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一种同时检测七种益生菌的多重PCR引物组合和试剂盒及其应用、检测方法
申请号	CN202311483809.X	申请日	2023-11-09	公开(公告)号	CN117701739A	公开(公告)日	2024-03-15
申请人	浙江方圆检测集团股份有限公司;			发明人	刘鹏鹏; 梁媛媛; 孙丽萍; 夏琪琪; 黄甜甜; 郑方媛; 盛华栋;
摘要	本发明公开了一种同时检测七种益生菌的多重PCR引物组合和试剂盒及其应用、检测方法。所述多重PCR体系包括7组引物：针对鼠李糖乳杆菌dnaK基因的引物组、针对植物乳杆菌dnaK基因的引物组、针对嗜热链球菌recA基因的引物组、针对副干酪乳杆菌dnaK基因的引物组、针对青春双歧杆菌fusA基因的引物组、针对两歧双歧杆菌fusA基因的引物组和针对嗜酸乳杆菌fusA基因的引物组，其序列依次为SEQ ID No.1～14。本发明利用靶基因的特异性，所述引物组合仅对各自菌种的目的基因片段进行特异性扩增，不受其他菌种干扰，实现了在同一体系里鉴定7种常见益生菌的目的，提高了检测效率、节约了检测成本，适用于益生菌制品中益生菌成分的大规模快速检测。
权利要求	1.一种同时检测七种益生菌的多重PCR引物组合，其特征在于：所述引物组合包含针对鼠李糖乳杆菌dnaK基因、植物乳杆菌dnaK基因、嗜热链球菌recA基因、副干酪乳杆菌dnaK基因、青春双歧杆菌fusA基因、两歧双歧杆菌fusA基因和嗜酸乳杆菌fusA基因的引物；针对鼠李糖乳杆菌dnaK基因的扩增引物包括如SEQ ID No.1所示的Lrham_dnaK_F和如SEQ ID No.2所示的Lrham_dnaK_R；针对植物乳杆菌dnaK基因的扩增引物包括如SEQ ID No.3所示的Lplan_dnaK_F和如SEQ ID No.4所示的Lplan_dnaK_R；针对嗜热链球菌recA基因的扩增引物包括如SEQ ID No.5所示的Sth_recA_F和如SEQ ID No.6所示的Sth_recA_R；针对副干酪乳杆菌dnaK基因的扩增引物包括如SEQ ID No.7所示的Lpaca_dnaK_F和如SEQ ID No.8所示的Lpaca_dnaK_R；针对青春双歧杆菌fusA基因的扩增引物包括如SEQ ID No.9所示的Badol_fusA_F和如SEQ ID No.10所示的Badol_fusA_R；针对两歧双歧杆菌fusA基因的扩增引物包括如SEQ ID No.11所示的Bbifi_fusA_F和如SEQ ID No.12所示的Bbifi_fusA_R；针对嗜酸乳杆菌fusA基因的扩增引物包括如SEQ ID No.13所示的Lacid_fusA_F和如SEQ ID No.14所示的Lacid_fusA_R。 2.一种同时检测七种益生菌的多重PCR 试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求 1所述的引物组合。 3.如权利要求2所述的多重PCR试剂盒，其特征在于：包括反应液A、反应液B和高保真热启动酶；反应液A为2×PCR Master Mix，包含dNTP 0.4mM、Tris‑HCl pH8.3 20mM、MgCl2 4mM、KCl 100mM、BSA 1mg/mL、甘油1％v/v、PEG8000 2％v/v和二甲基亚砜2％v/v；反应液B为Primer Mix，包括七种益生菌的引物Lrham_dnaK_F/R、Lplan_dnaK_F/R、Sth_recA_F/R、Lpaca_dnaK_F/R、Badol_fusA_F/R、Bbifi_fusA_F/R、Lacid_fusA_F/R，各自浓度为0.7μM；高保真Taq酶为5U/μL。 4.如权利要求2所述的多重PCR试剂盒，其特征在于还包括阳性对照和阴性对照；所述阳性对照为根据鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌、嗜热链球菌、副干酪乳杆菌、青春双歧杆菌、两歧双歧杆菌和嗜酸乳杆菌目的基因片段构建的质粒按照1:1:1:1:1:1:2比例的混合物；所述阴性对照为DEPC水。 5.一种同时检测七种益生菌的多重PCR方法，其特征在于包括以下步骤： 1)提取待测样本的基因组DNA备用； 2)将待测样本的基因组DNA作为模板加入到多重PCR反应体系中进行PCR扩增，PCR反应体系包括如权利要求2‑4任一所述的PCR试剂盒； 3)设定PCR程序并进行扩增，将扩增产物用于1.5％琼脂糖凝胶电泳，通过电泳条带的大小分析判断是否存在上述七种益生菌。 6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中PCR反应体系具体包括反应液A 12.5μL，反应液B 7μL，高保真Taq酶0.5μL，加入10～200ng DNA作为模板，补水至25μL。 7.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中PCR程序为：95℃预变性5min； 95℃变性15s，60℃退火30s，72℃延伸60s，共35个循环；72℃最终延伸5min。 8.如权利要求5‑7任一所述的方法，其特征在于包含PCR阳性对照和阴性对照。 9.如权利要求1任一所述的引物组合以及权利要求2‑4任一所述的试剂盒在以下任意一种中的应用： (a)检测鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌、嗜热链球菌、副干酪乳杆菌、青春双歧杆菌、两歧双歧杆菌和嗜酸乳杆菌中至少一种益生菌； (b)制备用于(a)检测的试剂盒或产品。
说明书全文	一种同时检测七种益生菌的多重PCR引物组合和试剂盒及其应用、检测方法技术领域 [0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种同时检测七种益生菌的多重PCR引物组合和试剂盒及其应用、检测方法。背景技术 [0002] 益生菌是一类利用可发酵的碳水化合物产生大量乳酸的革兰氏阳性菌，从分类学上看，益生菌至少包含了乳杆菌属、链球菌属、双歧杆菌属、芽胞杆菌属等23个菌属。有关益生菌提高营养物质利用率、预防和治疗疾病、调节机体的免疫力、维持宿主健康等益生功能已有很多报道。除了用于生产发酵乳，益生菌也广泛应用在休闲零食、膳食补充剂、日化用品、口腔护理用品等多个产业领域。 [0003] 近年来市面上涌现出大量益生菌产品制品，由于受到研发技术和生产条件的限制，产品出现了质量参差不齐的状况，尤其是标签标示上问题较多。有的产品的标签标示信息与产品实际内容物不相符，有的产品所标识的菌种名称是厂家自行命名的，与卫生部门公布的可用于保健食品的益生菌菌种名单甚至国际标准数据库的菌种信息都无法对应，更谈不上溯源。迄今为止，我国尚未有一个有效的标准及方法用以准确、快速地、高通量地检测益生菌成分，这也就直接影响了该产业的健康发展。因此，建立一套可靠、快速、经济易行的益生菌检测和鉴定技术势在必行。 [0004] 早期关于益生菌的分类和鉴定多以生理生化表型为基础，但往往缺乏可靠性。目前国内出台的益生菌检测标准主要集中在常规PCR和实时荧光PCR技术，大多数标准检测方法只能进行单一菌种的鉴别。然而在样本实际检测过程中，对于深度加工、成分不明确的益生菌制品，需要通过多次检测才能确定，这就增加了样品检测周期、加大了检测工作量，因此很难在检测一线进行推广应用。多重PCR技术，是在普通单一体系PCR技术基础上开发的，利用引物组合的特异性，实现在同一体系内对多个靶标的定性检测。如果将该技术应用于复合益生菌制剂实际检测并开发成检测试剂盒，无论是在常规食品抽检，还是在应对大规模快速筛查，都将具有重要的现实意义。发明内容 [0005] 针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种同时检测七种益生菌的多重PCR引物组合和试剂盒及其应用、检测方法的技术方案。 [0006] 本发明具体采用以下技术方案： [0007] 本发明第一方面提供了同时检测七种益生菌的多重PCR引物组合，所述引物组合包含针对鼠李糖乳杆菌dnaK基因、植物乳杆菌dnaK基因、嗜热链球菌recA基因、副干酪乳杆菌dnaK基因、青春双歧杆菌fusA基因、两歧双歧杆菌fusA基因和嗜酸乳杆菌fusA基因的引物； [0008] 针对鼠李糖乳杆菌dnaK基因的扩增引物包括如SEQ ID No.1所示的Lrham_dnaK_F和如SEQ ID No.2所示的Lrham_dnaK_R； [0009] SEQ ID No.1：Lrham_dnaK_F 5’‑GTCCGCAGCAGTTGAGAATACCTG‑3’； [0010] SEQ ID No.2：Lrham_dnaK_R 5’‑CGACAGTCAGCGTCAGGCAACC‑3’； [0011] 针对植物乳杆菌dnaK基因的扩增引物包括如SEQ ID No.3所示的Lplan_dnaK_F和如SEQ ID No.4所示的Lplan_dnaK_R； [0012] SEQ ID No.3：Lplan_dnaK_F 5’‑GCGACCTAACGTCTTGTTATCCGCTG‑3’； [0013] SEQ ID No.4：Lplan_dnaK_R 5’‑GTTGATGGCTTTAAAGCTGACAACGGTG‑3’； [0014] 针对嗜热链球菌recA基因的扩增引物包括如SEQ ID No.5所示的Sth_recA_F和如SEQ ID No.6所示的Sth_recA_R； [0015] SEQ ID No.5：Sth_recA_F 5’‑AGCTTCTTTTGTCGCAGCCTGATTC‑3’； [0016] SEQ ID No.6：Sth_recA_R 5’‑GGCTTTCTGAATAATGCCTATATCACTTG‑3’； [0017] 针对副干酪乳杆菌dnaK基因的扩增引物包括如SEQ ID No.7所示的Lpaca_dnaK_F和如SEQ ID No.8所示的Lpaca_dnaK_R； [0018] SEQ ID No.7：Lpaca_dnaK_F 5’‑AAGTACGTGGATATCAACGGCTGGTTG‑3’； [0019] SEQ ID No.8：Lpaca_dnaK_R 5’‑ATCCCAGTCGAAAATGCTTTGAAGGATG‑3’； [0020] 针对青春双歧杆菌fusA基因的扩增引物包括如SEQ ID No.9所示的Badol_fusA_F和如SEQ ID No.10所示的Badol_fusA_R； [0021] SEQ ID No.9：Badol_fusA_F 5’‑GACCCATGACGAGAAGCAGA‑3’； [0022] SEQ ID No.10：Badol_fusA_R 5’‑GGTCGCGCCCAGCTTGGT‑3’； [0023] 针对两歧双歧杆菌fusA基因的扩增引物包括如SEQ ID No.11所示的Bbifi_fusA_F和如SEQ ID No.12所示的Bbifi_fusA_R； [0024] SEQ ID No.11：Bbifi_fusA_F 5’‑GGTGCAGACCATCAAGGACAAGCTC‑3’； [0025] SEQ ID No.12：Bbifi_fusA_R 5’‑GTCGTCCAGCAGCTGAGCGC‑3’； [0026] 针对嗜酸乳杆菌fusA基因的扩增引物包括如SEQ ID No.13所示的Lacid_fusA_F和如SEQ ID No.14所示的Lacid_fusA_R； [0027] SEQ ID No.13：Lacid_fusA_F 5’‑CAACATTATGGAAAAGTATCTTGGC‑3’； [0028] SEQ ID No.14：Lacid_fusA_R 5’‑CGTATACTGGGAAGAATTCCAAGTTC‑3’。 [0029] 本发明第二方面提供了一种同时检测七种益生菌的多重PCR试剂盒，所述试剂盒包括上述的引物组合。 [0030] 进一步，所述的PCR试剂盒包括反应液A、反应液B和高保真热启动酶；反应液A为2×PCR Master Mix，包含dNTP 0.4mM、Tris‑HCl pH8.3 20mM、MgCl2 4mM、KCl 100mM、BSA 1mg/mL、甘油1％v/v、PEG8000 2％v/v和二甲基亚砜2％v/v；反应液B为Primer Mix，包括七种益生菌的引物Lrham_dnaK_F/R、Lplan_dnaK_F/R、Sth_recA_F/R、Lpaca_dnaK_F/R、Badol_fusA_F/R、Bbifi_fusA_F/R、Lacid_fusA_F/R，各自浓度为0.7μM；高保真Taq酶为5U/μL。 [0031] 进一步，所述的PCR试剂盒还包括阳性对照和阴性对照；所述阳性对照为根据鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌、嗜热链球菌、副干酪乳杆菌、青春双歧杆菌、两歧双歧杆菌和嗜酸乳杆菌目的基因片段构建的质粒按照1:1:1:1:1:1:2比例的混合物；所述阴性对照为DEPC水。 [0032] 本发明第三方面提供了一种同时检测七种益生菌的多重PCR检测方法，其包括以下步骤： [0033] 1)提取待测样本的基因组DNA备用； [0034] 2)将待测样本的基因组DNA作为模板加入到多重PCR反应体系中进行扩增，多重PCR反应体系包括上述的PCR试剂盒； [0035] 3)设定PCR程序并进行扩增。将扩增产物用于1.5％琼脂糖凝胶电泳，通过电泳条带的大小分析判断是否存在上述七种益生菌。 [0036] 进一步的，所述步骤2)中PCR反应体系具体包括反应液A 12.5μL，反应液B 7μL，高保真Taq酶0.5μL，加入10～200ng DNA作为模板，补水至25μL； [0037] 进一步的，所述步骤3)中PCR程序为95℃预变性5min；95℃变性15s，60℃退火30s，72℃延伸60s，共35个循环；72℃最终延伸5min。 [0038] 进一步的，所述步骤2)中PCR反应体系还包含PCR阳性对照和阴性对照。 [0039] 本发明第四方面提供了上述七种益生菌引物组以及上述试剂盒在以下任意一种应用： [0040] (a)检测鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌、嗜热链球菌、副干酪乳杆菌、青春双歧杆菌、两歧双歧杆菌和嗜酸乳杆菌中至少一种益生菌； [0041] (b)制备用于(a)检测的试剂盒或产品。 [0042] 与现有技术相比，本发明的有益效果是： [0043] (1)本发明的多重PCR引物探针组合具有很高的特异性，仅对各自菌种的目标片段进行特异性扩增。同时，使用本发明的多重PCR检测方法可以一次性检测鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌、嗜热链球菌、副干酪乳杆菌、青春双歧杆菌、两歧双歧杆菌、嗜酸乳杆菌等七个菌种，提高了检测效率、降低了检测成本； [0044] (2)本发明所涉及的试剂盒及使用方法能快速对鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌、嗜热链球菌、副干酪乳杆菌、青春双歧杆菌、两歧双歧杆菌、嗜酸乳杆菌等七个益生菌菌种进行鉴定，优化了PCR反应体系及程序，特别适用于益生菌产品制品大规模筛查和快速检测。 [0045] (3)本发明试剂盒组分和配比合理，具体成本低廉、操作简单、使用方便等优点。附图说明 [0046] 图1为多重PCR反应体系的建立； [0047] 图2为多重PCR特异性试验； [0048] 图3为多重PCR灵敏度试验。具体实施方式 [0049] 为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内；以下实施例中采用的材料不限于上述列举，可用其他同类材料替代，仪器未注明具体条件的，按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件；除非特别说明，本发明采用的试剂和方法为本技术领域常规试剂和常规方法。 [0050] 实施例1：特异性引物的设计 [0051] 在NCBI(National Center for Biotechnology Information，美国国家生物技术信息中心)网站上，检索并下载常见益生菌菌种的dnaK、recA、fusA等基因的编码序列，使用Vector NTI 软件对种及相似种的基因序列进行比对分析。最终，以鼠李糖乳杆菌dnaK基因(HM124880.1)、植物乳杆菌dnaK基因(JQ900768.1)、嗜热链球菌recA基因(KF796351.1)、副干酪乳杆菌dnaK基因(HM122252.1)、青春双歧杆菌fusA基因(AB845877.1)、两歧双歧杆菌fusA基因(AB846016.1)和嗜酸乳杆菌fusA基因(KF316867.1)为模板设计菌种特异性引物，并使用BLAST工具搜索确认特异性。在满足引物设计原则的前提下，确保扩增片段之间有100bp左右的长度差以确保良好的电泳分离效果。经过一系列前期筛选，特异性引物如下表所示： [0052] [0053] 实施例2：多重PCR方法的建立 [0054] 1)从中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)购买本实验所用的标准菌株，培养并进行细菌基因组DNA的提取(细菌基因组DNA提取试剂盒或者公认的、具有相同效力的其他提取方法)，‑20℃保存备用。 [0055] 2)多重PCR反应体系总体积25μL，配置方法如下：反应液A12.5μL，反应液B 7μL，高保真Taq酶0.5μL，加入DNA1μL作为模板，补水至25μL。PCR程序为95℃预变性5min；95℃变性15s，56℃～62℃退火30s，72℃延伸60s，共35个循环；72℃最终延伸5min。 [0056] 3)mPCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图1所示。退火温度分别设为56℃、58℃、60℃、62℃，其中退火温度范围60～62℃扩增条带特异性较好，且条带大小符合预期。 [0057] 实施例3：多重PCR反应体系特异性试验 [0058] 为了验证本发明所构建的多重PCR检测体系的特异性，提取鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌、嗜热链球菌、副干酪乳杆菌、青春双歧杆菌、两歧双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、长双歧杆菌和大肠杆菌的细菌基因组DNA，作为mPCR反应模板对构建的多重PCR检测体系进行特异性验证。按照实施例2建立的试剂盒和方法配置反应体系并进行PCR扩增，其中退火温度设置为60℃。 [0059] 多重PCR反应体系特异性试验结果如图2所示。(M)DL1000 DNA Marker；(B)空白对照；(1～7)mPCR模板分别为鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌、嗜热链球菌、副干酪乳杆菌、青春双歧杆菌、两歧双歧杆菌和嗜酸乳杆菌；(8)七重mPCR(mPCR模板包含鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌、嗜热链球菌、副干酪乳杆菌、青春双歧杆菌、两歧双歧杆菌和嗜酸乳杆菌)；(9～11)mPCR模板分别为干酪乳杆菌、长双歧杆菌和大肠杆菌。该结果表明本发明的多重荧光定量PCR检测体系具有较高的特异性。 [0060] 实施例4：多重PCR反应体系灵敏度试验 [0061] 为了验证本发明所构建的多重PCR检测体系的灵敏度，将细菌基因组DNA进行10倍1 0 ‑1 ‑2 ‑3 ‑4 ‑5 梯度稀释，使得DNA浓度梯度为10 、10、10 、10 、10 、10 、10 ng/μL并按照实施例2建立的试剂盒和方法进行mPCR扩增，其中退火温度设置为60℃。 [0062] mPCR反应体系灵敏度试验结果如图3所示。(M)DL1000 DNA Marker；(B)空白对照。‑3 结果显示七种益生菌的检测灵敏度均达到10 ng/μL，其中嗜热链球菌、青春双歧杆菌、两歧‑4 双歧杆菌和副干酪乳杆菌的检测灵敏度可达到10 ng/μL。 [0063] 以上实施例显示和描述了本发明的基本原理和特征，结果表明本发明的试剂盒具有准确性好、灵敏度高的特点，适合用于益生菌制品中鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌、嗜热链球菌、副干酪乳杆菌、青春双歧杆菌、两歧双歧杆菌和嗜酸乳杆菌的同时检测。