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一种检测皮毛携带病毒的玻璃基因芯片
申请号	CN201220262256.6	申请日	2012-06-06	公开(公告)号	CN202595152U	公开(公告)日	2012-12-12
申请人	河南出入境检验检疫局检验检疫技术中心;			发明人	徐超; 王素方; 杨向莹; 袁萍; 刘亚风; 张子宏; 冯松凯; 李轲; 苗丽; 杨娜;
摘要	本实用新型涉及一种检测皮毛携带病毒的玻璃基因芯片，可有效解决对皮毛中携带病毒进行高通量、快速检测的问题，其技术方案是，包括玻璃基片和阵列分布于基片之上的氨基化修饰的寡核苷酸探针和杂交质控对照的点涂层，所述的玻璃基片上覆盖有醛基化处理层，玻璃基片的一端上有标记区层，醛基化处理层上有检测阵列，所述的检测阵列为1~12个，检测阵列上有点涂层，所述的点涂层为平行垂直排列，横向为11行，纵向为11列，所述的点涂层为圆形，包括点样质控探针点涂层、阳性杂交质控探针点涂层、病毒寡核苷酸探针点涂层、空白点样液对照点涂层和水对照点涂层，本实用新型结构简单，新颖独特，可同时对皮毛中携带的病毒进行高通量、快速检测。
权利要求	1.一种检测皮毛携带病毒的玻璃基因芯片，包括玻璃基片和阵列分布于基片之上的氨基化修饰的寡核苷酸探针和杂交质控对照的点涂层，其特征在于，所述的玻璃基片（1）上覆盖有醛基化处理层（2），玻璃基片的一端上有标记区层（4），醛基化处理层（2）上有检测阵列（3），所述的检测阵列为1~12个，检测阵列上有点涂层（5），所述的点涂层为平行垂直排列，横向为11行，纵向为11列，所述的点涂层为圆形，包括点样质控探针点涂层、阳性杂交质控探针点涂层、病毒寡核苷酸探针点涂层、空白点样液对照点涂层和水对照点涂层；所述的病毒寡核苷酸探针点涂层由蓝舌病病毒的寡核苷酸探针点涂层、口蹄疫病毒的寡核苷酸探针点涂层、山羊痘病毒的寡核苷酸探针点涂层、绵羊痘病毒的寡核苷酸探针点涂层、牛病毒性腹泻病毒的寡核苷酸探针点涂层组成。 2.根据权利要求1所述的检测皮毛携带病毒的玻璃基因芯片，其特征在于，所述的玻璃基片（1）长75mm，宽24mm，厚度为1.0mm。 3.根据权利要求1所述的检测皮毛携带病毒的玻璃基因芯片，其特征在于，所述点样质控探针点涂层为21个，阳性杂交质控探针点涂层为10个，病毒寡核苷酸探针点涂层各为 5个，空白点样液对照点涂层和水对照点涂层各为5个。
说明书全文	一种检测皮毛携带病毒的玻璃基因芯片技术领域 [0001] 本实用新型涉及基因芯片，特别是一种检测皮毛携带病毒的玻璃基因芯片。技术背景 [0002] 我国是世界上最大的皮毛及其产品的进出口国家，每年约进口8000多万张动物皮毛。动物皮毛是病原微生物的主要载体，已经发现有蓝舌病病毒(Bluetongue virus，BTV)、口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，FMDV)、山羊痘病毒（Goat poxvirus，GPV）、绵羊痘病毒（Sheep pox virus，SPPV）、牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）等5种病毒的案例。但目前，对这几种病毒的检测以病原的分离鉴定、血清中和实验（SN）、琼脂扩散试验(AGIP)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、核酸杂交、聚合酶链反应(PCR)等方法为主。只有零星的几篇对皮毛携带一种或两种的病毒的检测方法的报道，缺少对皮毛携带病毒的高通量检测方法。 [0003] 基因芯片(gene chip)，又称基因微阵列(gene microarray)，是20世纪90年代发展起来的一种新兴的分子生物学研究技术。基因芯片技术作为一种新兴的分子生物学研究方法，具有高通量、多样性、微量化以及自动化的特点。该基因芯片具有快速、准确，在疾病的诊断和病原体的筛查上发挥着越来越重要的作用。基因芯片检测技术的基本原理是将设计的大量特异性寡核苷酸探针有序的点样在空白基片上，固定后与荧光标记的待检核酸进行杂交，用芯片扫描仪对杂交结果进行扫描，最后对杂交结果进行分析判断。 [0004] 目前，国内外对同时检测皮毛中携带的蓝舌病病毒(Bluetongue virus，BTV)、口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，FMDV)、山羊痘病毒（Goat poxvirus，GPV）、绵羊痘病毒（Sheep pox virus，SPPV）、牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）等5种病毒的基因芯片尚未见报道。发明内容 [0005] 针对上述情况，为解决现有技术之缺陷，本实用新型的目的就是提供一种检测皮毛携带病毒的玻璃基因芯片，可有效解决对皮毛中携带的病毒进行高通量、快速检测的问题。 [0006] 本实用新型的技术方案是，包括玻璃基片和阵列分布于基片之上的氨基化修饰的寡核苷酸探针和杂交质控对照的点涂层，所述的玻璃基片上覆盖有醛基化处理层，玻璃基片的一端上有标记区层，醛基化处理层上有检测阵列，所述的检测阵列为1~12个，检测阵列上有点涂层，所述的点涂层为平行垂直排列，横向为11行，纵向为11列，所述的点涂层为圆形，包括点样质控探针点涂层、阳性杂交质控探针点涂层、病毒寡核苷酸探针点涂层、空白点样液对照点涂层和水对照点涂层；所述的病毒寡核苷酸探针点涂层由蓝舌病病毒的寡核苷酸探针点涂层、口蹄疫病毒的寡核苷酸探针点涂层、山羊痘病毒的寡核苷酸探针点涂层、绵羊痘病毒的寡核苷酸探针点涂层、牛病毒性腹泻病毒的寡核苷酸探针点涂层组成。 [0007] 本实用新型结构简单，新颖独特，可同时对皮毛中携带的病毒进行高通量、快速检测。附图说明 [0008] 图1为本实用新型的结构示意图。 [0009] 图2为本实用新型检测阵列上点涂层的分布图。具体实施方式 [0010] 以下对本实用新型的具体实施方式作详细说明。 [0011] 由图1-2所示，本实用新型包括玻璃基片和阵列分布于基片之上的氨基化修饰的寡核苷酸探针和杂交质控对照的点涂层，其特征在于，所述的玻璃基片1上覆盖有醛基化处理层2，玻璃基片的一端上有标记区层4，醛基化处理层2上有检测阵列3，所述的检测阵列为1~12个，检测阵列上有点涂层5，所述的点涂层为平行垂直排列，横向为11行，纵向为11列，所述的点涂层为圆形，包括点样质控探针点涂层、阳性杂交质控探针点涂层、病毒寡核苷酸探针点涂层、空白点样液对照点涂层和水对照点涂层； [0012] 所述的病毒寡核苷酸探针点涂层由蓝舌病病毒的寡核苷酸探针点涂层、口蹄疫病毒的寡核苷酸探针点涂层、山羊痘病毒的寡核苷酸探针点涂层、绵羊痘病毒的寡核苷酸探针点涂层、牛病毒性腹泻病毒的寡核苷酸探针点涂层组成。 [0013] 所述的玻璃基片1长75mm，宽24mm，厚度为1.0mm。 [0014] 所述点样质控探针点涂层为21个，阳性杂交质控探针点涂层为10个，病毒寡核苷酸探针点涂层各为5个，空白点样液对照点涂层和水对照点涂层各为5个。 [0015] 每个基片设置12个阵列，每个阵列为11×11，点间距为270μm，阵间距6.5mm，在上述的检测皮毛携带5种病毒的玻璃基因芯片中，所述点涂层中检测探针的阵列排布为： [0016] A1-A11， B1，C1，D1，E1，F1，G1，H1，I1，J1，K1为点样质控探针点涂层； [0017] B2-B11，K2-K11为阳性杂交质控探针点涂层； [0018] C2-C6 为检测蓝舌病病毒的寡核苷酸探针点涂层； [0019] E2-E6 为检测口蹄疫病毒的寡核苷酸探针点涂层； [0020] G2-G6为检测山羊痘病毒的寡核苷酸探针点涂层； [0021] G7-G11为检测绵羊痘病毒的寡核苷酸探针点涂层； [0022] H2-H6为检测牛病毒性腹泻病毒的寡核苷酸探针点涂层； [0023] J2-J6为空白点样液对照点涂层；J7-J11为水对照点涂层。 [0024] 所述的检测皮毛携带病毒的寡核苷酸探针与质控对照的点涂层大小，可以根据点直径、点个数、点间距、探针在阵列的相对位置、阵间距的变化而变化。 [0025] 本实用新型中引物和探针的设计是：将每个病毒的基因序列BLAST比对分析后，选择每个病毒的最保守序列作为检测探针。同时设计芯片点样质控探针和阳性杂交质控探针，探针碱基长度小于35bp的探针5’端加T尾到35bp。在设计的每种病毒的上游引物5’端标记TAMARA荧光基团。 [0026] 此外，本实用新型对待检样品的扩增方法也进行了优化，分别建立了一组检测蓝舌病病毒（BTV）、口蹄疫病毒（FMDV）、牛病毒性腹泻病毒（BVDV）三重PCR方法和一组检测山羊痘病毒（GPV）、绵羊痘病毒（SPPV）双重PCR体系。 [0027] 实施例1 [0028] 每张芯片上共设12个矩阵，横向为2个矩阵，纵向为6个矩阵，横向阵间距为6.5mm，纵向阵间距为6.0mm。每个矩阵为11×11探针涂层点组成，横向和纵向的点间距均为270μm，在上述的检测皮毛携带5种病毒的玻璃基因芯片中，所述点涂层中检测探针的阵列排布为： A1-A11， B1，C1，D1，E1，F1，G1，H1，I1，J1，K1为点样质控探针点涂层； B2-B11，K2-K11为阳性杂交质控探针点涂层；C2-C6 为检测蓝舌病病毒的寡核苷酸探针点涂层；E2-E6 为检测口蹄疫病毒的寡核苷酸探针点涂层；G2-G6为检测山羊痘病毒的寡核苷酸探针点涂层； [0029] G7-G11为检测绵羊痘病毒的寡核苷酸探针点涂层；H2-H6为检测牛病毒性腹泻病毒的寡核苷酸探针点涂层；J2-J6为空白点样液对照点涂层；J7-J11为水对照点涂层。 [0030] 实施例2 本实用新型所述检测皮毛中携带5种病毒的玻璃基因芯片的制备[0031] 引物和探针序列的设计和合成： [0032] 在NCBI上查找蓝舌病病毒（BTV）、口蹄疫病毒（FMDV）、山羊痘病毒（GPV）、绵羊痘病毒（SPPV）、牛病毒性腹泻病毒（BVDV）等5种病毒的基因组序列，BLAST比对分析后，分别以使用 Prime 5.0 软件设计BTV、FMDV、GPV、SPPV和BVDV的引物和相应的探针。在设计的每种病毒的上游引物5’端标记TAMARA荧光基团。引物合成、标记由宝生物（大连）有限公司完成。 [0033] 芯片构建： [0034] 根据合成的5种病毒检测寡核苷酸探针的摩尔质量，使用芯片点样液将各个探针稀释为30μmol/L。使用SmartArrayerTM 48芯片点样仪对空白基片点样。每张基片上12个矩阵，每个矩阵为11×11阵列。点样布局见图2。点样完毕将芯片置于恒温干燥箱中，80℃固定探针2-3h，4℃保存备用。 [0035] 实施例3　本实用新型所述玻璃基因芯片的操作程序 [0036] 多重PCR方法的反应： [0037] 使用25μL的反应体系，建立BTV、FMDV、BVDV的三重PCR，反应成分为2×MasterMix Taq酶 12.5μL，逆转录酶1μL，每种病毒的上下游引物各加0.5μL，病毒模板2μL，补超纯水至25μL进行PCR反应。条件为42℃反转录30min，预变性5min，94℃变性1min，52℃退火1min，72℃延伸1min，共30个循环。使用25μL的反应体系，建立GPV、SPPV的多重PCR。反应成分为2×MasterMix Taq酶 12.5μL，两种病毒的上下游引物各加 0.5μL，病毒模板2μL，补超纯水至25μL进行PCR反应。反应条件为94℃预变性5min， 94℃变性1min，52℃退火1min，72℃延伸1min，共35个循环。 [0038] 芯片杂交、清洗和扫描： [0039] 使用47％甲酰胺的杂交液（100%甲酰胺 3.75μL、20×SSC 2.25μL、10% SDS0.3μL、50×Denhardt’s 1.5μL，加水补足8.0μL），42℃预热后取8μL杂交液和7μL PCR产物混匀组成杂交反应体系，于95℃变性10min，冰浴5min，然后与制备芯片于芯片杂交仪中42℃，5 RPM旋转杂交4h。将杂交后的芯片在预热的洗液Ⅰ（2×SSC，0.2％SDS）中 42℃振荡洗涤3min，重复3次；再用预热洗液Ⅱ(0.2×SSC)中42℃振荡洗涤3min，重复3次，最后用预热的超纯水清洗一次，300rpm离心甩干后备检。选择Cy3激光通道，预热基因芯片扫描仪。置待检测芯片于扫描仪中，使用5μm分辨率，调整激光强度，扫描芯片。当点样质控位点为绿色荧光，阳性杂交质控位点也出现明显的绿色荧光，而空白对照和阴性对照为无荧光信号，判定结果成立。当检测某种病毒用的探针位点出现绿色荧光，判定为检出该种病毒。 [0040] 实施例4 本实用新型所述玻璃基因芯片的特异性 [0041] 使用酚氯仿法分别提取BTV、FMDV、GPV、SPPV、BVDV5种病毒的皮毛样品的核酸。每种病毒PCR产物分别与制备的病毒基因芯片杂交，结果显示芯片的探针之间无交叉反应，设计的检测探针特异性强。 [0042] 实施例5 本实用新型所述玻璃基因芯片的敏感性结果 [0043] 用TaKaRa MiniBEST 病毒核酸提取试剂盒（市售产品）和酚氯仿法提取分别提取5种病毒核酸，使用微量核酸蛋白仪定量后，进行100倍梯度稀释，PCR扩增后，与制备的病毒基因芯片进行杂交，经扫描分析病毒基因芯片可检测到BTV、FMDV、GPV、SPPV、BVDV阳 3 3 3 性杂交信号核酸浓度分别为1.5×10copies、1.0×10copies、10copies、0.7×10copies、 3 2.0×10copies。 [0044] 经过2011年3月至2012年3月，该基因芯片在送检的520份皮毛样品中实用，均取得了商业化检测每种病毒PCR试剂盒一致的效果。该基因芯片的探针的特异性好，与其它病毒核酸不发生杂交反应；检测灵敏度可以检测到100 copies的病毒核酸；该芯片稳定性好，可以室温放置6个月而不影响检测效果。构建的检测的皮毛中携带5种病毒的玻璃基因芯片适用于临床皮毛样品的检测。 [0045] 本实用新型结构简单，新颖独特，可同时对皮毛中携带的病毒进行高通量、快速检测，经济和社会价值巨大。