引物，能够快速准确区分广西阿克曼氏菌菌株N21116和N2116，为菌种株水平的鉴定和污染控制提供了新手段。 [0006] 本发明提供了一种广西阿克曼菌菌株水平特异性检测引物，包括广西阿克曼菌菌株N21116检测引物对和/或广西阿克曼菌菌株N21169检测引物对； [0007] 所述广西阿克曼菌菌株N21116检测引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的反向引物； [0008] 所述广西阿克曼菌菌株N21169检测引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示的反向引物。 [0009] 本发明提供了一种广西阿克曼菌菌株水平检测试剂盒，包括所述引物和其它PCR检测试剂。 [0010] 优选的，所述其它PCR检测试剂包括2×PCR预混液。 [0011] 优选的，所述试剂盒还包括DNA提取试剂和DNA分子标准品。 [0012] 优选的，所述DNA分子标准品包括广西阿克曼菌菌株N21116的DNA分子标准品和广西阿克曼菌菌株N21169的DNA分子标准品； [0013] 所述广西阿克曼菌菌株N21116的DNA分子标准品的核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示； [0014] 所述广西阿克曼菌菌株N21169的DNA分子标准品的核苷酸序列如SEQ ID NO:22所示。 [0015] 本发明提供了所述引物在制备广西阿克曼菌菌株水平检测试剂盒中的应用。 [0016] 优选的，所述广西阿克曼菌菌株包括N21169和/或N21169。 [0017] 本发明提供了所述引物在制备广西阿克曼菌发酵培养中污染排查检测试剂盒中的应用。 [0018] 优选的，污染排查中污染微生物包括以下至少一项：厚壁菌门、放线菌门、变形菌、拟杆菌和非目标广西阿克曼菌菌株。 [0019] 本发明提供了一种广西阿克曼菌株污染排查检测试剂盒，包括所述引物或所述试剂盒和污染微生物检测引物； [0020] 所述污染微生物检测引物包括拟杆菌检测引物、厚壁菌门检测引物、放线菌门检测引物、Alpha变形菌门检测引物、gamma变形菌门检测引物。 [0021] 本发明提供了一种广西阿克曼菌菌株水平特异性检测引物，包括广西阿克曼菌菌株N21116检测引物对和/或广西阿克曼菌菌株N21169检测引物对；所述广西阿克曼菌菌株N21116检测引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的反向引物；所述广西阿克曼菌菌株N21169检测引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示的反向引物。本发明从基因数据库中下载目标检测菌株、实验室以及发酵车间污染微生物的基因组，以引物能够特异性扩增目标生物类群而不能扩增污染微生物的原则设计引物，针对目标检测菌株分别设计了5对引物，通过实验验证，针对广西阿克曼菌菌株N21116得到4对能够扩增得到目标片段的引物对，针对广西阿克曼菌菌株N21169得到3对能够扩增得到目标片段的引物，对筛选得到的引物进一步进行灵敏度检测，结果表明，与其他检测引物相比，AguN21116_1和AguN21169_1引物对于本物种来说均呈现阳性条带更清晰明亮，具有良好的灵敏度，其中AguN21116_1的检测灵敏阈值低于0.2ng/ml基因组DNA，AguN21169_1的检测灵敏阈值低于0.2ng/ml基因组DNA。同时本发明还对引物进行特异性检测，结果表明，AguN21116_1和AguN21169_1引物仅能对对应广西阿克曼菌菌株实现条带的扩增，而对其他种类的阿克曼菌的检测均未扩增到任何条带。因此，AguN21116_1和AguN21169_1可作为两种广西阿克曼菌的特异性引物，可应用在株型鉴定和污染排查方面。附图说明 [0022] 图1为广西阿克曼菌菌株水平检测引物的扩增结果； [0023] 图2为广西阿克曼菌菌株水平检测引物的灵敏度检测结果； [0024] 图3为广西阿克曼菌的两个株型(AguN21116_1和AguN21169_1)的特异检测引物对的特意性检测结果；其中AguN21116：广西阿克曼菌N21116；AguN21169：广西阿克曼菌N21169；Amu：嗜黏蛋白阿克曼菌BAA‑835T；Abi：琵琶湖阿克曼菌；Agl：嗜糖阿克曼菌；NC：阴性对照； [0025] 图4为广西阿克曼菌株污染排查结果。具体实施方式 [0026] 本发明提供了一种广西阿克曼菌菌株水平特异性检测引物，包括广西阿克曼菌菌株N21116检测引物对和/或广西阿克曼菌菌株N21169检测引物对； [0027] 所述广西阿克曼菌菌株N21116检测引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的反向引物； [0028] 所述广西阿克曼菌菌株N21169检测引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示的反向引物。 [0029] 在本发明中，所述广西阿克曼菌菌株N21116检测引物对能够扩增得到291bp长度的扩增产物，且所述引物仅能扩增广西阿克曼菌N21116菌株，而对广西阿克曼菌N21169菌株以及其他种类的阿克曼菌均无法成功扩增，说明所述引物具有良好的检测特异性。同时所述引物具有良好的检测灵敏度，对于0.2ng/ml的模板DNA能够扩增得到明亮的条带，说明所述引物检测灵敏阈值低于0.2ng/ml，较同批设计的其他引物对具有明显的优势。 [0030] 在本发明中，所述广西阿克曼菌菌株N21169检测引物对能够扩增得到259bp长度的扩增产物，且所述引物仅能扩增广西阿克曼菌N21169菌株，而对广西阿克曼菌N21116菌株以及其他种类的阿克曼菌均无法成功扩增，说明所述引物具有良好的检测特异性。同时所述引物具有良好的检测灵敏度，对于0.2ng/ml的模板DNA能够扩增得到明亮的条带，说明所述引物检测灵敏阈值低于0.2ng/ml，较同批设计的其他引物对具有明显的优势。 [0031] 本发明对所述引物的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的引物来源即可。在本发明实施例中，所述引物优选委托科拓公司合成得到。 [0032] 本发明提供了一种广西阿克曼菌菌株水平检测试剂盒，包括所述引物和其它PCR检测试剂。 [0033] 在本发明中，所述其它PCR检测试剂优选包括2×PCR预混液。本发明对所述2×PCR预混液的来源没有特殊限制，采用本领域熟知的PCR预混液的来源即可。在本发明实施例中，所述2×PCR预混液购自全式金公司。 [0034] 在本发明中，所述试剂盒优选还包括DNA提取试剂和DNA分子标准品。所述DNA分子标准品优选包括广西阿克曼菌菌株N21116的DNA分子标准品和广西阿克曼菌菌株N21169的DNA分子标准品。所述广西阿克曼菌菌株N21116的DNA分子标准品的核苷酸序列如SEQ ID NO:21(TCCGA CCAATTATCTCCGATAACCGGAAAATTCAGATTTCCGGAAGAGTTACTCCTTCCGGTCTAATCCAAATCTAATTCTTTCATTGTCAAAAGGCATGCCTTCTTTCAGGGCATGCCTTTTCGTTTTCTCTGATCTACTCTTGTCTGGTGGTACTCCTGTTTTAGAGACATTCAAAATGTTCAAAATCCAACAAAGTTGTAAAATGAACGACAAAAGAACATAAAATCGTTATACAGTGAAGGGTATGAATTCGAAAAGACTTATTCTCTCCTTCTGTCTGACTCTCAT)所示。所述广西阿克曼菌菌株N21169的DNA分子标准品的核苷酸序列如SEQ ID NO:22(TACCAATAGCATAATCGGTATCCAGATGGAGTTCACCAAGTGCTTCAT AATGGATATCTCCTGTATGAGTACCGGACTTTTCCAAATGGACATCACCCGTTCCCGTCACAGTCAGATTGGAACTGCCGGACAGCACGCCCTTCACATTCAATACCGGAGAAGAAGAAATGTTCTCTTCTCCCAAATTAATCTGTCCGCTTGCATTAAGAGCCAGATTGCCGATCGCCCAGTTCTCGTGAATATCCAGATTACGATCGGA)所示。 [0035] 本发明提供了所述引物在制备广西阿克曼菌菌株水平检测试剂盒中的应用。 [0036] 在本发明中，所述广西阿克曼菌菌株优选包括N21169和/或N21169。 [0037] 在本发明中，广西阿克曼菌菌株水平的检测方法，优选包括以下步骤： [0038] 提取待测样本的基因组DNA； [0039] 以所述基因组DNA为模板，利用上述技术方案中的目标引物进行PCR扩增，得到PCR产物； [0040] 所述PCR产物进行分析，当PCR产物中含有得目标片段，说明待测样本中含目标广西阿克曼菌菌株。 [0041] 本发明对提取待测样本的基因组DNA的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的提取微生物DNA的方法即可。在本发明实施例中，优选采用天根细菌基因组DNA抽提试剂盒完成提取。 [0042] 在本发明中，所述PCR扩增的反应体系的总体积优选为50μl，具体包括以下组分：2×PCR缓冲液25μl、模板DNA(10ng/μl)1μl、正向引物(10mM)1μl、反向引物(10mM)1μl和无菌水22μl。所述PCR扩增的反应程序优选如下：95℃2min；95℃30s，52℃30s，72℃30s，30个循环；72℃10min。 [0043] 在本发明中，所述PCR产物进行分析的方法，优选电泳检测和测序。所述电泳检测优选琼脂糖凝胶电泳和毛细管电泳。当电泳检测时，基于所述引物能够扩增得到291或259bp的目标产物，根据电泳结果有无目标大小的条带判断待测样本中是否存在目标菌株。当测序时，根据目标菌株的标准品DNA片段的序列与测序结果序列比对结果判断待测样本中是否存在目标菌株。 [0044] 本发明提供了一种广西阿克曼菌株污染排查检测试剂盒，包括所述引物或所述试剂盒和污染微生物检测引物；所述污染微生物检测引物包括拟杆菌检测引物、厚壁菌门检测引物、放线菌门检测引物、Alpha变形菌门检测引物、gamma变形菌门检测引物。 [0045] 在本发明中，所述拟杆菌检测引物优选包括核苷酸序列如SEQ ID NO:23(CCGGAWTYATGGGTTIAAAGG)所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:24(GGTAAGGTICCTCGCGTA)所示的反向引物。所述厚壁菌门检测引物优选包括核苷酸序列如SEQ ID NO:25(TGAAACTYAAGGAATTGACG)所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:26(ACCATGCACCACCTGTC)所示的反向引物。放线菌门检测引物优选包括核苷酸序列如SEQ ID NO:27(GGRCCCGCACAAGCGGC)所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:28 (TCWGCGATTACTAGCGAC)所示的反向引物。所述Alpha变形菌门检测引物优选包括核苷酸序列如SEQ ID NO:29(ARCGAACGCTGGCGGCA)所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:30(TACGAATTTYACCTCTACA)所示的反向引物。所述gamma变形菌门检测引物优选包括核苷酸序列如SEQ ID NO:31(CMATGCCGCGTGTGTGAA)所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:32(ACTCCCCAGGCGGTCDACTTA)所示的反向引物。 [0046] 本发明提供了所述引物在制备广西阿克曼菌发酵培养中污染排查检测试剂盒中的应用。 [0047] 在本发明中，污染排查中污染微生物优选包括以下至少一项：厚壁菌门、放线菌门、变形菌、拟杆菌和非目标广西阿克曼菌菌株。所述厚壁菌门优选包括Lactobacillus、Lactobacillus、Staphylococcus、Enterococcus、Leuconostoc和Streptococcus等。所述放线菌门优选包括Bifidobacterium。所述变形菌优选包括Alpha变形菌门和/或gamma变形菌门。所述Alpha变形菌门优选包括排除气单胞菌类。所述gamma变形菌门优选包括大肠杆菌类污染菌。 [0048] 本发明对所述广西阿克曼菌发酵培养中污染排查检测的方法没有特殊限制，采用上述广西阿克曼菌菌株水平的检测方法即可。需要注意的是：根据检验的目的不同，检验体系除了包含检测广西阿克曼菌菌株的引物，另外设置污染排查反应，使用上述一种或多种门水平检验通用引物，以确定具体的污染源，为高质量生产提供决策依据。每次检验仍应设置阴性对照，确保试剂本身无污染。 [0049] 下面结合实施例对本发明提供的一种特异性检测广西阿克曼菌菌株水平的引物和试剂盒及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。 [0050] 实施例1 [0051] 广西阿克曼菌属内株水平的引物对的设计和特异性检测 [0052] 获取基因组或Assembly，依据常见实验室和发酵车间污染微生物，在NCBIgenomeFTP下载代表序列。下载序列为fna格式，具备完整基因组的参考序列。其中即厚壁菌门(Bacillota)含Bacilli、Lactobacillales、Aerococccaceae、Carnobacteriaceae四个纲，Clostridia含Eubacteriales、thermoanaerobacterales、Halanaerobiales的三个纲，共计728个基因组；即放线菌门(Actinomycetota)含Actinomycetes(内含 Micrococcales、Kitasatosporales、Streptosporangiales、Frankiales、 glycomycetaceae、catenulisporales、actinopolysporales、kineosporiales、Jiangenllales、geodermatophilales和Nakamurellales的11个目)，Aciddimicrobiales、rubrobacteria、coriobacteriiales、eggerthellales和thermoleophilia的5个纲，共计 679个基因组；即变形菌门(Pseudomonadota/Preteobacteria)含alpha‑、beta‑、gamma‑、zeta‑bacteria，acidithiobacillia、hydrogenophilia6个纲的共1830个基因组。 Akkermansia菌属全部基因组共303个(截止2023年6月)。 [0053] 作为特异性引物，应可以扩增目标生物类群，而不能扩增排除生物类群。因此，在引物设计时，参照表格1设置包含和排除微生物类群。 [0054] Kmer统计：设置Kmer长度为99，使用软件kmc进行kmer统计；搜索仅出现在应包含分类群、且频次仅为1、且不出现于应排除分类群的kmer作为候选检测基因。剩余kmer利用skesa工具拼装成Contig。为了确保这些contig与应排除类群基因组具有足够高的差异性，使用MiniMap2将它们依次拼贴到应排除类群基因组上，只有满足每21个bp具备2个以上差异位点的contig部分才会被保留，否则会被过滤掉。最后保留的contig序列作为引物设计的模板。 [0055] 表1阿克曼菌株水平特异引物的包含和排除微生物类群 [0056] [0057] Primer3设计引物。在上述模板基础上，使用Primer3设计引物，约束参数为：长度250‑350p。所得引物使用RE‑PCR和MFEprimer工具进行特异性检测，目标为表格中“排除类群”的基因组。任何命中排除类群基因组的引物均需删除。使用MFEprimer工具排除存在二聚体和发夹结构的引物对。保留下来的引物进一步依据PRIMER_PAIR_PENALTY，PRIMER_LEFT_PENA LTY，PRIMER_RIGHT_PENALTY，PRIMER_LEFT_SELF_ANY_TH，PRIME R_RIGHT_SELF_ANY_TH，PRIMER_LEFT_SELF_END_TH，PRIMER_RIGHT_SELF_END_TH，PRIMER_LEFT_HAIRPIN_TH，PRIMER_RIGHT_HAIRPIN_TH，PRIMER_LEFT_END_STABILITY，PRIMER_RIGHT_END_STABILITY，PRIMER_LEFT_TEMPLATE_MISPRIMING，PRIMER_RIGHT_TEMPLATE_ MISPRIMING，PRIMER_PAIR_COMPL_ANY_TH，PRIMER_PAIR_COMPL_END_TH各项由低进行筛选排序，取排名居前的若干引物用于验证。 [0058] 广西阿克曼菌的两个株型的特异引物见表2和表3。 [0059] 表2广西阿克曼菌N21116菌株水平特异引物 [0060] [0061] [0062] 表3广西阿克曼菌N21169菌株水平特异引物 [0063] [0064] 取广西阿克曼菌(A.guangxiensis)N21116)和广西阿克曼菌(A.guangxiensis)N21169)菌株的甘油保存菌液，在BHI黏蛋白固体培养基划线，37℃培养过夜，活化三轮后，接入BHI黏蛋白液体培养基，37℃培养过夜，取1ml菌液用于DNA提取。DNA提取采用天根细菌基因组DNA抽提试剂盒。DNA经琼脂糖凝胶电泳检测，Nanodrop2000用量后，用作PCR体系模板。 [0065] PCR体系如下：2×PCR缓冲液25μl、模板DNA(10ng/μl)1μl、正向引物(10mM)1μl、反向引物(10mM)1μl、无菌水22μl。扩增条件为：95℃2min；95℃30s，52℃30s，72℃30s，30个循环；72℃10min。 [0066] 扩增产物取5μl进行琼脂糖凝胶电泳。 [0067] 验证结果如图1。由图1可见，AguN21116_1‑AguN21116_4和AguN21169_1‑AguN21169_3引物对于本物种来说均呈现阳性，且条带清晰无杂带，结果清晰，具有良好的特异性。AguN21116_5和AguN21169_4‑AguN21169_5引物对于本物种来说均呈现阴性，可排除。 [0068] 实施例2 [0069] 广西阿克曼菌属内株水平的引物对灵敏度检测 [0070] 取广西阿克曼菌(A.guangxiensis)N21116和广西阿克曼菌(A.guangxiensis)菌株N21169的模板DNA(20ng/ml)，分别稀释10倍(D10)，50倍(D50)和100倍(D100)，验证AguN21116_1‑AguN21116_4和AguN21169_1‑AguN21169_3引物对的灵敏度。 [0071] PCR检测方法同实施例1。 [0072] 扩增产物取5μl进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图2。由图2可见，基于不同浓度的排查，AguN21116_1和AguN21169_1引物对于本物种来说均呈现阳性条带更清晰明亮，具有良好的特异性和灵敏度。其中，AguN21116_1的检测灵敏阈值低于0.2ng/ml基因组DNA，AguN21169_1的检测灵敏阈值低于0.2ng/ml基因组DNA。 [0073] 实施例3 [0074] 广西阿克曼菌的株型特异性检测 [0075] 选取包含不同阿克曼菌在内的未标记菌株进行盲测，从中筛选出广西阿克曼菌N21116和N21169。(1)嗜黏蛋白阿克曼菌(A.muciniphila)；(2)嗜糖阿克曼菌(A.glycaniphila)(3)琵琶湖阿克曼菌(A.biwaensis)；(4)广西阿克曼菌N21116；(5)广西阿克曼菌N21169。 [0076] PCR检测方法同实施例1。 [0077] 扩增产物取5μl进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图3。由图3可知，使用两个株型的特异检测引物对(AguN21116_1和AguN21169_1)可以有效区分该菌属内的两个株型。与此同时，保持了对阿克曼菌属内其他成员不具有扩增能力。因此，AguN21116_1和AguN21169_1可作为两种广西阿克曼菌的特异性引物，可应用在株型鉴定和污染排查方面。 [0078] 实施例4 [0079] 广西阿克曼菌的株型污染排查 [0080] 实验室或发酵工厂的污染物来源有两类，一类是气生或土壤生天然污染菌(如醋酸杆菌)，一类是实验和生产中发生的交叉污染(如各种益生菌)。为了排查污染，设置以恶臭假单胞菌、大肠杆菌为代表的gamma‑变形菌门及alpha‑变形菌门、以纹膜醋酸杆菌为代表的变形菌门污染源混合培养物；以枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌(或芽孢杆菌)为代表的厚壁菌门混合培养物；以动物双歧杆菌、短双歧杆菌为代表的放线菌门混合培养物；以脆弱拟杆菌为代表的拟杆菌门混合培养物作为排查对象，这几个微生物分类已有通用引物，具体为拟杆菌门特异引物： [0081] CFBssf：CCGGAWTYATGGGTTIAAAGG(SEQ ID NO:23)； [0082] CFB968r：GGTAAGGTICCTCGCGTA(SEQ ID NO:24)； [0083] 厚壁菌门特异引物928F‑Firm‑TGAAACTYAAGGAATTGACG(SEQ ID NO:25)，1040FirmR‑ACCATGCACCACCTGTC(SEQ ID NO:26)； [0084] 放线菌门特异引物： [0085] S‑P‑Acti‑0927‑a‑S‑17：GGRCCCGCACAAGCGGC(SEQ ID NO:27)，S‑P‑Acti‑4339‑a‑A‑18：TCWGCGATTACTAGCGAC(SEQ ID NO:28)； [0086] Alpha变形菌门：Alf28f：ARCGAACGCTGGCGGCA(SEQ ID NO:29)；Al684r：TACGAATTTYACCTCTACA(SEQ ID NO:30)； [0087] gamma变形菌门：Gamma395f：CMATGCCGCGTGTGTGAA(SEQ ID NO:31)；Gamma871：ACTCCCCAGGCGGTCDACTTA(SEQ ID NO:32)。 [0088] 如实施例1记载的方法培养阿克曼菌，使用酸杆菌培养基培养醋酸杆菌、纹膜醋杆菌，使用LB培养基培养恶臭假单胞菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌，使用GAM培养基培养脆弱拟杆菌，使用MRS培养基培养植物乳杆菌，使用BBL培养基培养动物双歧杆菌和短双歧杆菌。设置单一污染微生物样本(包含alpha‑变形菌门和gamma‑变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门和放线菌门)，具体为菌株N21116与单一污染微生物按照活菌数10:1的比例复配得到的样本1以及菌株N21169与单一污染微生物按照活菌数10:1的比例复配得到的样本2。 [0089] 将上述三类样本采用试剂盒法分别提取DNA。PCR检测方法同实施例1。分别取5μl扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图4。 [0090] 阳性对照组显示，污染物特异引物均可特异扩增。引物对AguN21116_1和AguN21169_1对引物分别对alpha‑和gamma‑变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门和放线菌门无扩增，表明该样品未被以上微生物类群污染。结合以上结论，可以对培养物的污染情况进行综合判断，且成本低、用时少，是一种良好的污染控制手段。 [0091] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。