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嵌合抗原受体T细胞
申请号 CN202280044139.9 申请日 2022-04-21 公开(公告)号 CN117751181A 公开(公告)日 2024-03-22
申请人 帝国理工学院有限公司; 发明人 徐晓宁; 马伟伟; 钱宇新;
摘要 本 发明 涉及嵌合 抗原 受体(CAR)T细胞，并且具体地但不排他地涉及它们在免疫疗法中的用途，以及用于 治疗 、 预防 或改善癌症(例如T细胞淋巴瘤)、各种 微 生物 感染(例如HIV和TB)以及自身免疫性 疾病 的用途。本发明特别涉及CAR工程化粘膜相关恒定T(MAIT)细胞的用途，以及用于刺激、分离和扩增高度纯化的MAIT细胞的新方法，然后可以将其工程化改造为此类CAR‑MAIT细胞。本发明还涉及体外扩增MAIT细胞的方法。
权利要求

1.一种分离MAIT细胞的方法，所述方法包括：
(i)提供外周血单核细胞(PBMC)；和
(ii)对PBMC进行磁激活细胞分选(MACS)和/或荧光激活细胞分选(FACS)以从中分离
MAIT细胞。
2.一种产生CAR‑MAIT细胞的方法，所述方法包括：
(i)提供外周血单核细胞(PBMC)；
(ii)对PBMC进行MACS和/或FACS以从中分离MAIT细胞；
(iii)激活分离的MAIT细胞，任选地通过使它们与抗CD3和/或抗CD28抗体接触；和
(iv)用编码CAR的核酸转导激活的MAIT细胞，从而产生CAR‑MAIT细胞。
3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法包括在对PBMC进行MACS和/或FACS之前刺激PBMC。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述刺激步骤包括使PBMC接触：(a)包含MR1/5‑OP‑RU或5‑OP‑RU的抗原；和/或(b)细胞因子；优选地，所述刺激步骤包括使PBMC接触：(a)包含MR1/5‑OP‑RU或5‑OP‑RU的抗原；和(b)细胞因子。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述细胞因子是白细胞介素。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其中所述细胞因子是选自IL‑2、IL‑7、IL‑12、IL‑15、IL‑18和IL‑23或其任意组合中的一种或多种白细胞介素。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述一种或多种白细胞介素包含：(i)IL‑2；(ii)IL‑12和IL‑18；(iii)IL‑2、IL‑12和IL‑18；(iv)IL‑12、IL‑18和IL‑23；(v)IL‑2、IL‑12、IL‑
18和IL‑23，或(vi)IL‑7、IL‑15、IL‑12和IL‑18。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其中所述一种或多种白细胞介素包含IL‑12、IL‑18和IL‑23的组合。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法包括对PBMC进行MACS和FACS以从中分离MAIT细胞。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中对PBMC进行MACS，然后进行FACS。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述分离的MAIT细胞用抗CD3抗体激活。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述分离的MAIT细胞用抗CD28抗体激活。
13.根据权利要求2至12中任一项所述的方法，其中步骤(iv)包括用编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸转导MAIT细胞，任选地所述转导通过病毒或逆转录病毒进行。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述核酸编码靶向T细胞上的CD4抗原的CAR。
15.根据权利要求13所述的方法，其中所述核酸编码靶向T细胞上的至少一个或多个
TCR Vbeta区的CAR。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述一个或多个TCR Vbeta区是(i)表1中所示的TCR Vbeta区，和/或(ii)选自由以下Vbeta区：Vb 1、Vb 2、Vb 3、Vb 5.1、Vb 7.1、Vb8、Vb 
12、Vb 13.1、Vb 17和Vb 20。
17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法包括在步骤(iv)之后的后续步骤中扩增CAR‑MAIT细胞。
18.根据权利要求17所述的方法，其中CAR‑MAIT细胞的扩增步骤包括在转导后一天或两天收获转导的CAR‑MAIT细胞；任选地其中收获的细胞与白细胞介素接触，优选IL‑2；任选地其中所述白细胞介素是在R10培养基中。
19.一种通过根据前述权利要求中任一项所述的方法获得或可获得的CAR‑MAIT细胞。
20.一种表达嵌合抗原受体(CAR)的粘膜相关恒定T(MAIT)细胞。
21.根据权利要求19或20所述的MAIT细胞，其中所述CAR‑MAIT细胞表达靶向T细胞上的CD4抗原的CAR，任选地其中所述CAR对包含基本上如SEQ ID No：1所示的氨基酸或其变体或片段的CD4抗原具有特异性。
22.根据权利要求19或20所述的MAIT细胞，其中所述CAR‑MAIT细胞表达靶向T细胞上的T细胞受体(TCR)β链可变区(Vbeta)的CAR；任选地(i)如表1所示的任意一个Vbeta区，或者(ii)T细胞上的多个T细胞受体(TCR)β链可变区(Vbeta)，任选地其中所述多个Vbeta区选自表1所示的一组Vbeta区，任选地其中所述多个TCR Vbeta区是相同或不同的Vbeta区。
23.根据权利要求22所述的MAIT细胞，其中所述CAR靶向选自下组的T细胞上的一个或多个TCR Vbeta区：Vb 1、Vb 2、Vb 3、Vb 5.1，Vb 7.1、Vb 8、Vb 12、Vb 13.1、Vb 17和Vb 20，任选地其中所述CAR对包含基本上如SEQ ID No：2所示的氨基酸或其变体或片段的TCR Vbeta区具有特异性。
24.根据前述权利要求中任一项所述的MAIT细胞，其中所述CAR‑MAIT细胞包含一种或多种编码序列，其允许所述CAR‑MAIT细胞被可控地或诱导性地消除。
25.根据权利要求24所述的MAIT细胞，其中所述一种或多种编码序列编码表皮生长因子受体(EGFR)或截短的表皮生长因子受体(tEGFR)，任选地其中所述一种或多种编码序列包含编码基本上如SEQ ID No：22所示的氨基酸序列的核苷酸序列或其片段或变体，和/或包含基本上如SEQ ID No：23所示的核苷酸序列或其片段或变体。
26.根据权利要求24或25所述的MAIT细胞，其中所述一种或多种编码序列编码诱导型半胱天冬酶9(iC9)，任选地其中所述一种或多种编码序列包含编码基本上如SEQ ID No：24中所示的氨基酸序列的核苷酸序列或其片段或变体，和/或包含基本上如SEQ ID No：25所示的核苷酸序列或其片段或变体。
27.一种药物组合物，其包含根据权利要求19至26中任一项所述的MAIT细胞和药学上可接受的赋形剂。
28.根据权利要求19至26中任一项所述的MAIT细胞或根据权利要求27所述的药物组合物用于治疗。
29.根据权利要求19至26中任一项所述的MAIT细胞或根据权利要求27所述的药物组合物用于(i)免疫疗法；(ii)治疗、预防或改善癌症；(ii)治疗、预防或改善微生物感染；或(iv)治疗、预防或改善自身免疫性疾病。
30.根据权利要求19至26中任一项所述的MAIT细胞或根据权利要求27所述的药物组合物用于根据权利要求28或29所述的用途，其中用于治疗、预防或改善T细胞恶性肿瘤，任选实体瘤或液态肿瘤。
31.根据权利要求19至26中任一项所述的MAIT细胞或根据权利要求27所述的药物组合物用于根据权利要求30所述的用途，其中所述T细胞恶性肿瘤是外周T细胞淋巴瘤(PTCL)或皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)。
32.根据权利要求19至26中任一项所述的MAIT细胞或根据权利要求27所述的药物组合物用于根据权利要求31所述的用途，其中：
(i)所述PTCL是选自下组的PTCL亚型：成人T细胞急性淋巴细胞性淋巴瘤或白血病
(ATL)、肠病相关淋巴瘤、肝脾淋巴瘤、皮下脂膜炎样淋巴瘤(SPTCL)、前体T细胞急性淋巴细胞性淋巴瘤或白血病和血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤(AITL)；和/或
(ii)所述CTCL是选自下组的CTCL亚型：蕈样肉芽肿(MF)、塞扎里综合征(SS)和CD4+小中型多形性T细胞淋巴增殖性疾病。
33.根据权利要求19至26中任一项所述的MAIT细胞或根据权利要求27所述的药物组合物用于根据权利要求29所述的用途，其中用于治疗、预防或改善(i)病毒感染，任选HIV、HBV、HTLV、EBV或HPV，(ii)细菌感染，任选TB，或(iii)真菌感染；或者用于治疗、预防或改善自身免疫性疾病，例如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎或重症肌无力。
34.根据权利要求19至26中任一项所述的MAIT细胞或根据权利要求27所述的药物组合物用于根据权利要求28至33中任一项所述的用途，其中所述用途包括触发编码自杀蛋白的序列，任选地其中所述方法包括向受试者施用抗EGFR抗体和/或半胱天冬酶诱导药物(CID)。
35.一种制备根据权利要求27所述的药物组合物的方法，所述方法包括将治疗有效量的根据权利要求19至26中任一项所述的MAIT细胞与药学上可接受的赋形剂组合。
36.一种在PBMC培养物中刺激MAIT细胞的方法，所述方法包括使PBMC培养物接触：(a)包含MR1/5‑OP‑RU或5‑OP‑RU的抗原；和/或(b)选自IL‑2、IL‑7、IL‑12、IL‑15、IL‑18和IL‑23或其任意组合中的一种或多种白细胞介素。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述方法包括使PBMC培养物接触：(a)包含MR1/
5‑OP‑RU或5‑OP‑RU的抗原；和(b)选自IL‑2、IL‑7、IL‑12、IL‑15、IL‑18和IL‑23或其任意组合中的一种或多种白细胞介素。
38.根据权利要求36或37所述的方法，其中所述一种或多种白细胞介素是IL‑12、IL‑18和/或IL‑23。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述一种或多种白细胞介素是IL‑12、IL‑18和IL‑23。
说明书全文

嵌合抗原受体T细胞

[0001] 本发明涉及嵌合抗原受体(CAR)T细胞，并且具体地但不排他地涉及它们在免疫疗法中的用途，以及用于治疗、预防或改善癌症(例如T细胞淋巴瘤)、各种微生物感染(例如HIV和TB)以及自身免疫性疾病的用途。本发明特别涉及CAR工程化粘膜相关恒定T(MAIT)细胞的用途，以及用于刺激、分离和扩增高度纯化的MAIT细胞的新方法，然后可以将其工程化改造为此类CAR‑MAIT细胞。本发明还涉及体外扩增MAIT细胞的方法。本发明延伸至遗传构建体本身，以及它们在产生CAR‑MAIT细胞中的用途，以及转导的CAR‑MAIT细胞本身。本发明还延伸至构建体和转导的CAR‑MAIT细胞的各种医学用途，以及包含这些构建体和CAR‑MAIT细胞的药物组合物。
[0002] T细胞淋巴瘤是一组异质性临床侵袭性疾病，包括外周T细胞淋巴瘤(PTCL)，例如由人类T淋巴细胞病毒I型(HTLV‑1)引起的成人T细胞白血病/淋巴瘤(ATL)，皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)，例如塞扎里综合征(SS)。T细胞恶性肿瘤比B细胞恶性肿瘤更难治疗。ATL和SS代表一种罕见且通常具有侵袭性的T细胞淋巴瘤类型，目前还没有足够的患者参加随机试验来建立治疗标准。因此，常用的一线疗法与治疗其他类型T细胞淋巴瘤的疗法相同。例如，目前获得许可的治疗T细胞恶性肿瘤的药物包括化疗药物、生物反应调节剂(例如干扰素、贝沙罗汀和HDAC抑制剂)、单克隆抗体(阿仑单抗、莫加穆利珠单抗、本妥昔单抗)、造血干细胞移植(HSCT)和体外光分离疗法(ECP)等。然而，没有一种治疗方案在其总体反应率或反应持续时间方面优于其他治疗方案。尽管同种异体(HSCT)是唯一潜在的治疗方案，但由于高龄和合并症以及HSCT相关死亡率，大量患者可能不适合HSCT。因此，需要更有效的治疗，因为目前ATL治疗的中位生存期仅为8个月(Katsuya等，2015)。
[0003] 最近FDA批准的基于嵌合抗原受体(CAR)的T细胞疗法(CAR‑T)被认为是治疗B细胞恶性肿瘤最重大的突破之一，通过靶向CD19抗原实现了近100％的缓解(Park等，2018)。尽管CAR‑T治疗B细胞恶性肿瘤有效，但针对T细胞衍生恶性肿瘤的类似方法尚未建立。与大多数含有相同免疫球蛋白基因重排(即克隆)并表达泛B细胞标记物(例如CD19)的B细胞恶性肿瘤一样，大多数(>95％)ATL和CTCL源自表达确定的T细胞受体(TCR)基因(即克隆TCR‑Vbeta链)和泛T辅助细胞标记物CD4的优势T细胞克隆。因此，通过单克隆抗体(mAb)靶向泛T细胞标记物(例如CD4或TCR‑Vb链)来治疗T淋巴瘤已经过测试，但在小型临床试验中仅取得了部分疗效。
[0004] 目前的CAR‑T疗法主要基于传统的αβT细胞。然而，αβT细胞的抗原识别受到MHC的严重限制，这使得其适合自体治疗，但异体过继转移非常困难。此外，由于αβT细胞的肿瘤浸润不足，传统的CAR‑T疗法在实体瘤(如CTCL)中显示出较低的疗效，但在液态肿瘤治疗中具有广阔的前景。然而，传统的CAR‑T细胞疗法有一些主要缺点，限制了其进一步应用。例如，目前的CAR‑T疗法：(i)受到移植物抗宿主病(GVHD)导致的自体输血的限制，(ii)受到细胞因子释放综合征的靶向/脱瘤毒性的限制；(iii)自体CAR‑T的缺点，例如患者T细胞功能的变异性、产品标准化和成本。
[0005] 因此，需要为T细胞恶性肿瘤(例如T细胞淋巴瘤，包括PTCL和CTCL)以及治疗微生物感染(例如HIV和TB)提供改进的免疫疗法。
[0006] 为了治疗T细胞恶性肿瘤，发明人将注意力集中在粘膜相关恒定T细胞(MAIT细胞)上，它们是免疫系统中T细胞的一个亚群，表现出先天的类效应性。MAIT细胞由T细胞受体链Vα7.2的恒定使用定义，受主要组织相容性复合体(MHC)‑Ib相关蛋白MR1的限制，并表现出C型凝集素CD161和IL18受体的高表达。在人类中，MAIT细胞存在于血液、肝脏、肺和粘膜中，可防御微生物活动和感染。MHC I类蛋白MR1负责将细菌产生的维生素B代谢物(例如5‑OP‑RU)呈递给MAIT细胞。MR1呈递外源抗原后，MAIT细胞会分泌促炎细胞因子，并能够裂解细菌感染的细胞。
[0007] 目前的MAIT细胞扩增方法需要使用人同种异体饲养细胞来支持MAIT细胞在体外培养的生长，这对于人类适应性免疫治疗的大规模生产和质量控制来说是困难的。此外，使用这些已知方法产生的MAIT细胞含有一定比例的其他细胞亚群，例如常规CD4+T细胞和CD8+T细胞，因此这使得所得MAIT分离物完全不适合用于同种异体过继转移，因为这些细胞亚群会导致移植物抗宿主病(GvHD)。
[0008] 因此，还需要一种改进的方法来刺激和分离纯MAIT细胞培养物，而不需要同种异体饲养细胞，以扩大MAIT细胞的生产，从而用于同种异体过继转移。
[0009] 如示例中所述，发明人开发了一种用于从人PBMC中刺激和分离高纯度MAIT细胞培养物的新方法。发明人还开发了一些新颖的遗传构建体和载体(在本文中称为“CART4”和“CARTVb7.1”)，它们编码嵌合抗原受体(CAR)，然后转导至纯MAIT细胞中，从而产生CAR‑MAIT细胞，这种细胞会特异性地靶向T细胞上的CD4分子(使用“CART4”)或TCR‑Vbeta 7.1链(使用“CARTVb7.1”)。这是通过创建包含以下任一者的scFv的新型遗传构建体来实现的：(i)抗CD4 mAb(例如Hu5A8)或(ii)抗TCR‑Vb 7.1mAb(例如3G5)，与CD28/4‑1BB/CD3zeta链信号传导部分一起形成第三代CAR。然后将这些CAR转导至从外周血单核细胞(PBMC)纯化的MAIT细胞中，以产生靶向T细胞上的CD4或T细胞上的TCR‑Vbeta 7.1链的最终CAR‑MAIT细胞。发明人已经证实，这些CAR‑MAIT细胞令人惊讶地表现出与常规CAR‑T细胞相当甚至更优异的抗T淋巴瘤活性。
[0010] 因此，在本发明的第一方面，本文提供了表达嵌合抗原受体(CAR)的粘膜相关恒定T(MAIT)细胞。
[0011] 如本文所述，MAIT细胞是表达恒定T细胞受体(TCR)的非常规和先天性T细胞，在哺乳动物进化过程中高度保守，识别MR1蛋白呈递的微生物抗原，并存在于人类血液中并维持组织稳态以获得广泛的抗菌反应性。此外，有利的是，MAIT细胞的抗原识别机制不依赖于MHC，这使得MAIT细胞成为同种异体T细胞杀伤疗法的有力的候选者，使得其不限于自体疗法，如当前依赖于MHC的T细胞疗法。换句话说，MAIT细胞具有较低的同种异体反应性，并且不易诱发人类移植物抗宿主病(GVHD)，因此代表了同种异体CAR‑T疗法的理想T细胞亚群。相比之下，本发明的CART‑MAIT细胞和由此产生的细胞疗法可以容易地进行同种异体转移，并且MAIT细胞的内源性特征使其成为浸润到外周组织用于实体瘤治疗的有希望的候选者。
因此，CAR‑MAIT细胞能够有效地渗透到实体瘤中，这使得基于MAIT细胞的细胞疗法成为实体瘤和液态肿瘤的有前景的疗法。
[0012] 有利的是，本发明的CAR‑MAIT细胞可用于治疗T细胞恶性肿瘤，例如由人类T淋巴细胞病毒I型(HTLV‑1)引起的成人T细胞白血病/淋巴瘤(ATL)，皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)，例如塞扎里综合征(SS)。应当理解，T细胞恶性肿瘤是一组异质性临床侵袭性疾病，并且比B细胞恶性肿瘤更难治疗。有利的是，CAR‑MAIT疗法预计对实体瘤表现出增强的功效并且是同种异体的，从而不需要自体移植，因此将其定位为即用型疗法。
[0013] 优选地，在一个实施方案中，CAR‑MAIT细胞表达靶向T细胞上的CD4抗原的CAR。因此，优选地，CAR对T细胞上的CD4抗原具有特异性。应当理解，CD4抗原是在免疫细胞例如T辅助细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突细胞表面上发现的糖蛋白(T细胞表面糖蛋白CD4[智人]UniProt No.P01730.1；NCBI参考序列NP_000607.1)。CD4抗原的多肽序列的一个实施方案在本文中表示为SEQ ID No：1，如下：
[0014]
[0015] 因此，优选地，CAR对包含基本上如SEQ ID No：1所示的氨基酸序列或其变体或片段的CD4抗原具有特异性。
[0016] 优选地，在另一个实施方案中，CAR‑MAIT细胞表达靶向T细胞上的T细胞受体(TCR)β链可变区(Vbeta)的CAR。应当理解，T细胞受体(TCR)是在T细胞或T淋巴细胞表面上发现的蛋白质复合物，其负责将抗原片段识别为与主要组织相容性复合物(MHC)分子结合的肽。TCR由两条不同的蛋白质链组成。在人类中，95％的T细胞中的TCR由TRA编码的alpha(α)链和TRB编码的beta(β)链组成。
[0017] 下面的表1列出了T细胞上的Vbeta区以及相关的编码基因，并且它们中的任何一个或多个可以被本发明的CAR‑MAIT细胞上的CAR靶向。
[0018] 表1–T细胞上的β链可变区(Vbeta)
[0019]
[0020]
[0021] CAR‑MAIT细胞可以表达靶向T细胞上的多个T细胞受体(TCR)β链可变区(Vbeta)的CAR。优选地，多个Vbeta区可以选自表1中所示的一组Vbeta区。例如，CAR‑MAIT细胞可以表达靶向T细胞上的至少两个、至少三个或至少四个T细胞受体(TCR)β链可变区(Vbeta)的CAR，优选地如表1所示。CAR‑MAIT细胞可以表达靶向T细胞上的至少五个、至少六个或至少七个T细胞受体(TCR)β链可变区(Vbeta)的CAR，优选地如表1所示。多个TCR Vbeta区可以是相同或不同的Vbeta区。
[0022] 以下Vb家族被认为经常与T细胞淋巴瘤相关，即Vb 1、Vb 2、Vb 3、Vb 5.1、Vb 7.1、Vb 8、Vb 12、Vb 13.1、Vb 17和Vb 20。因此，在优选的实施方案中，CAR‑MAIT细胞表达靶向T细胞上的一个或多个TCR Vbeta区的CAR，这些Vbeta区选自以下：Vb 1、Vb 2、Vb3、Vb 5.1、Vb 7.1、Vb 8、Vb 12、Vb 13.1、Vb 17和Vb 20。优选地，CAR‑MAIT细胞表达靶向T细胞上的至少两个或三个TCR Vbeta区的CAR，这些Vbeta区选自以下：Vb 1、Vb 2、Vb 3、Vb 5.1、Vb 7.1、Vb 8、Vb 12、Vb 13.1、Vb 17和Vb 20。
[0023] 因此，优选地，CAR对T细胞上的至少一个或多个TCR Vbeta区具有特异性，最优选TCR‑Vbeta 7.1链。TCR Vbeta 7.1区的多肽序列(智人重排的TCR Vbeta 7.1UniProtKB/Swiss‑Prot:A0A577.1)的一个实施方案在本文中表示为SEQ ID No：2，如下：
[0024] MGCRLLCCAVLCLLGAVPIDTEVTQTPKHLVMGMTNKKSLKCEQHMGHRAMYWYKQKAKKPPELMFVYSYEKLSINESVPSRFSP
[0025] ECPNSSLLNLHLHALQPEDSALYLCASSQ
[0026] [SEQ ID No:2]
[0027] 因此，优选地，CAR对包含基本上如SEQ ID No：2所示的氨基酸序列或其变体或片段的至少一个或多个TCR Vbeta区(更优选TCR‑Vbeta 7.1链)具有特异性。
[0028] 优选地，CAR‑MAIT细胞被配置为通过诱导细胞凋亡来直接杀死靶向T细胞。
[0029] 优选地，CAR‑MAIT细胞包含一种或多种编码序列，其允许可控地或诱导地消除CAR‑MAIT细胞，例如在患者不良反应的情况下。技术人员可以将该一种或多种编码序列称为所谓的“自杀基因”。
[0030] 因此，在一个实施方案中，一种或多种编码序列可以编码表皮生长因子受体(EGFR)或截短的表皮生长因子受体(tEGFR)(参考)(UniProt No.P00533；NCBI参考序列NP_001333826.1)。tEGFR的表达可以通过抗EGFR mAb(西妥昔单抗)来控制，以监测或消除患者体内的CAR‑T细胞。应当理解，EGFR在人类中被称为HER1，并且是跨膜蛋白，其是细胞外蛋白配体的表皮生长因子(EGF)成员的受体(UniProt No.P01133；NCBI参考序列NP_
001171601.1)。
[0031] 在另一个实施方案中，一种或多种编码序列可以编码诱导型半胱天冬酶9(iC9)(Mol.Therapy,Diaconu et al.,580,25,3,March 2017)。iC9是一种修饰的人半胱天冬酶9(UniProt No.P55211；NCBI参考序列NP_001220.2)，与人FK506结合蛋白(UniProt No.P62942；NCBI参考序列NP_000792.1)融合，允许使用化学诱导剂进行条件二聚化(半胱天冬酶诱导药物(CID)，Rimiducid)，触发表达融合蛋白的CAR‑T细胞凋亡。
[0032] 优选地，CAR‑MAIT细胞包含编码截短的表皮生长因子受体(tEGFR)和/或诱导型半胱天冬酶9(iC9)的编码序列。更优选地，CAR‑MAIT细胞包含编码截短的表皮生长因子受体(tEGFR)和诱导型半胱天冬酶9(iC9)的编码序列。
[0033] 应当理解，CAR‑MAIT细胞是通过用编码CAR的核酸或遗传构建体转导MAIT细胞来产生的。将高度纯化的MAIT细胞的培养物用于CAR转导步骤以产生T细胞特异性和活性CAR‑MAIT细胞是重要的。因此，本发明人开发了一种从人外周血单核细胞(PBMC)中分离纯化的MAIT细胞的有效方法，通过结合磁激活细胞分选(MACS)和荧光激活细胞分选(FACS)，使得所得方法得到大量具有高扩增倍数的MAIT细胞。
[0034] 因此，优选地，MAIT细胞分离自人外周血单核细胞(PBMC)。优选地，通过磁激活细胞分选(MACS)和/或荧光激活细胞分选(FACS)，更优选MACS和FACS两者，从PBMC分离MAIT细胞。发明人相信他们的MAIT分离方法本身是新颖的。
[0035] 因此，在第二方面，本文提供了分离MAIT细胞的方法，该方法包括：
[0036] (i)提供外周血单核细胞(PBMC)；和
[0037] (ii)对PBMC进行磁激活细胞分选(MACS)和/或荧光激活细胞分选(FACS)以从中分离MAIT细胞。
[0038] 优选地，本发明的方法导致纯的离体MAIT细胞的分离。在一个实施方案中，该方法包括对PBMC进行MACS或FACS以从中分离MAIT细胞。然而，优选地，该方法包括对PBMC进行MACS和FACS两者以从中分离MAIT细胞。优选地，首先对PBMC进行MACS，然后进行FACS。优选地，该方法包括通过MACS从PBMC分离TCR Vα7.2+细胞，然后使用MR1‑5‑OP‑RU四聚体染色对这些细胞进行FACS，以分离MAIT细胞。
[0039] MACS程序(在步骤(ii)中)可以包括收集PBMC，然后用结合缓冲液洗涤细胞。可弃7
去上清液，并将所得细胞沉淀重悬于MACS缓冲液中(例如浓度为1x 10/100μl)。溶液可以与藻红蛋白(PE)抗人TCR Vα7.2抗体接触(例如以1:100的比例)。可以将溶液混合，然后可以将其培养(例如在冰上培养30分钟)。可以用MACS缓冲液洗涤细胞(例如以300xg离心5分
7
钟)。细胞可以重悬于MACS缓冲液中(例如浓度为10 /80μl)。可以使悬浮液与抗PE微珠接触，然后可以将其培养(例如在冰上培养20分钟)。可以洗涤细胞(例如10倍体积的MACS缓冲液)。可以将溶液离心(例如以300x g离心5分钟)。细胞可以重悬(例如在1ml MACS缓冲液中)。MS柱可以用MACS缓冲液预清洗并组装在磁体上。可以将细胞应用于柱上并进行MACS。
然后可以将柱洗涤一次或多次(例如每次用MACS缓冲液)。可以将柱从磁体上移除，并且可以从柱上洗脱结合的细胞(例如在MACS缓冲液中)。
[0040] FACS程序(在步骤(ii)中)可以包括收集磁分离的细胞，然后离心(例如以300x g7
离心5分钟)。可以将细胞重悬(例如用FACS缓冲液以10/100μl的浓度重悬)。溶液可以与BV421标记的人5‑OP‑RU MR1四聚体(例如以1:500的比例)和APC‑H7‑缀合的抗人CD3(例如以1:200的比例)接触。然后可以培养溶液(例如在冰上培养20分钟)。可以洗涤细胞(例如用
10倍体积的FACS缓冲液)。可以将溶液离心(例如以300x g离心5分钟)。可以将细胞重悬(例如在2ml FACS缓冲液中)。然后可以将细胞样本装入FACS分选仪(例如BD Prodigy分选仪)并进行FACS。
[0041] 在用编码CAR的核酸转导分离的MAIT细胞之前，优选地在第二方面的方法中在步骤(ii)之后的后续步骤中激活MAIT细胞。因此，该方法还包括用抗CD3抗体激活分离的MAIT细胞，优选在体外激活。该方法包括用抗CD28抗体激活分离的MAIT细胞，优选在体外激活。优选地，用抗CD3和抗CD28抗体基本上同时地或依次地激活分离的MAIT细胞。依次激活可以包括使MAIT细胞首先与抗CD3接触，然后与抗CD28抗体接触，或者首先与抗CD28抗体接触，然后与抗CD3抗体接触。与抗体接触可以持续至少一天、两天或三天。
[0042] MAIT细胞激活程序可以包括通过离心(例如以300x g离心5分钟)收集分选的MAIT6
细胞。可以弃去上清液，并且可以将沉淀重悬(例如在R10培养基中至10个细胞/ml)。该溶液可以与Dynabeads人T活化剂CD3/CD28接触(例如通过涡旋30秒)。可将所需体积的Dynabeads转移至试管中。可以将等体积的缓冲液添加到试管中并且可以将其混合(例如通过涡旋5秒)。可将试管置于磁体上(例如1分钟)，并可丢弃上清液。可以将试管从磁体上取下，并且可以将清洗过的Dynabeads重悬(例如在R10培养基中)。所需体积的Dynabeads可以与细胞悬浮液接触(例如在37℃培养箱中的24孔板中使用100IU/ml IL‑2获得约1:1的微珠与细胞之比)。
[0043] 然后，该方法可以包括用编码CAR的核酸转导分离的且现已激活的MAIT细胞。
[0044] MAIT细胞是先天性T细胞的一个亚群，定义为CD3+TCRVa7.2+CD161+细胞，可识别MHC I类分子MR1。先前的研究表明，MAIT细胞可以在体外扩增，但需要同种异体饲养细胞的存在。然而，该方法的一个问题是难以大规模生产和质量控制。如实施例10所述和图15所示，发明人现已开发出一种用于体外扩增MAIT细胞的令人惊讶的有效方法，其中通过首先用负载抗原(5‑OP‑RU)的MR1四聚体珠或5‑OP‑RU(单独)刺激PBMC，在多种细胞因子组合存在下进行长达6天的体外培养。然后通过MACS或FACS分选分离MAIT细胞，随后通过抗CD3/CD28珠进一步扩增以用于基于CAR的治疗，如上所述。
[0045] 因此，在优选的实施方案中，该方法可以包括在对PBMC进行MACS和/或FACS步骤(即步骤ii)之前刺激PBMC。优选地，该初始的刺激步骤包括使PBMC接触：(a)包含MR1/5‑OP‑RU或5‑OP‑RU的抗原；和/或(b)细胞因子。优选地，刺激步骤包括使PBMC接触：(a)包含MR1/5‑OP‑RU或5‑OP‑RU的抗原；和(b)细胞因子。刺激步骤可以包括使PBMC接触抗原和/或细胞因子至少1天、2天或3天。刺激步骤可以持续至少4天、5天或6天。优选地，刺激步骤包括使PBMC接触体外培养物中的抗原和/或细胞因子。
[0046] WO 2015/149130描述了MR1/5‑OP‑RU和5‑OP‑RU，其全部内容通过引用并入本文。因此，优选地，抗原包含MR1/5‑OP‑RU或5‑OP‑RU，如WO 2015/149130(PCT/AU2015/050148)中所述。
[0047] 细胞因子可以是任何白细胞介素。然而，优选地，细胞因子可以是选自IL‑2、IL‑7、IL‑12、IL‑15、IL‑18和IL‑23或其任意组合中的一种或多种白细胞介素。白细胞介素的浓度可以是至少5ng/ml、10ng/ml或20ng/ml，优选至少30ng/ml、40ng/ml或50ng/ml。
[0048] 例如，一种或多种白细胞介素可包含：(i)单独的IL‑2(图15中的条件1)；(ii)IL‑12和IL‑18(图15中的条件11)；(iii)IL‑2、IL‑12和IL‑18(图15中的条件3)；(iv)IL‑12、IL‑
18和IL‑23(图15中的条件12)；(v)IL‑2、IL‑12、IL‑18和IL‑23(图15中的条件13)，或(vi)IL‑7、IL‑15、IL‑12和IL‑18(图15中的条件8)。
[0049] 最优选地，一种或多种白细胞介素可以包含IL‑12、IL‑18和IL‑23的组合。因此，优选地，刺激步骤包括使PBMC接触：(a)包含MR1/5‑OP‑RU或5‑OP‑RU的抗原；和(b)IL‑12、IL‑18和IL‑23的组合。
[0050] 发明人相信他们已经设计出一种在PBMC培养物中刺激MAIT细胞的新方法。
[0051] 因此，在另一个方面，本文提供了在PBMC培养物中刺激MAIT细胞的方法，该方法包括使PMBC培养物接触：(a)包含MR1/5‑OP‑RU或5‑OP‑RU的抗原；和/或(b)选自IL‑2、IL‑7、IL‑12、IL‑15、IL‑18和IL‑23或其任意组合中的一种或多种白细胞介素。
[0052] 优选地，一种或多种白细胞介素是IL‑12、IL‑18和/或IL‑23。更优选地，一种或多种白细胞介素是IL‑12、IL‑18和IL‑23。
[0053] 发明人相信他们的产生CAR‑MAIT细胞的方法本身也是新颖的。
[0054] 因此，在第三方面，本文提供了一种产生CAR‑MAIT细胞的方法，该方法包括：
[0055] (i)提供外周血单核细胞(PBMC)；
[0056] (ii)对PBMC进行MACS和/或FACS以从中分离MAIT细胞；
[0057] (iii)激活分离的MAIT细胞，任选地通过使它们与抗CD3和/或抗CD28抗体接触；和[0058] (iv)用编码CAR的核酸转导激活的MAIT细胞，从而产生CAR‑MAIT细胞。
[0059] 第三方面的方法的步骤(i)、(ii)和/或(iii)可以与本文中关于第二方面的方法描述的步骤相同，因此这些方法步骤是可互换的。
[0060] 另外，优选地，该方法包括在对PBMC进行MACS和/或FACS步骤(即步骤ii)之前刺激PBMC。优选地，该初始的刺激步骤包括使PBMC接触：(a)包含MR1/5‑OP‑RU或5‑OP‑RU的抗原；和/或(b)细胞因子。优选地，刺激步骤包括使PBMC接触：(a)包含MR1/5‑OP‑RU或5‑OP‑RU的抗原；和(b)细胞因子。细胞因子可以是关于第二方面描述的白细胞介素，优选选自IL‑2、IL‑7、IL‑12、IL‑15、IL‑18和IL‑23或其任意组合中的一种或多种白细胞介素，如上所述。
[0061] 最优选地，一种或多种白细胞介素可以包含IL‑12、IL‑18和IL‑23的组合。因此，优选地，刺激步骤包括使PBMC接触：(a)包含MR1/5‑OP‑RU或5‑OP‑RU的抗原；和(b)IL‑12、IL‑18和IL‑23的组合。
[0062] 优选地，在步骤(iv)用编码CAR的核酸转导分离的MAIT细胞之前，在步骤(iii)中激活MAIT细胞。分离的MAIT细胞可用抗CD3抗体激活，优选在体外激活。分离的MAIT细胞可以用抗CD28抗体激活，优选在体外激活。优选地，用抗CD3和抗CD28抗体基本上同时地或依次地激活分离的MAIT细胞，如关于第二方面的方法所述。
[0063] MAIT细胞转导程序(即步骤(iv))可以包括用编码CAR的核酸转导MAIT细胞。转导步骤可以包括病毒转导。优选地，MAIT细胞转导程序包括用编码CAR的核酸通过逆转录病毒转导MAIT细胞。MAIT细胞可以用如本文所述的编码CAR的任何核酸转导，例如根据第五方面或根据第六方面的载体。核酸可编码靶向T细胞上的CD4抗原或至少一个或多个TCR Vbeta区的CAR。优选地，核酸可以编码靶向T细胞上表1中所示的一个或多个TCR Vbeta区(并且更优选TCR‑Vbeta 7.1链)的CAR。该核酸可以编码靶向T细胞上的一个或多个TCR Vbeta区的CAR，该TCR Vbeta区选自以下：Vb 1、Vb 2、Vb 3、Vb 5.1、Vb 7.1、Vb 8、Vb 12、Vb 13.1、Vb 17和Vb 20。
[0064] 优选地，转导在MAIT细胞激活后至少34小时、36小时或48小时进行。在转导之前(例如大约1天前)，可以制备RetroNectin包被的板。可以将RetroNectin(例如约15μg)与PBS(例如约1ml)接触以形成溶液。该方法可以包括将溶液引入到未经组织培养物处理的24孔板的一个孔中。可以将板包裹起来(例如用保鲜膜)并在约4℃下保存(例如在冰箱中过夜)。在基因转移当天，将未结合的RetroNectin从孔中除去。可以清洗孔(例如用2ml PBS清洗一次或两次)。优选地，不允许孔干燥。逆转录病毒上清液可以解冻(例如在37℃水浴中)。优选将病毒上清液(例如约1ml)转移至RetroNectin包被的板的每个孔中。板可以用保鲜膜包裹。可将板离心(例如在32℃下以1000x g离心2小时)。离心时，可以收集激活的MAIT细
6
胞。收集的细胞可以重悬(例如在含有100IU/ml IL‑2的新鲜R10培养基中，至浓度1x10 /ml)。离心完成后，可将上清液从板中丢弃。可以将细胞悬浮液(例如1ml)添加到每个孔中。
可将板离心(例如，以500x g离心10分钟)。然后可以对板进行培养(例如在37℃培养箱中)。
如果需要，可以重复转导步骤以获得更高的转导效率。转导后约48小时可通过流式细胞术检测转导效率。
[0065] 在第三方面的方法中，本发明的方法优选地包括在步骤(iv)之后的后续步骤中扩增CAR‑MAIT细胞。CAR‑MAIT细胞扩增步骤可以包括在转导后一天或两天收获转导的CAR‑MAIT细胞，优选使用逆转录病毒或病毒。可以对收获的细胞进行计数(例如通过血细胞计数7
器)。然后可以将收获的细胞转移到板的孔中(例如，将1x 10个细胞转移到Grex6M孔板的孔中)。然后可以将收获的细胞与白细胞介素接触。例如，白细胞介素可以是包含在合适的培养基例如R10培养基(例如130ml)中的IL‑2(例如约100IU/ml)。可将板放回培养箱。然后可以更新IL‑2(例如每三天达到100IU/ml的终浓度)。培养8‑12天后即可收获CAR‑MAIT细胞。扩增的CAR‑MAIT细胞可用于表型测试、功能分析和/或冷冻以供以后使用(例如在液氮中)。
[0066] 有利的是，如实施例中所述，培养11天产生100倍扩增水平的CAR‑MAIT细胞，且转导效率高于50％。发明人观察到，CAR‑MAIT细胞令人惊讶地表现出至少与表达常规CAR的CD8+T细胞相当的细胞毒性效力。
[0067] 在第四方面，本文提供了通过第三方面的方法获得的或可获得的CAR‑MAIT细胞。
[0068] 如本文所述，使用第二方面或第三方面的方法获得的分离的MAIT细胞可以被激活，并且最终用编码CAR的核酸构建体转导以产生第一方面或第四方面的CAR‑MAIT细胞。如本文所述，发明人开发了编码CAR的新型遗传构建体和重组载体，其特异性靶向CD4分子(在这种情况下构建体和载体在本文中称为“CART4”)或一个或多个TCR‑Vbeta区，例如T细胞上的TCR‑Vbeta 7.1链(在这种情况下构建体和载体在本文中称为“CARTVb7.1”)。这些构建体和载体中的任一种都可以用于在第三方面或第四方面的方法中转导MAIT细胞。
[0069] 遗传构建体包含以下任一者的scFv：(i)抗CD4 mAb(例如Hu5A8)或(ii)抗TCR‑Vb mAb，例如抗TCR‑Vb 7.1mAb(例如3G5)，与CD28/4‑1BB/CD3zeta链信号传导部分一起形成第三代CAR。编码CAR的构建体还包含至少一个由所谓的自杀基因编码的安全开关，例如截短的表皮生长因子受体(tEGFR)和/或诱导型半胱天冬酶9(iC9)，并且其能够清除所得的CAR‑T细胞，因此在治疗中使用CAR‑T细胞时提供了一个精妙的监控系统或安全机制。tEGFR的表达可以被抗EGFR mAb识别(例如西妥昔单抗)用于监测或消除CAR‑T细胞，而iC9是一种与人FK506结合蛋白融合的修饰人半胱天冬酶9，可使用二聚化化学诱导剂(例如Rimiducid)进行条件二聚化，从而触发表达融合蛋白的CAR‑T细胞凋亡。发明人相信，他们开发的CAR编码核酸构建体本身是新颖的。参考图1A(1和2)，该示意图说明了包括在根据本发明的CAR编码构建体的两个实施例中的功能元件，即，图1A(1)示出“CART4”，图1A(2)示出“CARTVb7.1”。然而，应当理解，具有靶向Vbeta 7.1家族的抗TCR‑Vb 7.1的“CARTVb7.1”纯粹是说明性的，任何Vbeta区都可以被CAR靶向，例如表1中所示的任何Vbeta，尤其是Vb 1、Vb 2、Vb 3、Vb 
5.1、Vb 7.1、Vb 8、Vb 12、Vb 13.1、Vb 17和Vb 20中的任一个。
[0070] 因此，在第五方面，本文提供了包含可操作地连接至第一编码序列的启动子，所述第一编码序列编码抗CD4嵌合抗原受体(CAR)或抗T细胞受体(TCR)Vbeta CAR。
[0071] 启动子可以是任何合适的启动子，包括组成型启动子、激活型启动子、诱导型启动子或组织特异型启动子。组成型启动子允许异源基因(也称为转基因)在宿主细胞中组成型表达。本文考虑的示例性组成型启动子包括但不限于巨细胞病毒(CMV)启动子、人延伸因子‑1α(hEFla)、泛素C启动子(UbiC)、磷酸甘油激酶启动子(PGK)、猿猴病毒40早期启动子(SV40)，以及与CMV早期增强子(CAGG)偶联的鸡β‑肌动蛋白启动子。诱导型启动子属于调控型启动子的范畴。诱导型启动子可以由一种或多种条件诱导，例如物理条件、工程化免疫效应细胞的微环境或工程化免疫效应细胞的生理状态、诱导物(即诱导剂)或其组合。在一些实施方案中，诱导条件不诱导工程化哺乳动物细胞中和/或接受药物组合物的受试者中内源基因的表达。在一些实施方案中，诱导条件选自以下：诱导剂、辐射(例如电离辐射、光)、温度(例如热)、氧化还原状态、肿瘤环境和工程化哺乳动物细胞的激活状态。
[0072] 在一个实施方案中，启动子可以是PGK启动子(EMBL NO：A19297.1)。在一个实施方案中，PGK启动子在本文中被称为SEQ ID No：3，如下：
[0073] GGGTAGGGGAGGCGCTTTTCCCAAGGCAGTCTGGAGCATGCGCTTTAGCAGCCCCGCTGGGCACTTGGCGCTACACAAGTGGCCT
[0074] CTGGCCTCGCACACATTCCACATCCACCGGTAGGCGCCAACCGGCTCCGTTCTTTGGTGGCCCCTTCGCGCCACCTTCTACTCCT
[0075] CCCCTAGTCAGGAAGTTCCCCCCCGCCCCGCAGCTCGCGTCGTGCAGGACGTGACAAATGGAAGTAGCACGTCTCACTAGTCTCG
[0076] TGCAGATGGACAGCACCGCTGAGCAATGGAAGCGGGTAGGCCTTTGGGGCAGCGGCCAATAGCAGCTTTGCTCCTTCGCTTTCTG
[0077] GGCTCAGAGGCTGGGAAGGGGTGGGTCCGGGGGCGGGCTCAGGGGCGGGCTCAGGGGCGGGGCGGGCGCCCGAAGGTCCTCCGGA
[0078] GGCCCGGCATTCTGCACGCTTCAAAAGCGCACGTCTGCCGCGCTGTTCTCCTCTTCCTCATTCTCCGGGCCTTTCG
[0079] [SEQ ID No:3]
[0080] 因此，优选地，启动子可以包含基本上如SEQ ID No：3所示的核苷酸序列或其片段或变体。
[0081] 核酸构建体可以包含编码信号肽的核苷酸序列。有利的是，信号肽被配置为将CAR(即，其是融合蛋白)引导至T细胞外膜。优选地，编码信号肽的序列位于启动子的3’。优选地，信号肽是Igκ信号肽。在一个实施方案中，信号肽可具有在本文中称为SEQ ID No：4的氨基酸序列，如下：
[0082] METDTLLLWVLLLWVPGSTGD
[0083] [SEQ ID No:4]
[0084] 因此，优选地，构建体包含编码具有基本上如SEQ ID No：4所示的氨基酸序列的信号肽的核苷酸序列或其片段或变体。
[0085] 在一个实施方案中，编码信号肽的核苷酸序列在本文中称为SEQ ID No：5，如下：
[0086] ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTGCTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACAGGTGAC
[0087] [SEQ ID No:5]
[0088] 因此，优选地，构建体包含基本上如SEQ ID No：5所示的核苷酸序列或其片段或变体。
[0089] 优选地，第一编码序列位于编码信号肽的序列的3’。在核酸构建体的第一实施方案中，第一编码序列编码抗CD4嵌合抗原受体(CAR)。优选地，CAR对包含基本上如SEQ ID No：1所示的氨基酸序列或其变体或片段的CD4抗原具有特异性。
[0090] 如图1A(1)(“CART4”)所示，第一编码序列可编码scFv区，其可包含VL(可变轻链)序列和VH(可变重链)序列。优选地，VL序列位于VH序列的上游(即5’)。然而，在一些实施方案中，VH序列可以位于VL序列的上游。
[0091] 在一个实施方案中，VL和VH序列可以是用于结合T细胞上的CD4抗原的Hu5A8(即抗CD4单克隆抗体的杂交瘤克隆名称)轻链可变区和重链可变区。
[0092] 因此，在一个实施方案中，第一编码序列(其可编码用于结合CD4的VL序列)编码在本文中称为SEQ ID No：6的氨基酸序列，如下：
[0093] DIVMTQSPDSLAVSLGERVTMNCKSSQSLLYSTNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQ
[0094] AEDVAVYYCQQYYSYRTFGGGTKLEIK
[0095] [SEQ ID No:6]
[0096] 因此，优选地，第一编码序列包含编码基本上如SEQ ID No：6所示的氨基酸序列的核苷酸序列或其片段或变体。
[0097] 在一个实施方案中，第一编码序列(其可编码用于结合CD4的VL序列)包含在本文中称为SEQ ID No：7的核苷酸序列，如下：
[0098] GACATTGTGATGACTCAGAGCCCCGACAGCCTGGCCGTCTCACTGGGCGAAAGGGTGACCATGAATTGTAAATCTTCTCAGAGCC
[0099] TGCTGTACAGTACAAACCAGAAAAATTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAACCCGGCCAGAGCCCTAAGCTGCTGATCTATTGGGC
[0100] AAGTACCCGAGAGTCAGGAGTGCCAGACAGATTCTCCGGGTCTGGAAGTGGCACAGACTTCACCCTGACAATTAGCTCCGTGCAG
[0101] GCCGAGGACGTGGCTGTCTACTATTGCCAGCAGTACTATAGCTACCGAACTTTCGGCGGGGGAACCAAACTGGAAATCAAG
[0102] [SEQ ID No:7]
[0103] 因此，优选地，第一编码序列包含基本上如SEQ ID No：7所示的核苷酸序列或其片段或变体。
[0104] 在一个实施方案中，第一编码序列(其可编码用于结合CD4的VH序列)编码在本文中称为SEQ ID No：8的氨基酸序列，如下：
[0105] QVQLQQSGPEVVKPGASVKMSCKASGYTFTSYVIHWVRQKPGQGLDWIGYINPYNDGTDYDEKFKGKATLTSDTSTSTAYMELSS
[0106] LRSEDTAVYYCAREKDNYATGAWFAYWGQGTLVTVSS
[0107] [SEQ ID No:8]
[0108] 因此，优选地，第一编码序列包含编码基本上如SEQ ID No：8所示的氨基酸序列的核苷酸序列或其片段或变体。
[0109] 在一个实施方案中，第一编码序列(其可编码用于结合CD4的VH序列)包含在本文中称为SEQ ID No：9的核苷酸序列，如下：
[0110] CAGGTGCAGCTGCAGCAGTCCGGACCAGAGGTGGTCAAACCCGGCGCTAGCGTCAAAATGTCCTGTAAGGCATCTGGCTACACTT
[0111] TCACCTCTTATGTGATTCACTGGGTCAGACAGAAGCCTGGGCAGGGACTGGACTGGATCGGGTACATTAACCCATATAATGATGG
[0112] AACTGACTACGATGAAAAGTTTAAAGGCAAGGCCACACTGACTTCCGACACCTCAACAAGCACTGCTTATATGGAGCTGTCTAGT
[0113] CTGAGGTCTGAAGACACAGCAGTGTACTATTGCGCCCGCGAGAAGGATAACTACGCCACTGGCGCTTGGTTTGCATATTGGGGCC
[0114] AGGGGACCCTGGTGACAGTCTCATCC
[0115] [SEQ ID No:9]
[0116] 因此，优选地，第一编码序列包含基本上如SEQ ID No：9所示的核苷酸序列或其片段或变体。
[0117] 优选地，VH(例如SEQ ID No：9)和VL(例如SEQ ID No：7)序列，当处于任一方向时，均由接头序列分隔开。在一个实施方案中，接头序列可以是G4S接头序列，其在本文中称为SEQ ID No：10，如下：
[0118] GGGGSGGGGSGGGGS
[0119] [SEQ ID No:10]
[0120] 因此，优选地，第一编码序列包含编码基本上如SEQ ID No：10所示的氨基酸序列或其片段或变体。
[0121] 在一个实施方案中，接头序列可以由在本文中称为SEQ ID No：11的核苷酸序列编码，如下：
[0122] GAGGAGGAGGCAGTGGCGGAGGAGGGTCAGGAGGAGGAGGAAGC
[0123] [SEQ ID No:11]
[0124] 因此，优选地，接头序列包含基本上如SEQ ID No：11所示的核苷酸序列或其片段或变体。
[0125] 然而，在核酸构建体(“CARTVb7.1”)的第二实施方案中，第一编码序列编码抗T细胞受体(TCR)Vbeta区CAR。应当理解，任何Vbeta区都可以被CAR靶向。例如，表1中列出的任何Vbeta区可以被第一编码序列编码的CAR靶向。
[0126] 第一编码序列可以编码多个T细胞受体(TCR)β链可变区(Vbeta)CAR。优选地，多个Vbeta区可以选自表1中所示的一组Vbeta区。还可以在同一构建体上组合两个或多个靶向Vbeta区的CAR。例如，构建体可以包含编码至少两个、至少三个或至少四个T细胞受体(TCR)β链可变区(Vbeta)靶向CAR的编码序列，优选地如表1中所示。构建体可以包含编码至少五个、至少六个或至少七个T细胞受体(TCR)β链可变区(Vbeta)靶向CAR的编码序列，优选地如表1中所列。多个TCR Vbeta区可以是相同或不同的Vbeta区。
[0127] 以下Vb家族被认为经常与T细胞淋巴瘤相关，即Vb 1、Vb 2、Vb 3、Vb 5.1、Vb 7.1、Vb 8、Vb 12、Vb 13.1、Vb 17和Vb 20。因此，在一个优选的实施方案中，构建体包含编码至少一种CAR的编码序列，该CAR靶向T细胞上的一个或多个TCR Vbeta区，其选自以下Vbeta区：Vb 1、Vb 2、Vb 3、Vb 5.1、Vb 7.1、Vb 8、Vb 12，Vb 13.1、Vb 17和Vb 20。优选地，构建体包含编码至少一种CAR的编码序列，该CAR靶向T细胞上的至少两个或三个TCR Vbeta区，其选自以下Vbeta区：Vb 1、Vb 2、Vb 3、Vb 5.1、Vb 7.1、Vb 8、Vb 12、Vb 13.1、Vb 17和Vb 20。
[0128] 因此，优选地，本文提供了包含可操作地连接至第一编码序列的启动子的核酸构建体，其中第一编码序列编码多个抗T细胞受体(TCR)Vbeta CAR，其中T细胞受体(TCR)Vbeta CAR上的不同Vbeta区细胞被靶向。
[0129] 优选地，CAR对TCR Vbeta区(优选TCR‑Vbeta 7.1链)具有特异性，其包含基本上如SEQ ID No：2所示的氨基酸序列或其变体或片段。
[0130] 如图1A(2)所示，第一编码序列可编码scFv区，其可包含VL(可变轻链)序列和VH(可变重链)序列。优选地，VL序列位于VH序列的上游(即5’)。然而，在一些实施方案中，VH序列可以位于VL序列的上游。优选地，VH和VL编码序列当处于任一方向时均被接头序列(例如G4S接头序列)分隔开。
[0131] 在一个实施方案中，VL和VH序列可以是用于结合TCR Vbeta 7.1抗原的3G5(即抗TCR Vbeta 7.1单克隆抗体的杂交瘤克隆名称)轻链可变区和重链可变区。
[0132] 在一个实施方案中，第一编码序列(其可编码用于结合TCR Vbeta、优选TCR‑Vbeta 7.1链的VL序列)编码在本文中称为SEQ ID No：12的氨基酸序列，如下：
[0133] QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTRYWITWVKQRPGQGLEWIGDIYPGSGFTKYNEKFKSKATLTVDTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAREGGNYWYFDVWGTGTTVTVSS         [SEQ ID No:12][0135] 因此，优选地，第一编码序列包含编码基本上如SEQ ID No：12所示的氨基酸序列的核苷酸序列或其片段或变体。
[0136] 在一个实施方案中，第一编码序列(其可编码用于结合TCR Vbeta、优选TCR‑Vbeta 7.1链的VL序列)包含在本文中称为SEQ ID No：13的核苷酸序列，如下：
[0137] CAAGTTCAGCTGCAACAGCCTGGCGCCGAGCTTGTGAAACCTGGCGCCTCTGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCTCCGGCTACACCTTCACCAGATACTGGATCACCTGGGTCAAGCAGAGGCCTGGACAGGGACTCGAGTGGATCGGCGATATCTATCCTGGCTCCGGCTTCACCAAGTACAACGAGAAGTTCAAGAGCAAGGCCACACTGACCGTGGACACCAGCAGCAGCACAGCCTACATGCAGCTGTCTAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGTGCTAGAGAAGGCGGCAACTACTGGTACTTCGACGTGTGGGGCACCGGCACCACAGTGACAGTTAGTTCT    [SEQ ID No:13][0139] 因此，优选地，第一编码序列包含基本上如SEQ ID No：13所示的核苷酸序列或其片段或变体。
[0140] 在一个实施方案中，第一编码序列(其可编码用于结合TCR Vbeta、优选TCR‑Vbeta 7.1链的VH序列)编码在本文中称为SEQ ID No：34的氨基酸序列，如下：
[0141] DIQMTQSPSSLSASLGGKVTLTCKASQDINKYIAWYQHKPGKGPRLLIHYTSTLQPGIPSRFSGSGSGRDYSFSISNLEPEDVATYYCLQYDNLRTFGGGTKLEIKRTD                [SEQ ID No:34][0143] 因此，优选地，第一编码序列包含编码基本上如SEQ ID No：34所示的氨基酸序列的核苷酸序列或其片段或变体。
[0144] 在一个实施方案中，第一编码序列(其可编码用于结合TCR Vbeta、优选TCR‑Vbeta 7.1链的VH序列)包含在本文中称为SEQ ID No：35的核苷酸序列，如下：
[0145] GACATCCAGATGACACAGAGCCCTAGCAGCCTGTCTGCCTCTCTCGGCGGAAAAGTGACCCTGACATGCAAGGCCAGCCAGGACATCAACAAGTATATCGCCTGGTATCAGCACAAGCCCGGCAAGGGACCTAGACTGCTGATCCACTACACCAGCACACTGCAGCCTGGCATCCCCAGCAGATTTTCTGGCAGCGGCTCCGGCAGAGACTACAGCTTCAGCATCAGCAACCTGGAACCTGAGGACGTGGCCACCTACTACTGCCTGCAGTACGACAACCTGCGGACCTTTGGCGGCGGAACAAAGCTGGAAATCAAGCGGACAGAT          [SEQ ID No:35]
[0147] 因此，优选地，第一编码序列包含基本上如SEQ ID No：35所示的核苷酸序列或其片段或变体。
[0148] 优选地，VH(例如SEQ ID No：35)和VL(例如SEQ ID No：13)序列当处于任一方向时均被接头序列分隔开。在一个实施方案中，接头序列可以是G4S接头序列，其可包含基本上如SEQ ID No：10所示的氨基酸序列或其片段或变体或由其组成。因此，优选地，接头序列包含基本上如SEQ ID No：11所示的核苷酸序列或其片段或变体。
[0149] 核酸构建体可以包含编码CD8a铰链和跨膜(TM)结构域的核苷酸序列。有利的是，铰链和TM结构域被配置用于CAR展示并锚定在CAR‑T细胞上。优选地，编码铰链和TM结构域的序列位于第一编码序列的3’。
[0150] 在一个实施方案中，CD8a铰链和跨膜结构域的氨基酸序列在本文中称为SEQ ID No：14，如下：
[0151] FVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRN                  [SEQ ID No:14]
[0153] 因此，优选地，构建体包含编码基本上如SEQ ID No：14所示的氨基酸序列的核苷酸序列或其片段或变体。
[0154] 在一个实施方案中，编码CD8a铰链和跨膜结构域的核苷酸序列在本文中称为SEQ ID No：15，如下：
[0155] TTCGTGCCGGTCTTCCTGCCAGCGAAGCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAACCACAGGAAC         [SEQ ID No:15]
[0157] 因此，优选地，构建体包含基本上如SEQ ID No：15所示的核苷酸序列或其片段或变体。
[0158] 核酸构建体可包含编码胞内结构域的核苷酸序列，所述胞内结构域可包含CD28的信号传导结构域、4‑1BB的信号传导结构域和/或CD3ζ链，其中更优选CD28的信号传导结构域、4‑1BB的信号传导结构域和CD3ζ链。应当理解，这些组分形成了第三代CAR的基础并且是触发细胞内信号传导途径所必需的。优选地，胞内结构域位于编码铰链和跨膜结构域的序列的3'处。CD28的信号传导结构域可以是4‑1BB的信号传导结构域的5'。4‑1BB的信号传导结构域可能是CD3ζ链的5'。
[0159] CD28信号传导结构域的一个实施方案可以具有在本文中称为SEQ ID No：16的氨基酸序列，如下：
[0160] RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS
[0161] [SEQ ID No:16]
[0162] 因此，优选地，构建体包含编码基本上如SEQ ID No：16所示的氨基酸序列的核苷酸序列或其片段或变体。
[0163] 在一个实施方案中，CD28信号传导结构域可以由在本文中称为SEQ ID No：17的核酸序列编码，如下：
[0164] AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGC
[0165] CCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC
[0166] [SEQ ID No:17]
[0167] 因此，优选地，构建体包含基本上如SEQ ID No：17所示的核苷酸序列或其片段或变体。
[0168] 4‑1BB信号传导结构域的一个实施方案可以具有在本文中称为SEQ ID No：18的氨基酸序列，如下：
[0169] RFSVVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
[0170] [SEQ ID No:18]
[0171] 因此，优选地，构建体包含编码基本上如SEQ ID No：18所示的氨基酸序列的核苷酸序列或其片段或变体。
[0172] 在一个实施方案中，4‑1BB信号传导结构域可以由在本文中称为SEQ ID No：19的核酸序列编码，如下：
[0173] CGTTTCTCTGTTGTTAAACGGGGCAGAAAGAAGCTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAG
[0174] AGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG
[0175] [SEQ ID No:19]
[0176] 因此，优选地，构建体包含基本上如SEQ ID No：19所示的核苷酸序列或其片段或变体。CD3ζ链的一个实施方案可以具有在本文中称为SEQ ID No：20的氨基酸序列，如下：
[0177] RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKG
[0178] HDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
[0179] [SEQ ID No:20]
[0180] 因此，优选地，构建体包含编码基本上如SEQ ID No：20所示的氨基酸序列的核苷酸序列或其片段或变体。
[0181] 在一个实施方案中，CD3ζ链可以由在本文中称为SEQ ID No：21的核酸序列编码，如下：
[0182] AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAA
[0183] GAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGG
[0184] CCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGG
[0185] CACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
[0186] [SEQ ID No:21]
[0187] 因此，优选地，构建体包含基本上如SEQ ID No：21所示的核苷酸序列或其片段或变体。
[0188] 优选地，核酸构建体包含第二编码序列，其编码至少一种自杀蛋白，更优选至少两种自杀蛋白。本发明的构建体的优点在于存在编码至少一种自杀蛋白的第二编码序列，这意味着用该构建体转导的所得CAR‑T细胞可以被可控地或诱导地检测或消除，例如在患者出现不良反应的情况下。
[0189] 因此，优选地，在一个实施方案中，本文提供了一种核酸构建体，其包含可操作地连接至第一编码序列和第二编码序列的启动子，其中该第一编码序列编码抗CD4嵌合抗原受体(CAR)，该第二编码序列编码至少一种自杀蛋白，更优选至少两种自杀蛋白。
[0190] 优选地，在另一个实施方案中，本文提供了一种核酸构建体，其包含可操作地连接至第一编码序列和第二编码序列的启动子，其中该第一编码序列编码抗T细胞受体(TCR)Vbeta CAR，该第二编码序列编码至少一种自杀蛋白，更优选至少两种自杀蛋白。
[0191] 在又一个实施方案中，本文优选地提供了一种核酸构建体，其包含可操作地连接至第一编码序列和第二编码序列的启动子，其中该第一编码序列编码多个抗T细胞受体(TCR)Vbeta CAR，其中T细胞上不同的Vbeta区被靶向，该第二编码序列编码至少一种自杀蛋白，更优选至少两种自杀蛋白。
[0192] 在一个实施方案中，第二编码序列可以编码表皮生长因子受体(EGFR)或截短的表皮生长因子受体(tEGFR)(UniProt No.P00533；NCBI参考序列NP_001333826.1)。tEGFR的表达可以通过抗EGFR mAb(西妥昔单抗)来控制，以监测或消除患者体内的CAR‑T细胞。在一个实施方案中，tEGFR的氨基酸序列在本文中可以称为SEQ ID No：22，如下：
[0193] MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILK
[0194] TVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLF
[0195] GTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQA
[0196] MNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATGMV
[0197] GALLLLLVVALGIGLFM
[0198] [SEQ ID No:22]
[0199] 因此，优选地，构建体包含编码基本上如SEQ ID No：22所示的氨基酸序列的核苷酸序列或其片段或变体。
[0200] 在一个实施方案中，tEGFR可以由在本文中称为SEQ ID No：23的核酸序列编码，如下：
[0201] ATGCTTCTCCTGGTGACAAGCCTTCTGCTCTGTGAGTTACCACACCCAGCATTCCTCCTGATCCCACGCAAAGTGTGTAACGGAA
[0202] TAGGTATTGGTGAATTTAAAGACTCACTCTCCATAAATGCTACGAATATTAAACACTTCAAAAACTGCACCTCCATCAGTGGCGA
[0203] TCTCCACATCCTGCCGGTGGCATTTAGGGGTGACTCCTTCACACATACTCCTCCTCTGGATCCACAGGAACTGGATATTCTGAAA
[0204] ACCGTAAAGGAAATCACAGGGTTTTTGCTGATTCAGGCTTGGCCTGAAAACAGGACGGACCTCCATGCCTTTGAGAACCTAGAAA
[0205] TCATACGCGGCAGGACCAAGCAACATGGTCAGTTTTCTCTTGCAGTCGTCAGCCTGAACATAACATCCTTGGGATTACGCTCCCT
[0206] CAAGGAGATAAGTGATGGAGATGTGATAATTTCAGGAAACAAAAATTTGTGCTATGCAAATACAATAAACTGGAAAAAACTGTTT
[0207] GGGACCTCCGGTCAGAAAACCAAAATTATAAGCAACAGAGGTGAAAACAGCTGCAAGGCCACAGGCCAGGTCTGCCATGCCTTGT
[0208] GCTCCCCCGAGGGCTGCTGGGGCCCGGAACCCAGGGACTGCGTCTCTTGCCGGAATGTCAGCCGAGGCAGGGAATGCGTGGACAA
[0209] GTGCAACCTTCTGGAGGGTGAGCCAAGGGAGTTTGTGGAGAACTCTGAGTGCATACAGTGCCACCCAGAGTGCCTGCCTCAGGCC
[0210] ATGAACATCACCTGCACAGGACGGGGACCAGACAACTGTATCCAGTGTGCCCACTACATTGACGGCCCCCACTGCGTCAAGACCT
[0211] GCCCGGCAGGAGTCATGGGAGAAAACAACACCCTGGTCTGGAAGTACGCAGACGCCGGCCATGTGTGCCACCTGTGCCATCCAAA
[0212] CTGCACCTACGGATGCACTGGGCCAGGTCTTGAAGGCTGTCCAACGAATGGGCCTAAGATCCCGTCCATCGCCACTGGGATGGTG
[0213] GGGGCCCTCCTCTTGCTGCTGGTGGTGGCCCTGGGGATCGGCCTCTTCATG
[0214] [SEQ ID No:23]
[0215] 因此，优选地，构建体包含基本上如SEQ ID No：23所示的核苷酸序列或其片段或变体。
[0216] 在另一个实施方案中，第二编码序列可以编码诱导型半胱天冬酶9(iC9)。iC9是一种修饰的人半胱天冬酶9(UniProt No.P55211；NCBI参考序列NP_001220.2)，与人FK506结合蛋白(UniProt No.P62942；NCBI参考序列NP_000792.1)融合，允许使用二聚化化学诱导剂进行条件二聚化(半胱天冬酶诱导药物(CID)，Rimiducid)，触发表达融合蛋白的CAR‑T细胞凋亡。在一个实施方案中，iC9的氨基酸序列在本文中可以称为SEQ ID No：24，如下：
[0217] MLEGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAY
[0218] GATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLESGGGSGVDGFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNID
[0219] CEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTS
[0220] CPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTSVDYPYDVPDYALD*
[0221] [SEQ ID No:24]
[0222] 因此，优选地，构建体包含编码基本上如SEQ ID No：24所示的氨基酸序列的核苷酸序列或其片段或变体。
[0223] 在一个实施方案中，iC9可以由在本文中称为SEQ ID No：25的核酸序列编码，如下：
[0224] ATGCTCGAGGGAGTGCAGGTGGAAACCATCTCCCCAGGAGACGGGCGCACCTTCCCCAAGCGCGGCCAGACCTGCGTGGTGCACT
[0225] ACACCGGGATGCTTGAAGATGGAAAGAAAGTTGATTCCTCCCGGGACAGAAACAAGCCCTTTAAGTTTATGCTAGGCAAGCAGGA
[0226] GGTGATCCGAGGCTGGGAAGAAGGGGTTGCCCAGATGAGTGTGGGTCAGAGAGCCAAACTGACTATATCTCCAGATTATGCCTAT
[0227] GGTGCCACTGGGCACCCAGGCATCATCCCACCACATGCCACTCTCGTCTTCGATGTGGAGCTTCTAAAACTGGAATCTGGCGGTG
[0228] GATCCGGAGTCGACGGATTTGGTGATGTCGGTGCTCTTGAGAGTTTGAGGGGAAATGCAGATTTGGCTTACATCCTGAGCATGGA
[0229] GCCCTGTGGCCACTGCCTCATTATCAACAATGTGAACTTCTGCCGTGAGTCCGGGCTCCGCACCCGCACTGGCTCCAACATCGAC
[0230] TGTGAGAAGTTGCGGCGTCGCTTCTCCTCGCTGCATTTCATGGTGGAGGTGAAGGGCGACCTGACTGCCAAGAAAATGGTGCTGG
[0231] CTTTGCTGGAGCTGGCGCAGCAGGACCACGGTGCTCTGGACTGCTGCGTGGTGGTCATTCTCTCTCACGGCTGTCAGGCCAGCCA
[0232] CCTGCAGTTCCCAGGGGCTGTCTACGGCACAGATGGATGCCCTGTGTCGGTCGAGAAGATTGTGAACATCTTCAATGGGACCAGC
[0233] TGCCCCAGCCTGGGAGGGAAGCCCAAGCTCTTTTTCATCCAGGCCTGTGGTGGGGAGCAGAAAGACCATGGGTTTGAGGTGGCCT
[0234] CCACTTCCCCTGAAGACGAGTCCCCTGGCAGTAACCCCGAGCCAGATGCCACCCCGTTCCAGGAAGGTTTGAGGACCTTCGACCA
[0235] GCTGGACGCCATATCTAGTTTGCCCACACCCAGTGACATCTTTGTGTCCTACTCTACTTTCCCAGGTTTTGTTTCCTGGAGGGAC
[0236] CCCAAGAGTGGCTCCTGGTACGTTGAGACCCTGGACGACATCTTTGAGCAGTGGGCTCACTCTGAAGACCTGCAGTCCCTCCTGC
[0237] TTAGGGTCGCTAATGCTGTTTCGGTGAAAGGGATTTATAAACAGATGCCTGGTTGCTTTAATTTCCTCCGGAAAAAACTTTTCTT
[0238] TAAAACATCAGTCGACTATCCGTACGACGTACCAGACTACGCACTCGACTAA
[0239] [SEQ ID No:25]
[0240] 因此，优选地，构建体包含基本上如SEQ ID No：25所示的核苷酸序列或其片段或变体。
[0241] 优选地，本发明的核酸构建体包含编码EGFR或截短的表皮生长因子受体(tEGFR)和/或诱导型半胱天冬酶9(iC9)的编码序列。当用于治疗时，具有一个自杀基因可以对CAR和CAR‑MAIT细胞的表达提供强有力的控制(检测和/或消除)。
[0242] 然而，更优选地，核酸构建体包含编码截短的表皮生长因子受体(tEGFR)和诱导型半胱天冬酶9(iC9)的编码序列。有利的是，当用于治疗时，具有两个自杀基因可以对CAR和CAR‑MAIT细胞的表达提供更严格的控制(检测和/或消除)。
[0243] 优选地，核酸构建体包含编码肽间隔区的核苷酸序列，其中肽间隔区可被消化(或自切割)从而产生间隔区两侧作为单独分子的编码多肽，例如胞内结构域和自杀基因编码的蛋白质，可以是tEGFR和/或iC9。因此，肽间隔区可被称为自切割肽。
[0244] 优选地，间隔序列包含并编码病毒肽间隔序列，更优选病毒2A肽间隔序列(Furler S,Paterna J‑C,Weibel M and Bueler H Recombinant AAV vectors containing the foot and mouth disease virus 2A sequence confer efficient bicistronic gene expression in cultured cells and rat substantia nigra neurons Gene Ther.2001,vol.8,PP:864–873)。
[0245] 优选地，编码2A肽序列的间隔序列将编码胞内结构域的序列与编码自杀蛋白的序列连接。在构建体编码两种自杀蛋白(例如，EGFR/tEGFR和iC9)的实施方式中，核酸构建体包含布置在编码胞内结构域的序列与编码第一自杀蛋白的序列之间的第一间隔区序列，以及布置在编码第一自杀蛋白的序列和编码第二自杀蛋白的序列之间的第二间隔区序列。第一自杀蛋白可以是EGFR/tEGFR，第二自杀蛋白可以是iC9。在另一个实施方案中，第一自杀蛋白可以是iC9并且第二自杀蛋白可以是EGFR/tEGFR。
[0246] 2A间隔序列可以是任何已知的变体，其包括称为E2A、F2A、P2A和T2A的那些序列，如Wang Y等公开的报道所述(Wang Y et al.Scientific Reports 2015,5)。优选地，自切割肽是P2A。在一个实施方案中，P2A间隔区具有在本文中称为SEQ ID No：26的氨基酸序列，如下：
[0247] GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP
[0248] [SEQ ID No:26]
[0249] 因此，优选地，构建体包含编码基本上如SEQ ID No：26所示的氨基酸序列的核苷酸序列或其片段或变体。
[0250] 在一个实施方案中，2A间隔区可由在本文中称为SEQ ID No：27的核酸序列编码，如下：
[0251] GGATCCGGAGCCACGAACTTCTCTCTGTTAAAGCAAGCAGGAGACGTGGAAGAAAACCCCGGTCCT[0252] 因此，优选地，构建体包含基本上如SEQ ID No：27所示的核苷酸序列或其片段或变体。
[0253] 在进一步的实施方案中，构建体还可包含编码土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE)的核苷酸序列，其增强转基因的表达。优选地，WPRE编码序列位于编码自杀蛋白的序列的3’。具体地，WPRE序列优选地是iC9编码序列的3'。
[0254] WPRE的一个实施方案是592bp长，包括γ‑α‑β元件，并且在本文中称为SEQ ID No：28，如下：
[0255] AATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTG
[0256] CTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTA
[0257] TGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCC
[0258] ACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCT
[0259] GCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAGCTGACGTCCTTTCCATGGCTGCTCGCCTG
[0260] TGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTG
[0261] CTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCCTG
[0262] [SEQ ID NO:28]
[0263] 优选地，核酸包含基本上如SEQ ID No：28所示的核酸序列或其片段或变体。
[0264] 优选地，构建体包含左(即5’)和/或右(即3’)长末端重复序列(LTR)。优选地，每个LTR位于构建体的5’和/或3’端。
[0265] 在一个优选的实施方案中，核酸构建体以该特定顺序包含5’启动子；编码对CD4或TCR Vbeta区特异性的scFv的序列；和编码胞内结构域的3’序列。5’和3’的使用指示该特征是上游或下游，并且并不旨在指示该特征必然是终端特征。
[0266] 在一个优选的实施方案中，核酸构建体以该特定顺序包含5’启动子；编码对CD4或TCR Vbeeta区特异性的scFv的序列；编码胞内结构域的序列；和编码至少一种自杀蛋白的3’序列。
[0267] 在更优选的实施方案中，核酸构建体以该特定顺序包含5’启动子(优选PGK启动子)；编码对CD4或一个或多个TCR Vbeta区(优选VL和/或VH结构域)特异性的scFv的序列；编码胞内结构域(优选CD28、4‑1BB和/或CD3ζ链)的序列；编码至少一种自杀蛋白(优选EGFR/EGFRt和/或iC9)的3’序列。
[0268] 在又一个更优选的实施方案中，核酸构建体以该特定顺序包含5’启动子(优选PGK启动子)；编码信号肽(SP)的序列；编码对CD4或一个或多个TCR Vbeta区(优选由G4S接头分隔的VL和VH结构域)特异性的scFv的序列；编码CD8a铰链和跨膜结构域的序列；编码胞内结构域(优选CD28、4‑1BB和CD3ζ链)的序列；编码至少一种自杀蛋白(优选EGFR/EGFRt和iC9)的3’序列，任选地在编码胞内结构域的序列与自杀蛋白编码序列之间具有自切割肽间隔区。
[0269] 在第一最优选的实施方案(称为“CART4”)中，核酸构建体以该特定顺序包含5’PGK启动子；编码信号肽(SP)的序列；编码对CD4特异性的scFv的VL和VH结构域的序列(优选由G4S接头分隔)；编码CD8a铰链和跨膜结构域的序列；编码胞内结构域的CD28、4‑1BB和CD3ζ链的序列；编码第一自切割肽间隔区的序列；编码EGFR/EGFRt的序列；编码第二自切割肽间隔区的序列；编码iC9的3’序列。
[0270] 在第二最优选的实施方案(称为“CARTVb7.1”)中，核酸构建体以该特定顺序包含5’PGK启动子；编码信号肽(SP)的序列；编码对一个或多个TCR Vbeta区、优选TCR‑Vbeta 
7.1链(优选由G4S接头分隔)特异性的scFv的VL和VH结构域的序列；编码CD8a铰链和跨膜结构域的序列；编码胞内结构域的CD28、4‑1BB和CD3ζ链的序列；编码第一自切割肽间隔区的序列；编码EGFR/EGFRt的序列；编码第二自切割肽间隔区的序列；编码iC9的3’序列。
[0271] 因此，核酸构建体(称为“CART4”)的一个优选实施方案具有在本文中称为SEQ ID No：29的氨基酸序列，如下：
[0272] METDTLLLWVLLLWVPGSTGDDIVMTQSPDSLAVSLGERVTMNCKSSQSLLYSTNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGV
[0273] PDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDVAVYYCQQYYSYRTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGPEVVKPGASVKMSC
[0274] KASGYTFTSYVIHWVRQKPGQGLDWIGYINPYNDGTDYDEKFKGKATLTSDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREKDNYATGA
[0275] WFAYWGQGTLVTVSSAAAFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCG
[0276] VLLLSLVITLYCNHRNRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRFSVVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQ
[0277] EEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDK
[0278] MAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMLLLVTSLLLCELPHPA
[0279] FLLIPRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPEN
[0280] RTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENS
[0281] CKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCA
[0282] HYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFM
[0283] GSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMLEGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWE
[0284] EGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLESGGGSGVDGFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCL
[0285] IINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGA
[0286] VYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISS
[0287] LPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTSVDYPYDVPDYALD*
[0288] [SEQ ID No:29]
[0289] 因此，优选地，构建体包含编码基本上如SEQ ID No：29所示的氨基酸序列的核苷酸序列或其片段或变体。
[0290] 优选地，核酸构建体(称为“CART4”)的实施方案具有在本文中称为SEQ ID No：30核苷酸序列，如下：
[0291] ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTGCTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACAGGTGACGACATTGTGATGACTCAGAGCC
[0292] CCGACAGCCTGGCCGTCTCACTGGGCGAAAGGGTGACCATGAATTGTAAATCTTCTCAGAGCCTGCTGTACAGTACAAACCAGAA
[0293] AAATTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAACCCGGCCAGAGCCCTAAGCTGCTGATCTATTGGGCAAGTACCCGAGAGTCAGGAGTG
[0294] CCAGACAGATTCTCCGGGTCTGGAAGTGGCACAGACTTCACCCTGACAATTAGCTCCGTGCAGGCCGAGGACGTGGCTGTCTACT
[0295] ATTGCCAGCAGTACTATAGCTACCGAACTTTCGGCGGGGGAACCAAACTGGAAATCAAGGGAGGAGGAGGCAGTGGCGGAGGAGG
[0296] GTCAGGAGGAGGAGGAAGCCAGGTGCAGCTGCAGCAGTCCGGACCAGAGGTGGTCAAACCCGGCGCTAGCGTCAAAATGTCCTGT
[0297] AAGGCATCTGGCTACACTTTCACCTCTTATGTGATTCACTGGGTCAGACAGAAGCCTGGGCAGGGACTGGACTGGATCGGGTACA
[0298] TTAACCCATATAATGATGGAACTGACTACGATGAAAAGTTTAAAGGCAAGGCCACACTGACTTCCGACACCTCAACAAGCACTGC
[0299] TTATATGGAGCTGTCTAGTCTGAGGTCTGAAGACACAGCAGTGTACTATTGCGCCCGCGAGAAGGATAACTACGCCACTGGCGCT
[0300] TGGTTTGCATATTGGGGCCAGGGGACCCTGGTGACAGTCTCATCCGCGGCCGCATTCGTGCCGGTCTTCCTGCCAGCGAAGCCCA
[0301] CCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCC
[0302] AGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGG
[0303] GTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAACCACAGGAACAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACA
[0304] TGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTC
[0305] CCGTTTCTCTGTTGTTAAACGGGGCAGAAAGAAGCTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAA
[0306] GAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACG
[0307] CCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAG
[0308] ACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAG
[0309] ATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTA
[0310] CAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCGGATCCGGAGCCACGAACTTCTCTCTGTTAAA
[0311] GCAAGCAGGAGACGTGGAAGAAAACCCCGGTCCTATGCTTCTCCTGGTGACAAGCCTTCTGCTCTGTGAGTTACCACACCCAGCA
[0312] TTCCTCCTGATCCCACGCAAAGTGTGTAACGGAATAGGTATTGGTGAATTTAAAGACTCACTCTCCATAAATGCTACGAATATTA
[0313] AACACTTCAAAAACTGCACCTCCATCAGTGGCGATCTCCACATCCTGCCGGTGGCATTTAGGGGTGACTCCTTCACACATACTCC
[0314] TCCTCTGGATCCACAGGAACTGGATATTCTGAAAACCGTAAAGGAAATCACAGGGTTTTTGCTGATTCAGGCTTGGCCTGAAAAC
[0315] AGGACGGACCTCCATGCCTTTGAGAACCTAGAAATCATACGCGGCAGGACCAAGCAACATGGTCAGTTTTCTCTTGCAGTCGTCA
[0316] GCCTGAACATAACATCCTTGGGATTACGCTCCCTCAAGGAGATAAGTGATGGAGATGTGATAATTTCAGGAAACAAAAATTTGTG
[0317] CTATGCAAATACAATAAACTGGAAAAAACTGTTTGGGACCTCCGGTCAGAAAACCAAAATTATAAGCAACAGAGGTGAAAACAGC
[0318] TGCAAGGCCACAGGCCAGGTCTGCCATGCCTTGTGCTCCCCCGAGGGCTGCTGGGGCCCGGAACCCAGGGACTGCGTCTCTTGCC
[0319] GGAATGTCAGCCGAGGCAGGGAATGCGTGGACAAGTGCAACCTTCTGGAGGGTGAGCCAAGGGAGTTTGTGGAGAACTCTGAGTG
[0320] CATACAGTGCCACCCAGAGTGCCTGCCTCAGGCCATGAACATCACCTGCACAGGACGGGGACCAGACAACTGTATCCAGTGTGCC
[0321] CACTACATTGACGGCCCCCACTGCGTCAAGACCTGCCCGGCAGGAGTCATGGGAGAAAACAACACCCTGGTCTGGAAGTACGCAG
[0322] ACGCCGGCCATGTGTGCCACCTGTGCCATCCAAACTGCACCTACGGATGCACTGGGCCAGGTCTTGAAGGCTGTCCAACGAATGG
[0323] GCCTAAGATCCCGTCCATCGCCACTGGGATGGTGGGGGCCCTCCTCTTGCTGCTGGTGGTGGCCCTGGGGATCGGCCTCTTCATG
[0324] GGATCTGGAGCCACGAACTTCTCTCTGTTAAAGCAAGCAGGAGACGTGGAAGAAAACCCCGGTCCTATGCTCGAGGGAGTGCAGG
[0325] TGGAAACCATCTCCCCAGGAGACGGGCGCACCTTCCCCAAGCGCGGCCAGACCTGCGTGGTGCACTACACCGGGATGCTTGAAGA
[0326] TGGAAAGAAAGTTGATTCCTCCCGGGACAGAAACAAGCCCTTTAAGTTTATGCTAGGCAAGCAGGAGGTGATCCGAGGCTGGGAA
[0327] GAAGGGGTTGCCCAGATGAGTGTGGGTCAGAGAGCCAAACTGACTATATCTCCAGATTATGCCTATGGTGCCACTGGGCACCCAG
[0328] GCATCATCCCACCACATGCCACTCTCGTCTTCGATGTGGAGCTTCTAAAACTGGAATCTGGCGGTGGATCCGGAGTCGACGGATT
[0329] TGGTGATGTCGGTGCTCTTGAGAGTTTGAGGGGAAATGCAGATTTGGCTTACATCCTGAGCATGGAGCCCTGTGGCCACTGCCTC
[0330] ATTATCAACAATGTGAACTTCTGCCGTGAGTCCGGGCTCCGCACCCGCACTGGCTCCAACATCGACTGTGAGAAGTTGCGGCGTC
[0331] GCTTCTCCTCGCTGCATTTCATGGTGGAGGTGAAGGGCGACCTGACTGCCAAGAAAATGGTGCTGGCTTTGCTGGAGCTGGCGCA
[0332] GCAGGACCACGGTGCTCTGGACTGCTGCGTGGTGGTCATTCTCTCTCACGGCTGTCAGGCCAGCCACCTGCAGTTCCCAGGGGCT
[0333] GTCTACGGCACAGATGGATGCCCTGTGTCGGTCGAGAAGATTGTGAACATCTTCAATGGGACCAGCTGCCCCAGCCTGGGAGGGA
[0334] AGCCCAAGCTCTTTTTCATCCAGGCCTGTGGTGGGGAGCAGAAAGACCATGGGTTTGAGGTGGCCTCCACTTCCCCTGAAGACGA
[0335] GTCCCCTGGCAGTAACCCCGAGCCAGATGCCACCCCGTTCCAGGAAGGTTTGAGGACCTTCGACCAGCTGGACGCCATATCTAGT
[0336] TTGCCCACACCCAGTGACATCTTTGTGTCCTACTCTACTTTCCCAGGTTTTGTTTCCTGGAGGGACCCCAAGAGTGGCTCCTGGT
[0337] ACGTTGAGACCCTGGACGACATCTTTGAGCAGTGGGCTCACTCTGAAGACCTGCAGTCCCTCCTGCTTAGGGTCGCTAATGCTGT
[0338] TTCGGTGAAAGGGATTTATAAACAGATGCCTGGTTGCTTTAATTTCCTCCGGAAAAAACTTTTCTTTAAAACATCAGTCGACTAT
[0339] CCGTACGACGTACCAGACTACGCACTCGACTAA
[0340] [SEQ ID No:30]
[0341] 因此，优选地，构建体包含基本上如SEQ ID No：30所示的核苷酸序列或其片段或变体。
[0342] 因此，核酸构建体(称为“CARTVb7.1”)的第二优选实施方案具有在本文中称为SEQ IDNo：31的氨基酸序列，如下：
[0343] MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQSPSSLSASLGGKVTLTCKASQDINKYIAWYQHKPGKGPRLLIHYTSTLQPGIPSRFSG
[0344] SGSGRDYSFSISNLEPEDVATYYCLQYDNLRTFGGGTKLEIKRTDGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKAS
[0345] GYTFTRYWITWVKQRPGQGLEWIGDIYPGSGFTKYNEKFKSKATLTVDTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAREGGNYWYFDVWG
[0346] TGTTVTVSSAAAAAFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLL
[0347] SLVITLYCNHRNRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRFSVVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDG
[0348] CSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEA
[0349] YSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMLLLVTSLLLCELPHPAFLLI
[0350] PRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDL
[0351] HAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKAT
[0352] GQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYID
[0353] GPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFMGSGA
[0354] TNFSLLKQAGDVEENPGPMLEGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVA
[0355] QMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLESGGGSGVDGFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINN
[0356] VNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGT
[0357] DGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTP
[0358] SDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTSVDYPYDVPDYALD*
[0359] [SEQ ID No:31]
[0360] 优选地，因此，构建体包含编码基本上如SEQ ID No：31所示的氨基酸序列的核苷酸序列或其片段或变体。
[0361] 优选地，核酸构建体(称为“CARTVb7.1”)的实施方案具有在本文中称为SEQ ID No：32的核苷酸序列，如下：
[0362] ATGGCTCTGCCTGTTACAGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTTCTGCATGCCGCCAGACCTGACATCCAGATGACACAGAGCC
[0363] CTAGCAGCCTGTCTGCCTCTCTCGGCGGAAAAGTGACCCTGACATGCAAGGCCAGCCAGGACATCAACAAGTATATCGCCTGGTA
[0364] TCAGCACAAGCCCGGCAAGGGACCTAGACTGCTGATCCACTACACCAGCACACTGCAGCCTGGCATCCCCAGCAGATTTTCTGGC
[0365] AGCGGCTCCGGCAGAGACTACAGCTTCAGCATCAGCAACCTGGAACCTGAGGACGTGGCCACCTACTACTGCCTGCAGTACGACA
[0366] ACCTGCGGACCTTTGGCGGCGGAACAAAGCTGGAAATCAAGCGGACAGATGGCGGAGGCGGATCAGGCGGCGGAGGAAGCGGTGG
[0367] CGGAGGATCTCAAGTTCAGCTGCAACAGCCTGGCGCCGAGCTTGTGAAACCTGGCGCCTCTGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCTCC
[0368] GGCTACACCTTCACCAGATACTGGATCACCTGGGTCAAGCAGAGGCCTGGACAGGGACTCGAGTGGATCGGCGATATCTATCCTG
[0369] GCTCCGGCTTCACCAAGTACAACGAGAAGTTCAAGAGCAAGGCCACACTGACCGTGGACACCAGCAGCAGCACAGCCTACATGCA
[0370] GCTGTCTAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGTGCTAGAGAAGGCGGCAACTACTGGTACTTCGACGTGTGGGGC
[0371] ACCGGCACCACAGTGACAGTTAGTTCTGCGGCCGCGGCCGCATTCGTGCCGGTCTTCCTGCCAGCGAAGCCCACCACGACGCCAG
[0372] CGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGG
[0373] CGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTG
[0374] TCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAACCACAGGAACAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTC
[0375] CCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCCGTTTCTCTGT
[0376] TGTTAAACGGGGCAGAAAGAAGCTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGC
[0377] TGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACC
[0378] AGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGA
[0379] CCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCC
[0380] TACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGG
[0381] ACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCGGATCCGGAGCCACGAACTTCTCTCTGTTAAAGCAAGCAGGAGA
[0382] CGTGGAAGAAAACCCCGGTCCTATGCTTCTCCTGGTGACAAGCCTTCTGCTCTGTGAGTTACCACACCCAGCATTCCTCCTGATC
[0383] CCACGCAAAGTGTGTAACGGAATAGGTATTGGTGAATTTAAAGACTCACTCTCCATAAATGCTACGAATATTAAACACTTCAAAA
[0384] ACTGCACCTCCATCAGTGGCGATCTCCACATCCTGCCGGTGGCATTTAGGGGTGACTCCTTCACACATACTCCTCCTCTGGATCC
[0385] ACAGGAACTGGATATTCTGAAAACCGTAAAGGAAATCACAGGGTTTTTGCTGATTCAGGCTTGGCCTGAAAACAGGACGGACCTC
[0386] CATGCCTTTGAGAACCTAGAAATCATACGCGGCAGGACCAAGCAACATGGTCAGTTTTCTCTTGCAGTCGTCAGCCTGAACATAA
[0387] CATCCTTGGGATTACGCTCCCTCAAGGAGATAAGTGATGGAGATGTGATAATTTCAGGAAACAAAAATTTGTGCTATGCAAATAC
[0388] AATAAACTGGAAAAAACTGTTTGGGACCTCCGGTCAGAAAACCAAAATTATAAGCAACAGAGGTGAAAACAGCTGCAAGGCCACA
[0389] GGCCAGGTCTGCCATGCCTTGTGCTCCCCCGAGGGCTGCTGGGGCCCGGAACCCAGGGACTGCGTCTCTTGCCGGAATGTCAGCC
[0390] GAGGCAGGGAATGCGTGGACAAGTGCAACCTTCTGGAGGGTGAGCCAAGGGAGTTTGTGGAGAACTCTGAGTGCATACAGTGCCA
[0391] CCCAGAGTGCCTGCCTCAGGCCATGAACATCACCTGCACAGGACGGGGACCAGACAACTGTATCCAGTGTGCCCACTACATTGAC
[0392] GGCCCCCACTGCGTCAAGACCTGCCCGGCAGGAGTCATGGGAGAAAACAACACCCTGGTCTGGAAGTACGCAGACGCCGGCCATG
[0393] TGTGCCACCTGTGCCATCCAAACTGCACCTACGGATGCACTGGGCCAGGTCTTGAAGGCTGTCCAACGAATGGGCCTAAGATCCC
[0394] GTCCATCGCCACTGGGATGGTGGGGGCCCTCCTCTTGCTGCTGGTGGTGGCCCTGGGGATCGGCCTCTTCATGGGATCTGGAGCC
[0395] ACGAACTTCTCTCTGTTAAAGCAAGCAGGAGACGTGGAAGAAAACCCCGGTCCTATGCTCGAGGGAGTGCAGGTGGAAACCATCT
[0396] CCCCAGGAGACGGGCGCACCTTCCCCAAGCGCGGCCAGACCTGCGTGGTGCACTACACCGGGATGCTTGAAGATGGAAAGAAAGT
[0397] TGATTCCTCCCGGGACAGAAACAAGCCCTTTAAGTTTATGCTAGGCAAGCAGGAGGTGATCCGAGGCTGGGAAGAAGGGGTTGCC
[0398] CAGATGAGTGTGGGTCAGAGAGCCAAACTGACTATATCTCCAGATTATGCCTATGGTGCCACTGGGCACCCAGGCATCATCCCAC
[0399] CACATGCCACTCTCGTCTTCGATGTGGAGCTTCTAAAACTGGAATCTGGCGGTGGATCCGGAGTCGACGGATTTGGTGATGTCGG
[0400] TGCTCTTGAGAGTTTGAGGGGAAATGCAGATTTGGCTTACATCCTGAGCATGGAGCCCTGTGGCCACTGCCTCATTATCAACAAT
[0401] GTGAACTTCTGCCGTGAGTCCGGGCTCCGCACCCGCACTGGCTCCAACATCGACTGTGAGAAGTTGCGGCGTCGCTTCTCCTCGC
[0402] TGCATTTCATGGTGGAGGTGAAGGGCGACCTGACTGCCAAGAAAATGGTGCTGGCTTTGCTGGAGCTGGCGCAGCAGGACCACGG
[0403] TGCTCTGGACTGCTGCGTGGTGGTCATTCTCTCTCACGGCTGTCAGGCCAGCCACCTGCAGTTCCCAGGGGCTGTCTACGGCACA
[0404] GATGGATGCCCTGTGTCGGTCGAGAAGATTGTGAACATCTTCAATGGGACCAGCTGCCCCAGCCTGGGAGGGAAGCCCAAGCTCT
[0405] TTTTCATCCAGGCCTGTGGTGGGGAGCAGAAAGACCATGGGTTTGAGGTGGCCTCCACTTCCCCTGAAGACGAGTCCCCTGGCAG
[0406] TAACCCCGAGCCAGATGCCACCCCGTTCCAGGAAGGTTTGAGGACCTTCGACCAGCTGGACGCCATATCTAGTTTGCCCACACCC
[0407] AGTGACATCTTTGTGTCCTACTCTACTTTCCCAGGTTTTGTTTCCTGGAGGGACCCCAAGAGTGGCTCCTGGTACGTTGAGACCC
[0408] TGGACGACATCTTTGAGCAGTGGGCTCACTCTGAAGACCTGCAGTCCCTCCTGCTTAGGGTCGCTAATGCTGTTTCGGTGAAAGG
[0409] GATTTATAAACAGATGCCTGGTTGCTTTAATTTCCTCCGGAAAAAACTTTTCTTTAAAACATCAGTCGACTATCCGTACGACGTA
[0410] CCAGACTACGCACTCGACTAA
[0411] [SEQ ID No:32]
[0412] 因此，优选地，构建体包含基本上如SEQ ID No：32所示的核苷酸序列或其片段或变体。
[0413] 因此，应当理解，使用第二方面或第三方面的方法获得的分离的MAIT细胞可以被激活，并且最终用根据第五方面的编码CAR的核酸构建体转导，从而产生第一方面或第四方面的CAR‑MAIT细胞。
[0414] 在第六方面，本文提供了编码第五方面的核酸构建体的表达载体。
[0415] 优选地，载体是重组的。优选地，载体是病毒载体，更优选逆转录病毒载体。图9和图10示出本发明载体的两个优选实施方案的特征的图谱。
[0416] 在一个实施方案中(CART4：CAR4‑tEGFR‑iC9；参见图9)，载体具有在本文中称为SEQ ID No：33的核酸序列，如下：
[0417] TGAAAGACCCCACCTGTAGGTTTGGCAAGCTAGCTTAAGTAACGCCATTTTGCAAGGCATGGAAAATACATAACTGAGAATAGAG
[0418] AAGTTCAGATCAAGGTTAGGAACAGAGAGACAGCAGAATATGGGCCAAACAGGATATCTGTGGTAAGCAGTTCCTGCCCCGGCTC
[0419] AGGGCCAAGAACAGATGGTCCCCAGATGCGGTCCCGCCCTCAGCAGTTTCTAGAGAACCATCAGATGTTTCCAGGGTGCCCCAAG
[0420] GACCTGAAATGACCCTGTGCCTTATTTGAACTAACCAATCAGTTCGCTTCTCGCTTCTGTTCGCGCGCTTCTGCTCCCCGAGCTC
[0421] AATAAAAGAGCCCACAACCCCTCACTCGGCGCGCCAGTCCTCCGATAGACTGCGTCGCCCGGGTACCCGTATTCCCAATAAAGCC
[0422] TCTTGCTGTTTGCATCCGAATCGTGGACTCGCTGATCCTTGGGAGGGTCTCCTCAGATTGATTGACTGCCCACCTCGGGGGTCTT
[0423] TCATTTGGAGGTTCCACCGAGATTTGGAGACCCCTGCCCAGGGACCACCGACCCCCCCGCCGGGAGGTAAGCTGGCCAGCGGTCG
[0424] TTTCGTGTCTGTCTCTGTCTTTGTGCGTGTTTGTGCCGGCATCTAATGTTTGCGCCTGCGTCTGTACTAGTTAGCTAACTAGCTC
[0425] TGTATCTGGCGGACCCGTGGTGGAACTGACGAGTTCTGAACACCCGGCCGCAACCCTGGGAGACGTCCCAGGGACTTTGGGGGCC
[0426] GTTTTTGTGGCCCGACCTGAGGAAGGGAGTCGATGTGGAATCCGACCCCGTCAGGATATGTGGTTCTGGTAGGAGACGAGAACCT
[0427] AAAACAGTTCCCGCCTCCGTCTGAATTTTTGCTTTCGGTTTGGAACCGAAGCCGCGCGTCTTGTCTGCTGCAGCGCTGCAGCATC
[0428] GTTCTGTGTTGTCTCTGTCTGACTGTGTTTCTGTATTTGTCTGAAAATTAGGGCCAGACTGTTACCACTCCCTTAAGTTTGACCT
[0429] TAGGTCACTGGAAAGATGTCGAGCGGATCGCTCACAACCAGTCGGTAGATGTCAAGAAGAGACGTTGGGTTACCTTCTGCTCTGC
[0430] AGAATGGCCAACCTTTAACGTCGGATGGCCGCGAGACGGCACCTTTAACCGAGACCTCATCACCCAGGTTAAGATCAAGGTCTTT
[0431] TCACCTGGCCCGCATGGACACCCAGACCAGGTCCCCTACATCGTGACCTGGGAAGCCTTGGCTTTTGACCCCCCTCCCTGGGTCA
[0432] AGCCCTTTGTACACCCTAAGCCTCCGCCTCCTCTTCCTCCATCCGCCCCGTCTCTCCCCCTTGAACCTCCTCGTTCGACCCCGCC
[0433] TCGATCCTCCCTTTATCCAGCCCTCACTCCTTCTCTAGGCGCCGGAATTAGATCTCTCGAGGTTAACGAATTCTACCGGGTAGGG
[0434] GAGGCGCTTTTCCCAAGGCAGTCTGGAGCATGCGCTTTAGCAGCCCCGCTGGGCACTTGGCGCTACACAAGTGGCCTCTGGCCTC
[0435] GCACACATTCCACATCCACCGGTAGGCGCCAACCGGCTCCGTTCTTTGGTGGCCCCTTCGCGCCACCTTCTACTCCTCCCCTAGT
[0436] CAGGAAGTTCCCCCCCGCCCCGCAGCTCGCGTCGTGCAGGACGTGACAAATGGAAGTAGCACGTCTCACTAGTCTCGTGCAGATG
[0437] GACAGCACCGCTGAGCAATGGAAGCGGGTAGGCCTTTGGGGCAGCGGCCAATAGCAGCTTTGCTCCTTCGCTTTCTGGGCTCAGA
[0438] GGCTGGGAAGGGGTGGGTCCGGGGGCGGGCTCAGGGGCGGGCTCAGGGGCGGGGCGGGCGCCCGAAGGTCCTCCGGAGGCCCGGC
[0439] ATTCTGCACGCTTCAAAAGCGCACGTCTGCCGCGCTGTTCTCCTCTTCCTCATTCTCCGGGCCTTTCGACCTGCAGCCCAAGCCA
[0440] CCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTGCTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACAGGTGACGACATTGTGATGACTCAGAG
[0441] CCCCGACAGCCTGGCCGTCTCACTGGGCGAAAGGGTGACCATGAATTGTAAATCTTCTCAGAGCCTGCTGTACAGTACAAACCAG
[0442] AAAAATTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAACCCGGCCAGAGCCCTAAGCTGCTGATCTATTGGGCAAGTACCCGAGAGTCAGGAG
[0443] TGCCAGACAGATTCTCCGGGTCTGGAAGTGGCACAGACTTCACCCTGACAATTAGCTCCGTGCAGGCCGAGGACGTGGCTGTCTA
[0444] CTATTGCCAGCAGTACTATAGCTACCGAACTTTCGGCGGGGGAACCAAACTGGAAATCAAGGGAGGAGGAGGCAGTGGCGGAGGA
[0445] GGGTCAGGAGGAGGAGGAAGCCAGGTGCAGCTGCAGCAGTCCGGACCAGAGGTGGTCAAACCCGGCGCTAGCGTCAAAATGTCCT
[0446] GTAAGGCATCTGGCTACACTTTCACCTCTTATGTGATTCACTGGGTCAGACAGAAGCCTGGGCAGGGACTGGACTGGATCGGGTA
[0447] CATTAACCCATATAATGATGGAACTGACTACGATGAAAAGTTTAAAGGCAAGGCCACACTGACTTCCGACACCTCAACAAGCACT
[0448] GCTTATATGGAGCTGTCTAGTCTGAGGTCTGAAGACACAGCAGTGTACTATTGCGCCCGCGAGAAGGATAACTACGCCACTGGCG
[0449] CTTGGTTTGCATATTGGGGCCAGGGGACCCTGGTGACAGTCTCATCCGCGGCCGCATTCGTGCCGGTCTTCCTGCCAGCGAAGCC
[0450] CACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGG
[0451] CCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTG
[0452] GGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAACCACAGGAACAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTA
[0453] CATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGC
[0454] TCCCGTTTCTCTGTTGTTAAACGGGGCAGAAAGAAGCTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTC
[0455] AAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGA
[0456] CGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAG
[0457] AGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATA
[0458] AGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAG
[0459] TACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCGGATCCGGAGCCACGAACTTCTCTCTGTTA
[0460] AAGCAAGCAGGAGACGTGGAAGAAAACCCCGGTCCTATGCTTCTCCTGGTGACAAGCCTTCTGCTCTGTGAGTTACCACACCCAG
[0461] CATTCCTCCTGATCCCACGCAAAGTGTGTAACGGAATAGGTATTGGTGAATTTAAAGACTCACTCTCCATAAATGCTACGAATAT
[0462] TAAACACTTCAAAAACTGCACCTCCATCAGTGGCGATCTCCACATCCTGCCGGTGGCATTTAGGGGTGACTCCTTCACACATACT
[0463] CCTCCTCTGGATCCACAGGAACTGGATATTCTGAAAACCGTAAAGGAAATCACAGGGTTTTTGCTGATTCAGGCTTGGCCTGAAA
[0464] ACAGGACGGACCTCCATGCCTTTGAGAACCTAGAAATCATACGCGGCAGGACCAAGCAACATGGTCAGTTTTCTCTTGCAGTCGT
[0465] CAGCCTGAACATAACATCCTTGGGATTACGCTCCCTCAAGGAGATAAGTGATGGAGATGTGATAATTTCAGGAAACAAAAATTTG
[0466] TGCTATGCAAATACAATAAACTGGAAAAAACTGTTTGGGACCTCCGGTCAGAAAACCAAAATTATAAGCAACAGAGGTGAAAACA
[0467] GCTGCAAGGCCACAGGCCAGGTCTGCCATGCCTTGTGCTCCCCCGAGGGCTGCTGGGGCCCGGAACCCAGGGACTGCGTCTCTTG
[0468] CCGGAATGTCAGCCGAGGCAGGGAATGCGTGGACAAGTGCAACCTTCTGGAGGGTGAGCCAAGGGAGTTTGTGGAGAACTCTGAG
[0469] TGCATACAGTGCCACCCAGAGTGCCTGCCTCAGGCCATGAACATCACCTGCACAGGACGGGGACCAGACAACTGTATCCAGTGTG
[0470] CCCACTACATTGACGGCCCCCACTGCGTCAAGACCTGCCCGGCAGGAGTCATGGGAGAAAACAACACCCTGGTCTGGAAGTACGC
[0471] AGACGCCGGCCATGTGTGCCACCTGTGCCATCCAAACTGCACCTACGGATGCACTGGGCCAGGTCTTGAAGGCTGTCCAACGAAT
[0472] GGGCCTAAGATCCCGTCCATCGCCACTGGGATGGTGGGGGCCCTCCTCTTGCTGCTGGTGGTGGCCCTGGGGATCGGCCTCTTCA
[0473] TGGGATCTGGAGCCACGAACTTCTCTCTGTTAAAGCAAGCAGGAGACGTGGAAGAAAACCCCGGTCCTATGCTCGAGGGAGTGCA
[0474] GGTGGAAACCATCTCCCCAGGAGACGGGCGCACCTTCCCCAAGCGCGGCCAGACCTGCGTGGTGCACTACACCGGGATGCTTGAA
[0475] GATGGAAAGAAAGTTGATTCCTCCCGGGACAGAAACAAGCCCTTTAAGTTTATGCTAGGCAAGCAGGAGGTGATCCGAGGCTGGG
[0476] AAGAAGGGGTTGCCCAGATGAGTGTGGGTCAGAGAGCCAAACTGACTATATCTCCAGATTATGCCTATGGTGCCACTGGGCACCC
[0477] AGGCATCATCCCACCACATGCCACTCTCGTCTTCGATGTGGAGCTTCTAAAACTGGAATCTGGCGGTGGATCCGGAGTCGACGGA
[0478] TTTGGTGATGTCGGTGCTCTTGAGAGTTTGAGGGGAAATGCAGATTTGGCTTACATCCTGAGCATGGAGCCCTGTGGCCACTGCC
[0479] TCATTATCAACAATGTGAACTTCTGCCGTGAGTCCGGGCTCCGCACCCGCACTGGCTCCAACATCGACTGTGAGAAGTTGCGGCG
[0480] TCGCTTCTCCTCGCTGCATTTCATGGTGGAGGTGAAGGGCGACCTGACTGCCAAGAAAATGGTGCTGGCTTTGCTGGAGCTGGCG
[0481] CAGCAGGACCACGGTGCTCTGGACTGCTGCGTGGTGGTCATTCTCTCTCACGGCTGTCAGGCCAGCCACCTGCAGTTCCCAGGGG
[0482] CTGTCTACGGCACAGATGGATGCCCTGTGTCGGTCGAGAAGATTGTGAACATCTTCAATGGGACCAGCTGCCCCAGCCTGGGAGG
[0483] GAAGCCCAAGCTCTTTTTCATCCAGGCCTGTGGTGGGGAGCAGAAAGACCATGGGTTTGAGGTGGCCTCCACTTCCCCTGAAGAC
[0484] GAGTCCCCTGGCAGTAACCCCGAGCCAGATGCCACCCCGTTCCAGGAAGGTTTGAGGACCTTCGACCAGCTGGACGCCATATCTA
[0485] GTTTGCCCACACCCAGTGACATCTTTGTGTCCTACTCTACTTTCCCAGGTTTTGTTTCCTGGAGGGACCCCAAGAGTGGCTCCTG
[0486] GTACGTTGAGACCCTGGACGACATCTTTGAGCAGTGGGCTCACTCTGAAGACCTGCAGTCCCTCCTGCTTAGGGTCGCTAATGCT
[0487] GTTTCGGTGAAAGGGATTTATAAACAGATGCCTGGTTGCTTTAATTTCCTCCGGAAAAAACTTTTCTTTAAAACATCAGTCGACT
[0488] ATCCGTACGACGTACCAGACTACGCACTCGACTAAACAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTT
[0489] AACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTT
[0490] TCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGT
[0491] GTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATT
[0492] GCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGT
[0493] CGGGGAAATCATCGTCCTTTCCTTGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTC
[0494] GGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACG
[0495] AGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCCTATCGATAAAATAAAAGATTTTATTTAGTCTCCAGAAAAAGGGGGGAATGAAA
[0496] GACCCCACCTGTAGGTTTGGCAAGCTAGCTTAAGTAACGCCATTTTGCAAGGCATGGAAAATACATAACTGAGAATAGAGAAGTT
[0497] CAGATCAAGGTTAGGAACAGAGAGACAGCAGAATATGGGCCAAACAGGATATCTGTGGTAAGCAGTTCCTGCCCCGGCTCAGGGC
[0498] CAAGAACAGATGGTCCCCAGATGCGGTCCCGCCCTCAGCAGTTTCTAGAGAACCATCAGATGTTTCCAGGGTGCCCCAAGGACCT
[0499] GAAATGACCCTGTGCCTTATTTGAACTAACCAATCAGTTCGCTTCTCGCTTCTGTTCGCGCGCTTCTGCTCCCCGAGCTCAATAA
[0500] AAGAGCCCACAACCCCTCACTCGGCGCGCCAGTCCTCCGATAGACTGCGTCGCCCGGGTACCCGTGTATCCAATAAACCCTCTTG
[0501] CAGTTGCATCCGACTTGTGGTCTCGCTGTTCCTTGGGAGGGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACCCGTCAGCGGGGGTCTTTCATG
[0502] GGTAACAGTTTCTTGAAGTTGGAGAACAACATTCTGAGGGTAGGAGTCGAATATTAAGTAATCCTGACTCAATTAGCCACTGTTT
[0503] TGAATCCACATACTCCAATACTCCTGAAATAGTTCATTATGGACAGCGCAGAAGAGCTGGGGAGAATTAATTCGTAATCATGGTC
[0504] ATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGT
[0505] GCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATT
[0506] AATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGT
[0507] CGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAAC
[0508] ATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACG
[0509] AGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTC
[0510] CCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCAT
[0511] AGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACC
[0512] GCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAG
[0513] GATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTT
[0514] GGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCG
[0515] GTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGA
[0516] CGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAA
[0517] AAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCT
[0518] CAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGG
[0519] CCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAG
[0520] CGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTA
[0521] ATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTC
[0522] CCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGT
[0523] AAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTG
[0524] TGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAA
[0525] TACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTG
[0526] TTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAA
[0527] AAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTA
[0528] TTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGC
[0529] ACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGC
[0530] CCTTTCGTCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGC
[0531] GGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAG
[0532] CAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCCATTCGC
[0533] CATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGC
[0534] AAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCGCAAGGAATGGTGCATGCAAGGAGA
[0535] TGGCGCCCAACAGTCCCCCGGCCACGGGGCCTGCCACCATACCCACGCCGAAACAAGCGCTCATGAGCCCGAAGTGGCGAGCCCG
[0536] ATCTTCCCCATCGGTGATGTCGGCGATATAGGCGCCAGCAACCGCACCTGTGGCGCCGGTGATGCCGGCCACGATGCGTCCGGCG
[0537] TAGAGGCGATTAGTCCAATTTGTTAAAGACAGGATATCAGTGGTCCAGGCTCTAGTTTTGACTCAACAATATCACCAGCTGAAGC
[0538] CTATAGAGTACGAGCCATAGATAAAATAAAAGATTTTATTTAGTCTCCAGAAAAAGGGGGGAA
[0539] [SEQ ID NO:33]
[0540] 优选地，载体包含基本上如SEQ ID NO：33所示的核酸序列或其片段或变体。
[0541] 在一个实施方案中(CARTVb7.1：CARTVb7.1‑tEGFR‑iC9；参见图10)，载体具有在本文中称为SEQ ID No：36的核酸序列，如下：
[0542] TGAAAGACCCCACCTGTAGGTTTGGCAAGCTAGCTTAAGTAACGCCATTTTGCAAGGCATGGAAAATACATAACTGAGAATAGAG
[0543] AAGTTCAGATCAAGGTTAGGAACAGAGAGACAGCAGAATATGGGCCAAACAGGATATCTGTGGTAAGCAGTTCCTGCCCCGGCTC
[0544] AGGGCCAAGAACAGATGGTCCCCAGATGCGGTCCCGCCCTCAGCAGTTTCTAGAGAACCATCAGATGTTTCCAGGGTGCCCCAAG
[0545] GACCTGAAATGACCCTGTGCCTTATTTGAACTAACCAATCAGTTCGCTTCTCGCTTCTGTTCGCGCGCTTCTGCTCCCCGAGCTC
[0546] AATAAAAGAGCCCACAACCCCTCACTCGGCGCGCCAGTCCTCCGATAGACTGCGTCGCCCGGGTACCCGTATTCCCAATAAAGCC
[0547] TCTTGCTGTTTGCATCCGAATCGTGGACTCGCTGATCCTTGGGAGGGTCTCCTCAGATTGATTGACTGCCCACCTCGGGGGTCTT
[0548] TCATTTGGAGGTTCCACCGAGATTTGGAGACCCCTGCCCAGGGACCACCGACCCCCCCGCCGGGAGGTAAGCTGGCCAGCGGTCG
[0549] TTTCGTGTCTGTCTCTGTCTTTGTGCGTGTTTGTGCCGGCATCTAATGTTTGCGCCTGCGTCTGTACTAGTTAGCTAACTAGCTC
[0550] TGTATCTGGCGGACCCGTGGTGGAACTGACGAGTTCTGAACACCCGGCCGCAACCCTGGGAGACGTCCCAGGGACTTTGGGGGCC
[0551] GTTTTTGTGGCCCGACCTGAGGAAGGGAGTCGATGTGGAATCCGACCCCGTCAGGATATGTGGTTCTGGTAGGAGACGAGAACCT
[0552] AAAACAGTTCCCGCCTCCGTCTGAATTTTTGCTTTCGGTTTGGAACCGAAGCCGCGCGTCTTGTCTGCTGCAGCGCTGCAGCATC
[0553] GTTCTGTGTTGTCTCTGTCTGACTGTGTTTCTGTATTTGTCTGAAAATTAGGGCCAGACTGTTACCACTCCCTTAAGTTTGACCT
[0554] TAGGTCACTGGAAAGATGTCGAGCGGATCGCTCACAACCAGTCGGTAGATGTCAAGAAGAGACGTTGGGTTACCTTCTGCTCTGC
[0555] AGAATGGCCAACCTTTAACGTCGGATGGCCGCGAGACGGCACCTTTAACCGAGACCTCATCACCCAGGTTAAGATCAAGGTCTTT
[0556] TCACCTGGCCCGCATGGACACCCAGACCAGGTCCCCTACATCGTGACCTGGGAAGCCTTGGCTTTTGACCCCCCTCCCTGGGTCA
[0557] AGCCCTTTGTACACCCTAAGCCTCCGCCTCCTCTTCCTCCATCCGCCCCGTCTCTCCCCCTTGAACCTCCTCGTTCGACCCCGCC
[0558] TCGATCCTCCCTTTATCCAGCCCTCACTCCTTCTCTAGGCGCCGGAATTAGATCTCTCGAGGTTAACGAATTCTACCGGGTAGGG
[0559] GAGGCGCTTTTCCCAAGGCAGTCTGGAGCATGCGCTTTAGCAGCCCCGCTGGGCACTTGGCGCTACACAAGTGGCCTCTGGCCTC
[0560] GCACACATTCCACATCCACCGGTAGGCGCCAACCGGCTCCGTTCTTTGGTGGCCCCTTCGCGCCACCTTCTACTCCTCCCCTAGT
[0561] CAGGAAGTTCCCCCCCGCCCCGCAGCTCGCGTCGTGCAGGACGTGACAAATGGAAGTAGCACGTCTCACTAGTCTCGTGCAGATG
[0562] GACAGCACCGCTGAGCAATGGAAGCGGGTAGGCCTTTGGGGCAGCGGCCAATAGCAGCTTTGCTCCTTCGCTTTCTGGGCTCAGA
[0563] GGCTGGGAAGGGGTGGGTCCGGGGGCGGGCTCAGGGGCGGGCTCAGGGGCGGGGCGGGCGCCCGAAGGTCCTCCGGAGGCCCGGC
[0564] ATTCTGCACGCTTCAAAAGCGCACGTCTGCCGCGCTGTTCTCCTCTTCCTCATTCTCCGGGCCTTTCGACCTGCAGCCCAAGCCA
[0565] CCATGGCTCTGCCTGTTACAGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTTCTGCATGCCGCCAGACCTGACATCCAGATGACACAGAG
[0566] CCCTAGCAGCCTGTCTGCCTCTCTCGGCGGAAAAGTGACCCTGACATGCAAGGCCAGCCAGGACATCAACAAGTATATCGCCTGG
[0567] TATCAGCACAAGCCCGGCAAGGGACCTAGACTGCTGATCCACTACACCAGCACACTGCAGCCTGGCATCCCCAGCAGATTTTCTG
[0568] GCAGCGGCTCCGGCAGAGACTACAGCTTCAGCATCAGCAACCTGGAACCTGAGGACGTGGCCACCTACTACTGCCTGCAGTACGA
[0569] CAACCTGCGGACCTTTGGCGGCGGAACAAAGCTGGAAATCAAGCGGACAGATGGCGGAGGCGGATCAGGCGGCGGAGGAAGCGGT
[0570] GGCGGAGGATCTCAAGTTCAGCTGCAACAGCCTGGCGCCGAGCTTGTGAAACCTGGCGCCTCTGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCT
[0571] CCGGCTACACCTTCACCAGATACTGGATCACCTGGGTCAAGCAGAGGCCTGGACAGGGACTCGAGTGGATCGGCGATATCTATCC
[0572] TGGCTCCGGCTTCACCAAGTACAACGAGAAGTTCAAGAGCAAGGCCACACTGACCGTGGACACCAGCAGCAGCACAGCCTACATG
[0573] CAGCTGTCTAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGTGCTAGAGAAGGCGGCAACTACTGGTACTTCGACGTGTGGG
[0574] GCACCGGCACCACAGTGACAGTTAGTTCTGCGGCCGCGGCCGCATTCGTGCCGGTCTTCCTGCCAGCGAAGCCCACCACGACGCC
[0575] AGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGG
[0576] GGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCC
[0577] TGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAACCACAGGAACAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGAC
[0578] TCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCCGTTTCTCT
[0579] GTTGTTAAACGGGGCAGAAAGAAGCTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATG
[0580] GCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTA
[0581] CCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGG
[0582] GACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGG
[0583] CCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAA
[0584] GGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCGGATCCGGAGCCACGAACTTCTCTCTGTTAAAGCAAGCAGGA
[0585] GACGTGGAAGAAAACCCCGGTCCTATGCTTCTCCTGGTGACAAGCCTTCTGCTCTGTGAGTTACCACACCCAGCATTCCTCCTGA
[0586] TCCCACGCAAAGTGTGTAACGGAATAGGTATTGGTGAATTTAAAGACTCACTCTCCATAAATGCTACGAATATTAAACACTTCAA
[0587] AAACTGCACCTCCATCAGTGGCGATCTCCACATCCTGCCGGTGGCATTTAGGGGTGACTCCTTCACACATACTCCTCCTCTGGAT
[0588] CCACAGGAACTGGATATTCTGAAAACCGTAAAGGAAATCACAGGGTTTTTGCTGATTCAGGCTTGGCCTGAAAACAGGACGGACC
[0589] TCCATGCCTTTGAGAACCTAGAAATCATACGCGGCAGGACCAAGCAACATGGTCAGTTTTCTCTTGCAGTCGTCAGCCTGAACAT
[0590] AACATCCTTGGGATTACGCTCCCTCAAGGAGATAAGTGATGGAGATGTGATAATTTCAGGAAACAAAAATTTGTGCTATGCAAAT
[0591] ACAATAAACTGGAAAAAACTGTTTGGGACCTCCGGTCAGAAAACCAAAATTATAAGCAACAGAGGTGAAAACAGCTGCAAGGCCA
[0592] CAGGCCAGGTCTGCCATGCCTTGTGCTCCCCCGAGGGCTGCTGGGGCCCGGAACCCAGGGACTGCGTCTCTTGCCGGAATGTCAG
[0593] CCGAGGCAGGGAATGCGTGGACAAGTGCAACCTTCTGGAGGGTGAGCCAAGGGAGTTTGTGGAGAACTCTGAGTGCATACAGTGC
[0594] CACCCAGAGTGCCTGCCTCAGGCCATGAACATCACCTGCACAGGACGGGGACCAGACAACTGTATCCAGTGTGCCCACTACATTG
[0595] ACGGCCCCCACTGCGTCAAGACCTGCCCGGCAGGAGTCATGGGAGAAAACAACACCCTGGTCTGGAAGTACGCAGACGCCGGCCA
[0596] TGTGTGCCACCTGTGCCATCCAAACTGCACCTACGGATGCACTGGGCCAGGTCTTGAAGGCTGTCCAACGAATGGGCCTAAGATC
[0597] CCGTCCATCGCCACTGGGATGGTGGGGGCCCTCCTCTTGCTGCTGGTGGTGGCCCTGGGGATCGGCCTCTTCATGGGATCTGGAG
[0598] CCACGAACTTCTCTCTGTTAAAGCAAGCAGGAGACGTGGAAGAAAACCCCGGTCCTATGCTCGAGGGAGTGCAGGTGGAAACCAT
[0599] CTCCCCAGGAGACGGGCGCACCTTCCCCAAGCGCGGCCAGACCTGCGTGGTGCACTACACCGGGATGCTTGAAGATGGAAAGAAA
[0600] GTTGATTCCTCCCGGGACAGAAACAAGCCCTTTAAGTTTATGCTAGGCAAGCAGGAGGTGATCCGAGGCTGGGAAGAAGGGGTTG
[0601] CCCAGATGAGTGTGGGTCAGAGAGCCAAACTGACTATATCTCCAGATTATGCCTATGGTGCCACTGGGCACCCAGGCATCATCCC
[0602] ACCACATGCCACTCTCGTCTTCGATGTGGAGCTTCTAAAACTGGAATCTGGCGGTGGATCCGGAGTCGACGGATTTGGTGATGTC
[0603] GGTGCTCTTGAGAGTTTGAGGGGAAATGCAGATTTGGCTTACATCCTGAGCATGGAGCCCTGTGGCCACTGCCTCATTATCAACA
[0604] ATGTGAACTTCTGCCGTGAGTCCGGGCTCCGCACCCGCACTGGCTCCAACATCGACTGTGAGAAGTTGCGGCGTCGCTTCTCCTC
[0605] GCTGCATTTCATGGTGGAGGTGAAGGGCGACCTGACTGCCAAGAAAATGGTGCTGGCTTTGCTGGAGCTGGCGCAGCAGGACCAC
[0606] GGTGCTCTGGACTGCTGCGTGGTGGTCATTCTCTCTCACGGCTGTCAGGCCAGCCACCTGCAGTTCCCAGGGGCTGTCTACGGCA
[0607] CAGATGGATGCCCTGTGTCGGTCGAGAAGATTGTGAACATCTTCAATGGGACCAGCTGCCCCAGCCTGGGAGGGAAGCCCAAGCT
[0608] CTTTTTCATCCAGGCCTGTGGTGGGGAGCAGAAAGACCATGGGTTTGAGGTGGCCTCCACTTCCCCTGAAGACGAGTCCCCTGGC
[0609] AGTAACCCCGAGCCAGATGCCACCCCGTTCCAGGAAGGTTTGAGGACCTTCGACCAGCTGGACGCCATATCTAGTTTGCCCACAC
[0610] CCAGTGACATCTTTGTGTCCTACTCTACTTTCCCAGGTTTTGTTTCCTGGAGGGACCCCAAGAGTGGCTCCTGGTACGTTGAGAC
[0611] CCTGGACGACATCTTTGAGCAGTGGGCTCACTCTGAAGACCTGCAGTCCCTCCTGCTTAGGGTCGCTAATGCTGTTTCGGTGAAA
[0612] GGGATTTATAAACAGATGCCTGGTTGCTTTAATTTCCTCCGGAAAAAACTTTTCTTTAAAACATCAGTCGACTATCCGTACGACG
[0613] TACCAGACTACGCACTCGACTAAACAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCT
[0614] CCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGT
[0615] ATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGC
[0616] AACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAA
[0617] CTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAATCAT
[0618] CGTCCTTTCCTTGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCC
[0619] AGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCC
[0620] CTTTGGGCCGCCTCCCCGCCTATCGATAAAATAAAAGATTTTATTTAGTCTCCAGAAAAAGGGGGGAATGAAAGACCCCACCTGT
[0621] AGGTTTGGCAAGCTAGCTTAAGTAACGCCATTTTGCAAGGCATGGAAAATACATAACTGAGAATAGAGAAGTTCAGATCAAGGTT
[0622] AGGAACAGAGAGACAGCAGAATATGGGCCAAACAGGATATCTGTGGTAAGCAGTTCCTGCCCCGGCTCAGGGCCAAGAACAGATG
[0623] GTCCCCAGATGCGGTCCCGCCCTCAGCAGTTTCTAGAGAACCATCAGATGTTTCCAGGGTGCCCCAAGGACCTGAAATGACCCTG
[0624] TGCCTTATTTGAACTAACCAATCAGTTCGCTTCTCGCTTCTGTTCGCGCGCTTCTGCTCCCCGAGCTCAATAAAAGAGCCCACAA
[0625] CCCCTCACTCGGCGCGCCAGTCCTCCGATAGACTGCGTCGCCCGGGTACCCGTGTATCCAATAAACCCTCTTGCAGTTGCATCCG
[0626] ACTTGTGGTCTCGCTGTTCCTTGGGAGGGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACCCGTCAGCGGGGGTCTTTCATGGGTAACAGTTTC
[0627] TTGAAGTTGGAGAACAACATTCTGAGGGTAGGAGTCGAATATTAAGTAATCCTGACTCAATTAGCCACTGTTTTGAATCCACATA
[0628] CTCCAATACTCCTGAAATAGTTCATTATGGACAGCGCAGAAGAGCTGGGGAGAATTAATTCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCC
[0629] TGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTG
[0630] AGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCC
[0631] AACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCG
[0632] GCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAA
[0633] GGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAA
[0634] ATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTC
[0635] TCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGT
[0636] AGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTAT
[0637] CCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGC
[0638] GAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCT
[0639] CTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTG
[0640] TTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAA
[0641] CGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTT
[0642] AAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTC
[0643] TATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGC
[0644] AATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGT
[0645] CCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCA
[0646] ACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAG
[0647] GCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCA
[0648] GTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGT
[0649] ACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACA
[0650] TAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGT
[0651] TCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGC
[0652] AAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTA
[0653] TCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGA
[0654] AAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTCG
[0655] CGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAG
[0656] CAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTG
[0657] AGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGC
[0658] GCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAG
[0659] TTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCGCAAGGAATGGTGCATGCAAGGAGATGGCGCCCAACA
[0660] GTCCCCCGGCCACGGGGCCTGCCACCATACCCACGCCGAAACAAGCGCTCATGAGCCCGAAGTGGCGAGCCCGATCTTCCCCATC
[0661] GGTGATGTCGGCGATATAGGCGCCAGCAACCGCACCTGTGGCGCCGGTGATGCCGGCCACGATGCGTCCGGCGTAGAGGCGATTA
[0662] GTCCAATTTGTTAAAGACAGGATATCAGTGGTCCAGGCTCTAGTTTTGACTCAACAATATCACCAGCTGAAGCCTATAGAGTACG
[0663] AGCCATAGATAAAATAAAAGATTTTATTTAGTCTCCAGAAAAAGGGGGGAA
[0664] [SEQ ID NO:36]
[0665] 优选地，载体包含基本上如SEQ ID NO：36所示的核酸序列或其片段或变体。
[0666] 因此，应当理解，使用第二方面或第三方面的方法获得的分离的MAIT细胞可以被激活，并最终用根据第六方面的编码CAR的表达载体转导，从而产生第一方面或第四方面的CAR‑MAIT细胞。
[0667] 在第十一方面，本文提供了包含根据第五构建体的构建体或根据第六方面的载体的T细胞，任选地其中所述T细胞表达抗CD4嵌合抗原受体(CAR)或抗Vbeta CAR。
[0668] 优选地，T细胞是粘膜相关恒定T(MAIT)细胞。
[0669] 在第七方面，本文提供了一种药物组合物，其包含根据第十一方面的T细胞，优选根据第一方面或第四方面的MAIT细胞，和药学上可接受的赋形剂。
[0670] 优选地，药物组合物包含多个本发明的T细胞或MAIT细胞。例如，组合物可包含至少100、1000或10000个T细胞或MAIT细胞。优选地，组合物包含至少100000、至少1000000或至少10000000个T细胞或MAIT细胞。
[0671] 在第八方面，本文提供了根据第十一方面的T细胞、根据第一方面或第四方面的MAIT细胞或第七方面的药物组合物用于治疗。
[0672] 在第九方面，本文提供了根据第十一方面的T细胞、根据第一方面或第四方面的MAIT细胞根据第七方面的药物组合物用于(i)免疫疗法；(ii)治疗、预防或改善癌症；(ii)治疗、预防或改善微生物感染；或(iv)治疗、预防或改善自身免疫性疾病。
[0673] 在第十方面，本发明提供了一种方法：(i)用免疫疗法治疗、预防或改善受试者的疾病；(ii)治疗、预防或改善癌症；(iii)治疗、预防或改善受试者的微生物感染；或(iv)治疗、预防或改善受试者的自身免疫性疾病，该方法包括向需要这种治疗的患者施用或已经施用治疗有效量的根据第十一方面的T细胞、根据第一方面或第四方面的MAIT细胞或第七方面的药物组合物。
[0674] 优选地，T细胞、MAIT细胞或药物组合物用于治疗、预防或改善T细胞恶性肿瘤，其可以是实体瘤或液态肿瘤。
[0675] T细胞恶性肿瘤可以是外周T细胞淋巴瘤(PTCL)或皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)。
[0676] 外周T细胞淋巴瘤(PTCL)包括多种罕见的侵袭性疾病，该疾病患者的T细胞会发生癌变。PTCL分为三类，即结内的、结外的和白血病的，每一类都包含在本发明内。
[0677] PTCL可以是选自下组的PTCL亚型：成人T细胞急性淋巴细胞性淋巴瘤或白血病(ATL)、肠病相关淋巴瘤、肝脾淋巴瘤、皮下脂膜炎样淋巴瘤(SPTCL)、前体T细胞急性淋巴细胞性淋巴瘤或白血病和血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤(AITL)。
[0678] 成人T细胞急性淋巴细胞性淋巴瘤或白血病(ATL)在日本和加勒比地区比在美国更常见，并且与人T细胞白血病病毒‑1(HTLV‑1)有关。肠病相关淋巴瘤与乳糜泻有关，乳糜泻是一种慢性肠道疾病，由对小麦、黑麦和大麦中的麸质蛋白过敏引起。症状通常包括胃痛、体重减轻、胃肠道出血或肠穿孔。肠病相关T细胞淋巴瘤患者的治疗包括基于蒽环类药物的化疗方案、营养补充剂以及(如果适用)无麸质饮食。肝脾淋巴瘤是一种极其罕见的侵袭性疾病，始于肝脏或脾脏，通常影响20多岁和30多岁的年轻人。肝脾T细胞淋巴瘤患者的治疗包括基于蒽环类药物的化疗，在某些情况下还包括干细胞移植。
[0679] 皮下脂膜炎样淋巴瘤(SPTCL)是最罕见且定义最不明确的T细胞淋巴瘤。这种淋巴瘤主要发生在皮下脂肪组织中，导致结节形成。症状包括发烧、发冷、体重减轻和口腔粘膜溃疡。SPTCL可能具有快速攻击性或惰性(生长缓慢)。治疗包括基于蒽环类药物的联合化疗或局部放疗。前体T细胞急性淋巴细胞性淋巴瘤或白血病可能被诊断为白血病或淋巴瘤或两者兼而有之。这种癌症在儿童和成人中都有发现，最常见于青少年和成年男性。新诊断患有前体T细胞急性淋巴细胞性淋巴瘤或白血病的患者的治疗方法是积极的化疗和放疗。奈拉滨 被批准用于治疗成人和儿童的复发性或难治性前体T细胞急性淋巴细胞性淋巴瘤或白血病。
[0680] 血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤(AITL)是一种以强烈炎症和免疫反应为特征的肿瘤，其临床、病理、细胞和生物学特性证明了这一点。由于肿瘤细胞在表型上类似于滤泡辅助T(Tfh)细胞，因此认为它们的功能在某种程度上与反应性滤泡增生中看到的非肿瘤性Tfh细胞相似。然而，在绝大多数AITL病例中，卵泡并不增生，而是相当耗尽或破坏。据最近报道，AITL占PTCL的36.1％。
[0681] 皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)约占原发性皮肤淋巴瘤的70‑75％。CTCL可以是选自下组的CTCL亚型：蕈样肉芽肿(MF)、塞扎里综合征(SS)和CD4+小中型多形性T细胞淋巴增殖性疾病。
[0682] 蕈样肉芽肿(MF)是最常见的亚型。塞扎里综合征(SS)是一种更具侵袭性的CTCL类型。SS患者患有红皮病(即影响>80％体表面积[BSA]的皮疹)、淋巴结病以及外周血中存在大量循环肿瘤性CD4+T细胞。
[0683] 在其他实施方案中，T细胞、MAIT细胞或药物组合物可以用于治疗、预防或改善病毒(例如HIV、HBV、HTLV、EBV、HPV)、细菌(例如TB)或真菌感染。
[0684] 在其他实施方案中，T细胞、MAIT细胞或药物组合物可用于治疗、预防或改善自身免疫性疾病，例如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎或重症肌无力。
[0685] 优选地，该方法包括触发编码自杀蛋白的序列。因此，在核酸构建体包含编码EGFR或tEGFR的序列的实施方案中，该方法优选地包括向受试者施用抗EGFR抗体。例如，抗EGFR抗体可以是单克隆抗体西妥昔单抗。施用抗体能够监测或消除受试者体内的CAR‑T细胞。
[0686] 在核酸构建体包含编码iC9的序列的实施方案中，该方法可以包括向受试者施用半胱天冬酶诱导药物(CID)。例如，CID可以包括Rimiducid。施用CID能够使半胱天冬酶有条件地二聚化，从而触发表达融合蛋白的CAR‑T细胞凋亡，从而导致受试者体内CAR‑T细胞的耗尽。
[0687] 在最优选的实施方案中，构建体编码两种自杀蛋白，包括iC9和tEGFR，因此抗EGFR抗体和CID的使用能够精确控制CAR‑T或CAR‑MAIT细胞在接受治疗的受试者中的寿命。
[0688] 应当理解，根据本发明的CAR‑T细胞或CAR‑MAIT细胞(在本文中统称为“试剂”)可以用于单一疗法(例如单独使用T细胞或CAR‑MAIT细胞)，用于治疗(优选在免疫治疗中)，其中用于(i)治疗、改善或预防癌症或T细胞恶性肿瘤；或(ii)治疗、预防或改善微生物感染，或(iii)自身免疫性疾病。或者，根据本发明的CAR‑T或CAR‑MAIT细胞可用作已知免疫疗法的辅助剂或与其组合，或用于治疗微生物感染以及癌症或自身免疫性疾病。
[0689] 本发明的试剂可以组合在具有多种不同形式的组合物中，具体取决于组合物的使用方式。因此，例如，组合物可以是粉末、片剂、胶囊、液体、软膏、霜剂、凝胶、水凝胶、气雾剂、喷雾剂、胶束溶液、透皮贴剂、脂质体悬浮液的形式或是任何其他适于向需要治疗的人或动物施用的形式。应当理解，根据本发明的药剂载体应该是被施用受试者良好耐受的载体。
[0690] 包含本发明试剂的药剂可以多种方式使用。例如，可能需要口服施用，在这种情况下，药剂可以包含在组合物内，该组合物可以例如以片剂、胶囊或液体的形式口服摄入。包含本发明试剂和药剂的组合物可以通过吸入(例如鼻内)施用。组合物也可配制用于局部使用。例如，可以将霜剂或软膏施用于皮肤。
[0691] 根据本发明的试剂和药剂还可以并入缓释或延迟释放装置中。此类装置可以例如插入皮肤上或皮肤下，并且药物可以在数周甚至数月内释放。该装置可以至少位于邻近治疗部位的位置。当需要用根据本发明的药剂进行长期治疗并且通常需要频繁施用(例如至少每天注射)时，此类装置可能特别有利。
[0692] 在一个优选的实施方案中，根据本发明的试剂和药剂可以通过注射到血流中或直接注射到需要治疗的部位来施用于受试者。注射可以是静脉内(推注或输注)或皮下(推注或输注)或皮内(推注或输注)。
[0693] 应当理解，所需的遗传构建体或载体(即试剂)的量由其生物活性和生物利用度决定，而生物活性和生物利用度又取决于施用模式、试剂的理化性质以及是否被用作单一疗法或联合疗法。施用频率也将受到所治疗受试者体内药剂的半衰期的影响。待施用的最佳剂量可由本领域技术人员确定，并且将随所使用的具体药剂、药物组合物的强度、施用方式和所治疗的疾病(例如癌症、T细胞恶性肿瘤、微生物感染或自身免疫性疾病)的进展而变化。取决于所治疗的特定受试者的其他因素将导致需要调整剂量，包括受试者年龄、体重、性别、饮食和施用时间。
[0694] 一般而言，在0.001μg/kg体重至10mg/kg体重之间的本发明试剂的日剂量可用于治疗，特别是用于治疗、改善或预防癌症、T细胞恶性肿瘤、微生物感染或自身免疫性疾病，具体取决于具体试剂。更优选地，试剂的日剂量为0.01μg/kg体重至1mg/kg体重，更优选为0.1μg/kg至100μg/kg体重，最优选为约0.1μg/kg至10μg/kg体重。
[0695] 或者，施用于受试者的剂量可以在0.5x107至5x1012转导单位(TU)/Kg体重之间。更8 11
优选地，给予受试者的剂量可以在0.5x10 至5x10 TU/Kg体重之间。最优选地，给予受试者
9 10
的剂量可以在0.5x10至5x10 TU/Kg体重之间。
[0696] 该药剂可以在癌症、T细胞恶性肿瘤、微生物感染或自身免疫性疾病发作之前、期间或之后施用。每日剂量可以作为单次给药(例如每日单次注射)施用。或者，试剂可能会要求一天内给药两次或多次。作为示例，可以以0.07μg至700mg(即假设体重为70kg)之间的每日两次(或更多次，取决于所治疗的疾病的严重程度，例如癌症)剂量来施用药剂。接受治疗的患者可以在醒来时施用第一剂，然后在晚上施用第二剂(如果采用两次剂量方案)或此后每隔3或4小时施用第二剂。或者，该药剂可能需要每周施用一次，甚至每月一次。或者，可以使用缓释装置向患者提供根据本发明的试剂的最佳剂量，而不需要施用重复剂量。已知的程序，例如制药业常规采用的程序(例如体内实验、临床试验等)，可用于形成根据本发明的试剂的特定配方和精确的治疗方案(例如试剂的每日剂量和给药频率)。
[0697] 本发明的药物组合物优选是免疫疗法治疗组合物、自身免疫性疾病治疗组合物、抗感染组合物或抗癌组合物，即用于受试者治疗性改善、预防或治疗癌症的药物制剂。
[0698] 在第十一方面，本发明还提供了制备根据第七方面的药物组合物的方法，该方法包括将治疗有效量的根据第一方面或第四方面的MAIT细胞与药学上可接受的载体组合。
[0699] “受试者”可以是脊椎动物、哺乳动物或家畜。因此，根据本发明的药剂可以用于治疗任何哺乳动物，例如牲畜(例如马)、宠物，或者可以用于其他兽医应用。最优选地，受试者是人类。
[0700] 遗传构建体或载体的“治疗有效量”是当施用于受试者时，治疗所治疗的疾病(例如癌症)或产生期望效果所需的药剂的任何量。
[0701] 例如，所使用的遗传构建体或载体的治疗有效量可以是约0.001ng至约1mg，优选约0.01ng至约100ng。优选地，遗传构建体或载体的量为约0.1ng至约10ng，最优选为约0.5ng至约5ng。
[0702] 本文提及的“药学上可接受的载体”是本领域技术人员已知可用于配制药物组合物的任何已知化合物或已知化合物的组合。
[0703] 在一实施方案中，药学上可接受的载体可以是固体，组合物可以是粉末或片剂的形式。固体药学上可接受的载体可以包括一种或多种物质，这些物质也可以充当矫味剂、润滑剂、增溶剂、悬浮剂、染料、填充剂、助流剂、压缩助剂、惰性粘合剂、甜味剂、防腐剂、染料、包衣或片剂崩解剂。载体还可以是封装材料。在粉末中，载体是与根据本发明的细分活性剂混合的细分固体。在片剂中，活性剂可以与具有必要的压缩特性的载体以合适的比例混合并压制成所需的形状和尺寸。粉末和片剂优选含有高达99％的活性剂。合适的固体载体包括例如磷酸钙、硬脂酸镁、滑石、糖、乳糖、糊精、淀粉、明胶、纤维素、聚乙烯吡咯烷、低熔点蜡和离子交换树脂。在另一实施方案中，药物载体可以是凝胶并且组合物可以是乳膏等形式。
[0704] 然而，药物载体可以是液体，药物组合物是溶液的形式。液体载体可用于制备溶液、悬浮液、乳液、糖浆、酏剂和加压组合物。本发明的活性剂可以溶解或悬浮在药学上可接受的液体载体中，例如水、有机溶剂、两者的混合物或药学上可接受的油或脂肪。液体载体可以含有其他合适的药物添加剂，例如增溶剂、乳化剂、缓冲剂、防腐剂、甜味剂、矫味剂、悬浮剂、增稠剂、着色剂、粘度调节剂、稳定剂或渗透压调节剂。用于口服和肠胃外施用的液体载体的合适实例包括水(部分含有如上所述的添加剂，例如纤维素衍生物，优选羧甲基纤维素钠溶液)、醇(包括一元醇和多元醇，例如乙二醇)及其衍生物，以及油(例如分馏椰子油和花生油)。对于肠胃外给药，载体还可以是油酯，例如油酸乙酯和肉豆蔻酸异丙酯。无菌液体载体可用于用于肠胃外施用的无菌液体形式组合物。用于加压组合物的液体载体可以是卤代烃或其他药学上可接受的推进剂。
[0705] 液体药物组合物为无菌溶液或悬浮液，可通过肌内注射、鞘内注射、硬膜外注射、腹膜内注射、静脉内注射且特别是皮下注射等方式使用。试剂可以配置为无菌固体组合物，其可以在施用时使用无菌水、盐水或其他合适的无菌可注射介质溶解或悬浮。
[0706] 本发明的试剂和组合物可以以无菌溶液或混悬液的形式口服施用，其中含有其他溶质或混悬剂(例如，足够的盐水或葡萄糖以使溶液具有等渗性)、胆汁盐、阿拉伯胶、明胶、失水山梨糖醇单油酸酯、聚山梨醇酯80(山梨醇及其酸酐与环氧乙烷共聚的油酸酯)等。根据本发明使用的试剂还可以以液体或固体组合物形式口服施用。适合口服施用的组合物包括固体形式，例如丸剂、胶囊、颗粒剂、片剂和粉末，以及液体形式，例如溶液剂、糖浆剂、酏剂和混悬剂。可用于肠胃外施用的形式包括无菌溶液、乳液和悬浮液。
[0707] 应当理解，本发明延伸至任何核酸或肽或其变体、衍生物或类似物，其基本上包含本文提及的任何序列的氨基酸或核酸序列，包括其变体或片段。术语“基本上氨基酸/核苷酸/肽序列”、“变体”和“片段”可以是与本文中所提及的任一序列的氨基酸/核苷酸/肽序列具有至少40％序列同一性的序列。例如与SEQ ID No:1至SEQ ID No:36等所标识的序列有40％的同一性。
[0708] 氨基酸/多核苷酸/多肽序列与上述任何序列的序列同一性大于65％，更优选大于70％，甚至更优选大于75％，更优选大于80％，也是可以考虑的。优选地，氨基酸/多核苷酸/多肽序列与本文所提及的任何序列具有至少85％同一性，更优选至少90％同一性，甚至更优选至少92％同一性，甚至更优选至少95％同一性，甚至更优选至少97％同一性，甚至更优选至少98％同一性，最优选至少99％同一性。
[0709] 技术人员将理解如何计算两个氨基酸/多核苷酸/多肽序列之间的同一性百分比。为了计算两个氨基酸/多核苷酸/多肽序列之间的同一性百分比，必须首先对两个序列进行比对，然后计算序列同一性值。两个序列的百分比同一性可能取不同的值，具体取决于：(i)用于比对序列的方法，例如ClustalW、BLAST、FASTA、Smith‑Waterman(在不同程序中实现)或来自3D比较的结构比对；(ii)比对方法使用的参数，例如局部与全局比对、使用的配对分数矩阵(例如BLOSUM62、PAM250、Gonnet等)，以及间隙罚分，例如函数形式和常数。
[0710] 进行比对后，有许多不同的方法来计算两个序列之间的同一性百分比。例如，可以将同一性的数量除以：(i)最短序列的长度；(ii)对齐长度；(iii)序列的平均长度；(iv)无间隙位置的数量；或(v)除悬垂外的等效位置的数量。此外，应当理解，同一性百分比也与长度密切相关。因此，一对序列越短，偶然出现的序列同一性就越高。
[0711] 因此，应当理解，蛋白质或DNA序列的精确比对是一个复杂的过程。流行的多重比对程序ClustalW(Thompson et al.,1994,Nucleic Acids Research,22,4673‑4680；Thompson et al.,1997,Nucleic Acids Research,24,4876‑4882)是根据本发明生成蛋白质或DNA的多重比对的首选方法。ClustalW的合适参数如下：对于DNA比对：空位开放罚分＝
15.0，空位延伸罚分＝6.66，矩阵＝同一性。对于蛋白质比对：空位开放罚分＝10.0，空位延伸罚分＝0.2，矩阵＝Gonnet。对于DNA和蛋白质比对：ENDGAP＝‑1，GAPDIST＝4。本领域技术人员将意识到，可能有必要改变这些参数和其他参数，以实现最佳序列比对。
[0712] 优选地，两个氨基酸/多核苷酸/多肽序列之间同一性百分比的计算可以通过这样的比对计算出来，即(N/T)*100，其中N是序列共享相同残基的位置数，T是比对的位置总数，包括空位以及包括或不包括悬垂部分。优选地，计算中包括悬垂部分。因此，用于计算两个序列之间的百分比同一性的最优选方法包括(i)使用ClustalW程序使用一组合适的参数来准备序列比对，例如如上所述的参数；(ii)将N和T的值代入以下公式：‑序列同一性＝(N/T)*100。
[0713] 本领域技术人员都知晓用于鉴定相似序列的其他方法。例如，基本相似的核苷酸序列将由在严格条件下与DNA序列或其互补序列杂交的序列编码。所谓严格条件，发明人是指在大约45℃下在3x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中核苷酸与滤膜结合的DNA或RNA杂交，然后在大约20‑65℃下在0.2xSSC/0.1％SDS中洗涤至少一次。另外，基本上相似的多肽可以与例如SEQ ID No:1至SEQ ID No:36中所示的氨基酸序列有至少1个、但少于5、10、20、50或100个氨基酸的差异。
[0714] 由于遗传密码的简并性，显然本文所述的任何核酸序列都可以在不对其编码的蛋白质序列产生实质性影响的情况下进行变化或改变，以提供其功能变体。合适的核苷酸变体是那些具有通过替换序列内编码相同氨基酸的不同密码子而改变的序列的核苷酸变体，从而产生沉默(同义)改变。其他合适的变体是具有同源核苷酸序列但包含全部或部分序列的变体，其通过不同密码子的取代而改变，这些密码子编码具有与其取代的氨基酸具有相似生物物理特性的侧链的氨基酸，以产生保守的改变。例如，小的非极性疏水氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸和甲硫氨酸。大的非极性疏水氨基酸包括苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。极性中性氨基酸包括丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电荷的(碱性)氨基酸包括赖氨酸、精氨酸和组氨酸。带负电(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。因此，应当理解哪些氨基酸可以用具有类似生物物理特性的氨基酸取代是显而易见的，熟练的技术人员也知道编码这些氨基酸的核苷酸序列。
[0715] 本文描述的所有特征(包括任何所附权利要求、摘要和附图)和/或公开的任何方法或过程的所有步骤可以与上述任何方面任意组合，但至少其中某些特征和/或步骤相互排斥的组合除外。
[0716] 为了更好地理解本发明，并且为了说明如何实施本发明的实施例，现在将通过举例的方式参考附图，其中：
[0717] 图1示出了根据本发明的实施方案的第三代CD4靶向T细胞的产生。A(1)：该图表示包含在根据本发明的CAR构建体(称为“CART4”)的一个实施方案中的功能元件。源自单克隆抗体Hu5A8的scFv与CD8跨膜结构域(TM)、CD28胞内结构域、4‑1BB胞内结构域和CD3ζ链融合。tEGFR(截短的表皮生长因子受体)和iC9(诱导型半胱天冬酶9)的基因序列通过自切割2A接头标记在CAR后面。A(2)：该图表示包含在根据本发明的CAR构建体(称为“CARTVb7.1”)的另一个实施方案中的功能元件。源自单克隆抗体3G5的scFv与CD8跨膜结构域(TM)、CD28胞内结构域、4‑1BB胞内结构域和CD3ζ链融合。tEGFR(截短的表皮生长因子受体)和iC9(诱导型半胱天冬酶9)的基因序列通过自切割2A接头标记在CAR后面。B：转导的T细胞用抗小鼠+ + +
IgG F(ab)’2抗体和抗EGFR抗体染色。细胞在CD3单淋巴细胞上增殖，数字表示CAR/tEGFR细胞的百分比。C：逆转录病毒转导CAR后，每天对原代T细胞取样并进行表面标记物染色，包括CD3和tEGFR。蓝色直方图是非转导细胞的结果。图中显示了CAR和标记物呈阳性的细胞百分比。D：存活率定义为未处理条件下和化学诱导二聚体(CID，Rimiducid)处理条件下暴露于指定剂量24小时后EGFR阳性(A)或EGFR高表达(B)百分比的比值。E：显示了存活细胞中EGFR表达的平均荧光强度。数据反映了来自不同供体的三个重复样本的典型结果。每个样本重复三次。数据以平均值±SEM表示。经双尾非配对t检验，发现组间差异显著。**＝p<
0.01；*＝p<0.05。
[0718] 图2示出了根据本发明的CART4 T细胞的实施方案的体外功能验证。A：PBMC由Dynabeads人T活化剂和IL7/IL15激活。激活的PBMC包含两个T细胞亚群：CD4+和CD8+(左)。细胞由CART20(中)或CART4(右)逆转录病毒颗粒转导。从转导后第三天开始，用抗CD4和抗CD8抗体对细胞进行染色，并通过流式细胞术进行分析。B：该图中汇总了CD4+比率的统计数据。数据反映了五个健康个体的典型结果。C：原代CD4+T细胞(左)或CD20+B细胞(右)与自体CART4细胞、CART20细胞或非转导CD8+T细胞共培养4小时。使用Countbright珠通过流式细胞术分析对存活靶细胞的绝对数量进行计数。D：用抗CD4抗体对两种T细胞系CEM‑ss细胞、Jurkat细胞和一种B细胞系进行染色。通过流式细胞术分析评估CD4表达水平。E：CART4细胞杀伤T肿瘤细胞的代表性结果。每个样本重复三次。数据反映了三个独立实验的典型结果。
F：与不同靶细胞共培养的CART4细胞的胞内细胞因子表达。每个样本重复三次。数据反映了三个独立实验的典型结果。
[0719] 图3示出了CART4细胞特异性杀伤CD4+T肿瘤细胞。在进行流式细胞术分析和共培养实验前，从液氮中复苏ATLL患者的PBMC，并在培养箱中静置过夜。A：PBMC用抗CD4、CD8和特异性TCR Vbeta染色。用PBS洗涤两次后进行流式细胞术分析。在流式细胞术分析之前，将复苏的ATLL(B)或CTCL(C)PBMC与同种异体CART4或CART20细胞共培养4小时。每个条件重复三次。数据以平均值±SEM表示。
[0720] 图4示出了CART4细胞在体内有效介导抗白血病作用。A：NRG免疫缺陷小鼠注射5 6
1x10Gluc/GFP转导的CEM‑ss细胞，然后通过眼眶后途径再次输注4x10个T细胞。NTD n＝5，CART4 n＝7。B：每只小鼠抽取50μl外周血，提取血浆用于测定荧光素酶活性。荧光素酶活性的连续测量显示，CART4T细胞抑制CD4+白血病，但NTD CD8+T细胞没有抑制作用。C：通过Kaplan‑Meier存活率分析用所示CART4细胞或对照NTDT细胞治疗的小鼠的总体生存率。D：
在终点时，对小鼠进行解剖。将脾脏和骨髓研磨并用抗CD4 mAb和DAPI染色以检测残留肿瘤细胞。肿瘤细胞被鉴定为DAPI‑CD4+GFP+。E：脾脏中残留肿瘤细胞的CD4表达水平。灰线——培养的CEMss细胞，黑线——来自NTD对照小鼠的CEMss细胞，红线——来自CART4治疗小鼠的CEMss细胞。F：将脾细胞与CART4细胞或NTD T细胞以1:5的比例共培养4小时，然后进行流式细胞术分析。数据以平均值±SEM表示。使用双尾未配对t检验进行显着性分析。*＝p<
0.05。
[0721] 图5示出了符合GMP标准的CAR‑T细胞制造方法的开发。A：CAR‑T细胞制造的时间进程。在逆转录病毒转导CAR之前，先在烧瓶中用CD3/CD28 Dynabeads和IL7/IL15激活人6
PBMC。。转导两天后，将转导细胞转移至G‑Rex板(1x10/平方米)。细胞因子每两到三天补充一次，直到第12天。B：制造过程中的细胞扩增。第12天时CAR转导率(C)和分化状态(D)的代表性流程图。E：T细胞分化的统计。CM：中央记忆；EM：效应记忆。每个样本重复三次。每个样本重复三次。数据以平均值±SEM表示。数据反映了四个健康个体的典型结果。
[0722] 图6示出了CARTVb7.1的产生和功能验证。A：转导的T细胞用抗EGFR抗体染色以检测CAR表达。细胞在CD3+单淋巴细胞上增殖，数字表示tEGFR+细胞的百分比。B：CAR转导后五天的内源TCRVb7.1+群体检测。C：TCRVb7.1+原代ATL样本经CFSE染色并与不同数量的效应CAR‑T细胞混合。培养6小时后，收集细胞并用DAPI、3G5和CD3抗体染色15分钟。在每个样本中加入固定体积的5uL Countbright珠。将样本载入流式细胞仪中进行绝对定量。D：CARTVb7.1细胞杀伤T肿瘤细胞的代表性结果。每个样本重复三次。
[0723] 图7示出了MAIT‑CART细胞的产生过程。A：MAIT细胞染色的代表性流式细胞术示例。用BV421 MR1‑5‑OP‑RU四聚体和PE抗TCR Vα7.2抗体对PBMC染色20分钟。在通过流式细胞术表征之前，用PBS洗涤细胞两次。B：流式细胞术分选MAIT细胞的门控策略。通过磁分离方法从PBMC中分离TCR Vα7.2+细胞，然后用BV421 MR1‑5‑OP‑RU四聚体和PE抗CD3抗体染色20分钟。细胞经PBS冲洗两次后装入Melody细胞分选仪。对MR1‑5‑OP‑RU四聚体阳性群体进行分选和培养。C：体外培养的MAIT细胞和作为对照的CD8+T细胞的扩增曲线。D：培养12‑14天后，超过90％的扩增MAIT细胞具有MR1‑5‑OP‑RU四聚体特异性。E：用抗EGFR流式抗体对CAR转导的CD8+T细胞和MAIT细胞进行染色以检测转导效率。
[0724] 图8示出了扩增的MAIT和CD8 T细胞与CFSE染色的CD4+细胞系CEMss以E:T 0:1、1:1、3:1和5:1的比例共培养。培养20小时后收获共培养系统。使用Countbright珠通过流式细胞术分析计算存活肿瘤细胞的绝对数量。(A)3:1E:T条件下的流式细胞术数据。(B)细胞毒性统计结果。数据以平均值±SEM表示。
[0725] 图9示出了用于转导MAIT细胞的表达载体“CART4”的第一实施方案。
[0726] 图10示出了用于转导MAIT细胞的表达载体“CARTVb7.1”的第二实施方案。
[0727] 图11示出了从外周血单核细胞(PBMC)中检测人MAIT细胞。对淋巴细胞进行门控，并通过CD3的表达以及与5‑OP‑RU/MR1四聚体的反应性(A)或CD161和TCRVα7.2的表达(B)来鉴定MAIT细胞。
[0728] 图12示出了从外周血单核细胞(PBMC)中分离人MAIT细胞。通过磁珠进行Vα7.2表达分离后，Vα7.2阳性细胞群从2.2％(A)富集到>97％。根据与5‑OP‑RU/MR1四聚体的反应性对MAIT细胞进行分选(B)。
[0729] 图13示出了CAR‑MAIT细胞的产生。培养12‑14天后，超过90％的扩增MAIT细胞具有MR1‑5‑OP‑RU四聚体特异性(A)。CAR转导的CD8+T细胞和MAIT细胞用抗EGFR流式抗体染色以检测转导效率(B)。
[0730] 图14示出了CAR‑MAIT4细胞在体内表现出有效的抗白血病功能。A：NSG免疫缺陷小6 6
鼠进行静脉注射1x10Gluc/GFP转导的CEM‑ss细胞，然后再静脉注射4x10 个CAR转导细胞。
每周进行两次生物发光成像，直至肿瘤注射后第45天。B：通过Kaplan‑Meier存活率分析得出所示CAR转导细胞治疗的小鼠的总体存活率。C：肿瘤注射后40天的小鼠生物发光成像(BLI)。D：第40天时个体小鼠的辐射度。n＝5或6只小鼠/组。*通过t检验P<0.05。Ph，光子；
sr，球面度。
[0731] 图15示出了PBMC中MAIT细胞的富集。在表中所示的不同细胞因子存在的情况下，用MR1/5‑OP‑RU复合珠(珠与细胞比为1:1)或5‑OP‑RU抗原(10nM)刺激PBMC 6天。MAIT细胞增加的倍数是通过将第6天的活MAIT(CD3+Va7.2+CD161+)细胞的频率除以第0天的MAIT细胞的原始频率来计算的。前5组用橙色标出(即条件1、3、11、12和13)。IL‑12、IL‑18和IL‑23的组合使PBMC中MAIT细胞的增加倍数最高。实施例
[0732] 基于嵌合抗原受体(CAR)的T细胞疗法通过靶向泛B细胞特异性抗原，在治疗B细胞恶性肿瘤方面取得了巨大成功。然而，针对T细胞淋巴瘤的类似策略迄今尚未实现，这主要是由于与B细胞恶性肿瘤相比，T淋巴瘤中整体T细胞耗竭和正常T细胞功能障碍/频率低所带来的潜在严重毒性。为了克服这些限制，发明人设计了两种新型CAR构建体，第一种在本文中被称为“CART4”，其对泛T细胞标记物(CD4)具有特异性，第二种被称为“CARTVb7.1”，其对TCR‑Vb同型链具有特异性。这两种CAR构建体均包含一个或两个安全开关，这些开关选自截短的表皮生长因子受体(tEGFR)和诱导型半胱天冬酶9(iC9)。然而，如图1所示，两个安全开关都显示出来了。发明人研究了同种异体反应性低的粘膜相关恒定T(MAIT)细胞在用CAR构建体转导后是否会表现出与传统T细胞类似的抗肿瘤杀伤活性。
[0733] 此外，众所周知，MAIT细胞是先天性T细胞的一个亚群，定义为CD3+TCRVa7.2+CD161+细胞，可识别MHC I类分子MR1。先前的研究表明，MAIT细胞可以在体外扩增，但需要同种异体饲养细胞的存在。然而，该方法的一个问题是难以大规模生产和质量控制。在本项研究中，发明人现已开发出一种用于体外扩增MAIT细胞的有效方法，其中通过首先用负载抗原(5‑OP‑RU)的MR1四聚体珠或仅用5‑OP‑RU刺激PBMC，在多种细胞因子(IL‑2、IL‑7、IL‑15、IL‑12、IL‑18和IL‑23)组合存在下进行长达6天的体外培养。然后通过MACS或FACS分选分离MAIT细胞，随后通过抗CD3/CD28珠进一步扩增以用于基于CAR的治疗，如前面的实施例中所述。
[0734] 材料与方法
[0735] CAR质粒的构建
[0736] 由Genewiz合成编码Hu5A8和Leu16的scFv以及人Igκ前导序列的DNA片段。NcoI和NotI用于切割这些片段以及MSCV CAR表达逆转录病毒载体。MSCV CAR表达载体由MSCV‑IRES‑GFP载体(Addgene)改造而成，将IRES‑GFP区域替换为人CD8跨膜结构域和第三代CAR胞内信号结构域(CD28和4‑1BB的共刺激结构域、CD3ζ信号结构域)。tEGFR的序列从US 8802347B2获得，删除了人EGFR蛋白的胞外部分和胞内结构域的结构域I和II。tEGFR由Genewiz合成，具有自切割T2A序列和人粒细胞‑巨噬细胞集落刺激因子(GM‑CSF)受体的前导肽。iC9的DNA序列由Lishan Su教授(北卡罗来纳大学教堂山分校)友情提供。iC9的DNA片段由截短的半胱天冬酶9组成，包括半胱天冬酶分子的大亚基和小亚基，通过短的Gly‑Gly‑Gly‑Ser(GGGS)柔性接头与一个12‑kDa人FK506结合蛋白(FKBP12)连接。
[0737] 逆转录病毒载体的产生
[0738] 用MSCV‑逆转录病毒质粒和pCMV‑VSVG载体(Addgene)通过7ul X‑tremeGENE HP转染试剂(Roche)转染Plat‑GP细胞(Cellbiolabs)以产生具有VSV包膜的病毒。为了产生高滴度的CAR编码逆转录病毒上清液，随后用PG‑13(ATCC)进行了稳定的病毒生产细胞系。PG‑13细胞由含有8ug/ml聚凝胺(Sigma)的Plat‑GP病毒上清液转导。将板用保鲜膜包裹并在32℃下1000g离心2小时。为了产生高滴度的病毒颗粒，通过胰蛋白酶化将汇合细胞传代。24小时后收集上清液。在300g离心5分钟后，分装培养基并保存在‑80℃下。
[0739] 原代T细胞和肿瘤细胞
[0740] 通过Ficoll–Paque PLUS密度梯度离心(GE Healthcare)分离健康供体的外周血单核细胞(PBMC)，用于CAR‑T细胞工程。从ATL或CTCL患者产生的T淋巴瘤细胞系在D10培养基(DMEM，含10％胎牛血清、100IU/mL青霉素、100μg/mL链霉素和2mM L‑谷氨酰胺)中培养、T白血病细胞系(Jurket或CEM)在R10培养基(RPMI 1640，含10％胎牛血清、100IU/mL青霉素、100μg/mL链霉素和2mM L‑谷氨酰胺)中培养。
[0741] MAIT细胞的分离和扩增
[0742] 使用抗人TCR Vα7.2抗体(Biolegend，Cat#351724)、微珠(Miltenyi，Cat#130‑090‑485)，然后用BV421 MR1‑5‑OP‑RU四聚体(由澳大利亚墨尔本大学的Jim McCluskey教授友情提供)，通过两步法从健康PBMC中分离MAIT细胞。简言之，根据制造程序，使用生物素化抗人TCR Vα7.2抗体和抗生物素MicroBeads试剂盒(Miltenyi)从PBMC分离TCR Vα7.2+T细胞。然后通过对BV421 MR1‑5‑OP‑RU四聚体进行染色并使用FACSMelody细胞分选仪(BD)进行FACS分选，将MAIT细胞与TCR Vα7.2+T细胞分离。
[0743] 通过两步法将MAIT细胞与PBMC分离。对PBMC细胞进行计数，并在15mL试管中的8 8
PBS/EDTA缓冲液中稀释至1x 10细胞/mL。每10 个细胞添加5μL生物素抗人TCR Vα7.2抗体(Biolegend，Cat#351724)，并在4℃下培养20分钟。加入10倍体积的PBS/EDTA缓冲液洗涤细
8
胞，并以300×g离心10分钟。完全吸出上清液。每10 个细胞加入800μL PBS/EDTA缓冲液和
200μL抗生物素MicroBeads(Miltenyi，Cat#130‑090‑485)。充分混合并在4℃下培养15分钟。加入10倍体积的PBS/EDTA缓冲液洗涤细胞，并以300×g离心10分钟。完全吸出上清液。
在1mL PBS/EDTA缓冲液中重悬最多10细胞。将MS柱(Miltenyi)置于合适的MACS分离器的磁场中。用500μL PBS/EDTA缓冲液冲洗色谱柱。将细胞悬浮液涂在柱上。用3X 500μL PBS/EDTA缓冲液清洗色谱柱。加入1mL PBS/EDTA缓冲液，洗脱磁场外保留的细胞。收集TCR Vα
7.2+细胞，并用APC抗人CD3(Biolegend)和BV421 MR1‑5‑OP‑RU四聚体(1:500)在4℃下染色
30分钟。加入10倍体积的PBS/EDTA缓冲液洗涤细胞，并以300×g离心10分钟。完全吸出上清
8
液。每10个细胞加入1mL PBS/EDTA缓冲液。通过FACSMelody细胞分选仪(BD)对CD3+MR1‑5‑OP‑RU+细胞群进行流式分选。
[0744] MAIT细胞的激活和扩增
[0745] 对分选的MAIT细胞进行计数，并在R10培养基(90％ RPMI+10％ FBS+1％青霉素/6
链霉素+2mM L‑谷氨酰胺)中重悬至10 个/mL。使用Dynabeads人T活化剂CD3/CD28(Life Technologies公司)激活细胞，在37℃培养箱中的24孔板中使用100IU/mL IL‑2，使得珠子与细胞之比达到1:1。转导两天后，收获细胞并将细胞转移至6孔板。将R10刷新至0.5‑1x 
6
10个/mL。每2‑3天用R10培养基刷新细胞。
[0746] CAR‑T或CAR‑MAIT细胞的产生
[0747] 在含有100IU/mL IL‑2的R10培养基中用Dynabeads人T活化剂CD3/CD28(Life Technologies公司)刺激纯化的PBMC或MAIT细胞48小时。然后用编码CAR构建体的逆转录病毒转染激活的细胞，并在R10中再培养48小时。在收获前，在存在重组IL7和IL15(Miltenyi)的情况下，将CAR‑T或CAR‑MAIT细胞在G‑Rex六孔板(Wilsonwolf)中再维持7天。
[0748] CAR‑T或CAR‑MAIT细胞的产生
[0749] 在T细胞激活后48小时后进行逆转录病毒转导。如有必要，可以在24小时后重复转6
导步骤以提高转导效率。将10x10个细胞转移到G‑Rex六孔板(Wilsonwolf)中，并用110mL R10培养基进一步培养。每两三天补充一次细胞因子IL7/15。收获前将细胞在G‑Rex中培养一周。
[0750] 共培养细胞毒性测定
[0751] 该非放射性杀伤测定按照之前的报道进行(Rowan等，2014)。简而言之，靶细胞用1uM CFSE(Biolegend)在37℃下染色15分钟。PBS洗涤3次后，将100000个靶细胞与CAR‑T或CAR‑MAIT细胞按1:1、1:3、1:5的比例混合。将200ul共培养物在37℃培养箱中培养4小时。向样本中加入1ul DAPI和5ul Countbright珠子(BD Biosciences)。通过流式细胞术以恒定速度采集样本。存活的靶细胞的数量计算公式为：试管中的细胞数＝(收集的细胞数/收集的珠子数)x加入试管中的珠子总数。
[0752] 细胞内细胞因子染色
[0753] CART4或CART20 T细胞与特定靶细胞在96孔U底板中共培养。所有细胞以2x105个/孔接种于200uL/孔R10培养基中。单独培养的T细胞作为阴性对照，用10ug/ml PMA和10ug/ml离子霉素(Biolegend)联合刺激培养的T细胞作为阳性对照。培养1小时后，在所有孔中加入10ug/mL布雷非德菌素A(Biolegend)。共培养系统再培养五小时后收获。在黑暗中使用抗体对细胞进行表面标记染色30分钟。在室温下用4％多聚甲醛溶液(Biolegend)固定细胞15分钟，然后用PBS冲洗。用固定缓冲液再次洗涤后，用含有细胞内染色抗体的混合物重新悬浮细胞。将细胞在4℃下培养30分钟，然后用固定缓冲液洗涤。通过流式细胞术和荧光减一(FMO)对照对它们进行分析，以确定IFN‑γ和TNF‑α的表达水平。
[0754] 体外自杀测试
[0755] 用逆转录病毒转导CART4或CART4 w/o iC9构建体生成含有或不含iC9细胞的CART4。CAR‑T细胞在转导后保持扩增5至7天。将半胱天冬酶诱导药物(CID)、B/B同二聚体AP20187(Clontech Laboratories)以不同浓度添加到T细胞培养物中。24小时后，使用膜联蛋白‑v/7‑AAD(BD Biosciences)染色并通过流式细胞术分析评估CID诱导的细胞凋亡。通过计数珠(BD Biosciences)对存活细胞进行定量。存活指数计算方法如下：存活的tEGFR+细胞数/未处理对照样本中存活的tEGFR+细胞数。
[0756] 体内小鼠异种移植实验
[0757] 使用6至8周龄的NRG小鼠(Jackson Laboratory)进行T白血病细胞系的体内实验。6
将共表达Gaussia荧光素酶和EGFP的0.5x10CEM‑ss细胞通过逆轨道注射到小鼠体内。随后在注射T细胞前对小鼠进行随机分组。来自健康供体的PBMC被激活并转导生成CART4T细胞或非转导T细胞。在输血当天，根据制造商的说明，使用未接触的微珠人CD8 T细胞试剂盒(Miltenyi)从CART4 T细胞或非转导T细胞中阴性分离CART4 CD8+T细胞和非转导CD8+T细
6
胞。将4×10 个分离的细胞用PBS洗涤两次，重悬于100ul中并通过眼眶后注射输注至异种移植小鼠。每周通过空尾抽取30‑50ul外周血。500g离心5分钟后，分离血浆，按照制造商的仪器(Thermo Fisher Scientific)检测荧光素酶活性。红细胞裂解后，用100ul抗体预混液重悬细胞进行表面标记染色，其中包括人CD45、小鼠CD45、人CD3、人CD8、人EGFR和活/死染料。使用流式细胞仪(BD AriaIII)分析细胞亚群组成。在本文描述的所有研究中都对小鼠进行了密切监测。当小鼠表现出以下症状之一时，即对它们进行安乐死：初始体重下降超过
20％、明显嗜睡、驼背姿势、严重腹泻或严重皮炎。
[0758] 统计分析
[0759] 使用GraphPad Prism软件6.0版(GraphPad软件)进行统计分析。使用双尾未配对t检验来比较两组数据。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。所有带有误差线的数据均以平均值±平均值标准误差(SEM)的形式表示。P值小于0.05为显著。使用GraphPad Prism软件(版本8)分析数据。
[0760] 1.具体方法
[0761] 1.1.MAIT细胞的检测
[0762] 1.1.1.人外周血单核细胞(PBMC)的制备
[0763] 1.1.1.1.将5mL志愿者供体的外周血转移至肝素化管中。
[0764] 1.1.1.2.用等体积的PBS稀释全血。
[0765] 1.1.1.3.将5mL Histopaque‑1077放入15ml离心管中。小心地将10ml稀释的血液溶液沿着管壁轻轻地添加到Histopaque‑1077上；不要破坏液体界面。
[0766] 1.1.1.4.在室温下以400x g离心30分钟。
[0767] 注意：确保离心机的制动和加速设置处于最低设置，剧烈制动和加速可能会影响层分离。
[0768] 1.1.1.5.离心后，用巴斯德移液管小心地将上层吸至含有单核细胞的不透明界面0.5cm以内。丢弃上层。
[0769] 1.1.1.6.通过在250x g下离心10分钟，用10ml PBS清洗收获的PBMC两次。
[0770] 1.1.1.7.用RPMI1640培养基重新悬浮PBMC沉淀。
[0771] 1.1.2.BV421标记的5‑OP‑RU/MR1‑四聚体的制备
[0772] 1.1.2.1.将6.8μl 0.5mg/ml的链霉亲和素‑BV421稀释至10.2μl PBS中并充分混合。
[0773] 1.1.2.2.每10分钟将1/10的链霉亲和素‑BV421溶液(1.7μl)添加到18μl MR1‑5‑OP‑RU溶液(5μg)中，并用移液管混合，两步骤之间在室温下暗处培养。
[0774] 1.1.2.3.将BV421标记的5‑OP‑RU/MR1溶液保持在4℃。
[0775] 四聚体应滴定后使用；通常1:500稀释就足够了。
[0776] 1.1.3.通过流式细胞术检测人MAIT细胞
[0777] 可以通过流式细胞术检测人MAIT细胞，通过负载5‑OP‑RU的MR1四聚体或与CD161和TCR Vα7.2链抗体共染色。一般来说，MAIT细胞在外周血中占CD3+T细胞的0.1‑10％。6
1.1.3.1.以每100μl FACS染色缓冲液1x 10个细胞的浓度重新悬浮PBMC。
[0778] 1.1.3.2.将FACS抗体和/或5‑OP‑RU/MR1四聚体添加到样本中。
[0779] 对于人MAIT细胞的检测，可以使用两种方法：
[0780] a)四聚体染色：使用BV421标记的人5‑OP‑RU MR1四聚体(1:500)和APC‑H7缀合的抗人CD3(1:200)。
[0781] b)取代标记：PE缀合的抗人TCR Va7.2(1:200)、APC‑H7缀合的抗人CD3(1:200)和FITC缀合的抗人CD161(1:200)。
[0782] 1.1.3.3.4℃避光培养30分钟。
[0783] 1.1.3.4.通过在4℃下以300x g离心5分钟，用FACS染色缓冲液洗涤细胞，并用300μlFACS染色缓冲液重悬。
[0784] 1.1.3.5.通过流式细胞术分析MAIT细胞(见图11)。
[0785] 1.2.MAIT细胞的分离
[0786] 1.2.1.Vα7.2+细胞的磁珠分离。
[0787] 1.2.1.1.收集PBMC，并用结合缓冲液洗涤细胞。弃去上清液，并用浓度为1x 107/100μl的MACS缓冲液重悬细胞沉淀。添加PE抗人TCR Vα7.2抗体(1:100)。混合均匀并在冰上培养30分钟。
[0788] 1.2.1.2.以300x g离心5分钟，用MACS缓冲液清洗细胞一次。
[0789] 1.2.1.3.用MACS缓冲液以107/80μl的浓度重悬细胞。每107个细胞添加20μl抗PE微珠，在冰上培养20分钟。
[0790] 1.2.1.4.用10倍体积的MACS缓冲液清洗细胞一次。以300x g离心5分钟。在1ml MACS缓冲液中重悬。
[0791] 1.2.1.5.用1ml MACS缓冲液预洗MS柱并组装在磁体上。将细胞加到柱上并洗涤柱3次，每次用1ml MACS缓冲液。
[0792] 1.2.1.6.从磁体上取下柱子，并在1ml MACS缓冲液中洗脱结合的细胞。
[0793] 1.2.2.MAIT细胞的流式分选
[0794] 1.2.2.1.收集磁力分离的细胞并以300x g离心5分钟。
[0795] 1.2.2.2.用MACS缓冲液以107/100μl的浓度重悬细胞。添加BV421标记的人5‑OP‑RU MR1四聚体(1:500)和APC‑H7‑缀合的抗人CD3(1:200)。在冰上培养20分钟。
[0796] 1.2.2.3.用10倍体积的MACS缓冲液清洗细胞一次。以300x g离心5分钟。在2ml MACS缓冲液中重悬。
[0797] 1.2.2.4.打开BD Prodigy分选仪并加载细胞样本。分选CD3+四聚体+细胞群(见图12)。
[0798] 1.3.MAIT细胞的激活
[0799] 1.3.1.收集分选的MAIT细胞并以300x g离心5分钟。
[0800] 1.3.2.弃去上清液并在R10培养基中重悬至106个细胞/ml。
[0801] 1.3.3.通过涡旋重悬Dynabeads人T活化剂CD3/CD28 30秒。
[0802] 1.3.4.将所需体积的Dynabeads转移至试管中。
[0803] 1.3.5.添加等体积的缓冲液并涡旋混合5秒。将试管放在磁体上1分钟，弃去上清液。
[0804] 1.3.6.从磁体上取下试管，并将洗涤过的Dynabeads重新悬浮在R10介质中。
[0805] 1.3.7.将所需体积的Dynabeads添加到细胞悬浮液中，在37℃培养箱的24孔板中加入100IU/ml IL‑2，使得珠子与细胞之比达到1:1。
[0806] 1.4.MAIT细胞的逆转录病毒转导
[0807] 1.4.1.在MAIT细胞激活48小时后进行逆转录病毒转导。
[0808] 1.4.2.转导前一天，准备RetroNectin包被板。将15μg RetroNectin添加到1ml PBS中。
[0809] 充分混合并添加到未经组织培养处理的24孔板的一个孔中。
[0810] 1.4.3.用保鲜膜包裹板并在4℃冰箱中保存过夜。
[0811] 1.4.4.在基因转移当天，从孔中除去未结合的RetroNectin。用2ml PBS洗涤两次。避免充分干燥。
[0812] 1.4.5.在37℃水浴中解冻逆转录病毒上清液。将1ml病毒上清液转移至RetroNectin包被板的每个孔中。
[0813] 1.4.6.用保鲜膜包裹板并在32℃下以1000x g离心2小时。
[0814] 1.4.7.在离心过程中，收集激活的MAIT细胞。用含有100IU/ml IL‑2的新鲜R10培6
养基重悬细胞至浓度1x 10/ml。
[0815] 1.4.8.旋转结束后，弃去板上的上清液。每孔中加入1ml细胞悬液。
[0816] 1.4.9.将板以500x g离心10分钟。
[0817] 1.4.10.将板放回37℃培养箱中。
[0818] 1.4.11.如有必要，重复转导步骤以提高转导效率。
[0819] 注意：转导48小时后可通过流式细胞术检测转导效率。
[0820] 1.5.CAR‑MAIT细胞的扩增
[0821] 1.5.1.逆转录病毒转导两天后，收获细胞并通过血细胞计数器对细胞进行计数。
[0822] 1.5.2.将1x 107个细胞转移到Grex6M孔板的一个孔中。添加130ml含有100IU/ml IL‑2的新鲜R10培养基，并将板放回培养箱。
[0823] 1.5.3.每三天将IL‑2刷新至终浓度100IU/ml。
[0824] 1.5.4.培养8‑12天后即可收获CAR‑MAIT细胞(见图13)。
[0825] 注意：扩增的CAR‑MAIT细胞可用于表型测试、功能测定或液氮冷冻。
[0826] 结果
[0827] 实施例1：靶向CD4的T细胞和靶向TCR Vbeta 7.1的T细胞的产生
[0828] 参考图1A(1)和(2)，图中示出了说明根据本发明的CAR构建体的两种不同实施方式中包含的功能元件。
[0829] 在每个实施方案中，构建体的侧翼是上游和下游长末端重复序列(LTR)。5'启动子位于5'LTR下游，并且其可以是PGK启动子。启动子的3'端有SP，一种Igκ信号肽，用于引导融合蛋白到达T细胞外膜。SP的3'处设置有scFv区，其包括上游VL(可变轻链)序列、中央G4S序列和下游VH(可变重链)序列。在一个实施方案中(如图1A(1)所示)，VL和VH序列可以是Hu5A8轻链可变区和重链可变区以结合CD4抗原。在其他实施方案中(如图1A(2)所示)，VL和VH序列可以是3G5轻链可变区和重链可变区以结合TCR‑Vb7.1。
[0830] scFv区的3'处有CD8a铰链和跨膜(TM)结构域，用于CAR展示和锚定。铰链和TM的3’端设有胞内结构域，包括CD28、4‑1BB和CD3ζ链的信号结构域，用于触发胞内信号传导通路。P2A自切割肽位于ζ链的3'处和截短型EGFR(EGFRt)的5'处，用于跟踪并充当第一安全开关。
第二个P2A自切割肽位于EGFRt的3'处和诱导型半胱天冬酶9(iC9)的5'处，充当第二安全开关。该构建体包括土拨鼠肝炎调节元件(WPRE)(参见图9和图10质粒)，可增强表达，最后是末端3'LTR。
[0831] 对人CD4具有免疫特异性的小鼠IgG抗体人源化5A8(Hu5A8)的DNA序列从CN103282385中找到。Hu5A8也称为TNX‑355或艾巴利珠单抗(ibalizumab)，在I期和II期临床试验中进行了广泛评估，用于通过阻断CD4分子的HIV结合位点来抑制HIV进入。作为对照，还合成了抗CD20单克隆抗体(Leu16)的VH链和VL链，并在临床前和临床CAR‑T研究中评估了其功效。scFv片段被克隆到第三代CAR质粒的骨架中，具有CD8跨膜结构域、CD28胞内结构域、4‑1BB胞内结构域和CD3ζ链。经过研究证明，第三代CAR的使用优于第一代和第二代CAR。tEGFR作为一种选择，其作为体内追踪标记物以及消融工程CAR‑T细胞的第一安全开关的实用性得到了检验。因此，该残留的tEGFR序列通过T2A‑核糖体跳跃序列与CAR序列连接。
[0832] CAR‑T细胞有时可以在患者体内保留长达数十年，就像抗CD19和抗HIVCAR试验的情况一样。与B细胞再生障碍不同，长期CD4+T细胞再生障碍会危及生命。因此，有必要建立一种安全的方法，在肿瘤或病毒消除后或在CAR‑T治疗过程中由于严重副作用而导致的紧急情况下，从患者体内移除本发明的CART4细胞。二聚化药物诱导的半胱天冬酶9(iC9)自杀开关基于人半胱天冬酶9与突变的人FK506结合蛋白(FKBP)的融合，可在小分子化学药物AP20187(称为半胱天冬酶诱导药物，CID)存在的情况下实现条件二聚化。iC9的使用已在半相合HSC移植的临床试验中被证明是安全有效的。因此，随后合成了包含CD4 CAR、tEGFR和iC9的基因片段(图1A.1)并插入逆转录病毒MSCV(鼠干细胞病毒)载体中(如图9所示；10,348bp)。此外，随后合成了包含TCR Vbeta7.1 CAR、tEGFR和iC9的基因片段(图1A.2)并插入逆转录病毒MSCV(鼠干细胞病毒)载体中(如图10所示；10,347bp)。
[0833] 为了证实CAR和tEGFR的共表达，用Dynabeads人T活化剂激活人PBMC，并通过逆转录病毒转导图9和图10所示的质粒进行基因工程改造以表达CAR/tEGFR/iC9基因构建体。事实上，CAR和tEGFR的表达水平紧密相关，用小鼠scFv特异性抗小鼠IgG F(ab')2抗体结合EGFR特异性抗体进行表面染色后，可检测到双阳性细胞群(图1B)。随着T细胞的扩增，tEGFR+细胞群保持其比例在总细胞数的50％左右(图1C)。
[0834] 为了评估体外iC9安全开关的效率，克隆了不含iC9基因的CART4变体(CART4 w/o iC9)作为对照。用CART4或不含iC9构建体的CART4转导的T细胞暴露于浓度不断增加的CID AP20187(0.1nM至100nM)24小时。使用7AAD和膜联蛋白‑V进行流式细胞术分析来了解细胞死亡情况。存活细胞群体中的tEGFR阳性百分比随着CID浓度的增加而下降。单次100nM剂量的CID使69.1％的tEGFR高细胞被消除(图1D)。与其他研究的观察结果一致，逃脱杀伤的细胞是表达低水平转基因的细胞，CID后tEGFR的平均荧光强度(MFI)降低了50％(图1E)。因此，无反应的T细胞表达的iC9不足以激活CID的功能。对于临床应用，CAR‑T细胞可能需要在给药前进行分选，以获得足够的转基因表达。
[0835] 实施例2：CART4 T细胞的体外功能验证
[0836] 在CAR转导后四天内，与未转导的(NTD)和CART20对照相比，CD4+T细胞几乎完全耗尽，其中约45％的细胞仍呈CD4阳性(图2A)。这些数据表明，CART4细胞在T细胞扩增过程中具有强大的抗CD4活性。
[0837] 针对自体原代健康供体PBMC建立共培养物。CFSE标记的自体PBMC与CD8+CART4细胞或CART20细胞进行共培养。在这两种情况下，CART4/20细胞都能对各自的靶细胞产生高水平的细胞毒性。在4小时共培养期间，在E:T比例3:1的条件下，PBMC中94％的CD4+细胞被CART4细胞裂解。然而，与NTD T细胞相比，CART4对CD20+细胞没有特异性的T细胞毒性(图2C)。
[0838] 为了进一步评估CART4细胞的功能，发明人使用Jurkat细胞系和CEM‑ss细胞系测试了CART4细胞的抗肿瘤功效。Jurkat和CEM‑ss细胞系是最初从T细胞白血病或人T4淋巴细胞白血病患者的外周血中建立的T细胞系。这两种细胞系均表达CD4，而CEM‑ss细胞系表达更高水平的CD4(图2D)。事实上，CART4细胞根据CD4表达水平靶向T肿瘤细胞系。经过短期培养，CART4细胞以5:1的E:T(效应物：靶标)比例成功消除了CEM‑ss细胞。作为对照，还测试了CART4细胞对CD4‑淋巴瘤细胞(一种不表达CD4的人类B细胞系，BCL)的活性(图2D)。流式细胞术分析表明，CART4细胞无法靶向BCL(图2E)。此外，通过细胞内细胞因子染色，与CD4+肿瘤细胞一起培养的CART4细胞表现出显着的IFN‑γ和TNF‑α反应(图2F)。因此，这些数据证明了CART4对CD4表达的强烈的剂量依赖性反应。当CART4细胞与CD4阴性细胞一起培养时，没有观察到杀伤作用。因此，这些结果表明CART4细胞消融对CD4具有特异性。
[0839] 实施例3：CART4细胞特异性杀死CD4+T肿瘤细胞
[0840] 为了检测CART4对患者样本的功能，将来自ATLL患者的PBMC解冻并进行表型分析。所有样本的CD4表达率为67.4％至97.7％。大多数CD4+细胞表达一条独特的T细胞受体(TCR Vbeta)β链，表明T细胞白血病202‑204的克隆发展(图3A)。通过流式细胞术分析量化，ATLL患者样本与CART4细胞共培养4小时后，CD4+恶性肿瘤会快速、明确地消融。所有ATLL共培养物均观察到约80％的消融，与之前显示的母细胞T细胞系的消融一致(图3B)。研究还使用来自六名CTCL患者的样本。同样观察到CART4细胞对新鲜解冻的原代CTCL细胞具有强大的细胞毒性，共培养4小时后，恶性T细胞减少约60％至80％(图3C)。因此，CART4细胞能够有效地消除直接从患者样本中分离出的侵袭性CD4+T恶性肿瘤。这些结果表明，CD4是CD4+T恶性肿瘤很有前景的治疗靶点。
[0841] 实施例4：CART4细胞有效介导体内抗白血病作用
[0842] 为了评价体内抗肿瘤活性，发明人使用表达Gaussia荧光素酶的CEM‑ss细胞系开6
发了异种小鼠模型。首先使用单剂量(4x10)的CART4细胞测试了CART4细胞延缓NRG小鼠白血病出现的能力。流式细胞术分析表明，注射前约50％的细胞表达抗CD4 CAR。小鼠接受眼眶后注射CEM‑ss细胞。肿瘤移植四天后，对白血病小鼠进行单剂量的眼眶后注射CART4细胞或NTD CD8+T细胞(图4A)。通过每周测量外周血中的荧光素酶活性来监测肿瘤负荷。输注的CART4细胞能有效防止白血病恶化(图4B)，并显着延长了小鼠的中位生存期(对照组为38天，CART4组为60天，通过Mantel‑Cox对数秩检验P＝0.026)(图4C)。事实上，通过流式细胞术分析，到终点时，脾脏和骨髓中的eGFP+肿瘤进展显着延迟(图4D)。
[0843] 尽管复发的肿瘤细胞保留了CD4的表达，但与对照组相比，表达水平下降至约40％ MFI(图4E)。然而，这种下调不足以损害CART4细胞消除复发肿瘤的能力(图4F)。这一结果表明，肿瘤复发的主要原因是CAR‑T细胞缺乏持久性，而不是抗原逃逸。
[0844] 实施例5：开发符合GMP标准的CAR‑T细胞制造方法
[0845] 为了评估CAR‑T细胞的可扩展性并简化CAR‑T细胞制造，使用透气静态细胞培养系统(G‑Rex)建立了优化的标准操作程序，用于CAR‑T细胞的制造(图5A)。G‑Rex系统在板的底部包含一层硅胶膜。通过膜上的气体交换(包括O2和CO2)，可以增加培养基的深度，提供更多6
的营养物质并稀释废物。激活并转导PBMC后，将10x10个细胞转移到G‑Rex六孔板中进一步
6
培养。每两到三天向细胞补充细胞因子IL‑7和IL‑15。细胞从最初的2x10 个扩增至超过3x 
8
10个，在15天内增加了150倍(图5B)。接下来，确定了G‑Rex系统中T细胞扩增后最终产物的转导效率。CART4的最终转导效率为57.6％±7.1％，与传统烧瓶中产生的细胞(53.7％±
5.3％)相似，如图5C所示。正如预期的那样，最终产品中内源性CD4+群被完全耗尽，表明CAR‑T细胞具有抗CD4活性。
[0846] 有趣的是，G‑Rex中产生的CAR‑T细胞表现出对中央记忆表型的分化偏好。对记忆标记CD45RO和CD62L的评估显示，与传统培养瓶培养的细胞相比，CD45RO CD62L双阳性细胞的比例更高(77％7.1％vs 41％5.5％)(图5D)。CD45RO CD62L双阳性细胞是中央记忆T细胞，被认为是体内长期持续存在所必需的。因此，这种生物过程优化方法提高了细胞产量和具有中央记忆表型的比例，同时减少了技术人员干预的次数和CAR‑T制造的成本。
[0847] 实施例6：TCR Vbeta7.1特异性CAR‑T细胞的产生
[0848] T细胞恶性肿瘤通常由表达独特TCR的一种单克隆癌细胞发展而来。针对TCRβ(Vβ)链可变(V)区的多种抗体已以直接缀合的多色形式提供，可以评估25个Vβ家族中的22个，覆盖正常循环T细胞谱系的75％。因此，发明人认为TCR Vβ是CAR‑T疗法针对T细胞恶性肿瘤的潜在靶点。为了开发靶向CAR‑T(CARTVb7.1)细胞的TCR Vβ，发明人将杂交瘤细胞3G5的scFv区克隆到CAR构建体上，该杂交瘤细胞能产生针对人TCR Vβ7.1的单克隆抗体(来自牛津大学Andrew实验室的Margret Callam博士)，如图1A(2)所示。CAR转导五天后，内源性TCR Vβ7.1+细胞群几乎完全耗尽，与CART20对照相比，约1.2％的细胞仍保持TCR Vβ7.1阳性(图
6B)。这些数据表明，CAR‑T细胞在T细胞扩增过程中具有针对TCR Vβ7.1的强大活性。
[0849] 为了进一步评估CARTVb7.1细胞的功能，发明人使用从被诊断患有TCRVβ7.1阳性肿瘤的ATL患者身上分离的肿瘤细胞测试了抗肿瘤功效。事实上，通过流式细胞术分析量化结果，ATL患者样本与CARTVb7.1细胞共培养6小时后，CD4+恶性肿瘤会快速、明确地消融。所有ATL共培养物均观察到约60％的消融(图6C、D)。这些结果表明，TCR Vβ是T恶性肿瘤有前景的治疗靶点。
[0850] 实施例7：CAR‑MAIT细胞的开发
[0851] 目前，大多数CAR‑T疗法利用自体常规CD3+T细胞。然而，癌症患者的免疫细胞可能功能低下或数量很少。特别是，对T恶性肿瘤患者的PBMC进行扩增和基因改造是有风险的，因为可以用CAR改造肿瘤细胞。因此，需要开发一种可以制造第三方同种异体细胞的免疫疗法。在这里，发明人开发了一种两步法，通过将磁分离和流式细胞术分选相结合，从PBMC中分离出粘膜相关恒定T细胞(MAIT细胞)。第一步根据TCR Vα7.2表达进行分离后，MAIT细胞百分比从0.74％提高到33.3％(图7A、B)。下一步的流式分选可以进一步将MAIT纯度提高到95％。分选的细胞用Dynabeads人T活化剂CD3/CD28激活，并在细胞因子混合物(IL‑2、IL‑7和IL‑15)存在下扩增。该扩增方法在12至14天内实现了约100倍的扩增(图7C)。在收获时，
90.9％的扩增细胞保持了对MR1‑5‑OP‑RU四聚体的特异性(图7D)。此外，扩增的MAIT细胞可以通过逆转录病毒转导成功地进行CAR基因改造(图7E)。CAR转导的MAIT(CAR‑MAIT)细胞具有与传统CAR‑T细胞相当的细胞毒性能力(图8)。
[0852] 实施例8：CAR‑MAIT细胞有效介导体内抗白血病作用
[0853] 为了评价CAR‑MAIT细胞的体内抗肿瘤功能，发明人使用单剂量(4x106)的CAR细胞测试了抗CD4 CAR‑MAIT(CAR‑MAIT4)细胞延缓NRG小鼠白血病进展的能力。小鼠接受静脉注射CEM‑ss细胞。肿瘤移植四天后，对白血病小鼠进行单剂量静脉注射CAR‑MAIT4细胞或CART4细胞(图14A)。抗CD20 CAR‑MAIT(CAR‑MAIT‑Ctrl)细胞或抗CD20 CART(CART‑Ctrl)细胞作为对照组。通过每周测量荧光素酶活性来监测肿瘤负荷。输注的CAR‑MAIT4细胞和CART4细胞能有效防止白血病恶化(图14C和D)，并显着延长了肿瘤小鼠的存活期(图14B)。
[0854] 实施例9：人MAIT细胞的检测、分离、扩增和工程化改造
[0855] 使用本文描述的方法，对人MAIT细胞进行检测、分离、扩增和工程化改造。
[0856] 如图11所示，通过流式细胞术分析人MAIT细胞。
[0857] 如图12所示，MAIT细胞经过流式分选。
[0858] 然后激活MAIT细胞，并用表达CAR的载体转导以产生CAR‑MAIT细胞，然后进行扩增，如图13所示。
[0859] 实施例10：通过刺激PMBC扩增MAIT细胞
[0860] MAIT细胞是先天性T细胞的一个亚群，定义为CD3+TCRVa7.2+CD161+细胞，可识别MHC I类分子MR1。先前的研究表明，MAIT细胞可以在体外扩增，但需要同种异体饲养细胞的存在。然而，该方法的一个问题是难以大规模生产和质量控制。在本项研究中，发明人现已开发出一种非常新颖且有效的体外扩增MAIT细胞的方法，通过首先用负载抗原(5‑OP‑RU)的MR1四聚体珠或仅用5‑OP‑RU刺激PBMC，在多种细胞因子(IL‑2、IL‑7、IL‑15、IL‑12、IL‑18和IL‑23)组合存在下进行长达6天的体外培养。然后通过MACS或FACS分选分离MAIT细胞，随后通过抗CD3/CD28珠进一步扩增以用于基于CAR的治疗，如前面的实施例中所述。
[0861] 材料和方法
[0862] 1.PBMC分离
[0863] 通过Ficoll‑Hypaque密度梯度离心法从健康献血者的血沉棕黄层中分离出PBMC。将分离的PBMC等分试样冷冻并储存在液氮中备用。在开始实验之前，将冷冻的PBMC储存液解冻并在补充有10％ FBS的RPMI培养基中于37℃下培养。
[0864] 2.MR1/5‑OP‑RU复合珠的制备
[0865] 通过使用M‑280dynabeads和链霉亲和素(来自ThermoFisher)以及生物素化的MR1单体，制成MR1/5‑OP‑RU四聚体包被珠。负载5‑OP‑RU的MR1单体由Jim McCluskey博士(澳大7
利亚墨尔本大学)友情提供。将珠子与负载5‑OP‑RU的MR1单体(5ug/3x10珠子)在摇床上于
4℃下放置12小时混合。用PBS冲洗两次，每次10分钟，去除多余的未结合蛋白。将制备的MR1四聚体包被珠子重悬于PBS中，并保存在4℃下备用。
[0866] 3.PBMC中MAIT细胞的富集
[0867] PBMC(每孔2x105个细胞)在含有R10培养基(90％ RPMI+10％ FBS+1％青霉素/链霉素+2mM L‑谷氨酰胺)的96孔板中于37℃培养箱中培养，由MR1/5‑OP‑RU复合物包被珠(珠与细胞比例为1:1)或纯化的5‑OP‑RU抗原(10nM)(由澳大利亚昆士兰大学的Jeffrey Mak博士提供)刺激，与不同的细胞因子在体外结合6天。细胞因子IL‑2(100IU/ml)(Roche)、IL‑7(50ng/ml)(Miltenyi)、IL‑15(50ng/ml)(Miltenyi)、IL‑12(50ng/ml)(Miltenyi)、IL‑18(50ng/ml)(ThermoFisher)和IL‑23(50ng/ml)(Miltenyi)以15种不同的组合添加，编号为1至15，如图15中的表所示。第6天，收集扩增的细胞并进行分析，通过流式细胞术确定MAIT细胞的百分比，如下所述。
[0868] 4.FACS分析PBMC中MAIT细胞频率
[0869] 使用抗体在黑暗中对扩增的PBMC进行表面标记染色30分钟。FITC缀合的CD3(克隆BW264/56，Miltenyi)、PE缀合的Va7.2(克隆3C10，Biolegend)、APC缀合的CD161(克隆DX12，BD)以1:100的比例用于标记细胞。MAIT细胞定义为CD3+Va7.2+CD161+细胞。使用LIVE/TMDEAD  Fixable Aqua死细胞染色试剂盒(ThermoFisher)排除死细胞。用5至10倍体积的PBS洗涤染色的细胞，以500×g离心5分钟，然后用200μl PBS重悬，再进行流式细胞术分析。流式细胞术结果由FlowJo进行分析。
[0870] 结果
[0871] 图15显示了在PBMC中富集MAIT细胞的结果。PBMC通过(i)珠子与细胞比例为1:1的MR1/5‑OP‑RU复合珠，或(ii)10nM的5‑OP‑RU抗原进行刺激——在不同的细胞因子(IL‑2、IL‑7、IL‑15、IL‑12、IL‑18和IL‑23)存在下进行，持续6天，如表中所示。例如，条件1对应于仅IL‑2，条件2对应于IL‑7和IL‑15，条件3对应于IL‑2、IL‑12和IL‑18，等等。
[0872] MAIT细胞增加的倍数是通过将第6天的活MAIT(CD3+Va7.2+CD161+)细胞的频率除以第0天的MAIT细胞的原始频率来计算的。前五组用橙色标出(即条件1、3、11、12和13)。
[0873] 可以看出，对于MR1/5‑OP‑RU复合珠(供体1)，1、13、12、3和11的细胞因子组合给出了PBMC中MAIT细胞的最高增加倍数。对于MR1/5‑OP‑RU复合珠(供体2)，12、13、1、11和3的细胞因子组合给出了PBMC中MAIT细胞的最高增加倍数。
[0874] 可以看出，对于5‑OP‑RU(供体1)，3、1、12、13和11的细胞因子组合给出了PBMC中MAIT细胞的最高增加倍数。对于5‑OP‑RU(供体2)，8、13、12、11和3的细胞因子组合给出了PBMC中MAIT细胞的最高增加倍数。
[0875] 根据这些数据，很明显，不同的细胞因子和细胞因子的组合(IL‑2、IL‑7、IL‑15、IL‑12、IL‑18和IL‑23)会产生不同程度的刺激，从而提高PBMC中MAIT细胞的富集。总体而言，IL‑12、IL‑18和IL‑23的组合使PBMC中MAIT细胞的增加倍数最高。
[0876] 讨论
[0877] MAIT细胞是先天性T细胞的一个亚群，定义为CD3+TCRVa7.2+CD161+细胞，可识别MHC I类分子MR1。先前的研究表明，MAIT细胞可以在体外扩增，但需要同种异体饲养细胞的存在。然而，该方法的一个问题是难以大规模生产和质量控制。如上所述，发明人现已开发出一种用于体外扩增MAIT细胞的令人惊讶的有效方法，其中首先通过用负载抗原(5‑OP‑RU)的MR1四聚体珠或仅用5‑OP‑RU刺激PBMC，在三种细胞因子(IL‑12、IL‑18和IL‑23)组合存在下进行长达6天的体外培养。然后通过MACS或FACS分选分离MAIT细胞，随后通过抗CD3/CD28珠进一步扩增以用于基于CAR的治疗。
[0878] 目前，与B细胞恶性肿瘤相比，T细胞淋巴瘤尚无成熟的治疗方法，唯一潜在的治疗方案是同种异体造血干细胞移植(HSCT)，但是这种方法本身具有显着的治疗相关死亡率。由于大多数(>95％)T细胞淋巴瘤源自表达特定T细胞受体(TCR)基因(即克隆TCR‑Vb链)和泛T辅助细胞标记CD4的显性T细胞克隆，因此针对这些标记物的单克隆抗体已被用于治疗T细胞淋巴瘤，在小型临床试验中，其中一些抗体导致了部分淋巴瘤的消退(d’Amore et al.,2010；Hagberg et al.,2005；Kim et al.,2007)。
[0879] 尽管CAR‑T通过靶向泛B细胞标志物CD19是一种非常有效的B细胞恶性肿瘤治疗方法，但这种方法在应用于T细胞淋巴瘤的治疗时遇到了重大障碍。首先，与B细胞耗竭不同，持续性T细胞再生障碍，特别是CD4+T细胞耗竭，会导致严重的毒性，例如慢性HIV感染期间观察到的机会性感染。其次，T细胞淋巴瘤相关的T细胞功能受损和由T细胞肿瘤显性生长引起的正常T细胞计数降低，不能用于产生自体CAR‑T细胞，因此需要同种异体CAR‑T细胞来治疗T细胞细胞淋巴瘤。最后，大多数T细胞淋巴瘤是与淋巴结和皮肤组织相关的实体瘤，由于组织浸润能力较低以及肿瘤微环境恶劣，传统CAR‑T难以治疗。
[0880] 为了解决这些问题，发明人设计了一种靶向CD4抗原(CART4)的CAR，其含有tEGFR和iC9作为安全开关，以在根除肿瘤细胞后选择性地消除CART4转导的T细胞，从而使自体造血干细胞或同种异体HSCT恢复正常的CD4+T细胞。CD4+T细胞的转运耗竭已被证明在抗CD4抗体治疗自身免疫性疾病中是安全且可耐受的(Hagberg et al.,2005；Kim et al.,2007)。CART4转导的人类T细胞能够在体外杀死从ATLL或CTCL患者分离的CD4+T细胞淋巴瘤细胞系，并在小鼠异种移植模型中抑制体内肿瘤生长。更重要的是，这些CART4+T细胞与tEGFR(通过抗EGFR抗体检测)和iC9(通过CID药物诱导CART4+T细胞体外和体内凋亡而确定)共表达CAR。tEGFR的表达可用于监测CART4+T细胞增殖或体内用抗EGFR抗体消除CART4+T细胞。
[0881] 一般来说，正常T细胞由高度多样化的TCR库组成，以维持针对病原体感染的细胞免疫。TCR由含有N端可变区和C端恒定区的a和b链的异二聚体组成。TCR‑Vb区(链)比TCR‑Va更具多态性，通常用于分析免疫反应或T细胞恶性肿瘤的克隆性。目前，TCR‑Vb链家族有22种特异性mAbs，覆盖了75％的TCR库。由于大多数T细胞淋巴瘤都来自于表达相同TCR Vb链的单个T细胞克隆，因此针对肿瘤克隆定义的TCR‑Vb链的CART，同时保留其余正常T细胞库将是最大限度减少机会性感染的理想方法，并且在输血后无需移除CART细胞。
[0882] 作为抗TCR‑Vb的免疫疗法的概念验证，发明人设计了特异性靶向TCR‑Vb 7.1链(CARTVb7.1)的CAR，结果表明CARTVb7.1转导的T细胞能够有效消除从ATL患者中分离出的TCR‑Vb7.1阳性肿瘤细胞，表明抗TCR‑Vb CAR可以为T细胞淋巴瘤提供一种替代的免疫疗法。
[0883] 最后，发明人研究了MAIT细胞是否可以作为基于CAR的疗法的效应细胞，因为MAIT细胞相对于传统T细胞具有若干优势，包括：
[0884] (1)由于在哺乳动物进化过程中表达高度保守的恒定TCR，因此同种异体反应性低(即诱导移植物抗宿主病、GVHD)；
[0885] (2)调节功能，包括抑制小鼠模型中的GVHD；
[0886] (3)激活诱导GrB、穿孔素和GrA的杀伤活性；和
[0887] (4)组织归巢，例如分布于肠道粘膜、皮肤和肺部。
[0888] 如本文所述，CAR转导的MAIT细胞(CAR‑MAIT)在体外和体内表现出至少与常规CAR‑T细胞相当的抗肿瘤活性。总之，发明人开发了一种基于CAR‑MAIT的新型免疫疗法，可有效治疗T细胞恶性肿瘤，通过用可切换的CAR‑T靶向泛T细胞标记物CD4，减少细胞因子释放综合征的靶向/脱瘤毒性或特异性TCR‑Vb链(这是恶性T细胞所特有的)，从而避免整体免疫抑制。更重要的是，CAR‑MAIT细胞可能有潜力开发出治疗T细胞淋巴瘤所需的基于同种异体CAR的疗法。如果持续生产，即大规模体外扩增，它们可用于现成的开发。发明人相信，CAR‑MAIT不仅可以为T细胞恶性肿瘤提供有效的治疗新方法，而且还可以为其他非免疫细胞类型的肿瘤提供有效的治疗新方法。
[0889] 结论
[0890] 基于嵌合抗原受体(CAR)的T细胞疗法通过靶向泛B细胞特异性抗原，在治疗B细胞恶性肿瘤方面取得了巨大成功。然而，针对T细胞淋巴瘤的类似策略迄今尚未实现，这主要是由于与B细胞恶性肿瘤相比，T淋巴瘤中整体T细胞耗竭和正常T细胞功能障碍/频率低所带来的潜在严重毒性。为了克服这些限制，发明人设计了一种种新型CAR构建体，其对泛T细胞标记物(CD4)或TCR‑Vb同型链具有特异性，其中包含两个安全开关：截短的表皮生长因子受体(tEGFR)和诱导型半胱天冬酶9(iC9)。发明人研究了同种异体反应性低的粘膜相关恒定T(MAIT)细胞在用CAR构建体转导后是否会表现出与传统T细胞类似的抗肿瘤杀伤活性。
[0891] 令人惊讶的是，CAR转导的T细胞不仅对从患者体内分离出来的CD4+T淋巴瘤细胞或TCR‑Vb特异性T白血病克隆表现出特异性杀伤作用，而且在体外和体内用诱导剂处理后也会被消除。此外，本发明人还首次证明，CAR‑MAIT细胞能够在体外和体内与常规T细胞一样有效地抑制肿瘤生长。该研究为T细胞淋巴瘤的治疗提供了新的策略。
[0892] 因此，本发明的粘膜相关恒定T(MAIT)细胞是一类免疫细胞，这类免疫细胞参与广泛的感染性和非感染性疾病，并且它们对由组织相容性复合物(MHC)I类蛋白MR1呈递的微生物核黄素衍生物抗原具有不寻常的特异性，它们被开发成一种新型免疫疗法用于治疗癌症患者，通过用嵌合抗原受体(CAR)对MAIT细胞进行基因改造，使它们能够特异性识别和攻击T淋巴瘤。
[0893] 参考文献
[0894] d’Amore,F.,Radford,J.,Relander,T.,Jerkeman,M.,Tilly,H.,Osterborg,A.,Morschhauser,F.,Gramatzki,M.,Dreyling,M.,Bang,B.,&Hagberg,H.(2010).Phase II trial of zanolimumab(HuMax‑CD4)in
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[0904] 附文
[0905] 1.一种表达嵌合抗原受体(CAR)的粘膜相关恒定T(MAIT)细胞。
[0906] 2.根据第1条所述的MAIT细胞，其中所述CAR‑MAIT细胞表达靶向T细胞上的CD4抗原的CAR。
[0907] 3.根据第2条所述的MAIT细胞，其中所述CAR对包含基本上如SEQ ID No：1所示的氨基酸或其变体或片段的CD4抗原具有特异性。
[0908] 4.根据前述任一条所述的MAIT细胞，其中所述CAR‑MAIT细胞表达靶向T细胞上的T细胞受体(TCR)β链可变区(Vbeta)的CAR，优选如表1所示的任意一个Vbeta区。
[0909] 5.根据第4条所述的MAIT细胞，其中所述CAR靶向T细胞上的多个T细胞受体(TCR)β链可变区(Vbeta)，优选地其中所述多个Vbeta区选自表1所示的一组Vbeta区，任选地其中所述多个TCR Vbeta区是相同或不同的Vbeta区。
[0910] 6.根据第4条或第5条所述的MAIT细胞，其中所述CAR靶向选自下组的T细胞上的一个或多个TCR Vbeta区：Vb 1、Vb 2、Vb 3、Vb 5.1，Vb 7.1、Vb 8、Vb 12、Vb 13.1、Vb17和Vb 20。
[0911] 7.根据第4至6条中任一条所述的MAIT细胞，其中所述CAR对包含基本上如SEQ IDNo：2所示的氨基酸或其变体或片段的TCR Vbeta区具有特异性。
[0912] 8.根据前述任一条所述的MAIT细胞，其中所述CAR‑MAIT细胞包含一种或多种编码序列，其允许所述CAR‑MAIT细胞被可控地或诱导性地消除。
[0913] 9.根据第8条所述的MAIT细胞，其中所述一种或多种编码序列编码表皮生长因子受体(EGFR)或截短的表皮生长因子受体(tEGFR)。
[0914] 10.根据第8条或第9条所述的MAIT细胞，其中所述一种或多种编码序列编码诱导型半胱天冬酶9(iC9)。
[0915] 11.根据前述任一条所述的MAIT细胞，其中通过磁激活细胞分选(MACS)和/或荧光激活细胞分选(FACS)从人外周血单核细胞(PBMC)分离所述MAIT细胞，更优选MACS和FACS二者。
[0916] 12.一种核酸构建体，其包含可操作地连接至第一编码序列的启动子，所述第一编码序列编码抗CD4嵌合抗原受体(CAR)或抗T细胞受体(TCR)Vbeta CAR。
[0917] 13.根据第12条所述的构建体，其中所述启动子是PGK启动子，任选地所述启动子包含基本上如SEQ ID No：3所示的核苷酸序列或其片段或变体。
[0918] 14.根据第12条或第13条所述的构建体，其中所述第一编码序列编码抗CD4嵌合抗原受体(CAR)，任选地其中所述CAR对包含基本上如SEQ ID No：1所示的氨基酸序列或其变体或片段的CD4抗原具有特异性。
[0919] 15.根据第14条所述的构建体，其中：
[0920] (i)所述第一编码序列包含编码基本上如SEQ ID No：6所示的氨基酸序列的核苷酸序列或其片段或变体；
[0921] (ii)所述第一编码序列包含基本上如SEQ ID No：7所示的核苷酸序列或其片段或变体；
[0922] (iii)所述第一编码序列包含编码基本上如SEQ ID No：8所示的氨基酸序列的核苷酸序列或其片段或变体；和/或
[0923] (iv)所述第一编码序列包含基本上如SEQ ID No：9所示的核苷酸序列或其片段或变体。
[0924] 16.根据第12条或第13条所述的构建体，其中所述第一编码序列编码抗T细胞受体(TCR)Vbeta区CAR，任选地为表1中列出的任何Vbeta区。
[0925] 17.根据第16条所述的构建体，其中所述第一编码序列编码多个T细胞受体(TCR)β链可变区(Vbeta)CAR，优选地其中所述多个Vbeta区选自表1所示的一组Vbeta区。
[0926] 18.根据第16条或第17条所述的构建体，其中所述构建体包含编码至少一种CAR的编码序列，所述CAR靶向T细胞上的一个或多个选自以下的TCR Vbeta区：Vb 1、Vb 2、Vb 3、Vb 5.1、Vb 7.1、Vb 8、Vb 12、Vb 13.1、Vb 17和Vb 20；任选地其中所述构建体包含编码至少一种CAR的编码序列，所述CAR靶向T细胞上的至少两个或三个选自以下的TCR Vbeta区：Vb 1、Vb 2、Vb 3、Vb 5.1、Vb 7.1、Vb 8、Vb 12、Vb 13.1、Vb 17和Vb 20。
[0927] 19.根据第16至18条中任一条所述的构建体，其中所述CAR对包含基本上如SEQ ID No：2所示的氨基酸序列或其变体或其片段的TCR Vbeta区(优选TCR‑Vbeta 7.1链)具有特异性。
[0928] 20.根据第16至19条中任一条所述的构建体，其中：
[0929] (i)所述第一编码序列包含编码基本上如SEQ ID No：12所示的氨基酸序列的核苷酸序列或其片段或变体；
[0930] (ii)所述第一编码序列包含基本上如SEQ ID No：13所示的核苷酸序列或其片段或变体；
[0931] (iii)所述第一编码序列包含编码基本上如SEQ ID No：34所示的氨基酸序列的核苷酸序列或其片段或变体；和/或
[0932] (iv)所述第一编码序列包含基本上如SEQ ID No：35所示的核苷酸序列或其片段或变体。
[0933] 21.根据第12至20条中任一条所述的构建体，其中所述构建体包含编码CD8a铰链和跨膜(TM)结构域的核苷酸序列，任选地其中所述构建体包含编码基本上如SEQ ID No：14所示的氨基酸序列的核苷酸序列或其片段或变体，和/或其中所述构建体包含基本上如SEQ IDNo：15所示的核苷酸序列或其片段或变体。
[0934] 22.根据第12至21条中任一条所述的构建体，其中所述构建体包含编码胞内结构域的核苷酸序列，所述胞内结构域包含CD28的信号传导结构域、4‑1BB的信号传导结构域和/或CD3ζ链，其中更优选CD28的信号结构域、4‑1BB的信号结构域和CD3ζ链。
[0935] 23.根据第22条所述的构建体，其中：
[0936] (i)所述构建体包含编码基本上如SEQ ID No：16所示的氨基酸序列的核苷酸序列或其片段或变体；
[0937] (ii)所述构建体包含基本上如SEQ ID No：17所示的核苷酸序列或其片段或变体；
[0938] (iii)所述构建体包含编码基本上如SEQ ID No：18所示的氨基酸序列的核苷酸序列或其片段或变体；
[0939] (iv)所述构建体包含基本上如SEQ ID No：19所示的核苷酸序列或其片段或变体；
[0940] (v)所述构建体包含编码基本上如SEQ ID No：20所示的氨基酸序列的核苷酸序列或其片段或变体；和/或
[0941] (vi)所述构建体包含基本上如SEQ ID No：21所示的核苷酸序列或其片段或变体。
[0942] 24.根据第12至23条中任一条所述的构建体，其中所述核酸构建体包含第二编码序列，所述第二编码序列编码至少一种自杀蛋白，更优选至少两种自杀蛋白。
[0943] 25.根据第24条所述的构建体，其中所述第二编码序列编码：(i)表皮生长因子受体(EGFR)或截短的表皮生长因子受体(tEGFR)；和/或(ii)诱导型半胱天冬酶9(iC9)。
[0944] 26.根据第25条所述的构建体，其中：
[0945] (i)所述构建体包含编码基本上如SEQ ID No：22所示的氨基酸序列的核苷酸序列或其片段或变体，任选地其中所述构建体包含基本上如SEQ ID No：23所示的核苷酸序列或其片段或变体；和/或
[0946] (ii)所述构建体包含编码基本上如SEQ ID No：24中所示的氨基酸序列的核苷酸序列或其片段或变体，任选地其中所述构建体包含基本上如SEQ ID No：25所示的核苷酸序列或其片段或变体。
[0947] 27.根据第12至26条中任一条所述的构建体，其中所述构建体包含编码基本上如SEQ IDNo：29所示的氨基酸序列的核苷酸序列或其片段或变体，任选地其中所述构建体包含基本上如SEQ ID No：30所示的核苷酸序列或其片段或变体。
[0948] 28.根据第12至26条中任一条所述的构建体，其中所述构建体包含编码基本上如SEQ IDNo：31所示的氨基酸序列的核苷酸序列或其片段或变体，任选地其中所述构建体包含基本上如SEQ ID No：32所示的核苷酸序列或其片段或变体。
[0949] 29.一种表达载体，其编码根据第12至28条中任一条所述的核酸构建体，任选地其中所述载体包含基本上如SEQ ID No：33或SEQ ID No：36所示的核酸序列或其片段或变体。
[0950] 30.一种分离MAIT细胞的方法，所述方法包括：
[0951] (i)提供外周血单核细胞(PBMC)；和
[0952] (ii)对PBMC进行磁激活细胞分选(MACS)和/或荧光激活细胞分选(FACS)以从中分离MAIT细胞。
[0953] 31.一种产生CAR‑MAIT细胞的方法，所述方法包括：
[0954] (i)提供外周血单核细胞(PBMC)；
[0955] (ii)对PBMC进行MACS和/或FACS以从中分离MAIT细胞；
[0956] (iii)激活分离的MAIT细胞，任选地通过使它们与抗CD3和/或抗CD28抗体接触；和[0957] (iv)用编码CAR的核酸转导激活的MAIT细胞，从而产生CAR‑MAIT细胞。
[0958] 32.根据第30条或第31条所述的方法，其中所述方法包括对PBMC进行MACS和FACS以从中分离MAIT细胞，任选地其中对PBMC进行MACS，然后进行FACS。
[0959] 33.根据第30至32条中任一条所述的方法，其中所述分离的MAIT细胞用抗CD3抗体和抗CD28抗体激活。
[0960] 34.根据第31至33条中任一条所述的方法，其中步骤(iv)包括用编码CAR的核酸通过病毒或逆转录病毒转导MAIT细胞，优选地其中所述核酸编码CAR，所述CAR靶向T细胞上的(i)CD4抗原，或(ii)至少一个或多个TCR Vbeta区，优选表1中所示的一个或多个TCR Vbeta区，或选自以下的T细胞上的一个或多个TCR Vbeta区：Vb 1、Vb 2、Vb 3、Vb 5.1、Vb 7.1、Vb 8、Vb 12、Vb 13.1、Vb 17和Vb 20。
[0961] 35.根据第30至43条中任一条所述的方法，其中所述MAIT细胞用根据第12至28条中任一条所述的核酸构建体或根据第29条所述的表达载体来转导。
[0962] 36.根据第30至35条中任一条所述的方法，其中所述方法包括在步骤(iv)之后的后续步骤中扩增CAR‑MAIT细胞。
[0963] 37.一种通过根据第30至36条中任一条所述的方法获得或可获得的CAR‑MAIT细胞。
[0964] 38.一种药物组合物，其包含根据第1至11条中任一条或第37条所述的MAIT细胞和药学上可接受的赋形剂。
[0965] 39.根据第1至11条中任一条或第37条所述的MAIT细胞或根据第38条所述的药物组合物用于治疗。
[0966] 40.根据第1至11条中任一条或第37条所述的MAIT细胞或根据第38条所述的药物组合物用于(i)免疫疗法；(ii)治疗、预防或改善癌症；(ii)治疗、预防或改善微生物感染；或(iv)治疗、预防或改善自身免疫性疾病。
[0967] 41.根据第1至11条中任一条或第37条所述的MAIT细胞或根据第38条所述的药物组合物用于根据第39条或第40条所述的用途，其中用于治疗、预防或改善T细胞恶性肿瘤，任选实体瘤或液态肿瘤。
[0968] 42.根据第1至11条中任一条或第37条所述的MAIT细胞或根据第38条所述的药物组合物用于根据第41条所述的用途，其中所述T细胞恶性肿瘤是外周T细胞淋巴瘤(PTCL)或皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)。
[0969] 43.根据第1至11条中任一条或第37条所述的MAIT细胞或根据第38条所述的药物组合物用于根据第41条所述的用途，其中：
[0970] (i)所述PTCL是选自下组的PTCL亚型：成人T细胞急性淋巴细胞性淋巴瘤或白血病(ATL)、肠病相关淋巴瘤、肝脾淋巴瘤、皮下脂膜炎样淋巴瘤(SPTCL)、前体T细胞急性淋巴细胞性淋巴瘤或白血病和血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤(AITL)；
[0971] (ii)所述CTCL是选自下组的CTCL亚型：蕈样肉芽肿(MF)、塞扎里综合征(SS)和CD4+小中型多形性T细胞淋巴增殖性疾病。
[0972] 44.根据第1至11条中任一条或第37条所述的MAIT细胞或根据第38条所述的药物组合物用于根据第40至43条中任一条所述的用途，其中用于治疗、预防或改善病毒感染(例如HIV、HBV、HTLV、EBV、HPV)、细菌感染(例如TB)或真菌感染，或者用于治疗、预防或改善自身免疫性疾病，例如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎或重症肌无力。
[0973] 45.根据第1至11条中任一条或第37条所述的MAIT细胞或根据第38条所述的药物组合物用于根据第40至44条中任一条所述的用途，其中所述用途包括触发编码自杀蛋白的序列，任选地其中所述方法包括向受试者施用抗EGFR抗体和/或半胱天冬酶诱导药物(CID)。
[0974] 46.一种制备根据第38条所述的药物组合物的方法，所述方法包括将治疗有效量的根据第1至1条中任一条或第37条所述的MAIT细胞与药学上可接受的赋形剂组合。

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