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一种联合检测多种肺部感染真菌的引物组及试剂盒
申请号	CN202210093716.5	申请日	2022-01-26	公开(公告)号	CN114350846B	公开(公告)日	2024-03-15
申请人	重庆巴斯德生物医药科技有限公司;			发明人	张祥林; 张劲松; 侯艳雯; 魏鹏; 陈晨; 胡秋萍;
摘要	本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种联合检测多种肺部感染真菌的引物组及试剂盒，所述PCR引物组包括白色念珠菌检测引物对、热带念珠菌检测引物对、光滑念珠菌检测引物对、烟曲霉检测引物对、黄曲霉检测引物对、黑曲霉检测引物对、新型隐球菌检测引物对。所述试剂盒中包括多重PCR反应物，所述多重PCR反应物中包括所述PCR引物组。本发明的引物组和试剂盒利用多重PCR与毛细管片段分析法相结合，可以联合检测七种肺部感染真菌，该方法操作简单、检测准确、通量高、灵敏高、特异性高，显著缩短检测时间，可以实现2‑3小时内可出检测结果。
权利要求	1.一种联合检测多种肺部感染真菌的PCR引物组，其特征在于，所述PCR引物组包括白色念珠菌检测引物对、热带念珠菌检测引物对、光滑念珠菌检测引物对、烟曲霉检测引物对、黄曲霉检测引物对、黑曲霉检测引物对、新型隐球菌检测引物对； 1)白色念珠菌检测引物对：上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示； 2)热带念珠菌检测引物对：上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示； 3)光滑念珠菌检测引物对：上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示； 4)烟曲霉检测引物对：上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示； 5)黄曲霉检测引物对：上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示； 6)黑曲霉检测引物对：上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示； 7)新型隐球菌检测引物对：上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。 2.权利要求1所述的PCR引物组在制备检测白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉和新型隐球菌的试剂盒中的用途。 3.一种联合检测白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉和新型隐球菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括多重PCR反应物，所述多重PCR反应物中包括权利要求1所述的PCR引物组。 4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述多重PCR反应物中还包括Multiplex PCRMix和/或内参扩增引物对。 5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述内参扩增引物对包括核苷酸序列如SEQID NO.15所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示的下游引物。 6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，以所述多重PCR反应物的总体积为基准，每条引物的浓度为100nmol/L～300nmol/L。 7.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括样品基因组提取试剂、阳性质控品、阴性质控品中的任一项或多项。 8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性质控品为含各目标真菌特异核酸片段和人DNA内参特异核酸片段的pUC57质粒DNA，和/或，所述阴性质控品为TE缓冲液。 9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性质控品的核苷酸序列如SEQ ID NO.17～SEQ ID NO.23所示。
说明书全文	一种联合检测多种肺部感染真菌的引物组及试剂盒技术领域 [0001] 本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种联合检测多种肺部感染真菌的引物组及试剂盒。背景技术 [0002] 真菌在自然环境中广泛分布，也是人类皮肤、粘膜表面定植的常见菌，通过躲避人类免疫系统而与人类共生。然而，在免疫系统受损或宿主屏障破坏的情况下，真菌能够侵入人体，导致致死性感染。侵袭性肺部真菌感染(Invasive Pulmonary Fungal Infection，IPFI)是不包括真菌寄生和过敏性所致的支气管肺部真菌感染，分为原发性和继发性两种类型。近年来，随着人口老龄化﹑器官移植免疫抑制剂的使用、肿瘤放化疗、造血干细胞移植、超广谱抗生素和多种抗生素联合应用、皮质类固醇激素的使用以及各种导管介入治疗等，使侵袭性肺部真菌感染的发病率呈现逐渐上升的趋势。引起侵袭性肺部真菌感染常见的真菌主要是念珠菌属、曲霉属、隐球菌属、接合菌属(主要是毛霉)和肺孢子菌等。由于肺部真菌感染临床表现常无特异性，早期诊断困难，且病情易被基础病掩盖，造成误诊、漏诊而延误治疗。正确、及时诊断肺部真菌感染依赖于实验室精准的检测结果。 [0003] 肺部真菌感染的常见实验室检测方法包括：直接显微镜检查、组织病理学检查、真菌培养、血清学检测(1,3‑β‑D葡聚糖检测、半乳甘露聚糖检测、隐球菌荚膜多糖抗原检测、曲霉菌抗体等)、影像学检查和基于核酸检测的分子生物学方法等。目前，组织病理检查依然是诊断真菌感染的“金标准”。但由于其为有创性操作，患者难以忍受。其结果受限于取材的准确性，阳性率低。诊断结果经过一系列实验过程，耗时较长，不利于早期诊断。直接显微镜检查是最经典的方法，具有快速、简便的特点，但是阳性率较低。传统的真菌培养方法需要至少3‑5天，甚至需要更长的时间，且敏感性较低，不利于早期诊断。抗原检测特异度较好，但灵敏度较低，常有假阴性。抗体检测对于侵袭性肺部真菌感染早期诊断意义有限。以荧光定量PCR技术为代表的分子生物学方法，已逐步成为侵袭性肺部真菌感染诊断的重要方法。尽管荧光定量PCR具有高特异性、敏感性和时效性，但也存在如下缺点：(1)通量低：受限于荧光通道，单管仅能检测3种真菌；(2)成本高：多种真菌同时检测，成本较高。发明内容 [0004] 鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种联合检测多种肺部感染真菌的引物组及试剂盒，用于解决现有技术中的问题。 [0005] 为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种联合检测多种肺部感染真菌的PCR引物组，所述PCR引物组包括白色念珠菌检测引物对、热带念珠菌检测引物对、光滑念珠菌检测引物对、烟曲霉检测引物对、黄曲霉检测引物对、黑曲霉检测引物对、新型隐球菌检测引物对。 [0006] 优选的，所述PCR引物组还包括以下特征： [0007] 1)白色念珠菌检测引物对：包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的下游引物； [0008] 2)热带念珠菌检测引物对：包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的下游引物； [0009] 3)光滑念珠菌检测引物对：包括核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的下游引物； [0010] 4)烟曲霉检测引物对：包括核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的下游引物； [0011] 5)黄曲霉检测引物对：包括核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示的下游引物； [0012] 6)黑曲霉检测引物对：包括核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示的下游引物； [0013] 7)新型隐球菌检测引物对：包括核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示的下游引物。 [0014] 本发明还提供所述PCR引物组在制备检测白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉和新型隐球菌的试剂盒中的用途。 [0015] 本发明还提供一种联合检测白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉和新型隐球菌的试剂盒，所述试剂盒中包括多重PCR反应物，所述多重PCR反应物中包括所述PCR引物组。 [0016] 如上所述，本发明的一种联合检测多种肺部感染真菌的引物组及试剂盒，具有以下有益效果：可以联合检测或鉴定七种肺部感染真菌，该方法操作简单、检测准确、通量高、灵敏高、特异性高，显著缩短检测时间，可以实现2‑3小时内可出检测结果。人DNA内参可以确保从核酸提取、PCR扩增的检测过程中对核酸质量进行质控，避免因核酸提取质量、PCR扩增的问题导致假阴性的问题。多重PCR与毛细管片段分析法相结合，可以实现单管检测多种肺部感染真菌，保证检测的通量且成本较低，适合疾控中心、医院及其它医疗机构使用。附图说明 [0017] 图1为本发明实施例2中的白色念珠菌的毛细管电泳分离结果图。 [0018] 图2为本发明实施例2中的新型隐球菌的毛细管电泳分离结果图。 [0019] 图3为本发明实施例2中的阳性质控品的毛细管电泳分离结果图。 [0020] 图4为本发明实施例3特异性分析结果。 [0021] 图5为本发明对比例2中引物对1的扩增效果。 [0022] 图6为本发明对比例2中引物对2的扩增效果。 [0023] 图7为本发明对比例2中引物对3的扩增效果。具体实施方式 [0024] 本发明提供一种检测肺部感染真菌的PCR引物组，所述PCR引物组包括以下引物对： [0025] 1)白色念珠菌检测引物对：包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的下游引物； [0026] 2)热带念珠菌检测引物对：包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的下游引物； [0027] 3)光滑念珠菌检测引物对：包括核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的下游引物； [0028] 4)烟曲霉检测引物对：包括核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的下游引物； [0029] 5)黄曲霉检测引物对：包括核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示的下游引物； [0030] 6)黑曲霉检测引物对：包括核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示的下游引物； [0031] 7)新型隐球菌检测引物对：包括核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示的下游引物。 [0032] 本发明中，所述新型隐球菌选自新型隐球菌新生变种和/或新型隐球菌格特变种。新型隐球菌是一种带夹膜的酵母菌，根据其荚膜上的多糖分为A、B、C、D四个血清型，分别对应新型隐球菌的格鲁比变种(A)、格特变种(B和C)和新生变种(D)。 [0033] 对于上述的引物对具有的具体碱基序列而言，只要能够在PCR实施条件下特异性地识别各自的特异性识别区域(优选在单一的反应容器内使用的引物之间不发生退火及自退火)，则可以使1个或多个碱基替换为其他碱基，也可在3’端或5’端添加1个或多个碱基。此处，所谓多个，例如为2～3个。向引物添加1个或多个碱基的情况下，优选向引物的5’端添加。 [0034] 将上述的引物对具体的碱基序列中的1个或多个碱基取代为其他碱基而得到的碱基序列、与被取代前的碱基序列(即，序列号所示碱基序列)的同一性优选为70％以上，更优选为75％以上，更优选为80％以上，更优选为85％以上，更优选为90％以上，更优选为95％以上均可。 [0035] 对于各引物的长度而言，只要能够特异性地识别对应的特异性识别区域、且引物之间不发生杂交即可，没有特别限制，优选为15个碱基以上且40个碱基以下。更优选的是，引物的长度的下限为16个碱基以上，进一步优选为17个碱基以上，进一步优选为18个碱基以上。更优选的是，引物的长度的上限为39个碱基以下，进一步优选为38个碱基以下，进一步优选为37个碱基以下。 [0036] 所述PCR引物组为多重PCR引物组。各检测引物对可单独包装，也可以混合配成多重PCR混合液。所述多重PCR检测混合液中，上述各引物对的量采用本领域技术人员所知悉的常规用量即可。 [0037] 本发明还提供所述PCR引物组在制备检测白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉和新型隐球菌的试剂盒中的用途。 [0038] 进一步的，所述用途为在制备联合检测白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉和新型隐球菌的试剂盒中的用途。 [0039] 更进一步的，所述用途为在制备联合检测肺部感染白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉和新型隐球菌的试剂盒中的用途。 [0040] 本发明还提供一种联合检测白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉和新型隐球菌的试剂盒，所述试剂盒中包括多重PCR反应物，所述多重PCR反应物中包括所述PCR引物组。 [0041] 本发明的试剂盒采用多重PCR技术在单管中同时进行前述七种肺部感染真菌的检测，根据扩增及检测情况可分析判断白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉以及新型隐球菌(新生变种/格特变种)感染情况。引物的设计是本发明试剂盒的关键。 [0042] 所述多重PCR反应物中还可以包括其他一些PCR所需要的常规试剂，例如：Multi DNA Polymerase。由于此类PCR常用试剂可经市场途径单独购得或者自行配置，因此具体需要将哪些试剂装配入试剂盒，可以根据用户实际需要配置，为方便起见，也可全部装配入试剂盒。 [0043] 进一步地，所述多重PCR反应物中还包括内参扩增引物对。在一种实施方式中，所述内参扩增引物对为人DNA内参扩增引物对。所述人DNA内参扩增引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示的下游引物。 [0044] 所述多重PCR反应物可自行配置，也可直接以市售的不含引物的通用PCR反应液与所述引物组混合后获得。例如，所述通用PCR反应液可以是在苏州近岸蛋白质科技股份有限公司的Multiplex PCR Mix(UDG)中，加入本发明的所述引物组和内参扩增引物对获得。在一种实施方式中，以所述多重PCR反应物的总体积为基准，所述多重PCR反应物中每条引物的浓度为100nmol/L～300nmol/L。 [0045] 在一种实施方式中，所述试剂盒中还包括样品基因组提取试剂。所述样品基因组提取试剂可以市购或自行配制。 [0046] 进一步地，所述试剂盒还可以含有阳性质控品。所述阳性质控品为含不同目标真菌特异核酸片段和人DNA内参特异核酸片段的pUC57质粒DNA。在一种实施方式中，所述阳性质控品的核苷酸序列如SEQ ID NO.17～SEQ ID NO.23。可单独市购或根据现有技术自行构建。 [0047] 进一步地，所述试剂盒还含有阴性质控品。在一种实施方式中，所述阴性质控品为TE缓冲液。可单独市购或根据现有技术自行配置。 [0048] 本发明还提供了前述试剂盒的使用方法，包括如下步骤： [0049] (1)样本进行前处理后，提取样本基因组DNA； [0050] (2)加样：将样品DNA、阳性质控品或阴性质控品分别加入装有所述多重PCR反应物的PCR管中，获得对应的样品反应管、阳性反应管或阴性反应管； [0051] (3)PCR反应：反应管置于PCR仪上，设置循环参数，进行PCR反应； [0052] (4)PCR反应结束后，分析结果。 [0053] 步骤(1)中，提取样品基因组DNA为本领域的现有技术。 [0054] 在一种实施方式中，步骤(3)中，PCR反应的条件设置为：50℃2min循环1次；95℃2min循环1次；94℃20sec、60℃20sec、72℃30sec、循环35次；72℃5min循环1次；4℃∞循环1次。 [0055] 本发明还提供所述试剂盒在制备肺部感染真菌检测产品中的用途。 [0056] 以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。 [0057] 在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。 [0058] 当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。 [0059] 实施例1试剂盒的制备及使用方法 [0060] 分别合成白色念珠菌检测引物对、热带念珠菌检测引物对、光滑念珠菌检测引物对、烟曲霉检测引物对、黄曲霉检测引物对、黑曲霉检测引物对、新型隐球菌(新生变种/格特变种)检测引物对，其核苷酸序列如下表1所示。 [0061] 所述试剂盒还含有人DNA内参扩增引物对，其核苷酸序列如下表1所示。 [0062] 所述试剂盒还含有阳性质控品。所述阳性质控品为含目标真菌特异核酸片段和人DNA内参特异核酸片段的pUC57质粒DNA，各核苷酸序列见表2中。 [0063] 所述试剂盒还含有阴性质控品。所述阴性质控品为TE缓冲液。 [0064] 所述试剂盒还含Multiplex PCR Mix(UDG)(货号E024‑YBAB，苏州近岸蛋白质科技股份有限公司)、细菌、真菌DNA提取试剂盒(货号：T07‑100，上海美吉逾华生物医药科技有限公司)。 [0065] 表1 [0066] [0067] [0068] 表2 [0069] [0070] [0071] [0072] [0073] 实施例2试剂盒的检测效果评价 [0074] 本发明实施例中提供一种本试剂盒的具体使用方式，将表1中序列所示的各检测引物对、人DNA内参扩增引物对与购于苏州近岸蛋白质科技股份有限公司的Multiplex PCR Mix(UDG)混合均匀，获得多重PCR反应物，多重PCR反应物中各引物的浓度见表3。 [0075] 表3 [0076] [0077] [0078] 1、按照标准操作采集患者样本(痰液、支气管肺泡灌洗液等)，采集后应立即放置于冰袋中，并马上送检。 [0079] 2、样本进行前处理后，共同提取样本中DNA，获得待测DNA样本。 [0080] 3、PCR反应体系配制与检测 [0081] (1)根据检测需求设置排版方式，根据排版将多重PCR反应物加入8联管或96孔板中，每孔加17.5μL，并往反应孔中依次加入2.5μL的阴性质控品(TE缓冲液)、待测DNA样本和阳性质控品(含目标真菌特异核酸片段和人DNA内参特异核酸片段的pUC57质粒DNA)，盖好盖子。 [0082] (2)充分混匀并离心。 [0083] (3)上述配制好的试剂进行反应。 [0084] 4、设置PCR程序 [0085] (1)按照PCR仪操作说明书设置PCR程序，PCR反应扩增条件见下表4。 [0086] 表4 [0087] [0088] (2)PCR扩增结束后，将扩增板/管进行短暂离心，然后小心打开管盖，加矿物油密封，使用核酸片段分析仪进行检测。 [0089] 5、结果分析 [0090] 通过检测反应产物片段大小判断样本检测结果。阴性对照管中应无反应产物片段。否则，此次实验结果无效，重新检测。阳性质控品检测反应体系中，在70‑77bp和下表5所示范围内各有一反应产物片段，否则此次实验结果无效，重新检测。对于样本检测反应体系，在70‑77bp范围内应有内参反应产物片段，否则，此次实验结果无效，重新检测。若样本检测结果为阳性，根据反应产物信号强度和对应片段大小，判断出所感染的真菌类型。整个检测流程约为2‑3小时。 [0091] 参见图1至图3所示的实验检测数据，各真菌对应的片段大小值见下表5。 [0092] 表5 [0093]真菌种类片段大小热带念珠菌 102‑113bp 白色念珠菌 127‑138bp 烟曲霉 196‑207bp 光滑念珠菌 246‑258bp 新型隐球菌(新生变种/格特变种) 302‑312bp 黄曲霉 349‑359bp 黑曲霉 405‑415bp 人DNA内参 70‑77bp [0094] 实施例3试剂盒的灵敏度和特异性分析 [0095] 灵敏度分析： [0096] 所有真菌菌株购于广东省微生物菌种保藏中心和中国医学菌种保藏中心(表6)。为确定试剂盒的灵敏度，分别对将白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、新型隐球菌新生变种和新型隐球菌格特变种的核酸进行梯度稀释，浓度分别为1× 6 5 5 4 4 10copies/mL、5×10copies/mL、1×10copies/mL、5×10copies/mL、1×10 copies/mL、5 3 3 2 2 ×10copies/mL、1×10copies/mL、5×10copies/mL、1×10copies/mL，每个梯度稀释液重复3‑5份样本，利用与实施例2中相同的，确定的七种真菌毒多重PCR检测体系，进行多重PCR扩增和片段分析检测，直至检测不到信号，每份进行20次的重复检测，以95％的阳性检出率水平作为最低检测下限(LOD)，即为灵敏度。 [0097] 相关病原菌株如下： [0098] 表6 [0099] [0100] [0101] 本发明试剂盒的检测灵敏度，如下表所示： [0102] 表7 [0103] 检测指标 LOD(copies/mL)白色念珠菌 1000 热带念珠菌 1000 光滑念珠菌 1000 烟曲霉 1000 黄曲霉 1000 黑曲霉 1000 新型隐球菌新生变种 5000 新型隐球菌格特变种 5000 [0104] 特异性分析： [0105] 本发明建立的检测方法的特异性主要表现特异性引物的特异性。设计的引物都经过primer‑blast比对分析，具有高度保守性和特异性，能特异性区分七种真菌。为了确定试剂盒的特异性，选择以下十六种无关病原菌株作为模拟干扰样本，所有病原菌株购于广东省微生物菌种保藏中心和中国医学菌种保藏中心，将不同的病原菌株提取核酸后检测，浓度为10ng/μL，将以上得到的每种样本的总核酸与等量的人内参对照质粒(pUC57)混合，作为模板进行多重PCR扩增和片段分析，验证本发明试剂盒引物设计的特异性。 [0106] 相关病原菌株如下： [0107] 表8 [0108] [0109] [0110] 结果如图4显示，十六种无关病原体的总核酸与等量的人内参对照质粒(pUC57)为模板进行的多重PCR和片段分析，仅能扩增出76bp的人内参条带，无其他扩增条带。从以上数据可以看出，本发明试剂盒对这些微生物的检测结果都为阴性，证明本发明试剂盒与其他微生物之间没有交叉反应，体现试剂盒检测病原体的特异性强。 [0111] 实施例4试剂盒应用于临床样本检验 [0112] 选取临床微生物实验室培养检测方法作为“参比方法”，应用本发明实施例2和一代测序技术检测痰液和支气管肺泡灌洗液的临床标本。本次试验共检测疑似/确诊肺部真菌感染患者的痰液和支气管肺泡灌洗液共计20例标本。标本检测结果见下表9。 [0113] 表9 [0114] [0115] [0116] 根据以上检测数据可以得出，本发明方法的检测结果与培养检测方法检测的结果具有较高的符合性。 [0117] 对比例1 [0118] 按照实施例1的方法制备对比引物组1‑8，见下表10。 [0119] 表10 [0120] [0121] 区别仅在于，将实施例1的引物组中SEQ ID NO.1‑2所示的引物替换为SEQ ID NO.24‑25所示的引物获得对比引物组1。将实施例1的引物组中SEQ ID NO.3‑4所示的引物替换为SEQ ID NO.26‑27所示的引物获得对比引物组2。将实施例1的引物组中SEQ ID NO.5‑6所示的引物替换为SEQ ID NO.28‑29所示的引物获得对比引物组3。将实施例1的引物组中SEQ ID NO.7‑8所示的引物替换为SEQ ID NO.30‑31所示的引物获得对比引物组4。将实施例1的引物组中SEQ ID NO.9‑10所示的引物替换为SEQ ID NO.32‑33所示的引物获得对比引物组5。将实施例1的引物组中SEQ ID NO.11‑12所示的引物替换为SEQ ID NO.34‑ 35所示的引物获得对比引物组6。将实施例1的引物组中SEQ ID NO.13‑14所示的引物替换为SEQ ID NO.36‑37所示的引物获得对比引物组7。将实施例1的引物组中SEQ ID NO.15‑16所示的引物替换为SEQ ID NO.38‑39所示的引物获得对比引物组8。 [0122] 最低检出限验证按照实施例3的方法进行最低检出限验证。实施例3与对比例的最低检出限对比如下表11。 [0123] 表11 [0124] 检测指标实施例3，LOD(copies/mL) 对比例，LOD(copies/mL)白色念珠菌 1000 1000 热带念珠菌 1000 5000 光滑念珠菌 1000 5000 烟曲霉 1000 1000 黄曲霉 1000 5000 黑曲霉 1000 1000 新型隐球菌新生变种 5000 5000 新型隐球菌格特变种 5000 5000 [0125] 由表11可知，对于样本中痕量的光滑念珠菌、热带念珠菌、黄曲霉的核酸，本公开试剂盒比对比例有更强的检测能力。 [0126] 特异性验证按照实施例3的方法进行特异性验证。结果显示，对比例的引物对的反应结果均为阴性。 [0127] 由实施例3和对比例的对比可以看出，本公开可以一次性检测出七种肺部感染真菌，灵敏度高，特异性高，最低检出限更低，覆盖度更广。 [0128] 对比例2 [0129] 本对比例以光滑念珠菌为例，展示了在研发过程中发现的部分效果不理想的引物。光滑念珠菌引物序列及筛选：对3组引物组合，先用单重PCR扩增筛选引物扩增效果，单重检测结果发现引物对3扩增效率较低，引物对1和2可以基本满足后续实验需要(如图5至图7所示)，需要加入多重PCR法中做进一步验证。将引物对1和2分别加入多重PCR体系中进行扩增，检测结果如下： [0130] 引物对1 [0131] F‑1：(SEQ ID NO.40)ACTATTCTTTTGTTCGTTGGGG [0132] R‑1：(SEQ ID NO.41)CAATGTGCGTTCAAAGATTCG [0133] 引物对2 [0134] F‑2：(SEQ ID NO.42)TCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCG [0135] R‑2：(SEQ ID NO.43)CGCAAACGAGCAGCAGATTA [0136] 引物对3 [0137] F‑3：(SEQ ID NO.44)ACATTGCGCCCTCTGGTA [0138] R‑3：(SEQ ID NO.45)CAAAACACTCACTTATCCCTCC [0139] 引物对1加入多重PCR体系检测结果：引物对1使得白色念珠菌扩增效率变低，可能引物对1和白色念珠菌引物对之间有竞争抑制或者有引物二聚体导致该引物对扩增效率降低，从而影响后续检测的需求。引物对2加入多重PCR体系检测结果：各引物对扩增效率基本无改变。从多方面综合考虑，选择引物对2为光滑念珠菌在多重PCR检测体系中的引物对，该体系经过反复验证，满足检测要求。 [0140] 以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。