[0001] 本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种逆转肺癌顺铂耐药性的中药单体及其应用。

[0002] 基于国际癌症研究中心(IARC)2020年的统计数据，全球范围内新发肺癌病患数约为220万，占新发癌症总数的11.4％，是仅次于乳腺癌的最常见癌症类型。在中国，肺癌目前也是癌症死亡的首要原因，占所有癌症死亡病例数的近20％。尽管医疗技术在不断进步，但是肺癌患者的五年生存率依然很低，仅为15％左右。因此肺癌防治是我国恶性肿瘤防控面临的重大挑战。

[0003] 根据组织病理学及免疫组化特征，肺癌通常分为非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌(SCLC)。NSCLC的发病率远高于SCLC，约占肺癌总数的85％。目前临床上对于NSCLC的治疗越来越个体化。对于具有不同基因改变的NSCLC患者，相比于化疗，使用不同的酪氨酸激酶抑制剂来治疗，能够产生更高的应答率、更长的无进展生存期和更低的毒性。然而，对于无敏感基因突变的NSCLC患者，以铂类，特别是顺铂(DDP)为基础的联合化疗仍是不可或缺的治疗手段。但其在治疗过程中产生的获得性耐药仍然是目前临床上面临的重大难题。因此，探寻逆转非小细胞肺癌耐药的新药对临床上治疗非小细胞肺癌至关重要。

[0004] 飞龙掌血(Toddalia asiatica(L.)Lam)又名刺米通、三百棒、见血飞等，为芸香科飞龙掌血属植物，也是飞龙掌血属中唯一的植物。飞龙掌血是我国西南地区少数民族的传统民间药材，含有香豆素、生物碱、萜类、黄酮、酚酸等化学成分，具有抗炎镇痛、抗氧化、抗菌、心血管保护和抗肿瘤等药理作用，临床应用广泛。专利号为CN109172571A的发明专利公开了生物碱用于逆转肺癌顺铂耐药性的用途，CN114917219A的发明专利公开了异荭草素联合顺铂在制备逆转肺癌耐药的药物中的应用。暂未发现有关飞龙掌血素在逆转肺癌耐药的药物中的研究，从传统中药中寻找逆转非小细胞肺癌耐药的有效中药单体成分并明确其作用机制具有重大意义。

[0005] 有鉴于此，本发明提出了一种逆转肺癌顺铂耐药性的中药单体及其应用，该中药单体可以克服非小细胞肺癌顺铂耐药的作用，与顺铂联合用药能够显著提高非小细胞肺癌对顺铂的敏感性，抑制癌细胞的增殖。

[0006] 本发明的技术方案是这样实现的：第一，本发明提供了一种逆转肺癌顺铂耐药性的中药单体，其特征在于：所述中药单体为飞龙掌血素，结构式为：

[0007]

[0008] 在以上技术方案的基础上，优选的，所述肺癌为非小细胞肺癌。

[0009] 第二，本发明提供了一种逆转肺癌顺铂耐药性的中药单体在制备用于降低肺癌顺铂耐药性的药物中的应用。

[0010] 第三，本发明提供了一种逆转肺癌顺铂耐药性的中药单体在制备提升肺癌细胞对顺铂敏感性的药物中的应用。

[0011] 第四，本发明提供了一种逆转肺癌顺铂耐药性的中药单体联合顺铂在制备肺癌防治药物中的应用。

[0012] 本发明的一种逆转肺癌顺铂耐药性的中药单体及其应用相对于现有技术具有以下有益效果：

[0013] (1)本发明揭示了飞龙掌血素对于逆转非小细胞肺癌顺铂耐药具有显著作用，其效果明确可靠。

[0014] (2)本发明的中药单体成分单一、明确，其与顺铂联合用药能够显著提高非小细胞肺癌对顺铂的敏感性，抑制癌细胞的增殖。

[0015] (3)本发明的中药单体疗效好，使用方便，安全无毒副作用，适用于防治非小细胞肺癌顺铂耐药。

[0016] (4)本发明的中药单体飞龙掌血素逆转非小细胞肺癌顺铂耐药作用机制明确，其通过抑制Nrf2信号通路，下调相关耐药基因的表达，发挥克服非小细胞肺癌顺铂耐药的作用，使顺铂耐药指数由4.46降至1.53，具有显著的逆转作用。附图说明

[0017] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

[0018] 图1为非小细胞肺癌亲本细胞株A549及其顺铂耐药株A549/DDP顺铂和飞龙掌血素耐药指数的比较结果图；

[0019] 图2为飞龙掌血素对非小细胞肺癌顺铂耐药细胞株A549/DDP顺铂敏感性的影响结果图；

[0020] 图3为飞龙掌血素和顺铂及其联合对非小细胞肺癌顺铂耐药细胞株A549/DDP细胞增殖的影响结果图；

[0021] 图4为飞龙掌血素和顺铂及其联合对A549/DDP细胞克隆形成的影响结果图；

[0022] 图5为飞龙掌血素和顺铂及其联合对A549/DDP细胞中Nrf2信号通路的影响(mRNA水平)结果图；

[0023] 图6为飞龙掌血素和顺铂及其联合对A549/DDP细胞中Nrf2信号通路的影响(蛋白水平)结果图。

[0024] 下面将结合本发明实施方式，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。

[0025] 本发明所用飞龙掌血素直接购于成都德思特生物技术有限公司，纯度：HPLC≥98％，产品编码：DF0089，飞龙掌血素分子结构式为：

[0026]

[0027] 实施例1飞龙掌血素增强肺癌顺铂耐药细胞系的顺铂药物敏感性

[0028] 1、选择生长状态良好，处于对数生长期的A549和A549/DDP细胞以1×104个/孔的密度接种于96孔板中(每组设置6个复孔)，另设实验对照组(含培养液和细胞)、空白对照组(只加正常培养液，不加细胞)，细胞铺板后置于37℃、5％CO2培养箱中培养24h，24h后一组按照0μM、5μM、10μM、20μM、40μM、80μM的药物浓度分别在A549和A549/DDP细胞中加入顺铂，另一组按照0μM、10μM、20μM、40μM、80μM、160μM的药物浓度分别在A549和A549/DDP细胞中加入飞龙掌血素，第三组按照0μM、5μM、10μM、20μM、40μM、80μM的药物浓度在A549和A549/DDP细胞中分别加入顺铂和10μM飞龙掌血素，作用24h后分别加入CCK‑8试剂(10μL/孔)，37℃孵育2h后用酶标仪在450nm波长处测得吸光值，并按照公式计算细胞相对活力值并进行统计分析，公式为：细胞相对活力(％)＝(实验组吸光度‑空白组吸光度)/(对照组吸光度‑空白组吸光度)×100％。

[0029] 表1顺铂和飞龙掌血素的耐药指数

[0030]

[0031] 图1结果显示：如图1A所示，不管在哪种浓度顺铂处理下，顺铂耐药细胞的增殖活力均高于亲本细胞，说明与亲本株相比，顺铂耐药细胞对顺铂的敏感性降低。统计分析两者的IC50值，与亲本株相比，A549/DDP的耐药指数(RI)为4.46(表1)。而用不同浓度飞龙掌血素处理后的A549亲本株和顺铂耐药株之间的增殖活力没有显著性差异。也就是说不管在哪种浓度飞龙掌血素处理下，两种细胞株的增殖活力均相近，说明顺铂耐药并没有使细胞对飞龙掌血素也产生耐药性，即：飞龙掌血素抑制肺癌细胞的分子机制可能与顺铂不同(图1B)，统计分析两者的IC50值，与亲本株相比，A549/DDP的耐药指数(RI)为1.02(表1)。顺铂和飞龙掌血素联用后，耐药指数由4.46降低至1.53，表明飞龙掌血素具有逆转顺铂耐药性的效果。

[0032] 2、选择生长状态良好，处于对数生长期的A549/DDP细胞以1×104个/孔的密度接种于96孔板中(每组设置6个复孔)，另设实验对照组(含培养液和细胞)、空白对照组(只加正常培养液，不加细胞)，细胞铺板后置于37℃、5％CO2培养箱中培养24h，24h后一组按照0μM、5μM、10μM、20μM、40μM、80μM的药物浓度在A549/DDP细胞中加入顺铂，另一组按照同样的药物浓度在A549/DDP细胞中加入顺铂和10μM飞龙掌血素，作用24h后分别加入CCK‑8试剂(10μL/孔)，37℃孵育2h后用酶标仪在450nm波长处测得吸光值，并计算细胞相对活力值并进行统计分析，计算公式为：细胞相对活力(％)＝(实验组吸光度‑空白组吸光度)/(对照组吸光度‑空白组吸光度)×100％。

[0033] 图2结果显示：随着顺铂浓度的递增，顺铂耐药细胞株A549/DDP的活力逐渐降低。与顺铂组相比，顺铂和飞龙掌血素联合处理后的耐药细胞株细胞活力显著降低。

[0034] 实施例2飞龙掌血素与顺铂联合用药的协同作用

[0035] 选择生长状态良好，处于对数生长期的A549/DDP细胞以1×104个/孔的密度接种于96孔板中(每组设置6个复孔)，另设实验对照组(含培养液和细胞)、空白对照组(只加正常培养液，不加细胞)，细胞铺板后置于37℃、5％CO2培养箱中培养24h，24h后分别用10μM飞龙掌血素或/和10μM顺铂处理(DMSO处理对照组)，作用24h后分别加入CCK‑8试剂(10μL/孔)，37℃孵育2h后用酶标仪在450nm波长处测得吸光值，并计算细胞相对活力值并进行统计分析，计算公式为：细胞相对活力(％)＝(实验组吸光度‑空白组吸光度)/(对照组吸光度‑空白组吸光度)×100％。

[0036] 图3结果显示：与对照组、顺铂组和飞龙掌血素组相比，飞龙掌血素和顺铂联合组可显著抑制A549/DDP细胞的活力。

[0037] 实施例3飞龙掌血素联合顺铂对肺癌顺铂耐药细胞株增殖的抑制作用

[0038] 选择生长状态良好，处于对数生长期的A549/DDP细胞用0.25％的胰酶消化吹散至3
单细胞状态，以1×10 个/孔的密度接种于6孔板中，细胞铺板后置于37℃、5％CO2培养箱中培养24h，24h后分别用10μM飞龙掌血素或/和10μM顺铂处理(DMSO处理对照组)，期间每隔3天更换一次含对应药物的培养基。待肉眼可见细胞克隆且大小合适时，弃原培养基，每孔加入1×PBS溶液洗1次，弃PBS，每孔加入500μL4％多聚甲醛室温固定30min。弃多聚甲醛，每孔加入500μL1×PBS溶液洗3次，3～5min/次。弃PBS，每孔加入500μL 0.2％结晶紫室温染色
20min。弃结晶紫染色液，每孔加入1×PBS溶液洗3次，3～5min/次，弃PBS，晾干后采集图像并进行统计分析。

[0039] 图4结果显示：与对照组相比，顺铂组、飞龙掌血素组和飞龙掌血素联合顺铂处理组均能减少细胞克隆数，而联合组的抑制能力大于顺铂组和飞龙掌血素组，说明飞龙掌血素联合顺铂能显著抑制肺癌顺铂耐药细胞的克隆形成，起到抑制细胞增殖的作用。

[0040] 实施例4飞龙掌血素通过抑制Nrf2信号通路克服肺癌顺铂耐药

[0041] 1、选择生长状态良好，处于对数生长期的A549/DDP细胞以1×106个/孔的密度接种于6孔板中，细胞铺板后置于37℃、5％CO2培养箱中培养24h，24h后分别用10μM飞龙掌血素或/和10μM顺铂处理(DMSO处理对照组)24h。药物处理结束后，弃原培养基，每孔加入500μL 1×PBS溶液洗1次，弃PBS，每孔加入1mL Trizol试剂，置于4℃冰箱的摇床中摇20min。20min后反复吹打孔板底部，并将Trizol移至无核酸酶的1.5mL EP管中，加入1/5Trizol体积的氯仿即200μL氯仿，上下轻轻颠倒混匀，冰上放置10min。随后12000g 4℃离心7min。离心结束后，取水相上清加入预冷的等体积异丙醇，上下颠倒混匀，置于‑20℃静置1h。1h后
12000g 4℃离心10min，EP管管底会出现白色沉淀。弃上清，加入1mL 75％的乙醇上下颠倒清洗白色沉淀，12000g 4℃离心10min。弃尽上清，EP管敞口室温放置5min挥发残留的乙醇，随后加入适量DEPC水溶解RNA沉淀。用微量定量仪测定RNA含量并电泳鉴定RNA结构完整后，用逆转录试剂盒(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)合成cDNA。以合成的cDNA为模板，依据ChamQ SYBR qPCR MasterMix试剂盒说明书进行实时荧光定量PCR检测(β‑actin为内参基因)。Realtime PCR引物序列如下:Nrf2，F：5′‑CGACGGAA AGAGTATGAG‑3′，R：5′‑GGCAACCTGGGAGTAG‑3′；HO‑1，F：5′‑GCTGGCA GGAGGTCAT‑3′，R：5′‑TTTCTGGGCAATCTTTT‑3′；
NQO1，F：5`‑AAAGGACA TCACAGGTAAA‑3`，R：5`‑CAGAATGGCAGGGACT‑3`；β‑actin，F：5`‑CATG TACGTTGCTATCCAGGC‑3`，R：5`‑CTCCTTAATGTCACGCACGAT‑3`。

[0042] 图5结果显示：与对照组相比，飞龙掌血素组、顺铂组以及飞龙掌血素联合顺铂处理组中Nrf2及其下游靶蛋白HO‑1、NQO1的mRNA水平均显著性下调，而飞龙掌血素联合顺铂处理组Nrf2、HO‑1和NQO1的表达下调最为显著，说明飞龙掌血素是通过抑制Nrf2信号通路克服肺癌顺铂耐药。

[0043] 2、选择生长状态良好、处于对数生长期的A549/DDP细胞以1×106个/孔的密度接种于6孔板中，细胞铺板后置于37℃、5％CO2培养箱中培养24h，24h后分别用10μM飞龙掌血素或/和10μM顺铂处理(DMSO处理对照组)24h。药物处理结束后，弃原培养基，每孔加入500μL 1×PBS溶液洗1次，弃PBS，每孔加入200μL含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，冰上裂解30min。随后用细胞刮子收集裂解液，12000g 4℃离心10min，取上清，并利用BCA蛋白浓度试剂盒进行蛋白定量。随后上清液加入5×上样缓冲液并置于沸水浴中处理10min变性，每个样本按照20μg/孔的蛋白量上样，通过10％或12.5％的SDS‑PAGE凝胶电泳分离蛋白并转印至0.45μm或0.22μm的PVDF膜上。随后将膜放入5％BSA(牛血清白蛋白)溶液中在37℃恒温箱中封闭1h。依据Nrf2、HO‑1、NQO1和β‑actin的抗体说明书稀释一抗，4℃孵育过夜。次日用1×TBST溶液洗膜3次(10min/次)后，室温孵育HRP标记的二抗1h，孵育结束后1×TBST溶液洗膜3次(10min/次)，随后通过ECL发光液进行化学发光成像并采集图像(以β‑actin为内参蛋白)。

[0044] 图6结果显示：与对照组相比，飞龙掌血素组、顺铂组以及飞龙掌血素联合顺铂处理组中Nrf2及其下游靶蛋白HO‑1、NQO1的蛋白水平均显著性下调，而飞龙掌血素联合顺铂处理组Nrf2、HO‑1和NQO1的表达下调最为显著，说明飞龙掌血素是通过抑制Nrf2信号通路克服肺癌顺铂耐药。

[0045] 以上所述仅为本发明的较佳实施方式而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。