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用于检测阴道微生物的装置及方法
申请号	CN202011491851.2	申请日	2020-12-16	公开(公告)号	CN112574872B	公开(公告)日	2023-05-16
申请人	魏红;			发明人	魏红; 曹文明; 马军;
摘要	本发明公开用于检测阴道微生物的装置及方法。该装置包括基片和配套试剂，基片上设置加样孔、排出孔和多个液相小室，液相小室内壁分别固定针对多种不同阴道微生物的捕获探针。配套试剂包括第一缓冲液、清洗液、第二缓冲液和针对不同微生物的引物组。本发明的方法具备同时检测多种阴道微生物菌群的优势，检测方法灵敏度高，菌株之间无交叉反应，特异性好，在阴道微生物检测及临床应用中均有良好的应用前景。
权利要求	1.一种用于通过一次性加样同时检测多种阴道微生物的微流控装置，其特征在于，包括基片和配套试剂，其中：所述基片包括微流路系统、负压排气系统和在所述基片上设置加样孔、排出孔和多个液相小室，所述微流路系统包括流入通路和流出通路，所述负压排气系统设置为控制微管道内微量液体流动，直至充满整个液相小室，所述多个液相小室设置为使样本或试剂能够通过所述流入通路进入各个液相小室，并能够通过所述流出通路流出各个液相小室，每个液相小室采用菱多边形，底部采用锥形结构，从而有利于恒温扩增的温度均衡控制和防止因液体渗漏导致检测污染，各液相小室的内壁分别固定针对多种不同微生物的捕获探针；所述配套试剂包括第一缓冲液、清洗液、第二缓冲液和针对不同微生物的引物组，其中针对同一微生物的捕获探针与其对应的引物组具有不同的结合区，且捕获探针的Tm值低于引物组中各引物的Tm值，所述捕获探针的序列如SEQ ID NO:1‑8所示，所述引物组中引物的序列如SEQID NO:9‑40所示；所述第一缓冲液包含柠檬酸钠缓冲液、0.2‑0.8 M甜菜碱、1.5‑2.5M四甲基氯化铵、4‑ 6%重量/体积比的硫酸葡聚糖和10‑30体积%的甲酰胺，所述第二缓冲液包含Tris‑HCl、KCl、(NH4)2SO4、MgSO4、Tween‑20、Trion X‑100和dNTPs；所述多种微生物包括淋病奈瑟菌、阴道加德纳菌、肠球菌、生殖道支原体、沙眼衣原体、疱疹病毒、人类细小病毒和白色念珠菌。 2.根据权利要求1所述的微流控装置，其特征在于，所述多个液相小室通过通路分别与同一加样孔连通，从而能够通过一次加样使样本进入各个液相小室。 3.根据权利要求1所述的微流控装置，其特征在于，所述配套试剂进一步包括dNTPs和聚合酶。 4. 根据权利要求1所述的微流控装置，其特征在于，所述清洗液包含3 M NaCl、10 mMTris‑HCl pH 7.5、1 mM EDTA和0.1% Tween‑20。 5.根据权利要求1所述的微流控装置，其特征在于，所述第二缓冲液进一步包含Bst聚合酶。 6.根据权利要求1所述的微流控装置，其特征在于，所述引物组包含外引物对、内引物对和环引物。
说明书全文	用于检测阴道微生物的装置及方法技术领域 [0001] 本发明涉及微生物的检测，具体地涉及用于检测阴道微生物的装置及方法。背景技术 [0002] 1998年Burns等提出微流控技术的“芯片实验室”(lab on a chip,LOC)的概念，即把生物、化学、医学等领域分析样品的过程，包括制备、反应、分离、检测等基本单元集成到一块微米尺度的芯片上，自动完成分析全过程的检测。由于芯片尺寸、形式，反应孔位置等各不相同，一般均需要配备专用微阵列芯片检测仪器。目前，微流控技术属于检验技术发展的前沿方向之一，在临床POCT检测、精准医疗的等方向具有良好前景，主要在临床检测领域的核酸检测、免疫测定、耐药性检测，以及部分公共安全快速检测领域获得应用。国内微流控技术应用比较成熟方向包括微流控核酸检测和微流控免疫检测，其中微流控核酸检测产品主要集中在遗传性疾病，传染性疾病以及精准医疗检测等方向。微流控免疫检测主要产品集中在炎症标志物，心脑血管疾病标志物等方向。 [0003] 阴道炎是由致病性病原体引起，常见的阴道炎有细菌性阴道炎、病毒性阴道炎、真菌性阴道炎和非特异性阴道炎，分别由淋病奈瑟菌、阴道加德纳菌、肠球菌、生殖道支原体、沙眼衣原体、疱疹病毒、人类细小病毒、白色念珠菌、梅毒螺旋体等感染所致。根据检验结果，判断感染性质，由金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肠球菌、厌氧菌等所致阴道炎属非传染性；由梅毒螺旋体、淋病奈瑟菌、疱疹病毒、人乳头瘤病毒、解脲脲原体、沙眼衣原体、念珠菌、滴虫等引起的属性传播性疾病，有一定的传染性。阴道分泌物微生物学检查可检出阴道炎等疾病的病原菌，结合阴道分泌物的物理学及清洁度检查等可进行明确的病因诊断，并为临床治疗及其同其他非感染性疾病提供鉴别诊断依据。微生物培养后和进行药敏试验，选择敏感药物进行治疗，可提高治疗效果。发明内容 [0004] 为解决现有技术中的至少部分技术问题，本发明提供一种用于检测阴道微生物的装置及方法，该装置采用可检测阴道微生物的捕获探针、引物组合以及特定的检测缓冲液，通过检测装置的多个液相小室从而实现多种阴道微生物检测，具体如下。 [0005] 本发明的第一方面，提供一种用于检测阴道微生物的装置，其至少包括基片和配套试剂，其中： [0006] 所述基片上设置加样孔、排出孔和多个液相小室，所述多个液相小室设置为使样本或试剂能够通过流入通路进入各个液相小室，并能够通过流出通路流出各个液相小室，各液相小室的内壁分别固定针对多种不同微生物的捕获探针； [0007] 所述配套试剂包括第一缓冲液、清洗液、第二缓冲液和针对不同微生物的引物组，其中针对同一微生物的捕获探针与其对应的引物组具有不同的结合区，且捕获探针的Tm值低于引物组中各引物的Tm值； [0008] 所述多种微生物包括淋病奈瑟菌、阴道加德纳菌、肠球菌、生殖道支原体、沙眼衣原体、疱疹病毒、人类细小病毒、白色念珠菌。 [0009] 根据本发明所述的用于检测阴道微生物的装置，优选地，所述多个液相小室通过通路分别与同一加样孔连通，从而能够通过一次加样使样本进入各个液相小室。 [0010] 根据本发明所述的用于检测阴道微生物的装置，优选地，所述第一缓冲液包含柠檬酸钠缓冲液、0.2‑0.8M甜菜碱、1.5‑2.5M四甲基氯化铵、4‑6％重量/体积比的硫酸葡聚糖和10‑30体积％的甲酰胺。 [0011] 根据本发明所述的用于检测阴道微生物的装置，优选地，所述清洗液包含3M NaCl、10mM Tris‑HCl pH 7.5、1mM EDTA和0.1％Tween‑20。 [0012] 根据本发明所述的用于检测阴道微生物的装置，优选地，所述第二缓冲液包含Tris‑HCl、KCl、(NH4)2SO4、MgSO4、Tween‑20、Trion X‑100和dNTPs中的一种或多种，进一步包含Bst聚合酶。 [0013] 根据本发明所述的用于检测阴道微生物的装置，优选地，所述捕获探针的Tm值在55‑65℃范围内，所述引物组中各引物的Tm值在60‑70℃范围内。 [0014] 根据本发明所述的用于检测阴道微生物的装置，优选地，所述引物组包含外引物对、内引物对和环引物。 [0015] 本发明的第二方面，提供一种用于检测阴道微生物的方法，其包含使用根据第一方面所述的装置的步骤。 [0016] 根据本发明所述的用于检测阴道微生物的方法，优选地，所述方法至少包括以下步骤： [0017] (1)使核酸样本与第一缓冲液分别或同时经加样孔经流入通路进入各液相小室，并于92‑98℃下处理2‑10分钟，然后降低温度至55‑65℃进行捕获30‑60分钟； [0018] (2)使预热至55‑65℃的清洗液经加样孔和流入通路进入各液相小室替换第一缓冲液； [0019] (3)使所述引物组、反应酶与所述第二缓冲液混合得到反应液，并经加样孔和流入通进入各液相小室，控制温度65‑70℃并保持20‑40分钟。 [0020] 根据本发明所述的用于检测阴道微生物的方法，优选地，所述反应液进一步包含荧光染料。 [0021] 本发明的装置只需通过一次性加样即可同时检测多种阴道不同微生物，并且检测灵敏度高，无交叉反应，特异性好。另外，本发明的装置检测时需样量少，适于将装置进一步小型化。在临床应用中具有良好的应用前景。附图说明 [0022] 图1为本发明一种实例性的微流控芯片结构示意图及图标记说明。具体实施方式 [0023] 现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。 [0024] 应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。 [0025] 除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。除非另有说明，否则“％”为基于重量的百分数。 [0026] [检测装置] [0027] 本发明的检测装置用于检测阴道微生物，其具有用于检测的微流控系统，因此，本发明也可以称为“用于检测阴道微生物的微流控系统及方法” [0028] 所述微生物包括淋病奈瑟菌、阴道加德纳菌、肠球菌、生殖道支原体、沙眼衣原体、疱疹病毒、人类细小病毒和白色念珠菌。在具体实施方案中，所述阴道微生物由淋病奈瑟菌、阴道加德纳菌、肠球菌、生殖道支原体、沙眼衣原体、疱疹病毒、人类细小病毒和白色念珠菌组成。 [0029] 本发明的检测装置至少包括基片和配套试剂，所述基片设计模式不特别限定，例如可采用“鱼骨刺”模式设计该基片，其包括：加样孔、排出孔和多个液相小室。其中，所述多个液相小室设置为使样本或试剂能够通过流入通路进入各个液相小室，并能够通过流出通路流出各个液相小室。流入/流出通路为具有连接管路作用的微管道，其用于连接加样孔与液相小室，并沿所述微管道输送液体，优选地，所述多个液相小室通过通路分别与同一加样孔连通，从而能够通过一次加样使样本进入各个液相小室。流入/流出通路的数量不特别限定。 [0030] 本发明的基片上可设置多个液相小室，例如2、4、6、8、10、20个。在某些实施方案中，本发明的基片设置10个液相小室。 [0031] 本发明装置中的各液相小室的内壁分别固定针对多种不同微生物的捕获探针。优选地，所述探针具有SEQ ID NO.:1‑8所示的序列。固定方式可根据本领域已知方法进行固定，并无特别限定。 [0032] 本发明的配套试剂是重要的，其包括第一缓冲液、清洗液、第二缓冲液和针对不同微生物的引物组，其中针对同一微生物的捕获探针与其对应的引物组具有不同的结合区，且捕获探针的Tm值低于引物组中各引物的Tm值。优选地，本发明的捕获探针的Tm值在55‑65℃范围内，所述引物组中各引物的Tm值在60‑70℃范围内。还优选地，捕获探针的Tm值在55‑60℃范围内，所述引物组中各引物的Tm值在65‑70℃。进一步优选地，捕获探针的Tm值在58‑ 60℃范围内，所述引物组中各引物的Tm值在66‑68℃。 [0033] 优选地，所述引物组具有SEQ ID NO.:9‑40所示的序列。 [0034] 优选地，所述第一缓冲液包含柠檬酸钠缓冲液、0.2‑0.8M甜菜碱、1.5‑2.5M四甲基氯化铵、4‑6％重量/体积比的硫酸葡聚糖和10‑30体积％的甲酰胺。本发明人通过大量实验得到上述第一缓冲液，其是针对本申请所述低Tm值捕获探针专门设计的缓冲体系，能够确保在较低温度(例如，55‑65℃，与一般捕获探针70℃左右的Tm值不同)下捕获探针能够与靶标有效地特异性结合。该缓冲液体系中甜菜碱与甲酰胺的浓度适于本申请探针的捕获以及后续扩增，并进一步影响检出率。更优选地，所述第一缓冲液包含0.3‑0.6M甜菜碱、1.9‑2.3M四甲基氯化铵、4‑5％重量/体积比的硫酸葡聚糖和15‑25体积％的甲酰胺。还优选地，所述第一缓冲液包含0.4‑0.6M甜菜碱、2.0‑2.2M四甲基氯化铵、4‑4.5％重量/体积比的硫酸葡聚糖和18‑21体积％的甲酰胺。 [0035] 优选地，本发明的多个液相小室密封设置，且探针固定于所述液相小室内，例如，液相小室的底部、侧部等，冻干后室温保存；所述引物溶解于预装缓冲液中，冻干后室温保存。 [0036] 优选地，所述多个液相小室各自分别采用多边形，底部采用锥形结构，从而有利于恒温扩增的温度均衡控制和防止因液体渗漏导致检测污染。 [0037] 优选地，进行检测的受试者的样品为受试者生殖道分泌物，样品需要提取核酸。核酸提取可使用本领域已知的方法进行，核酸提取方法可参考已知的教科书，例如冷泉港的《分子克隆实验指南》第四版等公开出版物等。 [0038] 本发明利用具有链置换功能的聚合酶在恒温条件下进行核酸扩增反应。优选地，所述具有链置换功能的聚合酶是指用于恒温扩增的具有链置换的活性(stand displacement activity)的DNA聚合酶，其催化双链DNA中的被切除的单链部分的置换。此类聚合酶可举例例如Bst、Phi29或exo‑Klenow。 [0039] [检测方法] [0040] 本发明还提供一种非诊断和治疗目的用于检测阴道微生物的方法，其包含使用根据第一方面所述的装置的步骤。 [0041] 优选地，所述方法包括以下步骤： [0042] (1)使核酸样本与第一缓冲液分别或同时经加样孔经流入通路进入各液相小室，并于92‑98℃下处理2‑10分钟，然后降低温度至55‑65℃进行捕获30‑60分钟。进一步优选地，95‑98℃下处理3‑8分钟，然后降低温度至57‑65℃，例如58℃、59℃进行捕获30‑60分钟，如40‑55分钟。 [0043] (2)使预热至55‑65℃的清洗液经加样孔和流入通路进入各液相小室替换第一缓冲液，以便清洗未结合的核酸和其他废液。 [0044] (3)使所述引物组、反应酶与所述第二缓冲液混合得到反应液，并经加样孔和流入通进入各液相小室，控制温度65‑70℃并保持20‑60分钟。进一步优选地，控制温度68‑70℃并保持30‑40分钟。 [0045] 实施例 [0046] 本实施例为检测阴道微生物的装置检测检测阴道微生物的步骤，主要包括检测基片的制备、杂交捕获、进行核酸恒温扩增反应等步骤，实现对阴道微生物检测。具体如下。 [0047] 1.检测基片的制备 [0048] 基于微流控核酸检测技术平台和微阵列芯片检测仪，采用“鱼骨刺”模式设计阴道微生物检测基片。图1实例性的示出一种检测基片，共设计10个液相小室200，同时完成不超过10个阴道微生物的特异性检测。采用微机电加工技术在基片上构建微流路系统300，通过负压排气系统400的气阀(图中未示出)控制微管道内微量液体流动，直至充满整个液相小室200，每个小室采用菱多边形，底部采用锥形结构，利于恒温扩增技术温度均衡控制和因液体渗漏导致检测污染。 [0049] 针对阴道微生物淋病奈瑟菌、阴道加德纳菌、肠球菌、生殖道支原体、沙眼衣原体、疱疹病毒、人类细小病毒、白色念珠菌8种阴道微生物特异性检测靶标设计特异性引物和探针，并将上述8种阴道微生物探针及阴阳性对照特异性探针分散固定在不同的检测小室内，冻干室温保存，完成阴道微生物的多项联合检测基片的制备。其中，探针的序列各自分别选自SEQ ID NO:1‑8所示的序列(见表1)。 [0050] 表1‑探针及序列 [0051] [0052] 引物序列各自分别选自SEQ ID NO:9‑41所示的序列(见表2)。 [0053] 表2‑引物及序列 [0054] [0055] [0056] 2.基片性能验证 [0057] 对上述基片灵敏度、特异性进行适用性验证，以验证其产品性能及阴道微生物检测的适用性。 [0058] 2.1捕获杂交体系配置 [0059] 第一缓冲液包含柠檬酸钠缓冲液、0.2‑0.8M甜菜碱、1.5‑2.5M四甲基氯化铵、4‑6％重量/体积比的硫酸葡聚糖和10‑30体积％的甲酰胺。 [0060] 表3‑捕获杂交体系 [0061] [0062] 捕获杂交40min后经清洗液除去未杂交的核酸以及废液。清洗液在60℃条件下预热30分钟后使用。 [0063] 清洗液体系：3M NaCl(100μL)、10mM Tris‑HCl pH 7.5(150μL)、1mM EDTA(200μL)和0.1％Tween‑20(100μL)。 [0064] 2.2反应体系配置 [0065] 根据每次检测样本数量，以1个样本的测试为例，从试剂盒中分别取出引物组合以及第二缓冲液冻干品，加20ul无菌水，使其充分溶解，依照表4使用量在无核酸酶离心管中配置反应体系。 [0066] 在标本制备区，加入8μL待检核酸样品(模板)，轻轻吹打使其混合均匀，瞬时离心至管底。每份核酸扩增反应体系总体积为80.5μL，具体反应体系配置如表4所示。 [0067] 表4‑恒温扩增反应体系配置(1个检测样本) [0068] [0069] 2.3加样 [0070] 在标本制备区，用移液器吸取80.5μL配制好的核酸扩增反应体系，从加样孔加入到芯片主通道中，缓慢加入，尽量避免气泡的产生，待其充满整张基片通道，并能感觉到明显加样阻力时即停止加样。压紧加样孔与出气孔的卡扣。 [0071] 2.3核酸扩增及分析 [0072] 使用RJ4500微阵列芯片检测仪进行扩增，反应程序为69℃、20min，检测结束后自动分析检测结果，或根据反应曲线微调基线水平达到最优检测结果。 [0073] 3.阴道微生物检测的检测装置性能验证 [0074] 使用淋病奈瑟菌、阴道加德纳菌、肠球菌、生殖道支原体、沙眼衣原体、疱疹病毒、7 6 人类细小病毒、白色念珠菌等8种标准微生物分别梯度稀释为10copies/ml、10copies/ml、 5 4 3 2 2 10copies/ml、10copies/ml、10 copies/ml、5×10copies/ml、10 copies/ml、50copies/ml、10copies/ml，采用热景生物全自动核酸提取试剂提取样本中的微生物基因组DNA，提取后的基因组DNA于‑75℃以下保存备用。 [0075] 参照“2.微流控芯片性能验证”进行反应体系配置和检测结果判定，检测仪器为RJ4500微阵列芯片检测仪，性能验证结果如下： [0076] 生殖道支原体的检测灵敏度为20.55copies/ul； [0077] 人类细小病毒的检测灵敏度为17.36copies/ul； [0078] 白色念珠菌的检测灵敏度为5.11copies/ul； [0079] 沙眼衣原体的检测灵敏度为7.43copies/ul； [0080] 疱疹病毒的检测灵敏度为2.96copies/ul； [0081] 阴道加德纳菌的检测灵敏度为3.57copies/ul； [0082] 肠球菌的检测灵敏度为6.35copies/ul； [0083] 淋病奈瑟菌的检测灵敏度为3.49copies/ul； [0084] 浓度为107copies/ml的阴道微生物之间无交叉反应，特异性良好。 [0085] 4.阴道微生物检测与临床符合率 [0086] 选取2018年‑2019年收集检测的50份临床样本，与医院检测结果相对比，本发明装置检测的整体符合率为100％。 [0087] 5.结论 [0088] 本发明的检测装置以及检测方法具备检测多种阴道微生物的优势，在阴道微生物检测及临床应用中均有良好的应用前景。 [0089] 比较例1 [0090] 与实施例相比，采用如下表所示的第一缓冲液配置体系，研究其对于杂交捕获以及后续扩增的影响，其包含柠檬酸钠缓冲液、0.5M甜菜碱、4％重量/体积比的硫酸葡聚糖和甲酰胺。 [0091] 结果发现，该配置体系可能使捕获杂交效率降低，最终导致29.2％检出率的下降。 [0092] 杂交缓冲液杂交时间甜菜碱四甲基氯化铵杂交反应液比较例1 40min 0.5M ‑ 1X SSC、0.5M甜菜碱、4％(w/v)硫酸葡聚糖 [0093] 比较例2 [0094] 与实施例相比，采用如下表所示的第一缓冲液配置体系，研究其对于杂交捕获以及后续扩增的影响，其包含柠檬酸钠缓冲液、2.1M四甲基氯化铵、4％重量/体积比的硫酸葡聚糖和甲酰胺。 [0095] 结果发现，该配置体系可能使捕获杂交效率降低，导致19.5％检出率的下降。 [0096] 杂交缓冲液杂交时间甜菜碱四甲基氯化铵杂交反应液比较例2 40min ‑ 2.1M 1X SSC、4％(w/v)硫酸葡聚糖、2.1M四甲基氯化铵 [0097] 比较例3 [0098] 与实施例相比，采用如下表所示的第一缓冲液配置体系，研究其对于杂交捕获以及后续扩增的影响，其包含常规捕获杂交缓冲液体系0.25M磷酸钠缓冲液、0.5％SDS(w/v)、1mM EDTA、1X SSC。 [0099] 结果发现，该配置体系并不适用于本发明的捕检测方法，最终导致27.3％检出率的下降。 [0100] 杂交缓冲液杂交时间甜菜碱四甲基氯化铵杂交反应液比较例3 40min ‑ ‑ 0.25M磷酸钠缓冲液、0.5％SDS(w/v)、1mM EDTA、1X SSC[0101] 尽管本发明已经参考示例性实施方案进行了描述，但应理解本发明不限于公开的示例性实施方案。在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的示例性实施方案做多种调整或变化。权利要求的范围应基于最宽的解释以涵盖所有修改和等同结构与功能。