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检测不同类型真菌的组合物、试剂盒及其用途
申请号	CN202310477711.7	申请日	2023-04-27	公开(公告)号	CN116287420A	公开(公告)日	2023-06-23
申请人	湖南圣维尔医学检验所有限公司;			发明人	何胜; 刘让蛟; 陈熹; 王少波; 戴立忠;
摘要	本发明属于分子生物学检测领域，具体地，涉及耶氏肺孢子虫、烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、马尔尼菲篮状菌、新型隐球菌、白色念珠菌、组织胞浆菌的的联检并进行区分的组合物、方法和用途。本发明采用多重PCR技术及Qsep400高通量分析系统，将八个真菌扩增片段的长度至少差距20个碱基以上，达到目的片段能够精准区分的目的。在一管反应液中能同时检测耶氏肺孢子虫、烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、马尔尼菲篮状菌、新型隐球菌、白色念珠菌、组织胞浆菌。一个样本，只需进行一次核酸提取和同时进行单管PCR扩增，在Qsep400上就能通过条带分析得到样本检测结果，且PCR过程无干扰，检测结果准确。
权利要求	1.一种检测并区分不同类型真菌的组合物，包括：如SEQ ID NO:1～2所示的检测马尔尼菲篮状菌上下游引物；如SEQ ID NO:3～4所示的检测黄曲霉上下游引物；如SEQ ID NO:5～6所示的检测黑曲霉上下游引物；如SEQ ID NO:7～8所示的检测烟曲霉的上下游引物；如SEQ ID NO:9～10所示的检测新型隐球菌上下游引物；如SEQ ID NO:10～12所示的检测白色念珠菌上下游引物；如SEQ ID NO:13～14所示的检测组织胞浆菌上下游引物；以及如SEQ ID NO:15～16所示的检测耶氏肺孢子虫上下游引物。 2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物包括检测内标的上下游引物。 3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述内标是人源内标基因。 4.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物的各成分存在于同一个包装中。 5.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物的各成分以混合的形式存在。 6.根据权利要求1～5中任一项所述的组合物在制备不同类型真菌的检测并区分的试剂盒中的用途，其中，所述真菌是耶氏肺孢子虫、烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、马尔尼菲篮状菌、新型隐球菌、白色念珠菌、组织胞浆菌。 7.一种不同类型真菌的检测并区分的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1～5中任一项所述的组合物。 8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品。 9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括核酸释放试剂、核酸 2+ 提取试剂、dNTP、DNA聚合酶、PCR缓冲液以及Mg 中的至少一种。 10.一种制备不同类型真菌的检测并区分的试剂的用途，所述用途包括以下步骤： 1)提取或释放待测样本的核酸； 2)使用如权利要求1～5中任一项所述的组合物或权利要求7～9中任一项所述的试剂盒对步骤1)获得的核酸进行PCR； 3)获得并分析结果。
说明书全文	检测不同类型真菌的组合物、试剂盒及其用途技术领域 [0001] 本发明属于分子生物学检测领域，具体地，涉及耶氏肺孢子虫、烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、马尔尼菲篮状菌、新型隐球菌、白色念珠菌、组织胞浆菌的的联检并进行区分的组合物、方法和用途。背景技术 [0002] 近年来，随着广谱抗生素、糖皮质激素、免疫抑制剂的广泛使用，器官移植、各种侵袭性诊疗操作的广泛开展，特殊感染尤其是深部真菌感染越发多见，而肺部作为最易感部位，患病率在不断增加。同时，免疫健全人群的肺部真菌感染率也有逐年增加趋势。真菌感染常常继发与其他较严重的原发病，其临床表现形式大多以原发性疾病的症状而呈现，肺部真菌感染的临床症状表现为咳嗽、发热、呼吸困难等，不具有特异性，这对于肺部真菌感染的早期诊断具有较大难度，漏诊及误诊几率较大。常见的引起肺部感染的真菌有耶氏肺孢子虫、烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、马尔尼菲篮状菌、新型隐球菌、白色念珠菌、组织胞浆菌等，但不同的肺部感染在发病机制、临床表现、严重程度以及预后方面都可能有所不同，但共同点在于难以鉴别诊断，且往往引起较为严重的感染，其预后较差，死亡率较高。 [0003] 目前，真菌培养是现今临床诊断肺部真菌感染的“金标准”，但其培养周期较长、检出率低、易受污染可能导致假阳性率较高，并不适合作为一种常用临床检查手段。典型CT影像学可作为辅助诊断依据之一，需结合基础疾病初步诊断。除临床表现、病史、影像学资料外，肺部真菌感染的诊断主要依赖实验室病原学检测。目前最常见的分子生物学诊断方法是qPCR反应，它缩短了从采样到确诊所需的时间，但目前在真菌检测中应用相对较少，一个主要原因在于真菌的细胞壁较厚，常规方法下核酸提取困难，在灵敏度上受到很大的限制，也因此很难实现真正的高通量检测；另一个原因是它同样具有通量较低和假阳性率较高的劣势。 [0004] 因此，本领域需求一种早期快速、准确的病原学诊断，是改善肺部真菌感染预后、降低死亡率的关键。发明内容 [0005] 有鉴于此，第一方面，本发明提供一种检测并区分不同类型真菌的组合物，包括： [0006] 如SEQ ID NO:1～2所示的检测马尔尼菲篮状菌上下游引物； [0007] 如SEQ ID NO:3～4所示的检测黄曲霉上下游引物； [0008] 如SEQ ID NO:5～6所示的检测黑曲霉上下游引物； [0009] 如SEQ ID NO:7～8所示的检测烟曲霉的上下游引物； [0010] 如SEQ ID NO:9～10所示的检测新型隐球菌上下游引物； [0011] 如SEQ ID NO:10～12所示的检测白色念珠菌上下游引物； [0012] 如SEQ ID NO:13～14所示的检测组织胞浆菌上下游引物；以及 [0013] 如SEQ ID NO:15～16所示的检测耶氏肺孢子虫上下游引物。 [0014] 本发明采用多重PCR技术及Qsep400高通量分析系统，通过对各病原体的设计引物，并确保各引物之间不存在互相干扰，根据Qsep400电泳原理，将八个真菌扩增片段的长度至少差距20个碱基以上，达到目的片段能够精准区分的目的，在一管反应液中能同时检测耶氏肺孢子虫、烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、马尔尼菲篮状菌、新型隐球菌、白色念珠菌、组织胞浆菌。一个样本，只需进行一次核酸提取和同时进行单管PCR扩增，在Qsep400上就能通过条带分析得到样本检测结果，且PCR过程无干扰，检测结果准确。 [0015] 进一步地，所述组合物包括检测内标的上下游引物。 [0016] 在一些具体的实施方案中，内标是人源内标基因。在一个具体的实施方案中，内标是人管家基因。 [0017] 进一步地，在一些实施方案中，本发明的组合物可以同时包括上述引物对中的一对或多对。在本发明中，“对”是指检测一个靶点的互相匹配的上游和下游引物。 [0018] 本发明的组合物可以任意组合成检测对应8个靶点的任意组合形式。本领域技术人员可以根据需要进行组合，检测哪几个靶点，即把对应靶点的引物对进行组合即可。这些组合形式均包括在本发明中。 [0019] 举例来说，可以包括上述8对引物中的任意7对，8对引物中的任意6对，8对引物中的任意5对，8对引物中的任意4对，8对引物中的任意3对，8对引物中的任意8对，8对引物中的任意1对。 [0020] 在一些具体的实施方案中，本发明组合物用于PCR。 [0021] 在一个具体的实施方案中，本发明的组合物的各成分分别存在于单独包装中。 [0022] 在一个具体的实施方案中，本发明的组合物的各成分存在于同一个包装中。 [0023] 进一步地，本发明的组合物的各成分以混合的形式存在。 [0024] 第二方面，本发明提供了上述本发明的组合物在制备不同类型真菌的检测并区分的试剂盒中的用途，其中，所述真菌是耶氏肺孢子虫、烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、马尔尼菲篮状菌、新型隐球菌、白色念珠菌、组织胞浆菌。 [0025] 第三方面，本发明提供了一种不同类型真菌的检测并区分的试剂盒，所述试剂盒包括如上所述本发明的组合物。 [0026] 进一步地，所述试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品。 [0027] 在一个具体的实施方案中，阴性质控品是DEPC H2O、生理盐水、内标基因中的至少一种。阳性质控品是耶氏肺孢子虫、烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、马尔尼菲篮状菌、新型隐球菌、白色念珠菌、组织胞浆菌的片段质粒、片段DNA中的至少一种。 [0028] 进一步地，所述试剂盒还包括dNTP、PCR缓冲液以及Mg2+中的至少一种。 [0029] 更进一步地，所述试剂盒还包括：核酸释放试剂、核酸提取试剂，以及DNA聚合酶中的至少一种。 [0030] 更进一步地，所述试剂盒还包括核酸释放试剂、核酸提取试剂、dNTP、DNA聚合酶、2+ PCR缓冲液以及Mg 中的至少一种。 [0031] 进一步地，所述DNA聚合酶的浓度为3U/反应～15U/反应，例如DNA聚合酶可以是Taq酶。 [0032] 在一个具体的实施方案中，本发明试剂盒包括：Taq酶、Mg2+、dNTPs、引物和PCR缓冲液。 [0033] 常见的PCR缓冲液由Tris‑HCl、MgCl2、KCl、Triton X‑100等缓冲体系构成。一般单个PCR反应管中总体积为5‑15μl。 [0034] 第四方面，提供了一种制备不同类型真菌的检测并区分的试剂的用途，所述用途包括以下步骤： [0035] 1)提取或释放待测样本的核酸； [0036] 2)使用如上所述本发明的组合物或上述本发明的试剂盒对步骤1)获得的核酸进行PCR扩增； [0037] 3)获得并分析结果。 [0038] 在本发明中，用于检测的样本可以是血清、血液等，但不限于此。 [0039] 进一步地，所述PCR的反应条件为： [0040] 预变性，温度为95℃，时间为120秒，1次循环；变性，温度为95℃，时间为30秒，退火，温度为56℃，时间为30秒，延伸，72℃，时间为1分钟，45次循环，最后继续72℃延伸5分钟，一次循环。 [0041] 进一步地，所述获得并分析结果包括毛细管电泳。 [0042] 在一个具体的实施方案中，提供了一种用于以非诊断目的检测并区分不同类型真菌的方法，所述方法包括以下步骤： [0043] 1)提取或释放待测样本的核酸； [0044] 2)使用如上述本发明的组合物或上述本发明的试剂盒对步骤1)获得的核酸进行PCR扩增； [0045] 3)获得并分析结果。 [0046] 进一步地，所述PCR的反应条件为： [0047] 预变性，温度为95℃，时间为120秒，1次循环；变性，温度为95℃，时间为30秒，退火，温度为56℃，时间为30秒，延伸，72℃，时间为1分钟，45次循环，最后继续72℃延伸5分钟，一次循环。 [0048] 进一步地，所述获得并分析结果包括毛细管电泳。附图说明 [0049] 图1为本发明组合物检测八种真菌的检测结果图； [0050] 图2为本发明组合物灵敏度检测结果图； [0051] 图3为本发明组合物特异性检测结果图； [0052] 图4为本发明对比例组合物检测八种真菌的检测结果图；具体实施方式 [0053] 下文将结合具体实施方案和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方案和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。 [0054] 实施例1、本发明所使用的引物 [0055] 本发明所使用的引物如表1所示。 [0056] 表1 [0057] [0058] [0059] 实施例2、检测不同类型真菌并区分的方法 [0060] 试剂准备： [0061] 根据待测样本、阳性对照、阴性对照的数量，按比例取相应量的PCR反应液，充分混匀，2000rpm离心10s后备用。 [0062] 样本处理与加样 [0063] 取200μL待测样本、阴性对照、阳性对照到1.5mL离心管中，使用圣湘生物科技股份有限公司的核酸提取或纯化试剂按其说明书操作进行核酸提取。 [0064] 吸取上述提取完的核酸、阴性对照及阳性对照各2μL分别加入对应的0.2mL PCR反应管中。 [0065] PCR扩增 [0066] 依照表2配置多重PCR反应液，在各个0.2mL PCR反应管中加入5μl的反应液并按照如下表3进行扩增。 [0067] 表2 [0068] 组份每一个反应中的体积/浓度PCR buffer* 1μL dNTPs(100mM) 0.2μL 1mol/L MgCl2 0.8μL 引物(1μM) 2μL PCR Enzyme 0.5μL ddH2O 3.5μL DNA 2μL Total 10μL [0069] 表3 [0070] [0071] [0072] PCR产物纯化 [0073] PCR产物经离心后转至1.5ml EP管中，根据片段长度加入适当倍数的磁珠溶液，振荡混匀后静止3min； [0074] 将磁珠产物混合液离心后置于磁力架上，待磁珠聚集，吸弃上清； [0075] 加入200μL的80％乙醇，在磁力架上转向洗涤2‑3周，弃上清；重复洗涤操作2次； [0076] 离心后置于磁力架上，吸去残液，开盖静置5min，使管内残余乙醇完全挥发； [0077] 加入25‑50μL的ddH2O，振荡后静置3min，离心后置于磁力架上，取上清液为纯化产物，于‑20℃冷冻保存备用。 [0078] Qsep400上机 [0079] 将PCR纯化产物经Qubit荧光分光光度计(Thermo Fisher)测浓度后，用ddH2O稀释至2‑5ng/μL，取2μL稀释产物与13μL Qsep 1x Dilution buffer混合后，将样品加入96孔毛细管电泳分离板上适当数目的孔中进行毛细管电泳分离。 [0080] 检验结果的解释 [0081] 根据Qsep400全自动核酸蛋白分析系统自有软件上默认的参数对结果进行片段大小分析，其横坐标表示片段大小，纵坐标为信号强弱。将Qsep400分析仪的软件获得的图谱与标准图谱对比，判断出相应病原体的种类。 [0082] 实施例3、本发明组合物测试样本的检测结果 [0083] 将实施例1所示的引物，按照实施例2的方法对八种真菌样本进行检测并区分，检测结果如图1所示，从图中可以看出，本发明的组合物可以在一管中对八种真菌均进行检测并区分。 [0084] 实施例4、本发明组合物的灵敏度 [0085] 利用八个真菌合成的质粒，稀释到500copies/ml、400copies/ml，经过反应扩增并检测。如图2所示，500copies/ml的混合样本可以扩增出全部条带，显示八种真菌的对应产物；而400copies/ml的混合样本可以扩增出部分条带，所以确定检出限为500copies/ml。 [0086] 实施例5、本发明组合物的特异性 [0087] 利用本试剂盒的八种真菌和根霉、毛霉、根毛霉、赛多孢霉、尖孢镰刀菌、串珠镰刀菌、橘青霉、产黄青霉、卡他莫拉菌、肺炎克雷伯杆菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、肺炎支原体、鲍曼不动杆菌、大肠埃希菌、热带念珠菌、克柔念珠菌、人类基因组DNA等阳性样本混合之后，进行扩增并检测，结果仍然只有八种真菌的对应产物，结果见图3，其他交叉反应病原体均无对应的产物扩增出来，说明本试剂盒与根霉、毛霉、根毛霉、赛多孢霉、尖孢镰刀菌、串珠镰刀菌、橘青霉、产黄青霉、卡他莫拉菌、肺炎克雷伯杆菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、肺炎支原体、鲍曼不动杆菌、大肠埃希菌、热带念珠菌、克柔念珠菌、人类基因组DNA等阳性样本无交叉反应。 [0088] 对比例1、本发明设计的其余的效果不好的引物 [0089] 由于碱基互补配对原则，引物之间会形成二聚体，但这种概率很少，在设计之初就可以排除掉。但多种病原体联合检测时，引物众多，引物和引物、容易发生二聚体，要保证设计的保守性(保守性对检测的准确性至关重要)，又要考虑不同引物之间的相互干扰，需要精心对引物进行设计。 [0090] 因此，发明人还设计了其余一些引物(序列未示出)组成了不同的检测体系，同样用于八种真菌。具体检测结果如图4所示，结果表明，此检测体系只出现部分扩增条带，并不能够完全检测出8种真菌，因此，整体检测效果差。