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一种同时检测多种病原生物tNGS的试剂盒及方法

申请号 CN202311793863.4 申请日 2023-12-25 公开(公告)号 CN117757962A 公开(公告)日 2024-03-26
申请人 郑州人民医院(郑州人民医院医疗管理中心); 发明人 宋银森; 冯睿婷; 李冬青; 杨珍珍; 孟婧洁;
摘要 本 发明 提供一种同时检测多种病原 微 生物 的靶向病原高通量测序 试剂 盒 及方法,通过对不同感染类型的常见多发病原体的特异性引物设计、检测和筛选,获取一组引物,通过靶向病原高通量测序(tNGS)对目标病原微生物的特异性区域进行靶向扩增,获得目标病原微生物的DNA 片段 ,再进行目标序列与病原序列的比对,实现对病原微生物的鉴定。靶向病原高通量测序相比宏基因组测序,能够极大减少了被测样本中人源核酸的数据量,提高检测灵敏度,增加病原微生物检出率,降低样本测序成本。
权利要求

1.一种基于tNGS的病原生物检测的引物组,其特征在于,所述捕获探针组特异性捕获以下病原微生物基因组编码区序列:鲍曼不动杆菌,百日咳鲍特氏菌,洋葱伯克霍尔德菌,炎衣原体,鹦鹉热衣原体,白喉杆菌,阴沟肠杆菌,粪肠球菌,屎肠球菌,大肠埃希菌,流感嗜血杆菌,产气克雷伯菌,肺炎克雷伯菌,嗜肺军团菌,单核细胞增生李斯特氏菌,卡他莫拉菌,结核分枝杆菌复合群,分枝杆菌,胞内分枝杆菌,堪萨斯分枝杆菌,赛分枝杆菌,结核分枝杆菌,脓肿分枝杆菌,龟分枝杆菌,肺炎支原体,脑膜炎奈瑟菌,巴西诺卡菌,盖尔森基兴诺卡菌,皮疽诺卡菌,新星诺卡菌,豚鼠炎诺卡菌,恙虫病东方体,奇异变形杆菌,绿假单胞菌,肠道沙氏菌,黏质沙雷氏菌,金黄色葡萄球菌,嗜麦芽窄食单胞菌,嵴链球菌,肺炎链球菌,酿脓链球菌,BK多瘤病毒,乙型肝炎病毒,人腺病毒D型,单纯疱疹病毒
1型,单纯疱疹病毒2型,痘‑带状疱疹病毒,人巨细胞病毒,人疱疹病毒7型,人博卡病毒1型,EB病毒,人疱疹病毒6型,人腺病毒B型,人腺病毒C型,人腺病毒E型,人细小病毒B19,JC多瘤病毒,KI多瘤病毒,WU多瘤病毒,黄曲霉,烟曲霉,黑曲霉,土曲霉,白色念珠菌,光滑念珠菌,克柔念珠菌,热带念珠菌,新型隐球菌,镰刀菌属,耶氏肺孢子菌,微小根毛霉,小孢根霉,米根霉,尖端赛多孢子菌,马尔尼菲篮状菌,人冠状病毒229E型,人冠状病毒HKU1型,人冠状病毒NL63型,人冠状病毒OC43型,人偏肺病毒,人呼吸道合胞病毒B型,甲型流感病毒H1N1,甲型流感病毒H2N2,甲型流感病毒H3N2,甲型流感病毒H5N1,甲型流感病毒H7N9,甲型流感病毒H9N2,乙型流感病毒,日本乙型脑炎病毒,中东呼吸综合征病毒,人呼吸道合胞病毒A型,人鼻病毒A型,人鼻病毒B型,人鼻病毒C型,新型冠状病毒,SARS冠状病毒;
所述引物组包含如SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:350所示序列的引物。
2. 如权利要求1所述的引物组,所述引物组中SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:175为上游引物序列;SEQ ID NO:176至SEQ ID NO:350为下游引物序列。
3.一种基于tNGS的病原微生物检测用的试剂盒,其特征在于,包括权利要求1或权利要求2所述的引物组。
4.如权利要求3所述的试剂盒,其特征在于,还包括逆转录酶、DNA聚合酶和PCR产物纯化磁珠
5.如权利要求4所述的试剂盒,其特征在于,所述逆转录酶为2x RT Mix,所述DNA聚合酶为Multi‑PCR Mix,所述PCR产物纯化磁珠为DNA clean beads。
6.如权利要求3‑4所述的任一一项试剂盒,其特征在于,还包括超多重PCR扩增引物池、消化酶、DNA连接酶、测序接头和PCR反应Mix。
7.一种非诊断目的的用于检测病原微生物的靶向病原高通量测序方法,其特征在于,具体包括以下步骤:
步骤1,提取待测样本中的总DNA及RNA;
步骤2,将步骤1中得到的RNA逆转录成cDNA;
步骤3,以步骤1中获得的总DNA和步骤2中逆转录得到的cDNA为模板,利用扩增引物池进行超多重PCR扩增;
步骤4,对步骤3中得到的超多重PCR扩增产物进行酶处理,消化扩增产物两端的扩增引物部分;
步骤5,在步骤4中得到的消化后PCR产物的两端连接上测序接头;
步骤6,对步骤5得到的测序接头连接产物进行PCR扩增,得到tNGS测序文库;
步骤7,对步骤6制备好的tNGS测序文库进行质检和定量,并根据文库定量结果进行混库;
步骤8,对步骤7得到的混库后的测序文库进行高通量测序,得到测序序列;
步骤9,对测序序列先进行引物识别,再与数据库中的病原序列进行对比,最终确定待测样本中的病原体种类。
8.如权利要求7所述的方法,其特征在于,所述步骤3中,所述超多重PCR扩增的反应体系为:Multi‑PCR Mix 4μL、PCR Enhancer 1μL、Amplicon Primer Mix 1 5μL、总模板10μL,反应总体系20μL;超多重PCR扩增的反应条件为:95℃ 2min;95℃ 10s,60℃ 30s,72℃ 
30s,循环30次;60℃ 15min,反应结束后产物冷却至4℃。
9.如权利要求7所述的方法,其特征在于,所述步骤4中,所述扩增引物消化的反应体系为:DU Buffer 6μL、DU Enzyme 4μL,补加无核酸水洗脱的上步产物至总体积50μL;消化反应条件为:37℃ 10min;50℃ 10min;65℃ 5min,反应结束后产物冷却至4℃。
10.如权利要求7所述的方法,其特征在于,所述步骤5中,所述连接测序接头的反应体系为:Adaptor 5μL、Ligase Buffer 15μL、Ligase 10μL、上步产物至总体积80μL;连接反应条件为:25℃ 15min;反应结束后产物冷却至4℃。

说明书全文

一种同时检测多种病原生物tNGS的试剂盒及方法

技术领域

[0001] 本发明涉及基因检测技术领域,更具体的涉及一种同时检测多种病原微生物的tNGS(靶向病原高通量测序)试剂盒及方法。

背景技术

[0002] 20世纪以来,由于抗生素、抗病毒药物及疫苗的广泛使用,食品和饮用卫生状况的显著改善,现代医疗技术的迅速发展等,使得全球感染性疾病负担大幅下降。但尽管如此,感染性疾病仍然是全球发病和死亡的主要原因之一。
[0003] 目前,全球感染性疾病的发病率有所上升,病原体呈现多样化和复杂化的发展趋势。新型冠状病毒感染、H7N9禽流感等新发感染性疾病接连出现。而HIV、多重耐药结核分枝杆菌、沙眼支原体等经典感染性疾病病原体又死灰复燃或出现新的致病特征。各种新发和再发的感染性疾病、不易发现的多重感染以及不明病因的发热等,都给人类健康带来了巨大的威胁。
[0004] 感染性疾病是临床常见疾病之一,多为细菌、病毒、真菌和寄生虫等病原体及其产物所引起的局部或全身性炎症或器官功能障碍,具有较大的危害性和较高的病死率。因此,临床上对感染性疾病诊断的准确性和时效性提出了更高的要求。
[0005] 传统的病原微生物检测手段包括形态学检测、分离培养、生化检测和免疫学检测。这些方法受限于周期长、阳性率低和对操作人员的技术水平要求比较高等因素。荧光定量PCR技术和等温扩增技术等分子生物学方法的出现解决了上述检测周期长的问题,通过对核酸特异性序列的检测,可在2~4小时内快速判断病原体的种类,适合同时检测较少的病原靶标。而对于混合未知感染和由于罕见病原体导致的感染性疾病,荧光定量PCR等手段则显得捉襟见肘。
[0006] 随着现代基因组学的发展,高通量测序技术(也称下一代测序技术,NGS)已经能够做到不依赖于传统的微生物培养,可直接对临床样本中的核酸进行高通量测序,然后与数据库进行比对,实现感染性疾病的溯源、检测、分型和耐药评估等多个方面,受到越来越多临床和科研工作者的关注。目前临床上使用的宏基因组测序(mNGS)是对人体样本或特定环境样品中的总核酸(DNA或RNA)进行高通量测序,通过比对数据库,得到感染病原体的相关信息。由于mNGS能够检测出新发和罕见病原体,它在重症感染领域,特别是疑难、罕见病导致的重症感染中发挥了难以替代的作用:2016年FDA认可NGS用于病原微生物的诊断和耐药毒分析;2019年病原宏基因组被写入成人医院获得性炎与呼吸机相关性肺炎诊疗指南;2019年中华急诊医学杂志发表《宏基因组诊断技术在急危重症感染应用的专家共识》。
[0007] 当前临床上应用较多的病原体鉴定测序技术为宏基因组测序(mNGS),其能获取一份样本中的全部核酸序列信息,包括病原微生物序列信息及人源基因组序列信息。该方法对检测目标无偏好性,理论上可以检测数据库中的所有病原微生物。
[0008] 但在实际应用中还存在以下技术问题:1、宏基因组文库构建流程中,酶切打断那一步,是对样本中的所有核酸都进行无偏移的打断,其中也包括临床样本中大量的人源核酸及建库试剂所引入的试剂工程菌核酸。在后续得到的测序数据中,绝大部分的数据量也是被人源核酸序列所占据,样本中实际致病病原体可供分析的数据量占比较低,检测灵敏度会受到影响,故人源核酸会影响病原体的检测性能。2、一份临床样本的测序数据中基本90%以上的数据量为人源序列,病原序列的实际数据量占比较小,临床上为进一步提高病原检出灵敏度,只能不断提高样本的测序数据量,这也大大增加了检测成本。
[0009] 所以迫切需要一种新的病原体测序技术,来解决这些问题,在不提高测序数据量的前提下,尽量排除人源核酸序列的干扰,提高病原体检测的灵敏度和特异性。

发明内容

[0010] 本发明的目的是克服现有技术的上述不足,提出一种同时检测多种病原微生物的tNGS(靶向病原高通量测序)试剂盒及方法。本发明的技术方案如下:
[0011] 第一方面,本发明提供了一种基于tNGS的病原微生物检测的引物组,其特征在于,所述捕获探针组特异性捕获以下病原微生物基因组编码区序列:鲍曼不动杆菌,百日咳鲍特氏菌,洋葱伯克霍尔德菌,肺炎衣原体,鹦鹉热衣原体,白喉杆菌,阴沟肠杆菌,粪肠球菌,屎肠球菌,大肠埃希菌,流感嗜血杆菌,产气克雷伯菌,肺炎克雷伯菌,嗜肺军团菌,单核细胞增生李斯特氏菌,卡他莫拉菌,结核分枝杆菌复合群,分枝杆菌,胞内分枝杆菌,堪萨斯分枝杆菌,赛分枝杆菌,结核分枝杆菌,脓肿分枝杆菌,龟分枝杆菌,肺炎支原体,脑膜炎奈瑟菌,巴西诺卡菌,盖尔森基兴诺卡菌,皮疽诺卡菌,新星诺卡菌,豚鼠炎诺卡菌,恙虫病东方体,奇异变形杆菌,绿假单胞菌,肠道沙氏菌,黏质沙雷氏菌,金黄色葡萄球菌,嗜麦芽窄食单胞菌,嵴链球菌,肺炎链球菌,酿脓链球菌,BK多瘤病毒,乙型肝炎病毒,人腺病毒D型,单纯疱疹病毒1型,单纯疱疹病毒2型,水痘‑带状疱疹病毒,人巨细胞病毒,人疱疹病毒7型,人博卡病毒1型,EB病毒,人疱疹病毒6型,人腺病毒B型,人腺病毒C型,人腺病毒E型,人细小病毒B19,JC多瘤病毒,KI多瘤病毒,WU多瘤病毒,黄曲霉,烟曲霉,黑曲霉,土曲霉,白色念珠菌,光滑念珠菌,克柔念珠菌,热带念珠菌,新型隐球菌,镰刀菌属,耶氏肺孢子菌,微小根毛霉,小孢根霉,米根霉,尖端赛多孢子菌,马尔尼菲篮状菌,人冠状病毒229E型,人冠状病毒HKU1型,人冠状病毒NL63型,人冠状病毒OC43型,人偏肺病毒,人呼吸道合胞病毒B型,甲型流感病毒H1N1,甲型流感病毒H2N2,甲型流感病毒H3N2,甲型流感病毒H5N1,甲型流感病毒H7N9,甲型流感病毒H9N2,乙型流感病毒,日本乙型脑炎病毒,中东呼吸综合征病毒,人呼吸道合胞病毒A型,人鼻病毒A型,人鼻病毒B型,人鼻病毒C型,新型冠状病毒,SARS冠状病毒;
[0012] 所述引物组包含如SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:350所示序列的引物。
[0013] 进一步地,所述引物组中SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:175为上游引物序列;SEQ ID NO:176至SEQ ID NO:350为下游引物序列。
[0014] 第二方面,本发明提供了一种基于tNGS的病原微生物检测用的试剂盒,其特征在于,包括上述引物组。
[0015] 进一步地,所述试剂盒其特征在于,还包括逆转录酶、DNA聚合酶和PCR产物纯化磁珠
[0016] 再进一步地,所述的试剂盒其特征在于,所述逆转录酶为2x RT Mix,所述DNA聚合酶为Multi‑PCR Mix,所述PCR产物纯化磁珠为DNAclean beads。
[0017] 更进一步地,所述试剂盒其特征在于,还包括超多重PCR扩增引物池、消化酶、DNA连接酶、测序接头和PCR反应Mix。
[0018] 第三方面,本发明提供了一种非诊断目的的用于检测病原微生物的靶向病原高通量测序方法,其特征在于,具体包括以下步骤:
[0019] 步骤1,提取待测样本中的总DNA及RNA;
[0020] 步骤2,将步骤1中得到的RNA逆转录成cDNA;
[0021] 步骤3,以步骤1中获得的总DNA和步骤2中逆转录得到的cDNA为模板,利用扩增引物池进行超多重PCR扩增;
[0022] 步骤4,对步骤3中得到的超多重PCR扩增产物进行酶处理,消化扩增产物两端的扩增引物部分;
[0023] 步骤5,在步骤4中得到的消化后PCR产物的两端连接上测序接头;
[0024] 步骤6,对步骤5得到的测序接头连接产物进行PCR扩增,得到tNGS测序文库;
[0025] 步骤7,对步骤6制备好的tNGS测序文库进行质检和定量,并根据文库定量结果进行混库;
[0026] 步骤8,对步骤7得到的混库后的测序文库进行高通量测序,得到测序序列;
[0027] 步骤9,对测序序列先进行引物识别,再与数据库中的病原序列进行对比,最终确定待测样本中的病原体种类。
[0028] 优选地,所述超多重PCR扩增的反应体系为:Multi‑PCR Mix 4μL、PCR Enhancer 1μL、Amplicon Primer Mix 1 5μL、总模板10μL,反应总体系20μL;超多重PCR扩增的反应条件为:95℃2min;95℃10s,60℃30s,72℃30s,循环30次;60℃15min,反应结束后产物冷却至4℃。
[0029] 优选地,所述步骤4中,所述扩增引物消化的反应体系为:DU Buffer 6μL、DU Enzyme 4μL,补加无核酸水洗脱的上步产物至总体积50μL;消化反应条件为:37℃10min;50℃10min;65℃5min,反应结束后产物冷却至4℃。
[0030] 优选地,所述步骤5中,所述连接测序接头的反应体系为:Adaptor 5μL、Ligase Buffer 15μL、Ligase 10μL、上步产物至总体积80μL;连接反应条件为:25℃15min;反应结束后产物冷却至4℃。
[0031] 有益效果:
[0032] 本发明基于不同感染类型的常见多发病原体,靶向病原高通量测序技术先选择一定数量的目标病原微生物,通过生物信息学方法确定其对应的保守核酸区域,针对每一种病原微生物的多个保守核酸区域分别设计特异性引物,再将这些目标病原微生物的全部特异性引物对合并到一起,混合成一个扩增引物池。
[0033] 实际应用时,先提取临床样本核酸,再利用该扩增引物池进行超多重PCR扩增,得到不同病原微生物的一系列特异性DNA片段,通过高通量测序技术读取核酸序列信息,接着直接与用于引物设计的病原保守核酸区域进行比对,即可确定具体病原微生物的种类信息。附图说明
[0034] 图1是宏基因租测序(mNGS)技术路线图。
[0035] 图2是本发明所述的检测病原微生物的靶向病原高通量测序(tNGS)技术路线图。

具体实施方式

[0036] 为了便于理解本发明,下面将对本发明进行更全面的描述,以下实施例,仅用于具体说明本发明,而不用于限制本发明的范围。本发明可以通过不同的形式来实现,并不限于本文所描述的实施例。提供以下实施例的目的只是便于理解本发明的公开内容。
[0037] 除非另有定义,本文中所使用的所有科学和技术术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。
[0038] 高通量测序(NGS):是一种可以同时对数十万到数百万条DNA分子序列进行读取的测序技术。
[0039] 宏基因组测序(mNGS):通过直接提取临床样本中的核酸进行文库构建和高通量测序,利用生物信息学算法分析样本中包含的病原微生物序列的种类。
[0040] 靶向病原高通量测序(tNGS):使用特异性引物,对目标病原微生物的特异性区域进行靶向扩增,获得大量目标DNA片段,再通过高通量测序技术对这些DNA片段进行测序,与目标序列进行比对,实现对病原微生物的鉴定。
[0041] 实施例1
[0042] 本发明所述的试剂盒计划通过超多重PCR扩增,对目标内病原微生物的特异性基因组区域进行扩增富集,然后利用高通量测序技术获取具体核酸序列,再通过生物信息学分析技术对这些核酸序列进行比对分型,从而实现同时检测上百种病原微生物。
[0043] 试剂盒开发过程如下所示:
[0044] (1)目标病原微生物的选择。前期通过查找文献及感染领域相关专家共识,确定目标病原微生物列表。
[0045] (2)特异性引物设计。检索相关病原数据库,通过软件确定特异性基因组区域,分别设计引物对。
[0046] (3)引物特异性确认。针对有标准菌株或菌液的病原微生物,购买标准菌株,无标准菌株的病原微生物合成对应质粒。
[0047] (4)引物筛选和替换。通过PCR扩增联合琼脂糖凝胶电泳方式,进行引物验证,去掉会导致引物二聚体出现或者扩增效率较低的引物,并重新设计及合成引物。
[0048] (5)引物配比条件优化。不同引物的扩增效率有高有低,为尽量平衡各引物之间的扩增效率,测试不同引物配比浓度。
[0049] (6)PCR反应条件优化。根据引物特性,选择合适的退火温度,并测试不用PCR扩增循环数。
[0050] 通过上述开发过程筛选获得目标病原院微生物的检测引物组,如表1所示。
[0051] 表1目标病原微生物及其对应tGNS引物组
[0052]
[0053]
[0054]
[0055]
[0056]
[0057]
[0058] 实施例2
[0059] 利用靶向病原高通量测序(tNGS)方法检测下呼吸道感染者肺泡灌洗液中的病原微生物,整个检测环节如下所示:
[0060] 1、样本前处理
[0061] 取500μL肺泡灌洗液样本加入0.2mm研磨珠,于振荡器上振荡5min,促使细胞破碎并释放核酸。
[0062] 2、核酸提取
[0063] (1)向振荡后的肺泡灌洗液样本中加入500μL核酸结合液及20μL蛋白酶K,充分混匀,50℃下孵育10min,之后加入500μL无水乙醇进行混合。
[0064] (2)取混合后的液体,加到套有收集管的离心柱上,10000rpm离心1min,弃掉滤液。
[0065] (3)向离心柱上加入500μL漂洗液1,10000rpm离心1min,弃掉滤液。
[0066] (4)向离心柱上加入700μL漂洗液2,10000rpm离心1min,弃掉滤液。
[0067] (5)向离心柱上加入500μL漂洗液2,10000rpm离心1min,弃掉滤液。
[0068] (6)将离心柱转移至新的1.5mL离心管上,向离心柱的中央悬空加入50μL Nuclease‑Free Water,室温下静置2min,8000rpm离心1min以收集核酸。
[0069] 3、tNGS文库构建
[0070] (1)使用本发明所述的靶向病原高通量测序(tNGS)试剂盒,试剂盒组成及保存条件如表二所示,先通过超多重PCR扩增富集待测样本中的病原微生物核酸靶序列。反应体系为:Multi‑PCR Mix 4μL、PCR Enhancer 1μL、Amplicon Primer Mix 15μL、总模板10μL,反应总体系20μL;超多重PCR的反应条件为:95℃2min;95℃10s,60℃30s,72℃30s,循环30次;60℃15min,反应结束后产物冷却至4℃。
[0071] (2)对扩增产物两端的扩增引物区域进行消化。反应体系为:DU Buffer6μL、DU Enzyme 4μL,补加无核酸水洗脱的上步产物至总体积50μL;消化反应条件为:37℃10min;50℃10min;65℃5min,反应结束后产物冷却至4℃。
[0072] (3)连接测序接头。反应体系为:Adaptor 5μL、Ligase Buffer 15μL、Ligase10μL、上步产物至总体积80μL;连接反应条件为:25℃15min;反应结束后产物冷却至4℃。反应结束后,再经过一次PCR扩增及产物纯化即可得到可供测序的tNGS文库。
[0073] 表2靶向病原高通量测序(tNGS)试剂盒
[0074]
[0075] 2x RT Mix:逆转录酶,用于将RNA逆转录为cDNA;
[0076] Multi‑PCR Mix:DNA聚合酶,用于多重PCR扩增;
[0077] Amplicon Primer Mix 1:超多重PCR扩增引物池;
[0078] DU Enzyme:消化酶,用于消化扩增产物两端的扩增引物部分;
[0079] Ligase:DNA连接酶,用于连接测序接头;
[0080] Adaptor:测序接头,用于区分不同样本的一段标记引物序列;
[0081] PCR Mix:PCR反应Mix,用于完成PCR扩增;
[0082] DNAclean beads:DNA纯化磁珠,用于纯化PCR扩增产物。
[0083] 4、文库质检与定量
[0084] (1)使用安捷伦2100生物片段分析仪对tNGS文库进行片段质检,正常文库的主片段大小在300bp~400bp,不存在明显的引物二聚体条带及大片段。
[0085] (2)使用Qubit 4.0荧光计对tNGS文库的dsDNA浓度进行准确定量,并按照文库的定量结果进行混合。
[0086] 5、上机测序
[0087] 取1p mol的混合tNGS文库,使用一步法DNB制备试剂盒制备DNA纳米球,向测序试剂槽中加入对应试剂,使用MGISEQ‑200RS基因测序仪进行高通量测序,测序读长为SE50。
[0088] 6、数据分析
[0089] 对原始的下机数据首先进行接头识别,识别出接头reads,截掉接头以及后续序列,然后进行低质量reads过滤,保留高质量测序数据;对高质量测序数据进行引物识别,再与已构建好的病原微生物数据库进行比对,最终确定样本中的病原体种类。
[0090] 7、报告解读
[0091] 使用对应类型的报告模板,填写样本来源信息及样本中检出的病原体种类及序列数。
[0092] 实施例3
[0093] 为了验证本发明所提供的靶向病原高通量测序(tNGS)方法的检测性能,针对同一样本,分别进行宏基因组测序和tNGS检测,比较二者结果的差异。对于二者检出不一致的病原体,额外使用商品化荧光PCR试剂盒进行验证。
[0094] 结果如下表3所示:
[0095] 表3宏基因组测序(mNGS)与靶向病原高通量测序(tNGS)结果比对
[0096]
[0097]
[0098] 结果显示,tNGS检出性能较好,针对宏基因组测序检出的目标病原体没有出现漏检情况,且额外检出的部分病毒,也通过荧光PCR验证为真阳性。
[0099] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。