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用于扩增人粒细胞-巨噬细胞祖细胞的方法及其应用

申请号 CN202280031307.0 申请日 2022-05-18 公开(公告)号 CN117751182A 公开(公告)日 2024-03-22
申请人 南加利福尼亚大学; 发明人 应其龙; 郭政; 岳士; 泰·阮; 唐嘉琪; 张超;
摘要 本公开提供了用于长期扩增粒细胞‑巨噬细胞祖细胞的方法、由此生成的粒细胞‑巨噬细胞祖细胞以及其粒细胞‑巨噬细胞祖细胞的用途。
权利要求

1.一种用于扩增人粒细胞/巨噬细胞祖细胞(GMP)的群体的方法,包括:
在培养基中培养GMP,所述培养基包含:
(i)生长因子;
(ii)B‑Raf激酶抑制剂
(iii)抑制丝裂原活化激酶相互作用蛋白激酶1和2(Mnk1/2)的试剂
(iv)抑制PI3K通路的试剂;
(v)具有式I的结构的化合物:
其中,
1
R选自:
2
R选自:
3
R选自:
n是选自0、1、2、3、4和5的整数;
其中所述GMP在进行多次细胞传代和/或克隆扩增之后维持它们的形态特征。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述GMP衍生于或获得自人类干细胞。
3.根据权利要求2所述的方法,其中在培养之前或培养期间对所述人类干细胞进行基因工程化。
4.根据权利要求2所述的方法,其中所述人类干细胞为造血干细胞。
5.根据权利要求4所述的方法,其中所述造血干细胞与人类受试者的骨髓分离。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述培养基包含DMEM/F12和神经基础培养基。
7.根据权利要求6所述的方法,其中所述培养基包含比例为约5:1至约1:5的DMEM/F12和神经基础培养基。
8.根据权利要求7所述的方法,其中所述培养基包含比例为约1:1的DMEM/F12和神经基础培养基。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述培养基包含选自胰岛素、转蛋白、血清白蛋白(BSA)组分V、腐胺、亚硒酸钠、DL‑α生育酚、亚麻酸和/或亚油酸的一种或多种补充剂。
10.根据权利要求9所述的方法,其中所述培养基补充有胰岛素、转铁蛋白、BSA组分V、腐胺、亚硒酸钠、DL‑α生育酚和亚麻酸和/或亚油酸。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述生长因子为干细胞因子(SCF)。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述B‑Raf激酶抑制剂选自由以下项组成的组:GDC‑0879、PLX4032、GSK2118436、BMS‑908662、LGX818、PLX3603、RAF265、RO5185426、维罗非尼、PLX8394、SB590885及其任意组合。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述具有式I的结构的化合物选自:
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述抑制Mnk1/2的试剂选自由以下项组成的组:CGP‑57380、尾孢酰胺、BAY 1143269、托米沃色替(tomivosertib)、ETC‑206、SLV‑2436及其任意组合。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述抑制PI3K通路的试剂选自由以下项组成的组:3‑甲基腺嘌呤、LY294002、阿培利司、渥曼青霉素、槲皮素、hSMG‑1抑制剂
11j、赞得利司(zandelisib)、阿培利司盐酸盐、代拉里斯、布帕尼西、库潘尼西、IPI549、达克利司、匹替利司、SAR405、度维利塞、非美诺司他、GDC‑0077、PI‑103、YM‑20163、PF‑
04691502、塔色利司(taselisib)、奥米帕利司(omipalisib)、萨莫托利司(samotolisib)、异鼠李素、ZATK474、帕萨利司、瑞格色替、AZD8186、GSK2636771、地司特泰、TG100‑115、AS‑
605240、PI3K‑IN‑1、达克利司甲苯磺酸盐、吉达利塞、TGX‑221、厄布利塞、AZD 6482、色拉伯利司(serabelisib)、比米利司、阿托利司、α‑亚麻酸、Vps34‑PIK‑III、PIK‑93、Vps34‑IN‑1、CH5132799、莱尼利西布、沃克塔利司(voxtalisib)、GSK1059615、索诺利司(sonolisib)、PKI‑402、PI4KIIIβ‑IN‑9、HS‑173、BGT226来酸、匹替利司二甲烷磺酸盐、VS‑5584、IC‑
87114、二槲皮素、CNX‑1351、SF2523、GDC‑0326、司来利塞、阿卡利司(acalisib)、SAR‑
260301、ZAD‑8835、GNE‑317、AMG319、奈米利塞、IITZ‑01、PI‑103盐酸盐、木蝴蝶苷B、匹拉若利司(pilaralisib)、AS‑252424、二盐酸库潘尼西、AMG 511、地司特泰TFA、PIK‑90、泰那利塞、七叶苷原、CGS15943、GNE‑477、PI‑3065、A66、AZD3458、人参皂苷Rk1、槐根、布帕尼西盐酸盐、Vps34‑IN‑2、林普利塞、山金车内酯D、KP372‑1、CZC24832、PF‑4989216、(R)‑杜韦利西布、PQR530、P11δ‑IN‑1、厄布利塞盐酸盐、MTX‑211、PI3K/mTOR抑制剂‑2、LX2343、PF‑
04979064、瓜子金皂苷己、蓝萼甲素、NSC781406、MSC2360844、CAY10505、IPI‑3063、TG 
100713、BEBT‑908、PI‑828、布雷维亚酰胺F、ETP‑46321、PIK‑294、SRX3207、槐果碱水合物、AS‑604850、6,7,4'‑三羟基异黄、SKI V、WYE‑687、NVP‑QAV‑572、GNE‑493、CAL‑130氢氯化物、GS‑9901、BGT226、IHMT‑PI3Kδ‑372、PI3Kα‑IN‑4、帕萨利司盐酸盐、PF‑06843195、PI3K‑IN‑6、(S)‑PI3Kα‑IN‑4、PI3K(γ)‑IN‑8、BAY1082439、CYH33、PI3Kγ抑制剂2、PI3Kδ抑制剂
1、PARP/PI3K‑IN‑1、LAS191954、PI3K‑IN‑9、CHMFL‑PI3KD‑317、PI3K/HDAC‑IN‑1、MSC2360844半富马酸、PI3K‑IN‑2、PI3K/mTOR抑制剂‑1、PI3Kδ‑IN‑1、蔷薇酸、KU‑0060648、AZD 6482、WYE‑687二盐酸化物、GSK2292767、(R)‑厄布利塞、PIK‑293、艾代拉里斯D5、PIK‑
75、二芳庚烷(hirsutenone)、槲皮素D5、PIK‑108、hSMG‑1抑制剂11e、PI3K‑IN‑10、NVP‑BAG956、PI3Kγ抑制剂1、CAL‑130、ON 146040、PI3kδ抑制剂1、PI3Kα/mTOR‑IN‑1及其任意组合。
16.一种用于对粒细胞/巨噬细胞祖细胞(GMP)进行基因修饰的方法,包括:
通过使用基因编辑系统、同源重组或定点诱变,对通过前述权利要求中任一项所述的方法制备的GMP进行基因工程修饰。
17.根据权利要求16所述的方法,其中所述基因工程修饰包括替换或破坏现有基因(敲除),或改变基因位点以包含在所述基因位点未发现的序列信息(敲入)。
18.根据权利要求17所述的方法,其中所述GMP的所述基因工程修饰包括敲除SIRPα和/或PI3Kγ基因。
19.根据权利要求16至18中任一项所述的方法,还包括将所述GMP分化为巨噬细胞,包括:
用包含巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)的巨噬细胞分化培养基培养所述GMP。
20.根据权利要求19所述的方法,其中所述巨噬细胞分化培养基包含RPMI 1640、胎牛血清(FBS)和MCSF。
21.根据权利要求16至18中任一项所述的方法,还包括将所述GMP分化为粒细胞,包括:
用包含粒细胞集落刺激因子(GCSF)的粒细胞分化培养基培养所述GMP。
22.根据权利要求21所述的方法,其中所述粒细胞分化培养基包含RPMI 1640、FBS和GCSF。
23.一种用权利要求1至15中任一项所述的方法扩增的粒细胞/巨噬细胞祖细胞(GMP)的群体。
24.用权利要求16所述的方法制备的基因修饰的粒细胞/巨噬细胞祖细胞(GMP)。
25.用权利要求19或权利要求20所述的方法制备的巨噬细胞。
26.用权利要求21或权利要求22所述的方法制备的粒细胞。
27.一种具有式I的结构的化合物:
其中,
1
R选自:
2
R选自:
3
R选自:
n是选自0、1、2、3、4和5的整数。在又一实施例中,一种具有式I的结构的化合物不是
28.根据权利要求27所述的化合物,其中所述化合物具有选自由以下项组成的组的结构:
29.一种细胞培养基,其包含具有式I的结构的化合物:
其中,
1
R选自:
2
R选自:
3
R选自:
n是选自0、1、2、3、4和5的整数。在又一实施例中,一种具有式I的结构的化合物不是
30.根据权利要求29所述的细胞培养基,其中所述化合物具有选自由以下项组成的组的结构:

说明书全文

用于扩增人粒细胞‑巨噬细胞祖细胞的方法及其应用

[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请根据《美国法典》第35卷第119节要求2021年5月18日提交的临时申请序列号63/190,103的优先权,其公开内容通过引用并入本文。

技术领域

[0003] 本公开提供了用于扩增粒细胞‑巨噬细胞祖细胞的方法、由此生成的粒细胞‑巨噬细胞祖细胞以及其粒细胞‑巨噬细胞祖细胞的用途。

背景技术

[0004] 粒细胞、巨噬细胞和树突细胞是人类先天免疫系统的必要组分。它们是抵御病原体的第一线,并且还在维持我们的身体的体内平衡和预防包括感染、代谢疾病和癌症的各种疾病方面起到核心作用。这些细胞源自骨髓中常见的祖细胞,粒细胞‑巨噬细胞祖细胞(GMP)。发明内容
[0005] 本文提供了促进粒细胞/巨噬细胞祖细胞(GMP)的扩增的方法,例如GMP的长期克隆扩增。这些方法一般适用于生成来自任何数量的受试者来源的GMP的长期克隆扩增,包括来自小鼠、大鼠、人类等。在一些实施例中,通过本公开的方法生成的GMP的多个优势之一在于GMP易受基因修饰技术的影响,从而允许将GMP用于基础科学研究和临床治疗应用。因此,扩增并基因修饰的GMP可以很容易地转化为广泛的临床应用。例如,人类GMP可以被基因修饰,从而它们分化成巨噬细胞(例如,敲除SIRPα和/或PI3Kγ基因)。这些工程化的巨噬细胞可以或者期望具有强化的肿瘤效果,并且可以临床用于治疗癌症,无论作为单一疗法还是与其他免疫药剂的组合疗法,例如抗PD‑1/PD‑L1抗体和嵌合抗原受体T(CAR‑T)细胞。另外,体外扩增的人类GMP可以轻松用于输液或移植以治疗由例如化疗、放疗等引起的中性粒细胞减少症。这种体外扩增的GMP可以是受试者自体或异体的。
[0006] 本公开提供了一种用于在培养基中扩增粒细胞/巨噬细胞祖细胞(GMP)的群体的方法,培养基包含:(i)生长因子;(ii)B‑Raf激酶抑制剂;和(iii)具有式I的结构的化合物:
[0007]
[0008] 其中,R1选自:2
R 选自:
3
R 选自:
n是选自0、1、2、3、4和5的整数;
[0009] 其中GMP在进行多次细胞传代和/或克隆扩增之后基本保持形态不变。在一个实施例中,GMP衍生于或获得自干细胞。在又一实施例中,在培养之前或培养期间对干细胞进行基因工程化。在又一个或进一步的实施例中,干细胞为造血干细胞。在又一个或进一步的实施例中,造血干细胞与受试者的骨髓分离。在进一步的实施例中,受试者是哺乳动物受试者。在又一个或进一步的实施例中,受试者是人类、大鼠或小鼠。在又一个或进一步的实施例中,培养基包括DMEM/F12和神经基础培养基。在又一个或进一步的实施例中,培养基包含比例为约5:1至约1:5的DMEM/F12和神经基础培养基。在又一个或进一步的实施例中,培养基包含比例为约1:1的DMEM/F12和神经基础培养基。在又一个或进一步的实施例中,培养基包含选自胰岛素、转蛋白、BSA组分V、腐胺、亚硒酸钠、DL‑α生育酚、亚麻酸和/或亚油酸的一种或多种补充剂。在又一个或进一步的实施例中,培养基补充有胰岛素、转铁蛋白、BSA组分V、腐胺、亚硒酸钠、DL‑α生育酚和亚麻酸和/或亚油酸。在某一实施例中,具有式I的结构的化合物选自:
[0010]
[0011]
[0012]
[0013]
[0014] 在任一前述实施例中的又一实施例中,抑制丝裂原活化蛋白激酶相互作用蛋白激酶1和2(Mnk1/2)的一种或多种试剂选自CGP‑57380、尾孢酰胺、BAY 1143269、托米沃色替(tomivosertib)、ETC‑206、SLV‑2436及其任意组合。在又一个或进一步的实施例中,抑制PI3K通路的一种或多种试剂选自3‑甲基腺嘌呤、LY294002、阿培利司、渥曼青霉素、槲皮素、hSMG‑1抑制剂11j、赞得利司(zandelisib)、阿培利司盐酸盐、代拉里斯、布帕尼西、库潘尼西、IPI549、达克利司、匹替利司、SAR405、度维利塞、非美诺司他、GDC‑0077、PI‑103、YM‑20163、PF‑04691502、塔色利司(taselisib)、奥米帕利司(omipalisib)、萨莫托利司(samotolisib)、异鼠李素、ZATK474、帕萨利司、瑞格色替、AZD8186、GSK2636771、地司特泰、TG100‑115、AS‑605240、PI3K‑IN‑1、达克利司甲苯磺酸盐、吉达利塞、TGX‑221、厄布利塞、AZD 6482、色拉伯利司(serabelisib)、比米利司、阿托利司、α‑亚麻酸、Vps34‑PIK‑III、PIK‑93、Vps34‑IN‑1、CH5132799、莱尼利西布、沃克塔利司(voxtalisib)、GSK1059615、索诺利司(sonolisib)、PKI‑402、PI4KIIIβ‑IN‑9、HS‑173、BGT226来酸、匹替利司二甲烷磺酸盐、VS‑5584、IC‑87114、二槲皮素、CNX‑1351、SF2523、GDC‑0326、司来利塞、阿卡利司(acalisib)、SAR‑260301、ZAD‑8835、GNE‑317、AMG319、奈米利塞、IITZ‑01、PI‑103盐酸盐、木蝴蝶苷B、匹拉若利司(pilaralisib)、AS‑
252424、二盐酸库潘尼西、AMG 511、地司特泰TFA、PIK‑90、泰那利塞、七叶苷原、CGS15943、GNE‑477、PI‑3065、A66、AZD3458、人参皂苷Rk1、槐根、布帕尼西盐酸盐、Vps34‑IN‑2、林普利塞、山金车内酯D、KP372‑1、CZC24832、PF‑4989216、(R)‑杜韦利西布、PQR530、P11δ‑IN‑1、厄布利塞盐酸盐、MTX‑211、PI3K/mTOR抑制剂‑2、LX2343、PF‑04979064、瓜子金皂苷己、蓝萼甲素、NSC781406、MSC2360844、CAY10505、IPI‑3063、TG 100713、BEBT‑908、PI‑828、布雷维亚酰胺F、ETP‑46321、PIK‑294、SRX3207、槐果碱水合物、AS‑604850、6,7,4'‑三羟基异黄、SKI V、WYE‑687、NVP‑QAV‑572、GNE‑493、CAL‑130氢氯化物、GS‑9901、BGT226、IHMT‑PI3Kδ‑
372、PI3Kα‑IN‑4、帕萨利司盐酸盐、PF‑06843195、PI3K‑IN‑6、(S)‑PI3Kα‑IN‑4、PI3K(γ)‑IN‑8、BAY1082439、CYH33、PI3Kγ抑制剂2、PI3Kδ抑制剂1、PARP/PI3K‑IN‑1、LAS191954、PI3K‑IN‑9、CHMFL‑PI3KD‑317、PI3K/HDAC‑IN‑1、MSC2360844半富马酸、PI3K‑IN‑2、PI3K/mTOR抑制剂‑1、PI3Kδ‑IN‑1、蔷薇酸、KU‑0060648、AZD 6482、WYE‑687二盐酸化物、GSK2292767、(R)‑厄布利塞、PIK‑293、艾代拉里斯D5、PIK‑75、二芳庚烷(hirsutenone)、槲皮素D5、PIK‑108、hSMG‑1抑制剂11e、PI3K‑IN‑10、NVP‑BAG956、PI3Kγ抑制剂1、CAL‑130、ON 
146040、PI3kδ抑制剂1、PI3Kα/mTOR‑IN‑1及其任意组合。在又一个或进一步的实施例中,生长因子为干细胞因子(SCF)。在又一个或进一步的实施例中,B‑Raf激酶抑制剂选自GDC‑
0879、PLX4032、GSK2118436、BMS‑908662、LGX818、PLX3603、RAF265、RO5185426、维罗非尼、PLX8394、SB590885及其任意组合。在又一个或进一步的实施例中,B‑Raf激酶抑制剂为GDC‑
0879。在又一个或进一步的实施例中,GMP具有小、圆形和/或非粘连的均匀形态。
[0015] 本公开提供了一种用于在培养基中扩增粒细胞/巨噬细胞祖细胞(GMP)的群体的方法,培养基包含:(i)生长因子;(ii)B‑Raf激酶抑制剂;(iii)抑制丝裂原活化激酶相互作用蛋白激酶1和2(Mnk1/2)的试剂;(iv)抑制PI3K通路的试剂;(v)可选地,一个或多个血清组分;和(vi)具有式I的结构的化合物:
[0016]
[0017] 其中,R1选自:2
R 选自:
3
R 选自:
n是选自0、1、2、3、4和5的整数;
[0018] 其中GMP在进行多次细胞传代和/或克隆扩增之后基本保持形态不变。在一个实施例中,GMP衍生于或获得自干细胞。在又一实施例中,在培养之前或培养期间对干细胞进行基因工程化。在又一个或进一步的实施例中,干细胞为造血干细胞。在又一个或进一步的实施例中,造血干细胞与受试者的骨髓分离。在进一步的实施例中,受试者是哺乳动物受试者。在又一个或进一步的实施例中,受试者是人类、大鼠或小鼠。在又一个或进一步的实施例中,培养基包括DMEM/F12和神经基础培养基。在又一个或进一步的实施例中,培养基包含比例为约5:1至约1:5的DMEM/F12和神经基础培养基。在又一个或进一步的实施例中,培养基包含比例为约1:1的DMEM/F12和神经基础培养基。在又一个或进一步的实施例中,培养基包含选自胰岛素、转铁蛋白、BSA组分V、腐胺、亚硒酸钠、DL‑α生育酚、亚麻酸和/或亚油酸的一种或多种补充剂。在又一个或进一步的实施例中,培养基补充有胰岛素、转铁蛋白、BSA组分V、腐胺、亚硒酸钠、DL‑α生育酚和亚麻酸和/或亚油酸。在某一实施例中,具有式I的结构的化合物选自:
[0019]
[0020]
[0021]
[0022]
[0023] 在任一前述实施例中的又一实施例中,抑制丝裂原活化蛋白激酶相互作用蛋白激酶1和2(Mnk1/2)的一种或多种试剂选自CGP‑57380、尾孢酰胺、BAY 1143269、托米沃色替(tomivosertib)、ETC‑206、SLV‑2436及其任意组合。在又一个或进一步的实施例中,抑制PI3K通路的一种或多种试剂选自3‑甲基腺嘌呤、LY294002、阿培利司、渥曼青霉素、槲皮素、hSMG‑1抑制剂11j、赞得利司(zandelisib)、阿培利司盐酸盐、艾代拉里斯、布帕尼西、库潘尼西、IPI549、达克利司、匹替利司、SAR405、度维利塞、非美诺司他、GDC‑0077、PI‑103、YM‑20163、PF‑04691502、塔色利司(taselisib)、奥米帕利司(omipalisib)、萨莫托利司(samotolisib)、异鼠李素、ZATK474、帕萨利司、瑞格色替、AZD8186、GSK2636771、地司特泰、TG100‑115、AS‑605240、PI3K‑IN‑1、达克利司甲苯磺酸盐、吉达利塞、TGX‑221、厄布利塞、AZD 6482、色拉伯利司(serabelisib)、比米利司、阿托利司、α‑亚麻酸、Vps34‑PIK‑III、PIK‑93、Vps34‑IN‑1、CH5132799、莱尼利西布、沃克塔利司(voxtalisib)、GSK1059615、索诺利司(sonolisib)、PKI‑402、PI4KIIIβ‑IN‑9、HS‑173、BGT226马来酸、匹替利司二甲烷磺酸盐、VS‑5584、IC‑87114、二水槲皮素、CNX‑1351、SF2523、GDC‑0326、司来利塞、阿卡利司(acalisib)、SAR‑260301、ZAD‑8835、GNE‑317、AMG319、奈米利塞、IITZ‑01、PI‑103盐酸盐、木蝴蝶苷B、匹拉若利司(pilaralisib)、AS‑
252424、二盐酸库潘尼西、AMG 511、地司特泰TFA、PIK‑90、泰那利塞、七叶苷原、CGS15943、GNE‑477、PI‑3065、A66、AZD3458、人参皂苷Rk1、槐根碱、布帕尼西盐酸盐、Vps34‑IN‑2、林普利塞、山金车内酯D、KP372‑1、CZC24832、PF‑4989216、(R)‑杜韦利西布、PQR530、P11δ‑IN‑1、厄布利塞盐酸盐、MTX‑211、PI3K/mTOR抑制剂‑2、LX2343、PF‑04979064、瓜子金皂苷己、蓝萼甲素、NSC781406、MSC2360844、CAY10505、IPI‑3063、TG 100713、BEBT‑908、PI‑828、布雷维亚酰胺F、ETP‑46321、PIK‑294、SRX3207、槐果碱水合物、AS‑604850、6,7,4'‑三羟基异黄酮、SKI V、WYE‑687、NVP‑QAV‑572、GNE‑493、CAL‑130氢氯化物、GS‑9901、BGT226、IHMT‑PI3Kδ‑
372、PI3Kα‑IN‑4、帕萨利司盐酸盐、PF‑06843195、PI3K‑IN‑6、(S)‑PI3Kα‑IN‑4、PI3K(γ)‑IN‑8、BAY1082439、CYH33、PI3Kγ抑制剂2、PI3Kδ抑制剂1、PARP/PI3K‑IN‑1、LAS191954、PI3K‑IN‑9、CHMFL‑PI3KD‑317、PI3K/HDAC‑IN‑1、MSC2360844半富马酸、PI3K‑IN‑2、PI3K/mTOR抑制剂‑1、PI3Kδ‑IN‑1、蔷薇酸、KU‑0060648、AZD 6482、WYE‑687二盐酸化物、GSK2292767、(R)‑厄布利塞、PIK‑293、艾代拉里斯D5、PIK‑75、二芳庚烷(hirsutenone)、槲皮素D5、PIK‑108、hSMG‑1抑制剂11e、PI3K‑IN‑10、NVP‑BAG956、PI3Kγ抑制剂1、CAL‑130、ON 
146040、PI3kδ抑制剂1、PI3Kα/mTOR‑IN‑1及其任意组合。在又一个或进一步的实施例中,生长因子为干细胞因子(SCF)。在又一个或进一步的实施例中,B‑Raf激酶抑制剂选自GDC‑
0879、PLX4032、GSK2118436、BMS‑908662、LGX818、PLX3603、RAF265、RO5185426、维罗非尼、PLX8394、SB590885及其任意组合。在又一个或进一步的实施例中,B‑Raf激酶抑制剂为GDC‑
0879。在又一个或进一步的实施例中,GMP具有小、圆形和/或非粘连的均匀形态。
[0024] 本公开还提供了一种用于对粒细胞/巨噬细胞祖细胞(GMP)进行基因修饰的方法,包括:通过使用基因编辑系统、同源重组或定点诱变,对通过任一前述方法制备的GMP进行基因工程修饰。在一个实施例中,基因编辑系统为基于TALEN或CRISPR的系统。在又一个或进一步的实施例中,基因工程修饰包括替换或破坏现有基因(敲除),或改变基因位点以包含在基因位点未发现的序列信息(敲入)。在又一个或进一步的实施例中,GMP的基因工程修饰包括敲除SIRPα和/或PI3Kγ基因。在任一前述实施例中的另一实施例中,该方法还包括将GMP分化为巨噬细胞,包括:用包含巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)的巨噬细胞分化培养基培养GMP。在一个实施例中,巨噬细胞分化培养基包含RPMI 1640、胎血清(FBS)和MCSF。在又一个或进一步的实施例中,分化培养基包含RPMI 1640、10%FBS和20ng/mL的MCSF。在任一前述实施例中的又一个或进一步的实施例中,该方法还包括将GMP分化为粒细胞,包括:用包含粒细胞集落刺激因子(GCSF)的粒细胞分化培养基培养GMP。在又一个或进一步的实施例中,粒细胞分化培养基包含RPMI 1640、FBS和GCSF。在又一个或进一步的实施例中,粒细胞分化培养基包含RPMI 1640、10%FBS和20ng/mL的GCSF。
[0025] 本公开还提供了通过本公开的方法扩增的粒细胞/巨噬细胞祖细胞(GMP)的群体。
[0026] 本公开还提供了通过本公开的方法制备的基因修饰的粒细胞/巨噬细胞祖细胞(GMP)。
[0027] 本公开提供了通过本公开的方法制备的巨噬细胞。
[0028] 本公开提供了通过本公开的方法制备的粒细胞。
[0029] 本公开还提供了包含有效量的通过本文公开的方法制备的GMP群体、基因修饰的GMP、巨噬细胞或粒细胞的药物组合物以及可药用的载体或赋形剂。
[0030] 本公开还提供了一种用于治疗或预防有需要的受试者的疾病或病症的方法,该方法包括施用给所述受试者有效量的通过本公开的方法制备的GMP群体、基因修饰的GMP、巨噬细胞或粒细胞以及可药用的载体或赋形剂。
[0031] 本公开还提供了有效量的本公开的GMP群体、基因修饰的GMP、巨噬细胞或粒细胞在制造用于治疗或预防有需要的受试者的疾病或病症的药剂中的用途。附图说明
[0032] 图1提供了本公开的示例性化合物,所述化合物可以用于本公开的用于扩增人粒细胞‑巨噬细胞祖细胞的方法及其应用。
[0033] 图2示出了从人iPSC生成和扩增GMP的总体策略。
[0034] 图3A‑G示出了小鼠骨髓源干细胞的长期体外扩增的限定条件的开发。(A)用于识别可以促进小鼠骨髓源干细胞的扩增的生长因子和小分子的实验设计的示意图。(B)在补充有指示的小分子抑制剂的N2B27中培养7天的小鼠骨髓细胞的代表性相衬图像。(C)在补充有SCF加上GDC0879或SB590885的N2B27中培养3代的小鼠骨髓细胞的代表性相衬图像。5
(D)细胞生长曲线。从C57BL/6J小鼠分离的骨髓细胞以2×10个细胞/孔的密度接种到24孔板中并且在补充有指示的小分子/生长因子的B7培养基中培养。对细胞计数并每3天进行传代。数据表示为来自三次独立实验的均值±SD。(E)从C57BL/6J小鼠分离的骨髓细胞在补充有SCF/2i的B7培养基中培养。每3天进行细胞传代。代表性相衬图像示出了不同代的SCF/2i细胞。(F)使用GWT显带法对SCF/2i细胞的细胞遗传学分析。从母C57BL/6J小鼠分离的骨髓细胞在用于细胞遗传学分析之前在SCF/2i中扩增8代。在检查的21个中期中,所有中期都具有正常的40,XX核型。(G)在补充有SCF/2i的B7培养基中扩增期间各个骨髓细胞的连续图像。SCF/2i扩增的骨髓细胞以50个细胞/孔的密度接种到96孔板中并在SCF/2i中培养。每24小时使用Keyence BZ‑X710显微镜拍摄连续图像。第4天每孔形成15.7±4.0个集落(n=3×
96)。数据表示为来自三次独立实验的均值±SD。
[0035] 图4A‑D提供了SCF/2i扩增的细胞的特征。(A)示出SCF/2i扩增的细胞(第3代)中指示的标志物的表达模式的代表性流式细胞术直方图。填充蓝色的直方图,同型对照;填充红色的直方图,抗体染色。(B)SCF/2i扩增的细胞(第3代)和刚刚从成年C57BL/6J小鼠骨髓中分选的指示的细胞类型中基因表达的t‑SNE分析。(C)示出SCF/2i扩增的细胞和5个原代细胞类型中不同的基因表达谱的热图分析。(D)示出谱系标记基因的表达的scRNA‑seq的小提琴图。Fcgr2b、Spi1和Cebpa为GMP的标志物;Ly6a为HSC的标志物;Ly6d为CLP的标志物;Epor为MEP的标志物。
[0036] 图5A‑G展示了SCF/2i GMP可以在体外高效分化成巨噬细胞和粒细胞。(A)用M‑CSF治疗7天后从SCF/2i GMP分化的细胞中CD11b和F4/80表达的免疫荧光和流式细胞术分析。流式细胞术数据表示为来自三次独立实验的均值±SD。(B)用500ng/ml LPS刺激6小时的骨髓(BM)和SCF/2iGMP源巨噬细胞中细胞因子分泌的ELISA分析。数据表示为来自三次独立实验的均值±SD。(C)通过用FITC标记的乳胶珠孵育1小时对SCF/2i GMP源巨噬细胞的吞噬作用分析。上图,代表性荧光图像(绿色,FITC标记的珠;蓝色,巨噬细胞核)。下图,用(红色)或不用(蓝色)FITC标记的乳胶珠孵育的SCF/2i GMP源巨噬细胞的流式细胞术分析。流式细胞术数据表示为来自三次独立实验的均值±SD。(D)用GFP标记的大肠杆菌孵育的tdTomato阳性SCF/2i GMP源巨噬细胞的延时图像。图像上的数字指示以分钟计的时间。箭和箭头指示被巨噬细胞吞噬的细菌。(E)用PBS或G‑CSF治疗3天的SCF/2i GMP的吉姆萨染色(上图)和流式细胞术分析(下图)。流式细胞术数据表示为均值±SD(n=5)。(F)用500ng/ml LPS刺激6小时(用于ELISA测定)或100nM PMA刺激2小时(用于MPO测定)的所指示的细胞中的细胞因子分泌和MPO活性测量的ELISA分析。数据表示为来自三次独立实验的均值±SD。Ctrl,没有治疗控制;ns,不显著。(G)SCF/2i GMP和刚刚从小鼠骨髓分选的GMP的单细胞集落形成测定。图像示出接种后7天由单个SCF/2i GMP形成的代表性集落(M,仅有巨噬细胞的集落;G,仅有粒细胞的集落;GM,粒细胞/巨噬细胞集落)。直方图示出了每个集落类型的百分比。每组共统计了来自三个独立实验的192x3个孔。SCF/2i和分选的GMP组的每个实验形成的平均集落数分别为110±8.66和96±5.57。数据表示为均值±SD。
[0037] 图6A‑E示出了SCF/2i GMP在移植后分化成功能粒细胞和巨噬细胞。(A)从每只小7
鼠移植1x10个tdTomato阳性SCF/2i GMP的C57BL/6小鼠采集的外周血样本的流式细胞术+ ‑ + + +
分析的代表性图。G,粒细胞(CD11bCD115Ly6G);M,巨噬细胞(CD11bCD115)。(B)从移植
7
1x10个tdTomato阳性SCF/2i GMP 4天后的亚致死辐照的小鼠采集的外周血样本的流式细胞术分析的代表性图。数据表示为均值±SD(n=3只小鼠)。(C)用抗F4/80和抗tdToamto抗体对肝组织切片进行免疫染色。肝组织从移植tdTomato阳性SCF/2i GMP 7天后的小鼠中分离。箭头指示F4/80和tdTomato双阳性细胞。(D)从移植tdTomato阳性SCF/2i GMP 4天后并腹腔注射(IP)PBS或1ml的2%生物凝胶的C57BL/6小鼠采集的腹膜巨噬细胞的荧光图像和流式细胞术分析。流式细胞术数据表示为来自三次独立实验的均值±SD。(E)从每只小鼠移
7
植1x10个tdTomato阳性SCF/2i GMP一天后的C57BL/6小鼠采集的骨髓和脾细胞的流式细胞术分析。数据表示为均值±SD(n=3只小鼠)。M,巨噬细胞;G,粒细胞。
[0038] 图7A‑F展示了SCF/2i扩增的GMP在细菌感染的小鼠模型中取得疗效。(A)示出辐照、SCF/2iGMP移植和细菌接种的时间线的示意图。(B‑D)CGD小鼠在指示的时间点(A)经由尾静脉注射PBS或SCF/2i GMP并用金黄色葡萄球菌攻击。细菌接种7天后处死小鼠。(B)统计了肝脓肿的数量,(C)测量了脾肿的重量,(D)计算了小鼠的存活率(n=每组10只小鼠)。(E)接种洋葱伯克霍尔德氏菌并移植SCF/2i GMP的CGD小鼠的存活率(n=每组10只小鼠)。
(F)来自接种洋葱伯克霍尔德氏菌并移植SCF/2i GMP或PBS的CGD小鼠的血液样本的采集和接种。从接种洋葱伯克霍尔德氏菌7天后的每只CGD小鼠采集50μl的血液样本,并将其接种在10cm琼脂板上并在37℃下孵育16小时。左边,血液培养的代表性图像。右边,细菌的集落形成单位(CFU)的定量。
[0039] 图8A‑H示出了人GMP的扩增、分化和基因工程化。(A)人GMP的生长曲线。人GMP为从5
脐带血分选的FACS,并在指定条件下培养。每3天进行细胞传代并以1×10个细胞/孔的密度重新接种到12孔板中。数据表示为来自三次独立实验的均值±SD。(B)TN‑2‑30的结构。
(C)在修饰的SCF/2i中培养的人GMP的代表性相衬图像。P,传代次数。(D)分选的人GMP在修饰的SCF/2i中扩增并通过用30ng/ml人G‑CSF处理10天而诱导分化为粒细胞。分化的细胞利用吉姆萨染色(上图)和流式细胞术(下图)分析。流式细胞术数据表示为来自三次独立实验的均值±SD。(E)用或不用PMA刺激2小时的人GMP和人GMP源粒细胞的相对MPO活性。(D)中生
4
成的分化细胞以2×10 个细胞/孔的密度接种到96孔板中并用或不用PMA刺激2小时,之后测量上清中的MPO活性。数据表示为来自三次独立实验的均值±SD。(F)从体外扩增的人GMP分化的细胞中的人巨噬细胞标志物CD68和CD14的表达的免疫荧光和流式细胞术分析。通过在补充有20ng/ml的人M‑CSF的DMEM/10%FBS中培养10天,人GMP被诱导分化为巨噬细胞。流式细胞术数据表示为来自三次独立实验的均值±SD。(G)通过用GFP标记的大肠杆菌孵育一小时对人GMP源巨噬细胞的吞噬作用分析。示出由巨噬细胞吞噬的GFP标记的细菌的代表性相衬和荧光图像和用(红色)或不用(蓝色)GFP标记的细菌孵育的人GMP源巨噬细胞的流式细胞术分析的代表性图。流式细胞术数据表示为来自三次独立实验的均值±SD。(H)(D)和
4
(F)中生成的分化细胞以2×10 个细胞/孔的密度接种到96孔板中并用或不用500ng/ml的LPS刺激6小时,之后用ELISA测量上清中的细胞因子分泌。数据表示为来自三次独立实验的均值±SD。

具体实施方式

[0040] 如本文和所附权利要求中所用,单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数引用,除非上下文另有明确规定。因此,例如,对“一个细胞”的引用包括多个细胞,并且对“粒细胞‑巨噬细胞祖细胞”的引用包括对本领域技术人员已知的一个或多个粒细胞‑巨噬细胞祖细胞及其等同物的引用,等等。
[0041] 同样,“或”的使用指的是“和/或”,除非另有说明。类似地,“包括”、“包含”、“组成”、“含有”、“具有”、“构成”是可互换的,而不是限制性的。
[0042] 还应理解,在各种实施例的描述使用术语“包括”的情况下,本领域技术人员将理解,在一些特定实例下,可以使用“基本上由......组成”或“由......组成”的语言来替代地描述实施例。
[0043] 除非另有定义,否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管许多方法和试剂与本文所述的方法和试剂相似或等效,但本文公开了示例性方法和材料。
[0044] 为了描述和公开可结合本文描述使用的方法,本文中提及的所有出版物通过引用全部并入本文。此外,对于一份或多份出版物中提出的与本公开中明确定义的术语相似或相同的任何术语,本公开中明文规定的术语定义将在所有方面起控制作用。
[0045] 应当理解,本发明不限于本文所述的特定方法、方案和试剂等,因此可以变化。本文使用的术语仅用于描述特定实施例的目的,而不旨在限制仅由权利要求限定的本发明的范围。
[0046] 除了在操作示例中,或在另有指示的情况下,本文中使用的所有表示成分量或反应条件的数字在所有情况下都应理解为用术语“大约”修改。术语“大约”在用于描述本发明时,与百分比有关,是指±1%。术语“大约”包括预期在实验误差范围内的量或比率。
[0047] 如本文所用,术语“施用”是指通过导致药剂至少部分定位在所需位点的方法或途径将本文所公开的药剂(例如,工程化GMP或衍生自其的巨噬细胞或粒细胞)放置到受试者中。
[0048] 如本文所用的“自体细胞”是指衍生自同一个体的细胞,这些细胞稍后将被再次施用给该个体。
[0049] “B‑Raf激酶抑制剂”是指一种物质,例如化合物或分子,其阻断或降低一种名为B‑Raf激酶的蛋白的活性,或降低B‑Raf激酶的量。B‑Raf是一种激酶,有助于控制细胞生长和信号传导。在一些类型的癌症中,包括黑素瘤和结直肠癌,它可能以突变(改变)的形式被发现。一些B‑Raf激酶抑制剂用于治疗癌症。B‑Raf激酶抑制剂的示例包括但不限于GDC‑0879、PLX4032、GSK2118436、BMS‑908662、LGX818、PLX3603、RAF265、RO5185426、维罗非尼、PLX8394和SB590885。在特定实施例中,本文公开的方法包括使用B‑Raf激酶抑制剂GDC‑0879。
[0050] 如本文所用的术语“有效量”或“治疗有效量”是指包含减少疾病或失调的至少一种或多种症状的GMP(或衍生自其的巨噬细胞或粒细胞)的组合物的量,并且涉及提供所需效果的足够量的组合物。如本文所用的短语“治疗有效量”是指以适用于任何医疗的合理收益/险比来治疗失调的足够量的组合物。
[0051] 在某些实例中,症状的治疗或预防性显著减少包括相比对照或未治疗的受试者或受试者在施用本文所述的细胞组合物之前的状态所测量的参数增加、增强或升高了例如至少约10%、至少约20%、至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约100%、至少约125%、至少约150%或更多。在一些实例中,症状的治疗或预防性显著减少包括相比对照或未治疗的受试者或受试者在施用本文所述的细胞组合物之前的状态所测量的参数降低、阻碍或抑制例如至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%或更多。测量或可测量的参数包括临床上可检测的疾病标志物,例如生物标志物的升高或降低水平。所需的确切数量将因受试者的治疗疾病类型、性别、年龄和体重等因素而异。
[0052] “粒细胞集落刺激因子”或“GCSF”(也称为集落刺激因素3(CSF 3))是一种糖蛋白,其刺激骨髓产生粒细胞和干细胞。跨各种物种的基因序列、蛋白质序列和直向同源物是本领域已知的(参见,例如,NCBI参考序列:NP_000750.1,其通过引用并入本文)。
[0053] “生长因子”是指对促进细胞生长、细胞增殖或细胞分化(例如干细胞)有效的物质,例如化合物或分子,并且除非添加到培养基中作为补充剂,否则不属于基础培养基的组分。生长因子包括但不限于干细胞因子(SCF)、碱性纤维细胞生长因子(bFGF)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、表皮生长因子(EGF)、胰岛素状生长因子I(IGF‑I)、胰岛素状生长因子II(IGF‑II)、血小板衍生生长因子AB(PDGF)和血管内皮细胞生长因子(VEGF)、激活素A、Wnt和骨形态发生蛋白(BMP)、胰岛素、细胞因子、趋化因子、形态发生素、中和抗体、其他蛋白质和小分子。外源生长因子也可以添加到根据本公开的培养基中,以帮助将GMP的培养物维持在基本上未分化的状态。这些因子及其有效浓度可以如本文其他地方所述或使用培养细胞领域技术人员已知的技术来鉴定。在特定实施例中,GMP在包含SCF的培养基中培养。
[0054] 如本文所用的术语“分离的”是指基本上不含其通常相关的其他材料的分子、生物制品、细胞或细胞材料。在一个方面,术语“分离的”是指分别与存在于天然来源中的其他DNA或RNA,或蛋白质或多肽,或细胞或细胞器分离的核酸,如DNA或RNA,或蛋白质或多肽(例如抗体或其衍生物),或细胞或细胞器。术语“分离的”还指通过重组DNA技术生产时基本上不含细胞物质、病毒物质或培养基的核酸或肽,或化学合成时基本上无化学前体或其他化学物质的核酸或肽。此外,“分离的核酸”是指包括不是以片段的形式自然存在的、在自然状态下不会发现的核酸片段。术语“分离的”在本文中也用于指从其他细胞蛋白质中分离的多肽,并且意味着包括纯化的多肽和重组的多肽两者。术语“分离的”在本文中也用于指从其他细胞或组织分离的细胞或组织,并且意味着包括培养的和工程化的细胞或组织两者。
[0055] 如本文所用,“长期培养”或“长期扩增”是指在受控条件下繁殖细胞,使细胞数量扩增和/或保持基本的活和基本相似的形态。在一些实施例中,该术语是指在保持所需形态和细胞数量(例如,约两个月或更长时间)的同时培养的时间段,或者可以与至少10个培养基传代的传代次数(例如,培养基改变)相关联。在其他实施例中,该术语是指在一段时间内数量的增加(例如,在大约两个月的时间内增加至少一百万次)。在一些实施例中,长期培养物培养超过4个月、超过6个月或超过1年。在其他实施例中,长期培养物传代超过15次、超过18次或超过20次。
[0056] “巨噬细胞集落刺激因子”或“MCSF”(也称为集落刺激因素1(CSF 1))参与单核细胞、巨噬细胞和骨髓祖细胞的增殖、分化和存活。跨各种物种的基因序列、蛋白质序列和直向同源物是本领域已知的(参见,例如,NCBI参考序列:NP_000748.4,其通过引用并入本文)。
[0057] 如本文所用的“多核苷酸”包括但不限于DNA、RNA、cDNA(互补DNA)、mRNA(信使RNA)、rRNA(核糖体RNA)、shRNA(小发夹RNA)、snRNA(小核RNA)、snoRNA(短核仁RNA)、miRNA(微小RNA)、基因组DNA、合成DNA、合成RNA和/或tRNA。
[0058] 与另一序列具有一定百分比(例如,80%、85%、90%或95%)“序列同一性”的多核苷酸或多核苷酸区(或多肽或多肽区)意味着,当比对时,在比较两个序列时,该百分比的碱基(或基酸)是相同的。比对和同源性百分比或序列同一性可以使用本领域已知的软件程序来确定,例如在Molecular Biology中的Current Protocols(Ausubel等人,eds.1987)增补件30,第7.7.18节,表7.7.1中所述的那些。优选地,默认参数用于比对。典型的比对程序是BLAST,使用默认参数。特别是,典型的程序是BLASTN和BLASTP,使用以下默认参数:遗传密码=标准;过滤器=无;正负链=两者都有;截止值=60;期望值=10;矩阵=BLOSUM62;描述=50个序列;排序方式=高分;数据库=非冗余,GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻译+SwissProtein+SPupdate+PIR。有关这些程序的详细信息,请访问以下网址:
ncbi.nlm.nih.gov/cgi‑bin/BLAST。
[0059] 除非另有意图,否则在没有明确叙述的情况下推断,当本公开涉及多肽、蛋白质、多核苷酸、抗体或其片段时,其等效物或生物等效物意图在本公开的范围内。如本文所用,当提及参考蛋白、抗体或其片段、多肽或核酸时,术语“其生物等效物”旨在与“其等效物”同义,意指具有最小同源性同时仍保持所需结构或功能的那些。除非在本文中特别叙述,否则可以设想,上述任何内容也包括其等效物。例如,等效物具有至少约70%的同源性或同一性,或至少80%的同源性或同一性以及可替代地,或至少约85%,或可替代地至少约90%,或可替代地至少约95%,或可替代地至少98%的同源性或同一性并且表现出与参考蛋白、多肽、抗体或其片段或核酸基本上等效的生物活性。可替代地,当涉及多核苷酸时,其等效物是在严格条件下与参考多核苷酸或其补体杂交的多核苷酸。可替代地,当涉及多肽或蛋白质时,其等效物是来自在严格条件下与编码参考多肽或蛋白质的多核苷酸或其补体杂交的多核苷酸的表达的多肽或蛋白质。
[0060] “干细胞因子”或“SCF”(也称为KIT配体、KL或因子)是与c‑KIT受体(CD117)结合的细胞因子。SCF既可以作为跨膜蛋白存在,也可以作为可溶性蛋白存在。这种细胞因子在造血(血细胞的形成)、精子发生和黑色素生成中起着重要作用。跨各种物种的基因序列、蛋白质序列和直向同源物是本领域已知的(参见,例如,NCBI参考序列NP_000890.1,其通过引用并入本文。
[0061] 如本文所用,“基本均匀的群体”是指其中至少80%,优选地,至少90%、95%或甚至98%或更多的细胞是所指示的类型的细胞群体。
[0062] 如本文所用,术语“治疗”或“改善”是指治疗性治疗,其中目的是逆转、减轻、改善、抑制、减缓或停止与疾病或失调相关的病症的进展或严重程度。术语“治疗”包括减少或减轻病症、疾病或失调(如癌症)的至少一种不良影响或症状。如果一种或多种症状或临床标志物减少,治疗通常是“有效的”。另外地或替代地,如果疾病的进展减少或停止,治疗是“有效的”。也就是说,“治疗”不仅包括症状或标志物的改善,还包括至少停止在没有治疗的情况下预期的缓慢进展或症状恶化。有益的或期望的临床结果包括但不限于减轻一种或多种症状、减轻疾病程度、稳定(即不恶化)疾病状态、延缓或减缓疾病进展、改善或减轻疾病状态以及缓解(无论是部分还是全部),无论是可检测的还是不可检测的。术语疾病的“治疗”还包括缓解疾病的症状或副作用(包括姑息治疗)。在一些实施例中,癌症的治疗包括减少肿瘤体积、减少癌症细胞的数量、抑制癌症转移、增加预期寿命、减少癌症细胞增殖、减少癌症细胞存活或改善与癌症病症相关的各种生理症状。
[0063] “Wnt激活剂”是指诱导Wnt信号通路的化合物或分子。Wnt信号通路是一组信号转导通路,始于通过细胞表面受体将信号传递到细胞中的蛋白质。已经表征了三种Wnt信号通路:经典Wnt通路、非经典平面细胞极性通路和非经典Wnt/通路。这三种通路都是通过Wnt蛋白配体与Frizzled家族受体的结合激活的,该受体将生物信号传递给细胞内的Disheveled蛋白。Wnt包含不同的分泌型脂质修饰的信号糖蛋白家族,其长度为350‑400个氨基酸。这些蛋白质上发生的脂质修饰的类型是半胱氨酸在23‑24个半胱氨酸残基的保守模式下的棕榈酰化。棕榈酰化是必要的,因为它启动Wnt蛋白靶向质膜以进行分泌,并且由于脂肪酸的共价连接,它允许Wnt蛋白结合其受体。Wnt蛋白也会发生糖基化,糖基化会附着水化合物以确保正常分泌。在Wnt信号传导中,这些蛋白质作为配体经由旁分泌和自分泌途径激活不同的Wnt通路。这些蛋白质在物种间高度保守。它们可以在小鼠、人类、非洲爪蟾、斑马鱼、果蝇和许多其他动物身上发现。Wnt活化剂的示例包括但不限于SKL 2001、BML‑
284、WAY 262611、CAS 853220‑52‑7和QS11。在特定实施例中,本文公开的方法包括使用具有Wnt活化剂活性的本公开的化合物。
[0064] 粒细胞、巨噬细胞和树突细胞源自骨髓中常见的祖细胞,粒细胞‑巨噬细胞祖细胞(GMP)。尽管先天免疫细胞具有巨大的治疗潜力,但由于目前无法有效扩增和基因修饰这些细胞或其祖细胞GMP,它们在临床上的应用受到了极大的限制。本文提供了用于小鼠和人GMP的长期扩增和/或维持的方法。这些条件也可能用于扩增衍生自其他物种的GMP。体外扩增的GMP可以在体外和体内高效分化为成熟的功能性粒细胞、巨噬细胞和树突细胞。这些体外扩增的GMP也可以进行基因修饰。本文公开的用于生产GMP的方法以及由此生产的GMP具有很大的实用性,因为:(1)人GMP的长期扩增为基础研究和临床应用两者提供了无限的同质细胞群体;(2)人GMP的长期扩增允许通过修饰GMP基因及其表达来研究免疫应答的调节;和(3)体外扩增的人GMP可用于临床应用,包括移植。例如,体外扩增的人GMP可以很容易地用于治疗中性粒细胞减少症。此外,本公开还提供了人GMP的基因修饰(例如,敲除SIRPα和/或PI3Kγ基因;血管紧张素转换酶的过表达),其可以被进一步诱导分化为巨噬细胞和树突细胞。这些工程化的巨噬细胞和树突细胞期望具有强化的抗肿瘤效果,并且可以临床用于治疗癌症,无论作为单一疗法还是与其他免疫药剂的组合疗法,例如抗PD‑1/PD‑L1抗体和嵌合抗原受体T(CAR‑T)细胞。
[0065] 巨噬细胞表现出不同的表型,最初被分类为M1或M2极性。M1极化巨噬细胞显示出呈递抗原、产生IL‑12、IL‑23、干扰素γ(IFNγ)和活性(ROS)的能力。M1巨噬细胞在抗肿瘤和使T细胞反应偏向T辅助型1(Th1)或细胞介导的免疫应答方面更有效。相反,M2巨噬细胞产生IL‑10和TGF‑β并参与组织重塑,具有免疫抑制特性,并促进Th2或抗体介导的免疫应答。肿瘤相关巨噬细胞(TAM)是肿瘤微环境的主要组成部分。这些细胞是促进肿瘤免疫抑制的主要M2表型巨噬细胞。最近的研究支持它们对抑制T细胞功能的贡献,而使用免疫检查点阻断并不能消除T细胞功能。因此,巨噬细胞已成为对抗癌症的一个有吸引力的治疗靶点。尽管巨噬细胞具有巨大的治疗潜力,但其在临床上的应用受到了极大的限制,因为目前还没有有效的方法来扩增和基因修饰巨噬细胞或其祖细胞GMP。人GMP的长期扩增允许基因修饰,使这些细胞更具治疗应用性。
[0066] 发现抑制两种蛋白激酶,丝裂原活化蛋白激酶(MEK)和糖原合成酶激酶3(GSK3),可以使小鼠和大鼠胚胎干细胞(ESC)长期自我更新。基于这一发现,假设在长期体外培养过程中,通过抑制负责启动分化的信号通路,可以维持许多(如果不是全部的话)类型的干细胞。为了鉴定能够促进造血系统干细胞/祖细胞自我更新的抑制剂,将从成年C57BL/6小鼠分离的骨髓细胞在无血清N2B27培养基中接种到96孔板中,然后用小分子文库进行筛选。鉴定出一种B‑Raf激酶抑制剂(GDC‑0879;“GDC”),它可以显著促进包含均匀明亮、小且圆形的细胞的集落的形成。然而,传代后,这些细胞逐渐附着并分化。因此,进行了另一轮筛选。第二次筛选鉴定了一种Wnt活化剂(SKL2001;“SKL”),它与B‑Raf激酶抑制剂GDC‑0879协同作用,促进均匀圆形细胞的扩增。然而,发现GDC和SKL的组合不足以使细胞长期扩增。进行了第三次筛选。在这次筛选中,一组生长因子被鉴定为可能对细胞的长期扩增很重要。在对小鼠细胞进行进一步实验后,发现利用干细胞因子(SCF)与B‑Raf激酶抑制剂(GDC‑0879)和Wnt活化剂(SKL2001)组合的方法允许产生均匀的小鼠GMP细胞群体,该细胞群体由明亮、小且圆形的细胞组成,其可进一步进行长期细胞扩增。虽然该制剂被发现对小鼠GMP非常有效,但对人GMP细胞的有效性有限。因此,需要鉴定出能够有效扩增人GMP的化合物。
[0067] 本公开提供了可用于本公开的用于扩增人GMP细胞的方法中的新化合物(参见式I和图1)。因此,在本文提出的各种实施例中,本公开的方法利用本文公开的化合物与其他试剂来促进GMP的长期维持和/或扩增。在又一个实施例中,本公开的方法利用本公开的化合物来促进人GMP和其他GMP的长期扩增和/或维持。
[0068] 在特定实施例中,本公开提供了一种用于长期扩增和/或维持粒细胞/巨噬细胞祖细胞(GMP)的均匀细胞群体的方法,所述细胞群体在进行多次细胞传代和克隆扩增后在形态上保持不变(例如,基本上保持形态特征,例如形状、大小等)。在进一步的实施例中,本文公开的方法包括在培养基中培养GMP,所述培养基包含至少两种、至少三种、至少四种因子和试剂的组合,所述因子和试剂包括但不限于生长因子(例如SCF)、B‑Raf激酶抑制剂(例如GDC‑0879)、本公开的化合物(参见例如式I和图1)、抑制Mnk1/2的试剂、抑制PI3K通路的试剂,以及任选的一种或多种血清组分。
[0069] 在一个实施例中,本文公开的GMP衍生于或产生于干细胞。干细胞可以包括胚胎干细胞、诱导多能干细胞、非胚胎(成人)干细胞和脐血干细胞。可以使用本公开的培养基培养的干细胞类型包括衍生自任何哺乳动物物种的干细胞,哺乳动物物种包括人类、小鼠、大鼠、猴子和类人猿(参见,例如,Okita等人,Nature 448:313‑318,2007年7月;和Takahashi等人,Cell 131(5):861‑872;其通过引用并入本文)。
[0070] 干细胞是能够分化为其他细胞类型的细胞,包括具有特定、专功能的细胞(例如,组织特异性细胞、实质细胞及其祖细胞)。祖细胞(即“多能细胞”)是指能够产生不同终末分化细胞类型的细胞,以及能够产生各种祖细胞的细胞。产生生物体某些或许多(但不是全部)细胞类型的细胞通常被称为“多能”干细胞,它们能够分化为成熟生物体体内的任何细胞类型,尽管如果没有重新编程,它们就无法去分化为衍生出它们的细胞。可以理解,“多能”干细胞/祖细胞(例如粒细胞/巨噬细胞祖细胞(GMP))比多能干细胞具有更窄的分化潜力。在衍生成GMP之前,本文公开的干细胞可以通过使用任何数量的基因工程技术进行基因修饰,例如,基因治疗、基因编辑系统、同源重组等。这种修饰的干细胞可提供增强的治疗(例如,参见Nowakowski等人,Acta Neurobiol Exp(Wars)73(1):1‑18(2013))。
[0071] 在特定实施例中,本公开的GMP衍生自诱导多能干细胞(iPS,或iPSC)。iPSC是通过选择性基因表达(内源性基因的)或通过异源基因转染从非多能细胞获得的多能干细胞。日本京都大学的Shinya Yamanaka团队描述了诱导多能干细胞。Yamanaka已经鉴定出在胚胎干细胞中特别活跃的基因,并使用逆转录病毒和这些基因的选择转染小鼠成纤维细胞。最终,分离出了产生多能干细胞所必需的四个关键多能基因:Oct‑3/4、SOX2、c‑Myc和Klf4。通+过针对Fbx15细胞的抗生素选择来分离细胞。同一小组与哈佛大学、麻省理工学院和加州大学洛杉矶分校的另外两个独立研究小组一起发表了一项研究,显示小鼠成纤维细胞成功地重新编程为iPS,甚至产生了一种可行的嵌合体。诱导多能干细胞的过程在本领域中具有良好的特征。此外,正在进行的研究减少了诱导多能性所需的因子的数量。
[0072] 在一些实施例中,本文公开的GMP衍生自胚胎干细胞(ESC)。ESC是衍生自人类胚胎的未分化内部物质细胞的干细胞。胚胎干细胞是多能的,这意味着它们能够生长并分化为三个原胚层的所有衍生物:外胚层、内胚层和中胚层。多能性将胚胎干细胞与成人中发现的成人干细胞区分开来;虽然胚胎干细胞可以在体内生成所有细胞类型,但成人干细胞是多能的并且只能产生有限数量的细胞类型。另外,在限定条件下,胚胎干细胞能够无限期地自我繁殖。这使得胚胎干细胞可以作为研究和再生医学的有用工具,因为它们可以无限量的自我生成,用于持续的研究或临床应用。
[0073] 在一些实施例中,本文公开的GMP衍生于脐血干细胞。脐血是婴儿出生后留在胎盘和脐带中的血液。脐血是由全血中的所有元素组成的。它含有红细胞、白细胞、血浆、血小板,还富含造血干细胞。可以使用本领域中教导的任何数量的分离方法从脐血中分离造血干细胞,包括Chularojmontri等人,J Med Assoc Thai 92(3):S88‑94(2009)中教导的那些+方法。此外,商业试剂盒可用于从人脐血中分离CD34 细胞(即造血干细胞)。这些试剂盒可从多家供应商获得,包括STEMCELL科技、赛默飞世尔科技公司、Zen‑Bio等。
[0074] 在一些实施例中,本文公开的GMP衍生于非胚胎干细胞。非胚胎干细胞可以更新并分化,以产生组织或器官的部分或全部主要特化细胞类型。非胚胎干细胞在活体中的主要作用是维持和修复它们所在的组织。科学家还使用术语体细胞干细胞来代替非胚胎干细胞,体细胞指的是身体的细胞(而不是生殖细胞、精子或卵子)。非胚胎干细胞已在许多器官和组织中被鉴定,包括大脑、骨髓、外周血、血管、骨骼肌、皮肤牙齿、心脏、肠道、肝脏、卵巢上皮和睾丸。它们被认为存在于每个组织的特定区域(称为“干细胞生态位”)。在活体动物中,非胚胎干细胞可以在需要时长时间分裂,并可以产生具有特定组织的特征形状、特殊结构和功能的成熟细胞类型。
[0075] 在某些实施例中,本文公开的GMP衍生自造血干细胞(HSC)。HSC可以从脐血和骨髓中分离出来。在一些实例中,可以使用本领域已知的分离方案来分离HSC,所述分离方案通+常使用CD34作为分离HSC的细胞选择标志物(例如,参见Lagasse等人,Nat Med.6:1229‑
1234(2000),其通过引用并入本文)。
[0076] 在本文公开的方法中,GMP可以在培养基中生长和扩增,所述培养基包含至少两种、至少三种、至少四种因子和试剂的组合,所述因子和试剂包括但不限于生长因子(例如SCF)、B‑Raf激酶抑制剂(例如GDC‑0879)、本公开的化合物(参见例如式I和图1)、抑制Mnk1/2的试剂、抑制PI3K通路的试剂,以及任选的一种或多种血清组分。在一些实例中,培养基包含本公开的化合物(参见例如式I和图1)。在一些实例中,培养基包含本公开的化合物(参见例如式I和图1),并且还包含生长因子(例如SCF)、B‑Raf激酶抑制剂(例如GDC‑0879)、抑制Mnk1/2的试剂、抑制PI3K通路的试剂中的至少一种。在一些实例中,培养基包含生长因子(例如SCF)、B‑Raf激酶抑制剂(例如GDC‑0879)、本公开的化合物(参见例如式I和图1)、抑制Mnk1/2的试剂和抑制PI3K通路的试剂。任选地,培养基包含一种或多种血清组分。在一些实例中,培养基包含用各种其他生物制剂补充的改良的基础培养基。基础培养基是指有效支持培养中细胞生长的氨基酸、维生素、盐和营养素的溶液,尽管通常这些化合物除非补充额外的化合物,否则不会支持细胞生长。营养素包括可以被细胞代谢的碳源(例如,糖,如葡萄糖),以及细胞生存所需的其他化合物。这些是由于缺乏一种或多种编码合成化合物所需的蛋白质的基因(例如必需氨基酸),细胞自身不能合成的化合物,或者就细胞可以合成的化合物而言,由于其特定的发育状态,编码必要生物合成蛋白的基因没有以足够的水平表达。
哺乳动物细胞培养领域中已知各种基础培养基,例如Dulbecco改良鹰培养基(DMEM)、RPMI 
1640、敲除DMEM(KO‑DMEM)和DMEM/F12,尽管可以使用任何可以补充有支持干细胞在基本上未分化状态下生长的试剂的基础培养基。本公开进一步证明,包含上文举例说明的基础培养基之一(例如DMEM/F12)与神经基础培养基(或替代地其它基础培养基,例如IMDM和/或TM
StemSpan SFEMII)的比例的培养基出乎意料地提供了改进的GMP的生长。特别地,上文举例说明的基础培养基之一(例如DMEM/F12)与神经基础培养基的约5:1至约1:5的比例可用于培养GMP。在进一步的实施例中,用于生长GMP的培养基包含与神经基础培养基比例约1:1的DMEM/F12。
[0077] 本文公开的用于生长GMP的培养基可以补充有一种或多种额外的试剂,包括但不限于胰岛素、转铁蛋白、BSA组分V、腐胺、亚硒酸钠、DL‑α生育酚和亚麻酸和/或亚油酸。在某个实施例中,本文公开的用于生长GMP的培养基补充有胰岛素、转铁蛋白、BSA组分V、腐胺、亚硒酸钠、DL‑α生育酚和亚麻酸和/或亚油酸。
[0078] 如将理解的,希望用新鲜培养基连续地或周期性地(通常每1‑3天)代替用过的培养基。使用新鲜培养基的一个优点是能够调节条件,使细胞比根据传统技术在饲养细胞上或在条件培养基中培养时更均匀、更快地扩增。
[0079] 与初始或先前的起始细胞群体相比,可以获得扩增4倍、10倍、20倍、50倍、100倍、1000倍或更多的GMP群体。在合适的条件下,与用于启动培养物的GMP相比,扩增群体中的细胞将有50%、70%或更多处于未分化状态。每次传代的扩增程度可以通过将培养结束时收获的细胞的近似数量除以最初接种到培养物中的细胞的近似数量来计算。在生长环境的几何形状受到限制或由于其他原因的情况下,细胞可以任选地传代到类似的生长环境中以进一步扩增。总扩增是每次传代中所有扩增的乘积。当然,没有必要在每次传代中保留所有扩增的细胞。例如,如果细胞在每次培养中扩增两倍,但每次传代仅保留约50%的细胞,那么将向前携带大约相同数量的细胞。但在四次培养后,据说这些细胞已经扩增了16倍。细胞可以通过本领域已知的低温冷冻技术来储存。
[0080] 如本文更详细地指示的,GMP可以在培养基中生长和扩增,所述培养基包含至少两种、至少三种、至少四种因子和试剂的组合,所述因子和试剂包括但不限于生长因子(例如SCF)、B‑Raf激酶抑制剂(例如GDC‑0879)、本公开的化合物、抑制Mnk1/2的试剂、抑制PI3K通路的试剂和任选地,一种或多种血清组分。
[0081] 本公开提供了用于细胞培养或扩增的方法和/或组合物,其包含具有式I的结构的一种或多种化合物:
[0082]
[0083] 其中,1
[0084] R 选自:2
[0085] R选自:
[0086] R3选自:
[0087]
[0088] n是选自0、1、2、3、4和5的整数。在又一实施例中,一种具有式I的结构的化合物不是
[0089]
[0090] 在一些实施例中,本公开提供了用于细胞培养或扩增的方法和/或组合物,其包含具有以下结构的一种或多种化合物:
[0091]
[0092]
[0093]
[0094] 本公开进一步提供了使用基因工程技术对本文公开的GMP进行基因修饰的方法。特别地,本文表明,本公开的GMP易受基因修饰技术的影响,从而允许在基础科学研究和临床治疗应用中使用GMP。因此,扩增并基因修饰的GMP可以很容易地转化为广泛的临床应用。
相应地,本公开进一步提供了用于基因修饰本文公开的GMP的方法。此类方法可以包括以下步骤:通过使用基因编辑系统、同源重组或定点诱变,对GMP进行基因工程修饰。基因编辑系统的具体示例包括锌指核酸酶、TALEN和CRISPR。
[0095] 在某个实施例中,CRISPR系统为II型CRISPR系统,并且Cas酶为Cas9,其催化DNA裂解。衍生自化脓性链球菌的Cas9或任何密切相关的Cas9的酶作用在靶位点序列处生成双链断裂,所述靶位点序列与引导序列的20个核苷酸杂交,并且在靶序列的20个核苷酸之后具有原间隔区相邻基序(PAM)序列(示例包括NGG/NRG或PAM,其可如本文所述确定)。通过Cas9进行位点特异性DNA识别和切割的CRISPR活性由引导序列、部分与引导序列杂交的tracr序列和PAM序列定义。Karginov和Hannon在The CRISPR system:small RNA‑guided defence in bacteria and archaea,Mole Cell 2010年1月15日;37(1):7中描述了CRISPR系统的更多方面。
[0096] 来自化脓性链球菌SF370的II型CRISPR基因座,其包含四个基因Cas9、Cas1、Cas2和Csn1的簇,以及两个非编码RNA元件:tracrRNA和由短的非重复序列(间隔区,每个间隔区约30bp)间隔的重复序列(直接重复)的特征阵列。在该系统中,靶向DNA双链断裂(DSB)分四个顺序步骤生成。第一,两个非编码RNA,前crRNA阵列和tracrRNA,从CRISPR基因座转录。第二,tracrRNA与前crRNA的直接重复序列杂交,然后将其加工成包含单个间隔序列的成熟crRNA。第三,成熟的crRNA:tracrRNA复合物经由crRNA的间隔区域和原间隔区DNA之间的异源双链形成,将Cas9引导至包含原间隔区和相应PAM的靶序列。最后,Cas9介导PAM靶序列的切割,以在原间隔区内产生DSB。在某个实施例中,基于RNA聚合酶Ill的U6启动子用于驱动tracrRNA的表达。
[0097] 通常,在内源性CRISPR系统的情况下,CRISPR复合物(包括与靶序列杂交并与一种或多种Cas蛋白复合的引导序列)的形成导致靶序列中或附近(例如,间隔1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50或更多个碱基对内)的一条或两条链被切割。在不希望被理论束缚的情况下,tracr序列也可以形成CRISPR复合物的一部分,所述tracr序列可以包括野生型tracr序列的全部或一部分(例如野生型tracr序列的约20、26、32、45、48、54、63、67、85或更多个核苷酸),例如通过沿着tracr序列的至少一部分与可操作地连接到引导序列的tracr配偶序列的全部或一部分杂交。在一些实施例中,将驱动CRISPR系统的一个或多个元件表达的一个或多个载体引入宿主细胞(例如,GMP或干细胞)中,使得CRISPR系统元件的表达引导在一个或多个靶位点形成CRISPR复合物。例如,Cas酶、连接到tracr配偶序列的引导序列和tracr序列可以各自可操作地连接到单独载体上的单独调控元件。替代地,由相同或不同的调控元件表达的两个或多个元件可以组合在单个载体中,一个或多个额外的载体提供CRISPR系统的不包括在第一载体中的任何组分。组合在单个载体中的CRISPR系统元件可以按任何合适的方向排列,例如一个元件相对于第二个元件(“上游”)位于5′或相对于第二元件(“下游”)位于3′。一个元件的编码序列可以位于第二个元件的编码序列的相同或相反的链上,并且在相同或相反方向上定向。在一些实施例中,单个启动子驱动编码CRISPR酶的转录物以及引导序列、tracr配偶序列(任选地,可操作地连接到引导序列)和嵌入一个或更多个内含子序列内的tracr序列(例如,每个都在不同的内含子中,两个或多个在至少一个内含子中,或全部在单个内含子中)中的一者或多者的表达。在一些实施例中,CRISPR酶、引导序列、tracr配偶序列和tracr序列可操作地连接到同一启动子并从其表达。
[0098] 在一些实施例中,CRISPR表达载体包含一个或多个插入位点,例如限制性内切核酸酶识别序列(也称为“克隆位点”)。在一些实施例中,一个或多个插入位点(例如,约或多于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个插入位点)位于一个或多个载体的一个或多个序列元件的上游和/或下游。在一些实施例中,载体包括tracr配偶序列上游的插入位点,并且任选地,包括可操作地连接到tracr配偶序列的调控元件下游的插入位点,使得在将引导序列插入该插入位点之后并且在表达时引导序列引导CRISPR复合物与真核细胞(例如GMP或干细胞)中的靶序列的序列特异性结合。在一些实施例中,载体包括两个或多个插入位点,每个插入位点位于两个tracr配偶序列之间,从而允许在每个位点插入引导序列。在这样的布置中,两个或多个引导序列可以包含单个引导序列的两个或多个副本、两个或多个不同的引导序列、或这些的组合。当使用多个不同的引导序列时,可以使用单个表达构建体将CRISPR活性靶向细胞内的多个不同、对应的靶序列。例如,单个载体可以包含约或多于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20个或更多个引导序列。在一些实施例中,可以提供约或多于约1、2、3、
4、5、6、7、8、9、10个或更多这样的包含引导序列的载体,并且任选地将其递送到细胞。
[0099] 在一些实施例中,载体包含调控元件,所述调控元件可操作地连接到编码CRISPR酶的酶编码序列,例如Cas蛋白。Cas蛋白的非限制性示例包括Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX,Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4及其同源物,或其修饰版本。在一些实施例中,未修饰的CRISPR酶具有DNA切割活性,例如Cas9。在一些实施例中,CRISPR酶在靶序列的位置引导一条或两条链的切割,例如在靶序列内和/或在靶序列补体内。在一些实施例中,CRISPR酶引导从靶序列的第一个或最后一个核苷酸间隔约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、100、200、500或更多个碱基对内切割一条或两条链。在一些实施例中,载体编码CRISPR酶,所述CRISPR酶相对于相应的野生型酶突变,使得突变的CRISPR酶缺乏切割含有靶序列的靶多核苷酸的一条或两条链的能力。例如,来自化脓性链球菌的Cas9的RuvC I催化结构域中的天冬氨酸‑丙氨酸取代(D10A)将Cas9从切割两条链的核酸酶转化为切口酶(切割单链)。产生Cas9a切口酶的突变的其他示例包括但不限于H840A、N854A和N863A。作为进一步的示例,Cas9的两个或多个催化结构域(RuvC I、RuvC II和RuvC III或HNH结构域)可以突变以产生基本上缺乏所有DNA切割活性的突变Cas9。在一些实施例中,D10A突变与H840A、N854A或N863A突变中的一者或多者组合以产生基本上缺乏所有DNA切割活性的Cas9酶。在一些实施例中,当突变酶的DNA切割活性相对于其非突变形式小于约25%、10%、5%、1%、0.1%、0.01%或更低时,CRISPR酶被认为基本上缺乏所有DNA切割活性。在酶不是SpCas9的情况下,可以在对应于SpCas9位置10、762、840、854、863和/或986的任何或所有残基上进行突变(这可以通过例如标准序列比较工具来确定)。特别地,在SpCas9中,以下任何或所有突变是优选的:D10A、E762A、H840A、N854A、N863A和/或D986A;以及对任何取代氨基酸的保守取代也是可以设想的。在其他Cas9的相应位置也表明了相同的(或这些突变的保守取代)。
[0100] 本文还描述了指示的直系同源。Cas酶可以被鉴定为Cas9,因为这可以指与具有来自II型CRISPR系统的多个核酸酶结构域的最大核酸酶共享同源性的一般类别的酶。最优选地,Cas9酶来自或衍生自spCas9或saCas9。所谓衍生,是指衍生的酶在很大程度上基于野生型酶并与野生型酶具有高度序列同源性的意义,但它已经以本文所述的某种方式突变(修饰)。
[0101] 应当理解,术语Cas和CRISPR酶在本文中通常可互换使用,除非另外显而易见。如上所述,本文中使用的许多残基编号是指化脓性链球菌中II型CRISPR基因座的Cas9酶。然而,应当理解,本公开包括更多来自其他微生物物种的Cas9,例如SpCas9、SaCas9、St1Cas9等等。
[0102] 基因编辑系统(例如,锌指核酸酶、CRISPR和TALEN)可用于对GMP或干细胞进行基因工程修饰,例如替换或破坏在GMP或干细胞中发现的现有基因(敲除)。如本文给出的实例所示,本公开的GMP特别容易受到敲除突变的影响。此外,预计本公开的GMP可以容易地产生额外的敲除,例如SIRPα基因敲除和/或PI3Kγ基因敲除。替代地,可以使用相同的编辑系统(例如CRISPR和TALEN)来改变遗传基因座,以包含在遗传基因座未发现的序列信息(敲入突变)。这样的修饰可以用来形成“获得功能”的GMP。这种修饰的GMP特别适用于模拟疾病状态,例如通过表达与疾病或失调相关的生物分子。
[0103] 本公开进一步提供了将GMP分化成血细胞的髓系和淋巴系,例如单核细胞、巨噬细胞、粒细胞、中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞、巨核细胞到血小板、T细胞、B细胞和自然杀伤细胞。在特定实施例中,本文公开的方法还包括通过用包含MCSF的巨噬细胞分化培养基培养GMP而将本公开的GMP分化为巨噬细胞。在又一个实施例中,巨噬细胞分化培养基包含RPMI 1640、10%FBS和20ng/mL的MCSF。在替代实施例中,本文公开的方法还包括将本公开的GMP分化为粒细胞,包括:用包含GCSF的粒细胞分化培养基培养GMP。在又一个实施例中,粒细胞分化培养基包含RPMI 1640、10%FBS和20ng/mL的GCSF。
[0104] 以下实例旨在说明但不限制本公开。虽然它们是可能使用的那些程序中的典型程序,但是本领域技术人员已知的其他程序也可以替代地使用。
[0105] 实例
[0106] SKL2001类似物的合成方法和表征。
[0107] 所述的化合物根据方案1至6中描绘的方法制备
[0108] 一般程序1:羧酸与丙膦酸(T3P)形成酰胺
[0109]
[0110] N‑(3‑(1H‑吡唑‑1‑基)丙基)‑5‑(呋喃‑2‑基)异恶唑‑3‑甲酰胺:
[0111] 在0℃下向5‑呋喃‑2‑基‑异恶唑‑3‑羧酸(100mg,0.56mmol)、3‑(1H‑吡唑‑1‑基)丙‑1‑胺(73μL,0.61mmol)和三乙胺(233μL,1.67mmol)在DMF(1.5mL)的混合物中缓慢添加丙膦酸酐(T3P,在DMF中占50%w/w)(393μL,0.61mmol)。将溶液加温至室温并搅拌16小时。添加卤水,然后用EtOAc萃取水层三次。将组合的有机层用NaSO4干燥、过滤并蒸发。用快速柱色谱(100%的EtOAc)纯化原材料,以提供标题化合物(137mg,86%的产率)作为白色固体。
[0112] 1H NMR(400MHz,氯仿‑d)δ7.56(dd,J=1.8,0.8Hz,1H),7.52(dd,J=1.9,0.7Hz,1H),7.42(dd,J=2.3,0.7Hz,1H),7.30(t,J=5.7Hz,1H),6.93(dd,J=3.5,0.7Hz,1H),
6.83(s,1H),6.54(dd,J=3.5,1.8Hz,1H),6.24(t,J=2.1Hz,1H),4.25(t,J=6.5Hz,2H),+
3.45(q,J=6.4Hz,2H),2.17(p,J=6.5Hz,3H)。MS(ESI):287.11[M+H]。
[0113]
[0114] N‑(3‑(1H‑吡唑‑1‑基)丙基)‑5‑(噻吩‑2‑基)异恶唑‑3‑甲酰胺:
[0115] 一般程序1(方案1):快速色谱法(己烷/EtOAc=30/70)。88%的产率,作为黄色固体。
[0116] 1H NMR(400MHz,氯仿‑d)δ7.53(m,2H),7.47(dd,J=5.0,1.2Hz,1H),7.43(d,J=2.1Hz,1H),7.31(t,J=6.0Hz,1H),7.13(dd,J=5.0,3.7Hz,1H),6.79(s,1H),6.24(t,J=
2.1Hz,1H),4.25(t,J=6.5Hz,2H),3.45(q,J=6.4Hz,2H),2.17(p,J=6.5Hz,2H)。MS+
(ESI):303.09[M+H]。
[0117]
[0118] N‑(3‑(1H‑吡唑‑1‑基)丙基)‑5‑苯基异恶唑‑3‑甲酰胺:
[0119] 一般程序1(方案1):快速色谱法(己烷/EtOAc=30/70)。84%的产率,作为浅黄色固体。
[0120] 1H NMR(400MHz,氯仿‑d)δ7.79(m,2H),7.54(dd,J=1.9,0.7Hz,1H),7.47(m,4H),7.30(t,J=5.5Hz,1H),6.95(s,1H),6.26(t,J=2.1Hz,1H),4.27(t,J=6.5Hz,2H),3.47+
(q,J=6.4Hz,2H),2.19(p,J=6.5Hz,2H)。MS(ESI):297.13[M+H]。
[0121]
[0122] N‑(3‑(1H‑咪唑‑1‑基)丙基)‑5‑(噻吩‑2‑基)异恶唑‑3‑甲酰胺:
[0123] 一般程序1(方案1):快速色谱法(EtOAc/MeOH=90/10)。68%的产率,作为黄色固体。
[0124] 1H NMR(400MHz,氯仿‑d)δ7.53(s,1H),7.52(dd,J=2.6,1.1Hz,1H),7.48(dd,J=5.0,1.1Hz,1H),7.31(t,J=6.2Hz,1H),7.13(dd,J=5.0,3.7Hz,1H),7.06(s,1H),6.96(s,
1H),6.81(s,1H),4.05(t,J=7.0Hz,2H),3.47(q,J=6.6Hz,2H),2.12(p,J=6.9Hz,2H)。MS+
(ESI):303.09[M+H]。
[0125]
[0126] N‑(3‑(1H‑咪唑‑1‑基)丙基)‑5‑(噻唑‑2‑基)异恶唑‑3‑甲酰胺:
[0127] 一般程序1(方案1):快速色谱法:(EtOAc/MeOH=90/10)。52%的产率,作为浅黄色固体。
[0128] 1H NMR(400 MHz,氯仿‑d)δ8.02(d,J=3.1 Hz,1H),7.57(d,J=3.2 Hz,1H),7.56(s,1H),7.25(s,1H),7.10(m,2H),6.99(s,1H),4.07(t,J=7.0 Hz,2H),3.49(q,J=6.6 Hz,2H),2.15(p,J=6.9 Hz,2H)。
[0129]
[0130] N‑(3‑(1H‑咪唑‑1‑基)丙基)‑5‑苯基异恶唑‑3‑甲酰胺:
[0131] 一般程序1(方案1):快速色谱法(EtOAc/MeOH=90/10)。89%的产率,作为浅黄色固体。
[0132] 1H NMR(400 MHz,氯仿‑d)δ7.76(m,2H),7.52(s,1H),7.45(m,3H),7.06(s,1H),6.96(s,1H),6.95(s,1H),4.04(t,J=7.0 Hz,2H),3.47(q,J=6.6 Hz,2H),2.12(p,J=6.9 +
Hz,2H)。MS(ESI):297.13[M+H]。
[0133]
[0134] N‑(3‑(1H‑咪唑‑1‑基)丙基)‑5‑(吡啶‑2‑基)异恶唑‑3‑甲酰胺:
[0135] 一般程序1(方案1):快速色谱法:(EtOAc/MeOH=90/10)。43%的产率,作为白色固体。
[0136] 1H NMR(400 MHz,氯仿‑d)δ8.72(ddd,J=4.8,1.7,1.0 Hz,1H),7.86(m,2H),7.62(s,1H),7.37(ddd,J=7.3,4.8,1.5 Hz,1H),7.30(s,1H),7.14(m,2H),7.03(s,1H),4.07(t,J=7.0 Hz,2H),3.49(q,J=6.6 Hz,2H),2.15(p,J=6.9 Hz,2H)。
[0137]
[0138] N‑(3‑(1H‑咪唑‑1‑基)丙基)‑5‑(吡啶‑3‑基)异恶唑‑3‑甲酰胺:
[0139] 一般程序1(方案1):快速色谱法:(EtOAc/MeOH=80/20)。41%的产率,作为黄色固体。
[0140] 1H NMR(400MHz,氯仿‑d)δ9.06(dd,J=2.3,0.9Hz,1H),8.72(dd,J=4.9,1.7Hz,1H),8.09(ddd,J=8.0,2.3,1.6Hz,1H),7.63(s,1H),7.45(ddd,J=8.0,4.9,0.9Hz,1H),
7.10(s,1H),7.07(s,1H),7.05(t,J=5.4Hz,1H),6.99(s,1H),4.08(t,J=7.0Hz,2H),3.50(q,J=6.6Hz,2H),2.15(p,J=6.9Hz,2H)。
[0141]
[0142] N‑(3‑(1H‑咪唑‑1‑基)丙基)‑3‑苯基异恶唑‑5‑甲酰胺:
[0143] 一般程序1(方案1):快速色谱法:(EtOAc/MeOH=90/10)。62%的产率,作为黄色固体。
[0144] 1H NMR(400MHz,氯仿‑d)δ7.80(m,2H),7.61(s,1H),7.47(m,3H),7.43(t,J=5.7Hz,1H),7.23(s,1H),7.11(s,1H),7.01(s,1H),4.08(t,J=6.9Hz,2H),3.49(q,J=+
6.6Hz,2H),2.16(p,J=6.8Hz,2H)。MS(ESI):297.13[M+H]。
[0145]
[0146] N‑(3‑(1H‑咪唑‑1‑基)丙基)‑1‑苯基‑1H‑吡唑‑4‑甲酰胺:
[0147] 一般程序1(方案1):快速色谱法:(EtOAc/MeOH=90/10)。67%的产率,作为白色固体。
[0148] 1H NMR(600MHz,氯仿‑d)δ8.48(s,1H),7.97(s,1H),7.84(s,1H),7.67(m,2H),7.44(t,J=7.7Hz,2H),7.32(t,J=7.4Hz,1H),7.11(s,1H),7.01(s,1H),6.55(s,1H),4.11(t,J=6.7Hz,2H),3.46(q,J=6.3Hz,2H),2.15(p,J=6.6Hz,2H)。
[0149]
[0150] N‑(3‑(1H‑咪唑‑1‑基)丙基)‑1‑苯基‑1H‑咪唑‑4‑甲酰胺:
[0151] 一般程序1(方案1):快速色谱法:(EtOAc/MeOH=90/10)。32%的产率,作为无色油。
[0152] 1H NMR(400MHz,氯仿‑d)δ7.92(d,J=1.4Hz,1H),7.77(d,J=1.4Hz,1H),7.56(s,1H),7.51(m,2H),7.41(m,3H),7.07(s,1H),6.99(s,1H),4.06(t,J=7.1Hz,2H),3.48(td,J=6.4,3.0Hz,2H),2.11(p,J=6.8Hz,2H)。
[0153]
[0154] N‑(3‑(1H‑咪唑‑1‑基)丙基)‑5‑苯基‑1H‑吡唑‑3‑甲酰胺:
[0155] 一般程序1(方案1):快速色谱法:(EtOAc/MeOH=90/10)。81%的产率,作为白色固体。
[0156] 1H NMR(600MHz,氯仿‑d)δ7.88(s,1H),7.65(d,J=7.6Hz,2H),7.42(t,J=7.6Hz,2H),7.36(m,2H),7.11(s,1H),7.08(s,1H),7.00(s,1H),4.10(t,J=6.8Hz,2H),3.49(s,
1H),3.46(q,J=6.3Hz,2H),2.14(p,J=6.7Hz,2H)。
[0157]
[0158] N‑(3‑(1H‑咪唑‑1‑基)丙基)‑2‑苯基噻唑‑4‑甲酰胺:
[0159] 一般程序1(方案1):快速色谱法:(EtOAc/MeOH=90/10)。79%的产率,作为浅黄色固体。
[0160] 1H NMR(600MHz,氯仿‑d)δ8.11(s,1H),7.96(m,2H),7.69(s,1H),7.56(t,J=6.4Hz,1H),7.48(m,3H),7.12(s,1H),7.04(s,1H),4.10(t,J=7.0Hz,2H),3.52(q,J=
6.6Hz,2H),2.17(p,J=6.8Hz,2H)。
[0161]
[0162] N‑(3‑(1H‑咪唑‑1‑基)丙基)‑2‑(吡啶‑3‑基)噻唑‑4‑甲酰胺:
[0163] 一般程序1(方案1):快速色谱法:(EtOAc/MeOH=90/10)。71%的产率,作为浅黄色固体。
[0164] 1H NMR(600MHz,氯仿‑d)δ9.17(d,J=2.3Hz,1H),8.69(dd,J=4.9,1.6Hz,1H),8.21(dt,J=8.0,2.1Hz,1H),8.16(s,1H),7.56(m,2H),7.41(dd,J=7.7,4.9Hz,1H),7.07(s,1H),7.00(s,1H),4.07(t,J=7.0Hz,2H),3.51(q,J=6.6Hz,2H),2.15(p,J=6.9Hz,
2H)。
[0165]
[0166] N‑(3‑(1H‑咪唑‑1‑基)丙基)‑4‑苯基噻唑‑2‑甲酰胺:
[0167] 一般程序1(方案1):快速色谱法:(EtOAc/MeOH=90/10)。54%的产率,作为无色油。
[0168] 1H NMR(600MHz,氯仿‑d)δ7.87(m,2H),7.70(s,1H),7.61(m,2H),7.43(t,J=7.4Hz,2H),7.36(tt,J=7.3,1.3Hz,1H),7.08(s,1H),6.99(s,1H),4.05(t,J=7.0Hz,2H),
3.49(q,J=6.6Hz,2H),2.14(p,J=6.9Hz,2H)。
[0169]
[0170] N‑(3‑(1H‑咪唑‑1‑基)丙基)‑5‑苯基噻唑‑2‑甲酰胺:
[0171] 一般程序1(方案1):快速色谱法:(EtOAc/MeOH=90/10)。47%的产率,作为浅黄色固体。
[0172] 1H NMR(400MHz,氯仿‑d)δδ7.99(s,1H),7.80(s,1H),7.61(m,2H),7.44(m,3H),7.36(t,J=6.5Hz,1H),7.18(s,1H),7.11(s,1H),4.12(t,J=6.9Hz,2H),3.51(q,J=
+
6.5Hz,2H),2.17(p,J=6.8Hz,2H)。MS(ESI):313.11[M+H]。
[0173]
[0174] N‑(3‑(1H‑咪唑‑1‑基)丙基)‑[1,1'‑联苯]‑3‑甲酰胺:
[0175] 一般程序1(方案1):快速色谱法:(EtOAc/MeOH=90/10)。51%的产率,作为白色固体。
[0176] 1H NMR(600MHz,氯仿‑d)δ8.00(t,J=1.9Hz,1H),7.73‑7.70(m,2H),7.68(s,1H),7.61(t,J=1.7Hz,1H),7.60(dd,J=2.2,0.9Hz,1H),7.49(t,J=7.7Hz,1H),7.47‑7.43(m,
2H),7.39‑7.35(m,1H),7.08(s,1H),6.99(s,1H),6.60(t,J=6.1Hz,1H),4.08(t,J=
6.8Hz,2H),3.51(q,J=6.5Hz,3H),2.15(p,J=6.8Hz,2H)。
[0177]
[0178] N‑(3‑(1H‑咪唑‑1‑基)丙基)‑6‑苯基吡啶酰胺
[0179] 一般程序1(方案1):快速色谱法:(EtOAc/MeOH=90/10)。18%的产率,作为无色油。
[0180] 1H NMR(400MHz,氯仿‑d)δ8.76(dd,J=2.3,0.9Hz,1H),8.25(dd,J=8.1,0.9Hz,1H),8.17(t,J=6.3Hz,1H),8.04(ddd,J=8.0,2.3,0.7Hz,1H),7.73‑7.58(m,3H),7.53‑
7.48(m,2H),7.47–7.44(m,1H),7.15‑6.97(m,2H),4.08(t,J=7.0Hz,2H),3.53(q,J=
6.6Hz,2H),2.16(p,J=6.8Hz,2H)。
[0181]
[0182] N‑(3‑(1H‑咪唑‑1‑基)丙基)‑5‑苯基烟酰胺
[0183] 一般程序1(方案1):快速色谱法:(EtOAc/MeOH=90/10)。32%的产率,作为白色固体。
[0184] 1H NMR(400MHz,氯仿‑d)δ8.95(d,J=38.1Hz,2H),8.36(q,J=2.1Hz,1H),7.82(t,J=5.6Hz,1H),7.73(s,1H),7.62‑7.55(m,2H),7.49‑7.36(m,3H),7.02(d,J=20.4Hz,2H),4.10(t,J=6.6Hz,2H),3.48(q,J=6.4Hz,2H),2.23–2.09(m,2H)。
[0185]
[0186] N‑(3‑(1H‑咪唑‑1‑基)丙基)‑4‑苯基吡啶酰胺
[0187] 一般程序1(方案1):快速色谱法:(EtOAc/MeOH=90/10)。50%的产率,作为白色固体。
[0188] 1H NMR(400MHz,氯仿‑d)δ8.57(dq,J=5.1,0.8Hz,1H),8.43(dq,J=1.5,0.7Hz,1H),8.24(s,1H),7.93(s,1H),7.73‑7.67(m,2H),7.65(ddd,J=5.1,1.9,0.7Hz,1H),7.53‑
7.42(m,3H),7.13(s,1H),7.07(s,1H),4.15‑4.10(m,2H),3.53(q,J=6.5Hz,2H),2.16(p,J=6.8Hz,3H)。
[0189]
[0190] N‑(3‑(1H‑咪唑‑1‑基)丙基)‑1H‑苯并[d]咪唑‑2‑甲酰胺:
[0191] 一般程序1(方案1):快速色谱法:(EtOAc/MeOH=90/10)。65%的产率,作为白色固体。
[0192] 1H NMR(600MHz,氯仿‑d)δ8.37(t,J=7.8Hz,1H),7.67(s,1H),7.61(s,2H),7.31(dh,J=8.2,4.1Hz,2H),7.09(s,1H),6.95(s,1H),4.05(td,J=7.0,2.8Hz,2H),3.51(qd,J=6.3,2.7Hz,2H),3.48(d,J=3.4Hz,1H),2.12(p,J=6.7Hz,2H)。
[0193]
[0194] N‑丁基‑5‑(呋喃‑2‑基)异恶唑‑3‑甲酰胺:
[0195] 一般程序1(方案1):快速色谱法:(己烷/EtOAc:至多75%的EtOAc)。42%的产率,作为白色固体。
[0196] 1H NMR(400MHz,氯仿‑d)δ7.57(dd,J=1.8,0.7Hz,1H),6.94(d,J=3.5Hz,1H),6.85(s,1H),6.78(s,1H),6.55(dd,J=3.5,1.8Hz,1H),3.45(q,J=7.3Hz,2H),1.61(p,J=
7.4Hz,2H),1.42(p,J=7.4Hz,2H),0.96(t,J=7.3Hz,3H)。
[0197]
[0198] 5‑(呋喃‑2‑基)‑N‑(3‑苯丙基)异恶唑‑3‑甲酰胺
[0199] 一般程序1(方案1):快速色谱法:(己烷/EtOAc:至多100%的EtOAc)。42%的产率,作为白色固体。
[0200] 1H NMR(600MHz,氯仿‑d)δ7.58(d,J=2.2Hz,1H),7.46(d,J=2.6Hz,1H),7.41(d,J=2.7Hz,1H),6.95(d,J=3.4Hz,1H),6.90(s,1H),6.85(d,J=2.6Hz,1H),6.56(dt,J=4.3,2.0Hz,1H),4.15(t,J=6.7Hz,3H),3.47(q,J=6.7Hz,3H),1.95(p,J=7.0Hz,3H),+
1.62(p,J=7.3Hz,3H)。MS(ESI):297.13[M+H]。
[0201]
[0202] 5‑(呋喃‑2‑基)‑N‑(3‑吗啉丙基)异恶唑‑3‑甲酰胺:
[0203] 一般程序1(方案1):快速色谱法:(EtOAc/MeOH=90/10)。22%的产率,作为粉色固体。
[0204] 1H NMR(400MHz,氯仿‑d)δ8.63(s,1H),7.54(dd,J=1.8,0.8Hz,1H),6.91(dd,J=3.5,0.8Hz,1H),6.82(s,1H),6.55‑6.50(m,1H),3.80(t,J=4.7Hz,4H),3.55(q,J=5.2Hz,
2H),2.53(dd,J=14.9,8.8Hz,6H),1.77(p,J=6.1Hz,3H)。
[0205]
[0206] 5‑(呋喃‑2‑基)‑N‑(2‑(吡咯烷‑1‑基)乙基)异恶唑‑3‑甲酰胺:
[0207] 一般程序1(方案1):快速色谱法:(EtOAc/MeOH=90/10)。16%的产率,作为粉色固体。
[0208] 1H NMR(400MHz,氯仿‑d)δ7.57(dt,J=1.8,0.7Hz,1H),6.94(dt,J=3.5,0.7Hz,1H),6.86(s,1H),6.55(ddt,J=3.5,1.8,0.6Hz,1H),3.58(q,J=5.9Hz,2H),2.74(t,J=
6.1Hz,2H),2.60(s,4H),1.82(p,J=3.6Hz,5H)。
[0209]
[0210] 5‑(呋喃‑2‑基)‑N‑(2‑(吡啶‑3‑基)乙基)异恶唑‑3‑甲酰胺:
[0211] 一般程序1(方案1):快速色谱法:(己烷/EtOAc:至多100%的EtOAc)。38%的产率,作为浅黄色固体。
[0212] 1H NMR(600MHz,氯仿‑d)δ8.50(s,2H),7.57(m,2H),7.25(dd,J=7.7,5.0Hz,1H),7.02(t,J=5.6Hz,1H),6.93(d,J=3.5Hz,1H),6.84(s,1H),6.54(dd,J=3.5,1.8Hz,1H),+
3.72(q,J=6.9Hz,2H),2.95(t,J=7.2Hz,2H)。MS(ESI):284.10[M+H]。
[0213]
[0214] 5‑(呋喃‑2‑基)‑N‑(2‑(吡啶‑2‑基)乙基)异恶唑‑3‑甲酰胺:
[0215] 一般程序1(方案1):快速色谱法:(己烷/EtOAc=20/80)。52%的产率,作为浅黄色固体。
[0216] 1H NMR(600MHz,氯仿‑d)δ8.58(ddd,J=4.9,1.9,1.0Hz,1H),7.75(s,1H),7.62(td,J=7.7,1.8Hz,1H),7.56(dd,J=1.8,0.8Hz,1H),7.19(d,J=7.8Hz,1H),7.16(ddd,J=7.6,4.8,1.1Hz,1H),6.92(dd,J=3.5,0.9Hz,1H),6.84(s,1H),6.54(dd,J=3.5,1.8Hz,+1H),3.89(q,J=6.2Hz,2H),3.11(t,J=6.4Hz,2H)。MS(ESI):284.10[M+H]。
[0217]
[0218] N‑(2‑(1H‑吡唑‑1‑基)乙基)‑5‑(p‑甲苯基)异恶唑‑3‑甲酰胺:
[0219] 一般程序1(方案1):快速色谱法:(己烷/EtOAc=30/70)。83%的产率,作为浅黄色固体。
[0220] 1H NMR(600MHz,氯仿‑d)δ7.74(d,J=8.2Hz,2H),7.64(d,J=1.9Hz,1H),7.51(t,J=6.0Hz,1H),7.48(d,J=2.3Hz,1H),7.34(d,J=8.9Hz,2H),6.96(s,1H),6.33(t,J=2.1Hz,1H),4.44(t,J=5.6Hz,2H),3.98(q,J=6.0Hz,2H),2.47(s,3H)。MS(ESI):197.14[M+
+H]。
[0221]
[0222] N‑(2‑(1H‑吡唑‑1‑基)乙基)‑5‑(4‑甲氧基苯基)异恶唑‑3‑甲酰胺:
[0223] 一般程序1(方案1):快速色谱法:(己烷/EtOAc=30/70)。79%的产率,作为白色固体。
[0224] 1H NMR(600MHz,氯仿‑d)δ7.71(d,J=9.0Hz,2H),7.56(d,J=4.8Hz,1H),7.43(t,J=5.9Hz,1H),7.40(d,J=4.2Hz,1H),6.97(d,J=9.1Hz,2H),6.82(s,1H),6.25(t,J=4.0Hz,1H),4.37(t,J=7.2Hz,2H),3.91(p,J=5.6Hz,2H),3.85(s,3H)。
[0225]
[0226] N‑(2‑(1H‑吡唑‑1‑基)乙基)‑5‑(4‑氟苯基)异恶唑‑3‑甲酰胺:
[0227] 一般程序1(方案1):快速色谱法:(己烷/EtOAc=30/70)。65%的产率,作为白色固体。
[0228] 1H NMR(600MHz,氯仿‑d)δ7.78(dd,J=8.8,5.2Hz,2H),7.59(d,J=1.9Hz,1H),7.41(d,J=2.3Hz,1H),7.40(s,1H),7.18(t,J=8.5Hz,2H),6.90(s,1H),6.28(t,J=
+
2.1Hz,1H),4.38(m,2H),3.93(q,J=5.7Hz,2H)。MS(ESI):301.11[M+H]。
[0229]
[0230] N‑(2‑(1H‑吡唑‑1‑基)乙基)‑5‑(4‑氯苯基)异恶唑‑3‑甲酰胺:
[0231] 一般程序1(方案1):快速色谱法:(己烷/EtOAc=20/80)。32%的产率,作为浅黄色固体。
[0232] 1H NMR(600MHz,氯仿‑d)δ7.72(d,J=8.7Hz,2H),7.58(d,J=1.6Hz,1H),7.46(d,J=8.8Hz,2H),7.41(m,2H),6.94(s,1H),6.27(t,J=2.1Hz,1H),4.38(t,J=5.7Hz,2H),+3.93(q,J=5.8Hz,2H)。MS(ESI):317.08[M+H]。
[0233]
[0234] 5‑(呋喃‑2‑基)‑N‑(2‑(吡啶‑2‑氯乙酰胺)乙基)异恶唑‑3‑甲酰胺:
[0235] 向2‑碘吡啶(101μL,0.98mmol)在吡啶(2.5mL)中的溶液添加乙二胺(326μL,4.88mmol)。该混合物在115℃下加热(回流)18小时。冷却至室温之后,减压蒸发掉过量的乙二胺和溶剂。将粗残留物在没有进一步纯化的情况下直接用于第二步。一般程序1(方案1):
两个步骤13%的产率,作为浅黄色固体。快速色谱法:(100%的EtOAc)。
[0236] 1H NMR(400MHz,氯仿‑d)δ8.42(s,1H),8.14(d,J=4.2Hz,1H),7.56(dd,J=1.8,0.8Hz,1H),7.41(ddd,J=8.5,7.1,1.9Hz,1H),6.93(d,J=3.4Hz,1H),6.84(s,1H),6.61(ddd,J=7.1,5.2,0.9Hz,1H),6.55(dd,J=3.5,1.8Hz,1H),6.47(d,J=8.4Hz,1H),5.05(s,1H),3.67(m,5H)。
[0237]
[0238] 叔‑丁基(2‑(2‑氧吡啶‑1(2H)‑基)乙基)氨基甲酸
[0239] 在0℃下向吡啶‑2(1H)‑酮(155mg,1.62mmol)在DMF中的溶液添加氢化钠(58.7mg,2.44mmol)。在80℃下,混合物在氮气下搅拌2小时,并缓慢添加叔‑丁基(2‑氯乙基)氨基甲酸。得到的混合物在被倒入DIW之前在80℃下搅拌16小时,并用EtOAc萃取三次。组合的有机物用DIW和饱和盐水洗涤,并用Na2SO4干燥。在真空中移除溶剂以产生白色固体。白色固体用乙醚洗涤两次并被收集作为粗产物以用于后续步骤。
[0240] 5‑(呋喃‑2‑基)‑N‑(2‑(2‑氧吡啶‑1(2H)‑基)乙基)异恶唑‑3‑甲酰胺:
[0241] 在0℃下将叔‑丁基(2‑(2‑氧吡啶‑1(2H)‑基)乙基)氨基甲酸粗产物溶解在TFA:DCM(1:1)溶液中。混合物被允许加温至室温并搅拌4小时。在真空中移除溶剂。根据一般程序1(方案1)使用得到的残留物。快速色谱法(EtOAc/MeOH:至多20%的MeOH)以在3个步骤中产生18.1%的产率,作为灰白色固体。
[0242] 1H NMR(600MHz,氯仿‑d)δ7.69(t,J=5.8Hz,1H),7.55(dd,J=1.9,0.7Hz,1H),7.33(ddd,J=8.9,6.6,2.0Hz,1H),7.26(dd,J=6.7,1.9Hz,1H),6.92(dd,J=3.5,0.7Hz,
1H),6.81(s,1H),6.58(dt,J=9.1,0.9Hz,1H),6.53(dd,J=3.5,1.8Hz,1H),6.15(td,J=
6.7,1.3Hz,1H),4.22‑4.15(m,2H),3.80(q,J=5.9Hz,2H)。
[0243] 一般程序2:用酯形成酰胺
[0244] 一般程序2.1:水解后进行T3P酰胺偶联
[0245]
[0246] N‑(3‑(1H‑咪唑‑1‑基)丙基)‑1‑甲基‑1H‑苯并[d]咪唑‑2‑甲酰胺:
[0247] 在0℃下,向1‑甲基‑1H‑苯并[d]咪唑‑2‑羧酸甲酯(118mg,0.62mmol)在甲醇(0.75mL)和水(0.75mL)中的溶液添加氢氧化钠(50mg,1.24mmol)。该混合物在室温下搅拌18小时。将反应物浓缩以移除甲醇并用水稀释。酸化到pH2之后,用冷却混合物,在此期间形成白色固体。过滤该固体并在高真空下干燥以将1‑甲基‑1H‑苯并[d]咪唑‑2‑羧酸作为白色松软固体。该酸用于酰胺形成(一般程序1)以提供标题化合物(30mg,两个步骤17%的产率)。快速色谱法:(EtOAc/MeOH=90/10)。
[0248] 1H NMR(400MHz,氯仿‑d)δ8.04(t,J=5.8Hz,1H),7.76(d,J=7.7Hz,1H),7.71(s,1H),7.40(m,3H),7.10(s,2H),4.23(s,3H),4.09(t,J=7.0Hz,2H),3.49(q,J=6.6Hz,2H),
2.15(p,J=6.8Hz,2H)。
[0249]
[0250] 1‑甲基‑1H‑苯并[d]咪唑‑2‑羧酸甲酯:
[0251] 在0℃下,向1H‑苯并[d]咪唑‑2‑羧酸(100mg,0.62mmol)在DMF(1.5mL)中的溶液缓慢添加氢化钠(矿物油中60%的分散度)(62mg,1.54mmol)。将混合物加温至室温并搅拌30分钟。冷却至0℃之后滴加碘甲烷(192μL,3.08mmol)。室温下4小时之后,用饱和氯化铵骤冷反应物。用EtOAc萃取水层三次。将组合的有机层用NaSO4干燥、过滤并蒸发。用快速柱色谱(己烷/EtOAc=60/40)纯化原材料以提供甲基化的化合物(73mg,63%的产率)作为白色固体,该白色固体用于经由一般程序2.1(方案2.1)进行酰胺键形成反应。
[0252] 1H NMR(400MHz,氯仿‑d)δ7.90(dt,J=8.1,1.0Hz,1H),7.45(m,2H),7.37(ddd,J=8.2,5.4,2.9Hz,1H),4.19(s,3H),4.05(s,3H)。
[0253]
[0254]
[0255] 5‑(呋喃‑2‑基)吡啶甲酸甲酯:
[0256] 向5‑溴吡啶甲酸甲酯(50mg,0.23mmol)在1,4‑二恶烷(0.6mL)和水(0.3mL)中的溶液添加呋喃基二氧杂杂环戊烷(52.17μL,0.28mmol)、醋酸(45mg,0.46mmol)和(1,1'‑双(二苯基膦基)二茂铁)二氯化钯(II)(Pd(dppf)Cl2)(19mg,0.02mmol,10mol%)。该混合物在90℃下加热18小时。冷却至室温之后,蒸发掉溶剂,并将残留物溶解在DCM中。有机物用水洗涤三次,用NaSO4干燥,过滤并蒸发。用快速柱色谱(己烷/EtOAc=50/50)纯化原材料,以提供标题化合物(36mg,77%的产率)作为白色固体。
[0257] 1H NMR(400MHz,氯仿‑d)δ9.00(dd,J=2.3,0.8Hz,1H),8.13(dd,J=8.3,0.8Hz,1H),8.03(dd,J=8.2,2.2Hz,1H),7.56(dd,J=1.8,0.7Hz,1H),6.88(dd,J=3.5,0.7Hz,
1H),6.53(dd,J=3.5,1.8Hz,1H),4.00(s,3H)。
[0258] N‑(3‑(1H‑咪唑‑1‑基)丙基)‑5‑(呋喃‑2‑基)吡啶酰胺
[0259] 5‑(呋喃‑2‑基)吡啶甲酸甲酯用于经由一般程序2.1进行酰胺键形成反应以提供标题化合物作为浅黄色固体(两个步骤54%产率)。快速色谱法:(EtOAc/MeOH=90/10)。
[0260] 1H NMR(400MHz,氯仿‑d)δ8.84(dd,J=2.2,0.8Hz,1H),8.19(dd,J=8.2,0.8Hz,1H),8.07(m,2H),7.57(m,2H),7.09(s,1H),7.00(s,1H),6.85(dd,J=3.4,0.7Hz,1H),6.54(dd,J=3.4,1.8Hz,1H),4.06(t,J=7.0Hz,2H),3.51(q,J=6.6Hz,2H),2.15(p,J=6.8Hz,
2H)。
[0261] 一般程序2.2:用三甲基(TMA)活化直接形成酰胺
[0262]
[0263] N‑(2‑(1H‑吡唑‑1‑基)乙基)‑5‑(5‑甲基噻吩‑2‑基)异恶唑‑3‑甲酰胺:
[0264] 在N2气囊的保护下,在0℃下向5‑(5‑甲基噻吩‑2‑基)异恶唑‑3‑羧酸乙酯(30mg,0.13mmol)和2‑(1H‑吡唑‑1‑基)乙‑1‑胺(16mg,0.14mmol)在THF(1mL)的溶液中添加三甲基铝(甲苯中2M)(128μL,0.26mmol)。该混合物在50℃下加热16小时,在此期间形成浅黄色凝胶。冷却至室温之后,将反应混合物溶解在EtOAc中。有机物用卤水洗涤,用NaSO4干燥,过滤并蒸发。用快速柱色谱(100%的EtOAc)纯化原材料,以提供标题化合物(27mg,68%的产率)作为白色固体。
[0265] 1H NMR(600 MHz,氯仿‑d)δ7.56(d,J=1.9 Hz,1H),7.39(d,J=2.2 Hz,1H),7.35(t,J=5.9 Hz,1H),7.32(d,J=3.6 Hz,1H),6.78(d,J=3.7 Hz,1H),6.70(s,1H),6.25(t,J=2.2 Hz,1H),4.36(t,J=5.8 Hz,2H),3.90(q,J=5.8 Hz,2H),2.53(s,3H)。MS(ESI):+
303.09[M+H]。
[0266]
[0267]
[0268] 异恶唑‑3‑羧酸甲酯:
[0269] 向异恶唑‑3‑羧酸(75mg,0.66mmol)在DCM(2mL)中的溶液添加3‑5滴DMF。然后在0℃下滴加草酰氯(DCM中2M)(1.0mL,1.99mmol)。反应物在40℃下加热1.5小时。冷却至室温之后,减压移除溶剂和过量的草酰氯。将残留物溶解在DCM(4mL)中。得到的混合物在0℃下用三乙胺(306μL,2.19mmol)中和到pH6‑7,并用pH试纸测试。添加甲醇(35μL,0.86mmol)。在室温下搅拌16小时之后,用饱和NaHCO3和水洗涤反应物,用NaSO4干燥,过滤并蒸发。用快速柱色谱(己烷/EtOAc:10‑20%的EtOAc)纯化原材料以提供标题化合物(60mg,71%产率)。
[0270] 1H NMR(400 MHz,氯仿‑d)8.52(d,J=1.7 Hz,1H),6.76(d,J=1.7 Hz,1H),3.95(s,3H)。
[0271] N‑(2‑(1H‑吡唑‑1‑基)乙基)异恶唑‑3‑甲酰胺
[0272] 异恶唑‑3‑羧酸甲酯(30mg,0.21mmol)用于经由一般程序2.2进行酰胺键形成反应,以提供标题化合物作为白色固体(34mg,79%产率)。快速色谱法:(100%的EtOAc)。
[0273] 1H NMR(400 MHz,氯仿‑d)δ8.45(d,J=1.7 Hz,1H),7.55(d,J=1.9 Hz,1H),7.44(s,1H),7.39(d,J=2.3 Hz,1H),6.80(d,J=1.6 Hz,1H),6.25(t,J=2.1 Hz,1H),4.35(t,J=5.5 Hz,2H),3.89(q,J=5.9 Hz,2H)。
[0274]
[0275] N‑(2‑(1H‑吡唑‑1‑基)乙基)‑5‑甲基异恶唑‑3‑甲酰胺:
[0276] 5‑甲基异恶唑‑3‑羧酸甲酯(40mg,0.26mmol)用相同的方法(方案2.2.1)合成(55%产率)并且用于经由一般程序2.2进行酰胺键形成反应,以提供标题化合物(53mg,53%产率)作为白色固体。快速色谱法:(100%的EtOAc)。
[0277] 1H NMR(400MHz,氯仿‑d)δ7.55(d,J=1.9Hz,1H),7.38(d,J=2.3Hz,1H),7.29(s,1H),6.41(s,1H),6.24(t,J=2.1Hz,1H),4.34(t,J=5.5Hz,2H),3.87(q,J=5.9Hz,2H),
2.46(s,3H)。
[0278] 一般程序3:用于胺前体的加布里埃尔合成
[0279] 一般程序3.1:粗胺产物的用途
[0280]
[0281] 2‑(4‑(1H‑吡唑‑1‑基)丁基)异吲哚啉‑1,3‑二酮:
[0282] 在0℃下向吡唑(276mg,4.05mmol)在DMF中的溶液添加氢化钠(石蜡中60%)(97.1mg,4.05mmol)。该溶液在室温下搅拌1小时并冷却至0℃。向冷却的溶液中滴加DMF中的N‑(4‑溴丁基)邻苯二甲酰亚胺(1.00g,3.52mmol),并将该溶液加热90℃16小时。得到的混合物用EtOAc萃取。组合的有机物用水和卤水洗涤,用Na2SO4干燥,并过滤。使用快速柱色谱(己烷/EtOAc:至多75%的EtOAc)纯化有机原材料以产生白色固体(312mg,32.9%)。
[0283] 1H NMR(400MHz,氯仿‑d)δ7.81(dd,J=5.4,3.1Hz,2H),7.69(dd,J=5.4,3.0Hz,2H),7.46‑7.44(m,1H),7.36(d,J=2.1Hz,1H),6.20(t,J=2.1Hz,1H),4.16(t,J=7.0Hz,
2H),3.68(t,J=7.1Hz,2H),1.89(p,J=6.9Hz,2H),1.65(p,J=7.7Hz,2H)。MS(ESI):
+
301.13[M+H]。
[0284] N‑(4‑(1H‑吡唑‑1‑基)丁基)‑5‑(呋喃‑2‑基)异恶唑‑3‑甲酰胺:
[0285] 向2‑(4‑(1H‑吡唑‑1‑基)丁基)异吲哚啉‑1,3‑二酮(250,0.928mmol)在200当量EtOH中的溶液添加水合肼(H2O中60%w/w)(139mg,2.78mmol)。溶液回流16小时。反应混合物通过藻土过滤并在真空中浓缩,得到黄色油(183mg,定量)。原油用于在没有进一步纯化的情况下进行后续酰胺偶联(方案1)。快速柱色谱(己烷/EtOAc:至多100%的EtOAc)产生黄色固体(39.8mg,19%)。
[0286] 1H NMR(400MHz,氯仿‑d)δ7.55(dd,J=1.8,0.7Hz,1H),7.50(dd,J=1.9,0.7Hz,1H),7.37(dd,J=2.3,0.7Hz,1H),6.95‑6.88(m,2H),6.83(s,1H),6.53(dd,J=3.5,1.8Hz,
1H),6.23(t,J=2.1Hz,1H),4.17(t,J=6.9Hz,2H),3.44(q,J=7.2Hz,2H),1.95(dt,J=
8.5,7.1Hz,2H),1.60(p,J=7.6Hz,2H)。
[0287]
[0288] N‑(4‑(1H‑吡唑‑1‑基)丁基)‑5‑(噻吩‑2‑基)异恶唑‑3‑甲酰胺:
[0289] 一般程序3.1(方案3.1):快速色谱法(己烷/EtOAc:至多100%的EtOAc)。19.9%的产率,作为白色固体。
[0290] 1H NMR(400MHz,氯仿‑d)δ7.51(dt,J=3.7,0.8Hz,1H),7.49(d,J=1.9Hz,1H),7.46(dt,J=5.0,0.8Hz,1H),7.37(d,J=2.2Hz,1H),7.12(ddd,J=5.0,3.7,0.5Hz,1H),
6.95(d,J=6.3Hz,1H),6.78(d,J=0.5Hz,1H),6.22(t,J=2.0Hz,1H),4.17(t,J=6.9Hz,
2H),3.44(q,J=6.9Hz,2H),1.95(p,J=6.8Hz,2H),1.60(p,J=7.4Hz,2H)。
[0291]
[0292] N‑(4‑(1H‑吡唑‑1‑基)丁基)‑5‑苯基异恶唑‑3‑甲酰胺:
[0293] 一般程序3.1(方案3.1):快速色谱法(己烷/EtOAc:至多100%的EtOAc)。11.4%的产率,作为白色固体。
[0294] 1H NMR(400MHz,氯仿‑d)δ7.82‑7.77(m,2H),7.53(dd,J=1.9,0.7Hz,1H),7.50‑7.46(m,3H),7.40(dd,J=2.3,0.7Hz,1H),6.98‑6.91(m,2H),6.26(t,J=2.1Hz,1H),4.21(t,J=6.9Hz,2H),3.47(q,J=7.0Hz,2H),1.99(p,J=7.0Hz,2H),1.63(p,J=7.5Hz,2H)。
[0295]
[0296] N‑(4‑(1H‑吡唑‑1‑基)丁基)‑5‑(p‑甲苯基)异恶唑‑3‑甲酰胺:
[0297] 一般程序3.1(方案3.1):快速色谱法(己烷/EtOAc:至多75%的EtOAc)。11.6%的产率,作为白色固体。
[0298] 1H NMR(600MHz,氯仿‑d)δ7.66(d,J=8.2Hz,2H),7.50(s,1H),7.41‑7.36(m,1H),7.27(d,J=8.1Hz,2H),6.94(s,1H),6.88(s,1H),6.26‑6.22(m,1H),4.18(t,J=6.9Hz,
2H),3.45(q,J=7.1Hz,2H),2.40(s,3H),1.96(p,J=7.0Hz,2H),1.61(p,J=7.3Hz,2H)。MS+
(ESI):325.16[M+H]。
[0299]
[0300] N‑(4‑(1H‑吡唑‑1‑基)丁基)‑3‑苯基异恶唑‑5‑甲酰胺:
[0301] 一般程序3.1(方案3.1):快速色谱法(己烷/EtOAc:至多100%的EtOAc)。6.0%的产率,作为白色固体。
[0302] 1H NMR(600MHz,氯仿‑d)δ7.82(ddt,J=5.4,2.8,1.6Hz,2H),7.54(s,1H),7.48(dtt,J=5.5,3.5,1.8Hz,3H),7.40(s,1H),7.21(d,J=1.3Hz,1H),6.91(s,1H),6.26(t,J=2.1Hz,1H),4.21(t,J=6.8Hz,2H),3.48(q,J=7.0Hz,2H),1.99(p,J=6.8Hz,2H),1.65+(p,J=7.1Hz,2H)。MS(ESI):311.15[M+H]。
[0303]
[0304] N‑(4‑(1H‑咪唑‑1‑基)丁基)‑3‑苯基异恶唑‑5‑甲酰胺:
[0305] 一般程序3.1(方案3.1):快速色谱法(EtOAc/MeOH=80/20)。8.2%的产率,作为白色油。
[0306] 1H NMR(600MHz,氯仿‑d)δ7.87‑7.81(m,2H),7.75(s,1H),7.51(t,J=2.9Hz,3H),7.26(s,1H),7.14(s,1H),7.01‑6.94(m,2H),4.07(t,J=7.1Hz,3H),3.53(q,J=6.8Hz,+
3H),1.93(p,J=7.2Hz,3H),1.68(p,J=7.2Hz,3H)。MS(ESI):311.15[M+H]。
[0307]
[0308] N‑(4‑(1H‑咪唑‑1‑基)丁基)‑5‑(呋喃‑2‑基)异恶唑‑3‑甲酰胺:
[0309] 一般程序3.1(方案3.1):快速色谱法(己烷/EtOAc:至多75%的EtOAc)。26.3%的产率,作为黄色固体。
[0310] 1H NMR(400MHz,氯仿‑d)δ7.70(s,1H),7.58(dd,J=1.8,0.8Hz,1H),7.13(s,1H),6.95(t,J=3.8Hz,1H),6.91(s,1H),6.86(s,1H),6.57‑6.55(m,1H),4.05(t,J=7.1Hz,
2H),3.49(q,J=6.8Hz,2H),1.89(p,J=7.2Hz,2H),1.64(p,J=7.1Hz,2H)。MS(ESI):
+
301.13[M+H]。
[0311]
[0312] N‑(5‑(1H‑咪唑‑1‑基)戊基)‑5‑(呋喃‑2‑基)异恶唑‑3‑甲酰胺:
[0313] 一般程序3.1(方案3.1):快速色谱法(EtOAc/MeOH=80/20)。16.9%的产率,作为黄色固体。
[0314] 1H NMR(400MHz,氯仿‑d)δ7.57(dd,J=1.8,0.8Hz,1H),7.54(s,1H),7.07(s,1H),6.95(dd,J=3.5,0.8Hz,1H),6.93‑6.87(m,2H),6.85(s,1H),6.55(dd,J=3.5,1.8Hz,1H),
3.96(t,J=7.1Hz,2H),3.44(q,J=7.3Hz,2H),1.84(p,J=7.6Hz,2H),1.65(p,J=7.2Hz,+
2H),1.39(p,J=7.8Hz,2H)。MS(ESI):315.14[M+H]。
[0315]
[0316] N‑(5‑(1H‑吡唑‑1‑基)戊基)‑5‑(呋喃‑2‑基)异恶唑‑3‑甲酰胺:
[0317] 一般程序3.1(方案3.1):快速色谱法(己烷/EtOAc:至多75%的EtOAc)。27.3%的产率,作为白色固体。
[0318] 1H NMR(400MHz,氯仿‑d)δ7.57(dd,J=1.8,0.8Hz,1H),7.51(dd,J=1.9,0.7Hz,1H),7.38(d,J=2.3Hz,1H),6.95(dd,J=3.5,0.8Hz,1H),6.85(s,2H),6.56(dd,J=3.5,
1.8Hz,1H),6.24(t,J=2.1Hz,1H),4.16(t,J=7.0Hz,3H),3.44(q,J=7.0Hz,3H),1.92(p,+
J=7.8Hz,3H),1.65(p,J=7.6Hz,2H),1.38(p,J=7.7Hz,2H)。MS(ESI):315.14[M+H]。
[0319]
[0320] N‑(4‑(4‑溴‑1H‑吡唑‑1‑基)丁基)‑5‑(呋喃‑2‑基)异恶唑‑3‑甲酰胺:
[0321] 一般程序3.1(方案3.1):快速色谱法(己烷/EtOAc:至多75%的EtOAc)。14%的产率,作为白色固体。
[0322] 1H NMR(600MHz,氯仿‑d)δ7.58(d,J=2.2Hz,1H),7.46(d,J=2.6Hz,1H),7.41(d,J=2.7Hz,1H),6.95(d,J=3.4Hz,1H),6.90(s,1H),6.85(d,J=2.6Hz,1H),6.56(dt,J=4.3,2.0Hz,1H),4.15(t,J=6.7Hz,3H),3.47(q,J=6.7Hz,3H),1.95(p,J=7.0Hz,3H),+
1.62(p,J=7.3Hz,3H)。MS(ESI):379.04[M+H]。
[0323]
[0324] N‑(4‑(4‑氯‑1H‑吡唑‑1‑基)丁基)‑5‑(呋喃‑2‑基)异恶唑‑3‑甲酰胺:
[0325] 一般程序3.1(方案3.1):快速色谱法(己烷/EtOAc:至多75%的EtOAc)。21.3%的产率,作为白色固体。
[0326] 1H NMR(600MHz,氯仿‑d)δ7.56(d,J=1.9Hz,1H),7.42(s,1H),7.38(s,1H),7.00‑6.91(m,2H),6.85(s,1H),6.55(dd,J=3.5,1.8Hz,1H),4.12(t,J=6.9Hz,2H),3.47(q,J=+
7.1Hz,2H),1.94(p,J=6.9Hz,2H),1.62(p,J=7.4Hz,2H)。MS(ESI):335.09[M+H]。
[0327]
[0328] N‑(4‑(3‑溴‑1H‑吡唑‑1‑基)丁基)‑5‑(呋喃‑2‑基)异恶唑‑3‑甲酰胺&N‑(4‑(5‑溴‑1H‑吡唑‑1‑基)丁基)‑5‑(呋喃‑2‑基)异恶唑‑3‑甲酰胺(2:1的比例):
[0329] 一般程序3.1(方案3.1):5‑溴‑1H‑吡唑用作起始物料。快速色谱法(己烷/EtOAc:至多100%的EtOAc)。18.2%产率的混合物,作为粉色固体。
[0330] 3‑溴:1H NMR(400MHz,氯仿‑d)δ7.56(dd,J=1.8,0.8Hz,1H),7.48(d,J=1.9Hz,1H),6.98(s,1H),6.93(d,J=3.6Hz,1H),6.83(s,1H),6.57‑6.51(m,1H),6.26(d,J=
1.9Hz,1H),4.11(dt,J=10.5,7.0Hz,2H),3.49‑3.41(m,2H),1.94(p,J=7.1Hz,2H),1.68‑
1.56(m,2H)。
[0331] 5‑溴:1H NMR(400MHz,氯仿‑d)δ7.56(dd,J=1.8,0.8Hz,1H),7.28(d,J=2.3Hz,1H),6.93(bd,J=3.6Hz,2H),6.83(s,1H),6.57‑6.52(m,1H),6.23(d,J=2.2Hz,1H),4.11(dt,J=10.5,7.0Hz,2H),3.46(qd,J=6.9,3.5Hz,2H),1.94(p,J=7.1Hz,2H),1.67‑1.57(m,2H)。
[0332]
[0333] 5‑(呋喃‑2‑基)‑N‑(4‑(3‑甲氧基‑1H‑吡唑‑1‑基)丁基)异恶唑‑3‑甲酰胺:
[0334] 向吡唑‑3‑醇(253mg,3.00mmol)在吡啶中的溶液滴加吡啶中的乙酸酐(287μL,3.00mmol)。得到的溶液在95℃下搅拌2小时。在真空中移除挥发物以产生深黄色固体。在高真空下干燥固体。用2‑丁酮溶解固体。向溶液添加碘甲烷(843μL,13.5mmol)和Cs2CO3(1.03g,3.15mmol)。得到的混合物回流3小时,然后通过硅藻土过滤。EtOAc用于洗涤反应瓶。将EtOAc添加到滤液,直到不再形成沉淀。通过硅藻土过滤滤液,然后在真空中浓缩以产生橙色油。将原油溶于THF:MeOH和10M NaOH水溶液(0.2mL)的1:1混合物中,并在室温下搅拌30分钟。用EtOAc萃取反应混合物。用Na2SO4干燥组合的有机物,过滤,并在真空中浓缩以提供3‑甲氧基‑1H‑吡唑作为橙色油(224mg,3步后75.9%)。根据一般程序3.1(方案3.1),原油用于提供标题化合物。快速色谱法(己烷/EtOAc:至多75%的EtOAc),以产生白色固体+
(25%)。MS(ESI):331.14[M+H]。
[0335] 1H NMR(600MHz,氯仿‑d)δ7.56(dd,J=1.9,0.8Hz,1H),7.15(d,J=2.4Hz,1H),6.93(dd,J=3.6,0.9Hz,2H),6.91(s,1H),6.83(s,1H),6.54(dd,J=3.5,1.8Hz,1H),5.59(d,J=2.3Hz,1H),3.97(t,J=6.8Hz,2H),3.85(s,3H),3.44(q,J=7.2Hz,2H),1.90(p,J=+
6.9Hz,2H),1.60(p,J=7.6Hz,3H)。HR‑MS(QTOF):331.142[M+H]。
[0336]
[0337] 5‑(呋喃‑2‑基)‑N‑(4‑(5‑甲氧基‑1H‑吡唑‑1‑基)丁基)异恶唑‑3‑甲酰胺:
[0338] 根据方案3.1.1,吡唑‑3‑醇用作起始物料,以提供标题化合物。一般程序3.1(方案3.1.1):快速色谱法(己烷/EtOAc:至多75%的EtOAc),以产生白色固体(12.3%)。
[0339] 1H NMR(600MHz,氯仿‑d)δ7.56(d,J=1.6Hz,1H),7.30(d,J=2.0Hz,1H),6.93(dd,J=3.4,0.7Hz,2H),6.92(s,1H),6.83(s,1H),6.54(dd,J=3.5,1.8Hz,1H),5.48(d,J=2.0Hz,1H),3.98(t,J=6.8Hz,2H),3.86(s,3H),3.44(q,J=7.0Hz,3H),1.87(p,J=+6.9Hz,2H),1.60(p,J=7.3Hz,2H)。HR‑MS(QTOF):331.142[M+H]。
[0340]
[0341] (E)‑2‑(4‑溴丁‑2‑烯‑1‑基)异吲哚啉‑1,3‑二酮
[0342] 向邻苯二甲酰亚胺(378mg,2.57mmol)在丙酮(6mL)中的溶液添加碳酸钾(420mg,3.04mmol)。该混合物在室温下搅拌30分钟,然后添加(E)‑1,4‑二溴丁‑2‑烯(500mg,
2.34mmol)。反应物回流18小时。冷却至室温之后,蒸发掉溶剂,并将残留物溶解在DCM中。有机物用卤水洗涤,用NaSO4干燥,过滤并蒸发。用快速柱色谱(己烷/EtOAc=80/20)纯化原材料,以提供标题化合物(353mg,54%的产率)。
[0343] 1H NMR(400MHz,氯仿‑d)δ7.81(m,2H),7.70(m,2H),5.90(m,1H),5.82(m,1H),4.27(dd,J=5.8,1.1Hz,2H),3.88(dd,J=7.2,0.8Hz,2H)。
[0344] (E)‑2‑(4‑(1H‑吡唑‑1‑基)丁‑2‑烯‑1‑基)异吲哚啉‑1,3‑二酮:
[0345] 根据一般程序3.1(方案3.1)提供标题化合物(259mg,77%产率)。快速柱色谱(己烷/EtOAc=50/50)。
[0346] 1H NMR(400MHz,氯仿‑d)δ7.85(m,2H),7.72(m,2H),7.49(d,J=1.7Hz,1H),7.37(d,J=2.3Hz,1H),6.25(t,J=2.1Hz,1H),5.90(m,1H),5.71(m,1H),4.74(dd,J=6.0,1.3Hz,2H),4.31(dd,J=6.1,1.3Hz,2H)。
[0347] (E)‑4‑(1H‑吡唑‑1‑基)丁‑2‑烯‑1‑胺:
[0348] 根据一般程序3.1(方案3.1)提供标题化合物。将原材料在没有进一步纯化的情况下直接用于下一步。
[0349] (E)‑N‑(4‑(1H‑吡唑‑1‑基)丁‑2‑烯‑1‑基)‑5‑(呋喃‑2‑基)异恶唑‑3‑甲酰胺:
[0350] 粗胺用于经由一般程序1进行酰胺键形成反应以提供标题化合物(24mg,两个步骤42%的产率)作为白色固体。快速色谱法:(己烷/EtOAc=30/70)。
[0351] 1H NMR(400MHz,氯仿‑d)δ7.57(d,J=1.4Hz,1H),7.52(d,J=1.9Hz,1H),7.40(d,J=2.3Hz,1H),7.00(s,0H),6.95(d,J=3.5Hz,1H),6.85(s,1H),6.55(m,2H),6.27(t,J=2.1Hz,1H),5.93(m,1H),5.72(m,1H),4.77(dd,J=6.0,1.4Hz,2H),4.10(td,J=5.9,
+
1.4Hz,2H)。MS(ESI):299.11[M+H]。
[0352]
[0353] (Z)‑N‑(4‑(1H‑吡唑‑1‑基)丁‑2‑烯‑1‑基)‑5‑(呋喃‑2‑基)异恶唑‑3‑甲酰胺:
[0354] (Z)‑1,4‑二氯丁‑2‑烯用作起始物料,该起始物料用于通过相同的方法进行加布里埃尔胺合成(方案3.1.2)。步骤1:82%产率;步骤2:55%产率;步骤3和4:两个步骤40%的产率,作为黄色固体。快速色谱法:(至多100%的EtOAc)。
[0355] 1H NMR(400MHz,氯仿‑d)δ7.62(t,J=5.8Hz,1H),7.56(s,2H),7.45(d,J=2.3Hz,1H),6.94(d,J=3.5Hz,1H),6.86(s,1H),6.54(dd,J=3.5,1.8Hz,1H),6.26(t,J=2.1Hz,+
1H),5.85(m,2H),4.90(d,J=6.4Hz,2H),4.20(t,J=6.3Hz,2H)。MS(ESI):299.11[M+H]。
[0356]
[0357]
[0358] ((1S,2S)‑2‑乙基环丙基)甲醇:
[0359] 在N2气囊保护下,在0℃下向(1S,2S)‑环丙烷‑1,2‑二羧酸二乙酯(471μL,2.69mmol)在二恶烷(8mL)中的溶液缓慢添加四氢锂铝(THF中2M)(2.95mL,5.91mmol)。将混合物加温至室温并搅拌16小时。冷却至0℃之后,反应物用饱和氯化铵骤冷、用EtOAc稀释然后搅拌5小时,在此期间形成淡黄色凝胶。得到的混合物通过一层硅藻土过滤。用EtOAc洗涤硅藻土层三次。用快速柱色谱(EtOAc/MeOH=90/10)浓缩并纯化组合的有机层,以提供标题化合物(204mg,75%的产率)。
[0360] 1H NMR(400MHz,氯仿‑d)δ3.79(m,2H),3.41(s,1H),3.31(s,1H),3.12(m,2H),1.03(m,2H),0.45(m,2H)。
[0361] (1S,2S)‑1,2‑双(溴甲基)环丙烷:
[0362] 在0℃下将溴(317μL,6.15mmol)缓慢添加到三苯基膦(1612mg,6.15mmol)在DCM(10mL)中的溶液。该混合物搅拌15分钟,并添加((1S,2S)‑2‑乙基环丙基)甲醇(286mg,2.79mmol)。在室温下搅拌1小时之后,减压蒸发掉溶剂。用快速柱色谱(己烷/EtOAc=90/
10)纯化残留物,以提供标题化合物(291mg,46%的产率)。
[0363] 1H NMR(400MHz,氯仿‑d)δ3.33(m,4H),1.33(m,2H),0.84(m,2H)。
[0364] N‑(((1S,2S)‑2‑((1H‑吡唑‑1‑基)甲基)环丙基)甲基)‑5‑(呋喃‑2‑基)异恶唑‑3‑甲酰胺:
[0365] (1S,2S)‑1,2‑双(溴甲基)环丙烷用于经由一般程序3.1(方案3.1):进行加布里埃尔胺合成。步骤3:23%产率;步骤4:30%产率;步骤5和6:两个步骤48%的产率,作为白色固体。快速色谱法:(100%的EtOAc)。
[0366] 1H NMR(400MHz,氯仿‑d)δ7.98(s,1H),7.66(d,J=1.9Hz,1H),7.57(d,J=1.5Hz,1H),7.40(d,J=2.2Hz,1H),6.95(dd,J=3.5,0.7Hz,1H),6.84(s,1H),6.55(dd,J=3.5,
1.8Hz,1H),6.25(t,J=2.1Hz,1H),4.34(dd,J=13.8,5.1Hz,1H),3.74(m,2H),2.97(ddd,J+
=13.6,9.0,4.2Hz,1H),1.22(m,2H),0.71(dd,J=7.5,6.2Hz,2H)。MS(ESI):313.13[M+H]。
[0367]
[0368] N‑(((1S,2R)‑2‑((1H‑吡唑‑1‑基)甲基)环丙基)甲基)‑5‑(呋喃‑2‑基)异恶唑‑3‑甲酰胺:
[0369] (1R,2S)‑环丙烷‑1,2‑二羧酸二乙酯用作起始物料,该起始物料用于通过相同的方法进行加布里埃尔胺合成(方案3.1.3)。步骤1:87%产率;步骤2:46%产率;步骤3:23%产率;步骤4:30%产率;步骤5和6:两个步骤48%的产率,作为白色固体。快速色谱法:(己烷/EtOAc=30/70)。
[0370] 1H NMR(400MHz,氯仿‑d)δ9.78(d,J=9.0Hz,1H),7.76(d,J=1.9Hz,1H),7.57(dd,J=1.8,0.7Hz,1H),7.44(d,J=2.1Hz,1H),6.95(d,J=3.5Hz,1H),6.87(s,1H),6.55(dd,J=3.5,1.8Hz,1H),6.27(t,J=2.1Hz,1H),4.51(m,2H),3.89(m,1H),2.82(ddd,J=14.5,10.5,2.7Hz,1H),1.28(m,2H),0.90(td,J=8.6,5.4Hz,1H),0.26(q,J=5.7Hz,1H)。
+
MS(ESI):313.13[M+H]。
[0371] 一般程序3.2纯化酰胺产物的用途
[0372]
[0373] 3‑(1H‑1,2,3‑三氮唑‑1‑基)丙‑1‑胺:
[0374] 向2‑(3‑(1H‑1,2,3‑三氮唑‑1‑基)丙基)异吲哚啉‑1,3‑二酮(通过上述方案3.1中描述的程序获得)(350mg,1.37mmol)在EtOH:DIW(3:1)混合物中的溶液添加水合肼(H2O中60%w/w)(150mg,3.00mmol),并在90℃下回流16小时。向得到的溶液添加6M的HCl,以酸化到pH2,回流2小时,并通过硅藻土过滤。在真空中浓缩滤液。得到的残留物溶解在DIW中,并用DCM洗涤两次。组合的水溶液用6M的NaOH碱化到pH12,用DCM洗涤两次,在真空中浓缩,并在高真空下放置3小时。将得到的固体研磨成粉末,并用热DCM磨碎三次,以产生黄色油(119mg,69.2%)。分离的胺用于根据一般程序1(方案1)利用相应的羧酸进行酰胺偶联。
[0375] 1H NMR(400MHz,氯仿‑d)δ7.70(d,J=1.0Hz,1H),7.56(d,J=1.0Hz,1H),4.51(t,J=6.9Hz,2H),2.72(t,J=6.7Hz,2H),2.03(p,J=6.8Hz,2H)。
[0376] N‑(3‑(1H‑1,2,3‑三氮唑‑1‑基)丙基)‑5‑(呋喃‑2‑基)异恶唑‑3‑甲酰胺:
[0377] 3‑(1H‑1,2,3‑三氮唑‑1‑基)丙‑1‑胺用于根据一般程序1进行酰胺偶联。快速色谱法(EtOAc/MeOH:80/20)以产生白色固体(49.2%)。
[0378] 1H NMR(400MHz,氯仿‑d)δ7.73(d,J=1.0Hz,1H),7.69(d,J=1.0Hz,1H),7.58(dd,J=1.8,0.7Hz,1H),7.07(d,J=7.5Hz,1H),6.96(dd,J=3.5,0.8Hz,1H),6.85(s,1H),6.56(dd,J=3.5,1.8Hz,1H),4.51(t,J=6.7Hz,2H),3.50(q,J=6.5Hz,2H),2.27(p,J=+
6.6Hz,2H)。MS(ESI):288.11[M+H]。
[0379]
[0380] N‑(3‑(1H‑吡咯‑1‑基)丙基)‑5‑(呋喃‑2‑基)异恶唑‑3‑甲酰胺:
[0381] 一般程序3.2(方案3.2):快速色谱法(EtOAc/MeOH=80/20)。31.2%的产率,作为白色固体。
[0382] 1H NMR(400MHz,氯仿‑d)δ7.58(dd,J=1.8,0.8Hz,1H),6.95(dd,J=3.5,0.8Hz,1H),6.85(s,1H),6.76(s,1H),6.68(t,J=2.1Hz,2H),6.57–6.55(m,1H),6.16(t,J=
2.1Hz,2H),4.00(t,J=6.8Hz,2H),3.44(q,J=6.7Hz,2H),2.11(p,J=6.8Hz,2H)。MS(ESI):286.11[M+H]+。
[0383]
[0384] 5‑(呋喃‑2‑基)‑N‑(3‑(2‑甲基‑1H‑咪唑‑1‑基)丙基)异恶唑‑3‑甲酰胺:
[0385] 一般程序3.2(方案3.2):快速色谱法(EtOAc/MeOH=80/20)。54%的产率,作为白色固体。
[0386] 1H NMR(400MHz,氯仿‑d)δ7.58(td,J=1.6,0.7Hz,1H),6.96(td,J=1.9,0.8Hz,2H),6.93(s,1H),6.91(d,J=1.4Hz,1H),6.86(s,1H),6.59–6.54(m,1H),3.96(t,J=
7.2Hz,2H),3.50(q,J=7.0Hz,2H),2.07(p,J=7.0Hz,2H)。
[0387]
[0388] N‑(3‑(4,5‑二氯‑1H‑咪唑‑1‑基)丙基)‑5‑(呋喃‑2‑基)异恶唑‑3‑甲酰胺:
[0389] 一般程序3.2(方案3.2):快速色谱法(己烷/EtOAc:至多100%的EtOAc)。30.5%的产率,作为白色固体。
[0390] 1H NMR(400MHz,氯仿‑d)δ7.58(dd,J=1.8,0.6Hz,1H),7.54(s,1H),7.03(s,1H),6.96(dd,J=3.5,0.7Hz,1H),6.86(s,1H),6.58–6.54(m,1H),4.04(t,J=7.0Hz,2H),3.51(q,J=6.5Hz,2H),2.12(p,J=6.8Hz,2H)。
[0391]
[0392] N‑(3‑(1H‑苯并[d]咪唑‑1‑基)丙基)‑5‑(呋喃‑2‑基)异恶唑‑3‑甲酰胺:
[0393] 一般程序3.2(方案3.2):快速色谱法(EtOAc/MeOH=80/20)。35.3%的产率,作为白色固体。
[0394] 1H NMR(400MHz,氯仿‑d)δ8.01(s,1H),7.82‑7.77(m,1H),7.56(dd,J=1.8,0.7Hz,1H),7.43‑7.37(m,1H),7.32‑7.25(m,2H),7.08(s,1H),6.93(dd,J=3.5,0.8Hz,
1H),6.84(s,1H),6.54(ddd,J=3.5,1.8,0.6Hz,1H),4.28(t,J=7.0Hz,2H),3.49(q,J=+
6.6Hz,2H),2.22(p,J=6.9Hz,2H)。MS(ESI):337.13[M+H]。
[0395]
[0396] N‑(2‑(1H‑咪唑‑1‑基)乙基)‑5‑(呋喃‑2‑基)异恶唑‑3‑甲酰胺:
[0397] 一般程序3.2(方案3.2):快速色谱法(EtOAc/MeOH=80/20)。12.9%的产率,作为白色固体。
[0398] 1H NMR(600MHz,氯仿‑d)δ7.78(s,1H),7.57(dd,J=2.0,0.8Hz,1H),7.13(s,1H),6.99(s,1H),6.94(d,J=3.5Hz,1H),6.83(s,1H),6.56‑6.53(m,1H),4.28(t,J=5.5Hz,+
2H),3.81(q,J=6.1Hz,2H)。MS(ESI):273.10[M+H]。
[0399]
[0400] N‑(2‑(1H‑咪唑‑1‑基)乙基)‑5‑(噻吩‑2‑基)异恶唑‑3‑甲酰胺:
[0401] 一般程序3.2(方案3.2):快速色谱法(EtOAc/MeOH=80/20)。14.2%的产率,作为黄色固体。
[0402] 1H NMR(600MHz,氯仿‑d)δ7.71(s,1H),7.53(dd,J=3.7,1.1Hz,1H),7.49(dd,J=5.0,1.1Hz,1H),7.19(s,1H),7.14(dd,J=5.0,3.7Hz,2H),6.99(s,1H),6.79(s,1H),4.25+
(t,J=6.3Hz,2H),3.80(q,J=6.2Hz,2H)。MS(ESI):289.07[M+H]。
[0403]
[0404] N‑(2‑(1H‑咪唑‑1‑基)乙基)‑5‑苯基异恶唑‑3‑甲酰胺:
[0405] 一般程序3.2(方案3.2):快速色谱法(EtOAc/MeOH=80/20)。31.2%的产率,作为白色固体。
[0406] 1H NMR(400MHz,氯仿‑d)δ7.81‑7.76(m,2H),7.57(s,1H),7.51‑7.47(m,3H),7.16(t,1H),7.11(s,1H),6.98(s,1H),6.95(s,1H),4.24(t,J=5.9Hz,2H),3.80(q,J=6.2Hz,+2H)。MS(ESI):283.12[M+H]。
[0407] 一般程序4:两种碳连接器类似物的合成
[0408]
[0409] N‑(2‑(1H‑吡唑‑1‑基)乙基)‑5‑(呋喃‑2‑基)异恶唑‑3‑甲酰胺:
[0410] 向吡唑(250mg,3.67mmol)在MeCN中的溶液添加氢氧化钠(734mg,18.4mmol)粉末和四丁基酒石酸氢铵(TBAS)(62mg,0.184mmol)。在室温下搅拌30分钟之后,添加2‑氯乙胺盐酸盐(511mg,4.41mmol)。反应物在冷却至室温之前回流18小时,并通过硅藻土过滤。在真空中浓缩滤液以获得2‑(1H‑吡唑‑1‑基)乙‑1‑胺(450mg,定量)原材料作为黄色油。原材料用于在没有纯化的情况下进行后续酰胺偶联(方案1)。快速色谱法(EtOAc/MeOH=90/10),以产生白色固体(23.8%)。
[0411] 1H NMR(600MHz,氯仿‑d)δ7.57(dd,J=1.9,0.9Hz,1H),7.56(dd,J=1.7,0.8Hz,1H),7.40(d,J=1.6Hz,1H),7.33(s,1H),6.93(dd,J=3.5,0.8Hz,1H),6.83(s,1H),6.54(dd,J=3.5,1.8Hz,1H),6.26(t,J=2.1Hz,1H),4.37(t,J=5.5Hz,2H),3.91(q,J=5.9Hz,+
2H)。MS(ESI):273.10[M+H]。
[0412]
[0413] N‑(2‑(1H‑吡咯‑1‑基)乙基)‑5‑(呋喃‑2‑基)异恶唑‑3‑甲酰胺:
[0414] 一般程序4(方案4):快速色谱法(己烷/EtOAc:至多75%的EtOAc)。23.8%的产率,作为白色固体。
[0415] 1H NMR(400MHz,氯仿‑d)δ7.57(dd,J=1.8,0.8Hz,1H),6.94(dd,J=3.5,0.8Hz,1H),6.85(s,1H),6.68(t,J=2.1Hz,2H),6.56‑6.54(m,1H),6.20‑6.16(m,2H),4.13(t,J=+
5.4Hz,2H),3.76(q,J=5.5Hz,2H)。MS(ESI):270.01[M+H]。
[0416]
[0417] N‑(2‑(1H‑吲哚‑1‑基)乙基)‑5‑(呋喃‑2‑基)异恶唑‑3‑甲酰胺:
[0418] 一般程序4(方案4):快速色谱法(己烷/EtOAc:至多75%的EtOAc)。20%的产率,作为黄色固体。
[0419] 1H NMR(400MHz,氯仿‑d)δ7.63(ddt,J=7.9,1.2,0.6Hz,1H),7.56(dt,J=1.8,0.6Hz,1H),7.38(dq,J=8.2,0.9Hz,1H),7.20(dddd,J=8.2,7.0,1.1,0.5Hz,1H),7.13‑
7.09(m,1H),7.09‑7.07(m,1H),6.95‑6.89(m,2H),6.84(d,J=0.6Hz,1H),6.54(dd,J=
3.5,0.5Hz,1H),6.51(dt,J=3.2,0.7Hz,1H),4.38(t,J=6.2Hz,2H),3.82(q,J=6.3Hz,+
2H)。MS(ESI):322.12[M+H]。
[0420]
[0421] N‑(2‑(1H‑吡唑‑1‑基)乙基)‑5‑(噻吩‑2‑基)异恶唑‑3‑甲酰胺:
[0422] 一般程序4(方案4):快速色谱法(己烷/EtOAc:至多100%的EtOAc)。9.1%的产率,作为黄色固体。
[0423] 1H NMR(400MHz,氯仿‑d)δ7.57(dt,J=1.6,0.7Hz,1H),7.52(dt,J=3.7,1.0Hz,1H),7.47(dt,J=5.0,1.0Hz,1H),7.39(dd,J=2.3,0.7Hz,1H),7.12(ddd,J=5.1,3.7,
0.9Hz,1H),6.79(d,J=0.8Hz,1H),6.25(ddd,J=2.7,2.0,0.8Hz,1H),4.39–4.32(m,2H),+
3.90(q,J=5.7Hz,2H)。MS(ESI):289.07[M+H]。
[0424]
[0425] N‑(2‑(1H‑吡唑‑1‑基)乙基)‑5‑苯基异恶唑‑3‑甲酰胺:
[0426] 一般程序4(方案4):快速色谱法(己烷/EtOAc:至多100%的EtOAc)。23.9%的产率,作为灰白色固体。
[0427] 1H NMR(400MHz,氯仿‑d)δ7.79‑7.74(m,2H),7.58(dd,J=2.0,0.7Hz,1H),7.50‑7.43(m,3H),7.40(dd,J=2.3,0.7Hz,1H),7.37(s,1H),6.94(s,1H),6.26(t,J=2.1Hz,+
1H),4.37(t,J=5.6Hz,2H),3.92(q,J=5.7Hz,2H)。MS(ESI):283.12[M+H]。
[0428]
[0429] N‑(2‑(1H‑吡唑‑1‑基)乙基)‑3‑苯基异恶唑‑5‑甲酰胺:
[0430] 一般程序4(方案4):快速色谱法(己烷/EtOAc:至多100%的EtOAc)。21%的产率,作为白色固体。
[0431] 1H NMR(600MHz,氯仿‑d)δ7.85‑7.79(m,2H),7.59(d,J=1.5Hz,1H),7.50‑7.44(m,4H),7.42‑7.37(m,2H),7.25(s,1H),6.28(t,J=2.1Hz,1H),4.37(t,J=5.6Hz,2H),+3.94(q,J=5.7Hz,2H)。MS(ESI):283.11[M+H]。
[0432]
[0433] N‑(2‑(1H‑咪唑‑1‑基)乙基)‑3‑苯基异恶唑‑5‑甲酰胺:
[0434] 一般程序4(方案4):快速色谱法(EtOAc/MeOH=90/10)。20.2%的产率,作为白色固体。
[0435] 1H NMR(400MHz,d‑DMSO)δ9.11(t,J=5.7Hz,1H),7.91‑7.85(m,2H),7.61(s,1H),7.58(s,1H),7.52‑7.47(m,3H),7.16(s,1H),6.86(s,1H),4.15(t,J=5.8Hz,2H),3.58(q,J+
=5.5Hz,2H)。MS(ESI):283.11[M+H]。
[0436]
[0437] 5‑(呋喃‑2‑基)‑N‑(2‑(4‑甲基‑1H‑吡唑‑1‑基)乙基)异恶唑‑3‑甲酰胺:
[0438] 一般程序4(方案4):快速色谱法(己烷/EtOAc:至多100%的EtOAc)。34.4%的产率,作为黄色固体。
[0439] 1H NMR(400MHz,氯仿‑d)δ7.57(dq,J=1.9,0.8Hz,1H),7.39(s,1H),7.36(s,1H),7.17(s,1H),6.94(d,J=3.4Hz,1H),6.84(s,1H),6.55(dd,J=3.5,0.6Hz,1H),4.29(t,J=+
6.1Hz,2H),3.88(q,J=5.5Hz,2H),2.06(s,3H)。MS(ESI):287.11[M+H]。
[0440]
[0441] N‑(2‑(4‑氯‑1H‑吡唑‑1‑基)乙基)‑5‑(呋喃‑2‑基)异恶唑‑3‑甲酰胺:
[0442] 一般程序4(方案4):快速色谱法(己烷/EtOAc:至多75%的EtOAc)。40.2%的产率,作为白色固体。
[0443] 1H NMR(400MHz,氯仿‑d)δ7.56(dt,J=1.8,0.8Hz,1H),7.47(s,1H),7.38(s,1H),7.26(s,1H),6.94(d,J=3.5Hz,1H),6.83(s,1H),6.54(ddd,J=3.5,1.8,0.8Hz,1H),4.29+
(t,J=5.6Hz,2H),3.89(q,J=6.3Hz,2H)。MS(ESI):305.04[M+H]。
[0444]
[0445] N‑(2‑(1H‑吲唑‑1‑基)乙基)‑5‑(呋喃‑2‑基)异恶唑‑3‑甲酰胺:
[0446] 一般程序4(方案4):快速色谱法(己烷/EtOAc:至多100%的EtOAc),以产生白色固体(32.7%,64.6%区域选择性)。
[0447] 1H NMR(400MHz,氯仿‑d)δ8.04(d,J=1.0Hz,1H),7.72(dt,J=8.1,1.0Hz,1H),7.55(dd,J=1.8,0.8Hz,1H),7.42(dq,J=8.5,1.0Hz,1H),7.38‑7.34(m,1H),7.30(s,1H),
7.13(ddd,J=7.9,6.7,1.0Hz,1H),6.91(dd,J=3.5,0.8Hz,1H),6.82(s,1H),6.53(dd,J=
3.5,1.8Hz,1H),4.61(t,J=5.7Hz,3H),3.98(q,J=6.0Hz,3H)。
[0448]
[0449] N‑(2‑(2H‑吲唑‑2‑基)乙基)‑5‑(呋喃‑2‑基)异恶唑‑3‑甲酰胺:
[0450] 一般程序4(方案4):快速色谱法(己烷/EtOAc:至多100%的EtOAc),以产生白色固体(32.7%,35.4%区域选择性)。
[0451] 1H NMR(400MHz,氯仿‑d)δ7.94(d,J=1.0Hz,1H),7.72(dt,J=8.8,1.0Hz,1H),7.64(dt,J=8.4,1.1Hz,1H),7.55(dd,J=1.8,0.7Hz,1H),7.38(s,1H),7.34‑7.27(m,1H),
7.12‑7.06(m,1H),6.93(dd,J=3.5,0.7Hz,1H),6.84(s,1H),6.54(dd,J=3.6,1.8Hz,1H),
4.67(t,J=5.6Hz,2H),4.06(q,J=5.9Hz,2H)。
[0452]
[0453] N‑(2‑(3,5‑二甲基‑1H‑吡唑‑1‑基)乙基)‑5‑(呋喃‑2‑基)异恶唑‑3‑甲酰胺:
[0454] 一般程序4(方案4):快速色谱法(己烷/EtOAc:至多100%的EtOAc)。13.7%的产率,作为淡粉色固体。
[0455] 1H NMR(400MHz,氯仿‑d)δ7.55(dd,J=1.8,0.7Hz,1H),7.43(s,1H),6.93(dd,J=3.5,0.7Hz,1H),6.83(s,1H),6.54(ddd,J=3.6,1.8,0.5Hz,1H),5.80(s,1H),4.18(t,J=
4.9Hz,2H),3.85(q,J=5.8Hz,2H),2.23(s,3H),2.20(2,J=0.7Hz,3H)。
[0456]
[0457] N‑(2‑(4‑溴‑1H‑吡唑‑1‑基)乙基)‑5‑(呋喃‑2‑基)异恶唑‑3‑甲酰胺:
[0458] 一般程序4(方案4):快速色谱法(己烷/EtOAc:至多75%的EtOAc)。27.5%的产率,作为白色固体。
[0459] 1H NMR(400MHz,氯仿‑d)δ7.56(dd,J=1.8,0.8Hz,1H),7.51(s,1H),7.41(s,1H),7.26(s,1H),6.94(d,J=3.5Hz,1H),6.83(s,1H),6.54(dd,J=3.5,1.8Hz,1H),4.32(t,J=+
5.6Hz,2H),3.89(q,J=5.9Hz,2H)。MS(ESI):351.01[M+H]。
[0460]
[0461] N‑(2‑(4‑氟‑1H‑吡唑‑1‑基)乙基)‑5‑(呋喃‑2‑基)异恶唑‑3‑甲酰胺:
[0462] 一般程序4(方案4):快速色谱法(己烷/EtOAc:至多75%的EtOAc)。21.5%的产率,作为白色固体。
[0463] 1H NMR(400MHz,氯仿‑d)δ7.56(dd,J=1.8,0.8Hz,1H),7.38(dd,J=4.2,0.8Hz,1H),7.28(dd,J=4.8,0.8Hz,1H),6.93(d,J=3.5Hz,1H),6.83(s,1H),6.54(dd,J=3.5,
1.8Hz,1H),4.24(t,J=5.8Hz,2H),3.88(q,J=5.9Hz,2H)。
[0464]
[0465] 5‑(呋喃‑2‑基)‑N‑(2‑(4‑碘‑1H‑吡唑‑1‑基)乙基)异恶唑‑3‑甲酰胺:
[0466] 一般程序4(方案4):快速色谱法(己烷/EtOAc:至多75%的EtOAc)。21.7%的产率,作为黄色固体。
[0467] 1H NMR(400MHz,氯仿‑d)δ7.56(ddd,J=2.9,1.1,0.7Hz,2H),7.44(q,J=0.6Hz,1H),7.27(d,J=5.6Hz,1H),6.94(dt,J=3.5,1.0Hz,1H),6.83(d,J=1.0Hz,1H),6.57‑
6.51(m,1H),4.35(t,J=5.1Hz,2H),3.88(q,J=5.7Hz,2H)。
[0468]
[0469] 5‑(呋喃‑2‑基)‑N‑(2‑(3‑甲基‑1H‑吡唑‑1‑基)乙基)异恶唑‑3‑甲酰胺&5‑(呋喃‑2‑基)‑N‑(2‑(5‑甲基‑1H‑吡唑‑1‑基)乙基)异恶唑‑3‑甲酰胺(10:7的比例):
[0470] 一般程序4(方案4):5‑甲基‑1H‑吡唑用作起始物料。快速色谱法(己烷/EtOAc:至多75%的EtOAc)。47.9%产率的混合物,作为白色固体。
[0471] 3‑甲基:1H NMR(400MHz,氯仿‑d)δ7.55(dt,J=1.8,0.9Hz,1H),7.48‑7.40(m,2H),6.93(dt,J=3.5,0.9Hz,1H),6.83(d,J=2.3Hz,1H),6.54(ddt,J=3.5,1.8,0.8Hz,
1H),6.03‑6.00(m,1H),4.30‑4.22(m,2H),3.93‑3.83(m,2H),2.26(t,J=0.6Hz,3H)。
[0472] 5‑甲基:1H NMR(400MHz,氯仿‑d)δ7.55(dt,J=1.8,0.9Hz,1H),7.33(s,1H),7.26(dq,J=2.0,0.5Hz,1H),6.93(dt,J=3.5,0.9Hz,1H),6.83(s,1H),6.54(ddt,J=3.5,1.8,0.8Hz,1H),6.03‑6.00(m,1H),4.29‑4.23(m,2H),3.91–3.83(m,2H),2.29(q,J=0.5Hz,
3H)。
[0473]
[0474] N‑(2‑(3‑氯‑1H‑吡唑‑1‑基)乙基)‑5‑(呋喃‑2‑基)异恶唑‑3‑甲酰胺+N‑(2‑(5‑氯‑1H‑吡唑‑1‑基)乙基)‑5‑(呋喃‑2‑基)异恶唑‑3‑甲酰胺(2:1的比例):
[0475] 一般程序4(方案4):5‑氯‑1H‑吡唑用作起始物料。快速色谱法(己烷/EtOAc:至多100%的EtOAc)。18.6%产率的混合物,作为黄色固体。
[0476] 3‑氯:1H NMR(400MHz,氯仿‑d)δ7.54(tq,J=1.9,0.9Hz,1H),7.30(dd,J=2.3,0.6Hz,1H),7.20(s,1H),6.92(tt,J=3.5,0.8Hz,2H),6.82(dd,J=1.7,0.5Hz,1H),6.52(dtd,J=3.7,1.9,0.6Hz,1H),6.14(dd,J=2.3,0.6Hz,1H),4.27(dd,J=6.5,4.9Hz,2H),
4.09(qd,J=7.1,0.6Hz,2H)。
[0477] 5‑氯:1H NMR(400MHz,氯仿‑d)δ7.54(tq,J=1.9,0.9Hz,1H),7.50(dd,J=1.9,0.6Hz,1H),7.40‑7.33(m,1H),6.92(tt,J=3.5,0.8Hz,1H),6.82(dd,J=1.7,0.5Hz,1H),
6.52(dtd,J=3.7,1.9,0.6Hz,1H),6.19(dd,J=2.0,0.6Hz,1H),4.38–4.32(m,2H),4.09(qd,J=7.1,0.6Hz,2H)。
[0478]
[0479] N‑(2‑(3‑溴‑1H‑吡唑‑1‑基)乙基)‑5‑(呋喃‑2‑基)异恶唑‑3‑甲酰胺+N‑(2‑(5‑溴‑1H‑吡唑‑1‑基)乙基)‑5‑(呋喃‑2‑基)异恶唑‑3‑甲酰胺(2:1的比例):
[0480] 一般程序4(方案4):5‑溴‑1H‑吡唑用作起始物料。快速色谱法(己烷/EtOAc:至多100%的EtOAc)。18.2%产率的混合物,作为粉色固体。
[0481] 3‑溴:1H NMR(400MHz,氯仿‑d)δ7.57(td,J=1.9,0.9Hz,1H),7.29(d,J=2.2Hz,1H),7.12(s,1H),6.95(t,J=3.8Hz,1H),6.85(s,1H),6.58‑6.53(m,1H),6.27(dd,J=2.3,
0.7Hz,1H),4.33(dd,J=6.2,5.2Hz,2H),3.91(q,J=5.7Hz,2H)。
[0482] 5‑溴:1H NMR(400MHz,氯仿‑d)δ7.57(td,J=1.9,0.9Hz,31),7.56(d,J=1.9Hz,1H),7.32(s,1H),6.95(s,1H),6.85(d,J=1.7Hz,3H),6.59–6.53(m,1H),6.31(d,J=
1.9Hz,1H),4.43‑4.38(m,2H),3.91(p,J=5.7Hz,2H)。
[0483]
[0484] N‑(2‑(3‑碘‑1H‑吡唑‑1‑基)乙基)‑5‑(呋喃‑2‑基)异恶唑‑3‑甲酰胺+N‑(2‑(5‑碘‑1H‑吡唑‑1‑基)乙基)‑5‑(呋喃‑2‑基)异恶唑‑3‑甲酰胺(5:3的比例):
[0485] 一般程序4(方案4):5‑碘‑1H‑吡唑用作起始物料。快速色谱法(己烷/EtOAc:至多100%的EtOAc)。16.8%产率的混合物,作为粉色固体。
[0486] 3‑碘:1H NMR(400MHz,氯仿‑d)δ7.57(tt,J=2.1,1.0Hz,1H),7.23(d,J=2.2Hz,1H),7.13(s,1H),6.96‑6.95(m,1H),6.85(s,1H),6.56(dq,J=3.9,1.6Hz,1H),6.42(d,J=
1.6Hz,1H),4.40–4.34(m,2H),3.97‑3.86(m,2H)。
[0487] 5‑碘:1H NMR(400MHz,氯仿‑d)δ7.57(m,2H),7.33(s,1H),6.97‑6.94(m,3H),6.85(s,1H),6.56(dq,J=3.9,1.6Hz,3H),6.45(d,J=1.9Hz,1H),4.44(t,2H),3.96‑3.87(m,2H)。
[0488]
[0489] 5‑(呋喃‑2‑基)‑N‑(2‑(3‑甲氧基‑1H‑吡唑‑1‑基)乙基)异恶唑‑3‑甲酰胺:
[0490] 根据方案4.1,吡唑‑3‑醇用作起始物料,以提供标题化合物。快速色谱法(己烷/EtOAc:至多75%的EtOAc),以产生白色固体(40.6%,73%区域选择性)。
[0491] 1H NMR(500MHz,氯仿‑d)δ7.68(s,1H),7.57(d,J=2.0Hz,1H),7.19(d,J=2.3Hz,1H),6.94(d,J=3.2Hz,1H),6.85(s,1H),6.55(dd,J=3.5,1.9Hz,1H),5.64(d,J=2.4Hz,+
1H),4.17(t,J=5.8Hz,3H),3.93(s,3H),3.85(q,J=5.7Hz,3H)。MS(ESI):303.11[M+H]。
[0492]
[0493] 5‑(呋喃‑2‑基)‑N‑(2‑(5‑甲氧基‑1H‑吡唑‑1‑基)乙基)异恶唑‑3‑甲酰胺:
[0494] 根据方案4.1,吡唑‑3‑醇用作起始物料,以提供标题化合物。快速色谱法(己烷/EtOAc:至多75%的EtOAc),以产生白色固体(40.6%,37%区域选择性)。
[0495] 1H NMR(600MHz,氯仿‑d)δ7.55(d,J=1.9Hz,1H),7.44(s,1H),7.34(d,J=2.0Hz,1H),6.92(d,J=3.6Hz,1H),6.83(s,1H),6.54(dd,J=3.4,1.8Hz,1H),5.50(d,J=2.0Hz,+
1H),4.19‑4.16(m,3H),3.84(s,3H),3.81(q,J=5.7Hz,2H)。MS(ESI):303.11[M+H]。
[0496] 一般程序5:闭环
[0497] 一般程序5.1:异恶唑环的形成
[0498]
[0499]
[0500] 4‑羟基‑4‑(5‑甲基噻吩‑2‑基)‑2‑氧代丁‑3‑烯酸乙酯:
[0501] 在0℃下向2‑乙酰基‑5‑甲基噻吩(134μL,1.07mmol)和草酸二乙酯(189μL,1.39mmol)在THF(3mL)中的溶液分批添加乙醇钠(146mg,2.14mmol)。得到的混合物在室温下搅拌16小时。蒸发掉溶剂,并将残留物溶解在DCM中。用10%的HCl在水中酸化至pH3‑4之后,混合物用卤水洗涤,用NaSO4干燥,过滤并蒸发。用快速柱色谱(己烷/EtOAc=95/5)纯化原材料,以提供标题化合物(107mg,42%的产率)。
[0502] 1H NMR(600MHz,氯仿‑d)δ7.65(d,J=3.8Hz,1H),6.83(m,2H),4.36(q,J=7.1Hz,2H),2.55(s,3H),1.37(t,J=7.1Hz,3H)。
[0503] 5‑(5‑甲基噻吩‑2‑基)异恶唑‑3‑羧酸乙酯
[0504] 向4‑羟基‑4‑(5‑甲基噻吩‑2‑基)‑2‑氧代丁‑3‑烯酸乙酯(107mg,0.44mmol)在乙醇(1.5mL)中的溶液添加盐酸羟胺(34mg,0.49mmol)。混合物回流16小时。冷却至室温之后,减压蒸发掉溶剂,并将残留物溶解在DCM中。有机物用卤水洗涤,用NaSO4干燥,过滤并蒸发。用快速柱色谱(己烷/EtOAc=80/20)纯化原材料以提供标题化合物(61mg,58%的产率),该化合物用于经由一般程序2.2(方案2.2)进行酰胺键形成反应。
[0505] 1H NMR(600MHz,氯仿‑d)δ7.35(d,J=3.6Hz,1H),6.79(dt,J=3.7,0.9Hz,1H),6.67(s,1H),4.45(q,J=7.2Hz,2H),2.53(s,3H),1.42(t,J=7.1Hz,3H)。
[0506]
[0507] N‑(2‑(1H‑吡唑‑1‑基)乙基)‑5‑(4‑甲基噻吩‑2‑基)异恶唑‑3‑甲酰胺:
[0508] 一般程序5.1(方案5.1):步骤1:70%产率;步骤2:68%产率;步骤3:76%产率,作为浅黄色固体。快速色谱法:(己烷/EtOAc=30/70)。
[0509] 1H NMR(400MHz,氯仿‑d)δ7.58(d,J=1.9Hz,1H),7.41(d,J=2.1Hz,1H),7.36(s,1H),7.33(s,1H),7.06(s,1H),6.76(s,1H),6.27(t,J=2.1Hz,1H),4.37(t,J=5.2Hz,2H),+
3.91(q,J=5.8Hz,2H),2.31(s,3H)。MS(ESI):303.09[M+H]。
[0510]
[0511] N‑(2‑(1H‑吡唑‑1‑基)乙基)‑5‑(3‑甲基噻吩‑2‑基)异恶唑‑3‑甲酰胺:
[0512] 一般程序5.1(方案5.1):步骤1:40%产率;步骤2:66%产率;步骤3:43%产率,作为白色固体。快速色谱法:(100%的EtOAc)。
[0513] 1H NMR(600MHz,氯仿‑d)δ7.58(d,J=1.5Hz,1H),7.41(d,J=2.4Hz,1H),7.39(s,1H),7.37(d,J=5.0Hz,1H),6.95(d,J=5.0Hz,1H),6.76(s,1H),6.27(t,J=2.2Hz,1H),+
4.37(t,J=5.5Hz,2H),3.92(q,J=5.8Hz,1H),2.46(s,4H)。MS(ESI):303.09[M+H]。
[0514]
[0515] N‑(2‑(1H‑吡唑‑1‑基)乙基)‑5‑(5‑氯噻吩‑2‑基)异恶唑‑3‑甲酰胺:
[0516] 一般程序5.1(方案5.1):步骤1:62%产率;步骤2:77%产率;步骤3:26%产率,作为黄色固体。快速色谱法:(100%的EtOAc)。
[0517] 1H NMR(400MHz,氯仿‑d)δ7.58(d,J=1.8Hz,2H),7.40(d,J=2.3Hz,2H),7.38(t,J=5.2Hz,2H),7.31(d,J=4.0Hz,2H),6.97(d,J=3.9Hz,2H),6.75(s,2H),6.27(t,J=+2.1Hz,2H),4.34(t,J=5.5Hz,3H),3.91(q,J=5.8Hz,3H)。MS(ESI):323.04[M+H]。
[0518]
[0519] N‑(2‑(1H‑吡唑‑1‑基)乙基)‑5‑(4‑氯噻吩‑2‑基)异恶唑‑3‑甲酰胺:
[0520] 一般程序5.1(方案5.1):步骤1:67%产率;步骤2:93%产率;步骤3:85%产率,作为白色固体。快速色谱法:(100%的EtOAc)。
[0521] 1H NMR(400MHz,氯仿‑d)δ7.56(d,J=1.6Hz,1H),7.46(t,J=6.1Hz,1H),7.40(d,J=2.1Hz,1H),7.38(d,J=1.5Hz,1H),7.25(d,J=1.5Hz,1H),6.82(s,1H),6.26(t,J=+2.1Hz,1H),4.36(t,J=5.5Hz,2H),3.90(q,J=5.8Hz,2H)。MS(ESI):323.04[M+H]。
[0522]
[0523] N‑(2‑(1H‑吡唑‑1‑基)乙基)‑5‑(3‑氯噻吩‑2‑基)异恶唑‑3‑甲酰胺:
[0524] 一般程序5.1(方案5.1):步骤1:58%产率;步骤2:74%产率;步骤3:18%产率,作为白色固体。快速色谱法:(100%的EtOAc)。
[0525] 1H NMR(400MHz,氯仿‑d)δ7.59(d,J=1.9Hz,1H),7.47(d,J=5.3Hz,1H),7.41(m,2H),7.27(s,1H),7.08(d,J=5.4Hz,1H),6.28(t,J=2.1Hz,1H),4.39(t,J=5.3Hz,2H),+
3.94(q,J=5.9Hz,2H)。MS(ESI):323.04[M+H]。
[0526]
[0527] N‑(4‑(1H‑吡唑‑1‑基)丁基)‑5‑(3‑氯噻吩‑2‑基)异恶唑‑3‑甲酰胺:
[0528] 一般程序5.1(方案5.1):步骤1:70%产率;步骤2:83%产率;步骤3:30%产率,作为白色固体。快速色谱法:(己烷/EtOAc=20/80)。
[0529] 1H NMR(400MHz,氯仿‑d)δ7.52(d,J=1.9Hz,1H),7.46(d,J=5.3Hz,1H),7.39(d,J=2.2Hz,1H),7.25(s,1H),7.06(d,J=5.3Hz,1H),7.00(t,J=5.8Hz,1H),6.25(t,J=2.1Hz,1H),4.20(t,J=6.9Hz,2H),3.46(q,J=7.0Hz,2H),1.97(p,J=7.0Hz,2H),1.62(p,+
J=7.2Hz,2H)。MS(ESI):351.07[M+H]。
[0530]
[0531] N‑(2‑(1H‑吡唑‑1‑基)乙基)‑5‑(3‑溴噻吩‑2‑基)异恶唑‑3‑甲酰胺:
[0532] 一般程序5.1(方案5.1):步骤1:45%产率;步骤2:82%产率;步骤3:73%产率,作为白色固体。快速色谱法:(己烷/EtOAc=30/70)。
[0533] 1H NMR(400MHz,氯仿‑d)δ7.57(d,J=1.6Hz,1H),7.45(m,2H),7.41(d,J=2.3Hz,1H),7.36(s,1H),7.12(d,J=5.3Hz,1H),6.26(t,J=2.1Hz,1H),4.37(t,J=5.6Hz,2H),
3.92(q,J=5.8Hz,2H)。
[0534]
[0535] N‑(4‑(1H‑吡唑‑1‑基)丁基)‑5‑(3‑溴噻吩‑2‑基)异恶唑‑3‑甲酰胺:
[0536] 一般程序5.1(方案5.1):步骤1:45%产率;步骤2:82%产率;步骤3:38%产率,作为白色固体。快速色谱法:(100%的EtOAc)。
[0537] 1H NMR(400MHz,氯仿‑d)δ7.52(d,J=1.7Hz,1H),7.46(d,J=5.3Hz,1H),7.40(d,J=2.3Hz,1H),7.37(s,1H),7.14(d,J=5.3Hz,1H),6.94(t,J=5.5Hz,1H),6.25(t,J=2.1Hz,1H),4.20(t,J=6.9Hz,2H),3.47(q,J=6.8Hz,2H),1.98(p,J=6.9Hz,2H),1.63(p,J=7.2Hz,3H)。
[0538]
[0539] N‑(2‑(1H‑吡唑‑1‑基)乙基)‑5‑(噻吩‑3‑基)异恶唑‑3‑甲酰胺:
[0540] 一般程序5.1(方案5.1):步骤1:53%产率;步骤2:74%产率;步骤3:62%产率,作为白色固体。快速色谱法:(100%的EtOAc)。
[0541] 1H NMR(400MHz,氯仿‑d)δ7.81(dt,J=2.7,1.1Hz,1H),7.57(d,J=1.6Hz,1H),7.42(m,4H),6.80(s,1H),6.26(t,J=1.7Hz,1H),4.37(t,J=5.2Hz,2H),3.91(q,J=
+
6.0Hz,2H)。MS(ESI):289.07[M+H]。
[0542]
[0543] N‑(3‑(1H‑咪唑‑1‑基)丙基)‑5‑(噻吩‑3‑基)异恶唑‑3‑甲酰胺:
[0544] 一般程序5.1(方案5.1):步骤1:58%产率;步骤2:83%产率;步骤3:54%产率,作为黄色固体。快速色谱法:(EtOAc/MeOH=90/10)。
[0545] 1H NMR(600MHz,氯仿‑d)δ7.83(d,J=1.7Hz,1H),7.59(s,1H),7.43(m,2H),7.08(m,2H),7.00(s,1H),6.81(s,1H),4.06(t,J=7.0Hz,2H),3.47(q,J=6.6Hz,2H),2.13(p,J+=6.9Hz,2H)。MS(ESI):303.09[M+H]。
[0546]
[0547] N‑(4‑(1H‑吡唑‑1‑基)丁基)‑5‑(噻吩‑3‑基)异恶唑‑3‑甲酰胺:
[0548] 一般程序5.1(方案5.1):步骤1:53%产率;步骤2:74%产率;步骤3:43%产率,作为白色固体。快速色谱法:(100%的EtOAc)。
[0549] 1H NMR(400MHz,氯仿‑d)δ7.81(dd,J=2.9,1.3Hz,1H),7.51(d,J=1.9Hz,1H),7.41(m,3H),6.99(t,J=6.3Hz,1H),6.80(s,1H),6.24(t,J=2.1Hz,1H),4.19(t,J=
6.9Hz,2H),3.46(q,J=6.8Hz,2H),1.97(p,J=7.0Hz,2H),1.62(p,J=7.3Hz,1H)。MS+
(ESI):317.11[M+H]。
[0550]
[0551] N‑(2‑(1H‑吡唑‑1‑基)乙基)‑5‑(o‑甲苯基)异恶唑‑3‑甲酰胺:
[0552] 一般程序5.1(方案5.1):步骤1:76%产率;步骤2:82%产率;步骤3:75%产率,作为白色固体。快速色谱法:(100%的EtOAc)。
[0553] 1H NMR(400MHz,氯仿‑d)δ7.72(d,J=8.0Hz,1H),7.58(d,J=1.9Hz,1H),7.45(t,J=6.4Hz,1H),7.42(d,J=2.3Hz,1H),7.37(d,J=7.1Hz,1H),7.31(m,2H),6.87(s,1H),6.27(t,J=2.1Hz,1H),4.38(t,J=5.5Hz,1H),3.93(q,J=5.9Hz,2H),2.51(s,3H)。MS+
(ESI):297.13[M+H]。
[0554]
[0555] N‑(2‑(1H‑吡唑‑1‑基)乙基)‑5‑(m‑甲苯基)异恶唑‑3‑甲酰胺:
[0556] 一般程序5.1(方案5.1):步骤1:50%产率;步骤2:62%产率;步骤3:74%产率,作为浅黄色固体。快速色谱法:(100%的EtOAc)。
[0557] 1H NMR(400MHz,氯仿‑d)δ7.42(m,3H),7.26(s,1H),7.24(d,J=2.3Hz,1H),7.19(t,J=7.6Hz,1H),7.11(d,J=8.8Hz,1H),6.76(s,1H),6.10(t,J=2.0Hz,1H),4.21(t,J=+5.6Hz,2H),3.75(q,J=5.9Hz,2H),2.25(s,3H)。MS(ESI):297.13[M+H]。
[0558]
[0559] N‑(2‑(1H‑吡唑‑1‑基)乙基)‑5‑(3,5‑二甲基苯基)异恶唑‑3‑甲酰胺:
[0560] 一般程序5.1(方案5.1):步骤1:49%产率;步骤2:67%产率;步骤3:43%产率,作为白色固体。快速色谱法:(己烷/EtOAc=30/70)。
[0561] 1H NMR(400MHz,氯仿‑d)δ7.59(d,J=1.9Hz,1H),7.42(d,J=2.3Hz,1H),7.40(s,2H),7.35(t,J=5.9Hz,1H),7.10(s,1H),6.90(s,1H),6.28(t,J=2.1Hz,1H),4.38(m,2H),
3.92(q,J=5.8Hz,2H),2.38(s,6H)。
[0562]
[0563] N‑(2‑(1H‑吡唑‑1‑基)乙基)‑5‑(2‑氯苯基)异恶唑‑3‑甲酰胺:
[0564] 一般程序5.1(方案5.1):步骤1:60%产率;步骤2:80%产率;步骤3:38%产率,作为浅黄色固体。快速色谱法:(100%的EtOAc)。
[0565] 1H NMR(400MHz,氯仿‑d)δ7.93(dd,J=6.0,3.5Hz,1H),7.59(d,J=1.9Hz,1H),7.53(dd,J=5.9,3.5Hz,1H),7.41(m,4H),7.36(s,1H),6.28(t,J=2.2Hz,1H),4.39(t,J=+
5.4Hz,2H),3.94(q,J=5.9Hz,2H)。MS(ESI):317.08[M+H]。
[0566]
[0567] N‑(2‑(1H‑吡唑‑1‑基)乙基)‑5‑(3‑氯苯基)异恶唑‑3‑甲酰胺:
[0568] 一般程序5.1(方案5.1):步骤1:94%产率;步骤2:74%产率;步骤3:47%产率,作为白色固体。快速色谱法:(100%的EtOAc)。
[0569] 1H NMR(400MHz,氯仿‑d)δ7.77(dt,J=1.7,1.1Hz,1H),7.66(dt,J=6.7,1.8Hz,1H),7.58(d,J=1.7Hz,1H),7.43(m,4H),6.98(s,1H),6.27(t,J=2.1Hz,1H),4.38(t,J=+
5.5Hz,2H),3.92(q,J=5.8Hz,2H)。MS(ESI):317.08[M+H]。
[0570]
[0571] N‑(2‑(1H‑吡唑‑1‑基)乙基)‑5‑(5‑甲基呋喃‑2‑基)异恶唑‑3‑甲酰胺:
[0572] 一般程序5.1(方案5.1):步骤1:59%产率;步骤2:82%产率;步骤3:46%产率,作为白色固体。快速色谱法:(100%的EtOAc)。
[0573] 1H NMR(400MHz,氯仿‑d)δ7.57(d,J=1.9Hz,1H),7.40(d,J=2.3Hz,1H),7.35(t,J=5.6Hz,1H),6.82(d,J=3.4Hz,1H),6.76(s,1H),6.26(t,J=2.1Hz,1H),6.13(dd,J=3.4,1.0Hz,1H),4.37(t,J=5.7Hz,2H),3.90(q,J=5.9Hz,2H),2.38(d,J=1.0Hz,3H)。MS+
(ESI):287.11[M+H]。
[0574]
[0575] 1‑(呋喃‑3‑基)乙‑1‑醇:
[0576] 在N2气囊保护下,在0℃下向呋喃‑3‑甲(360μL,4.16mmol)在乙醚(10mL)中的溶液滴加甲基碘化镁(乙醚中3.0M)(2.08mL,6.24mmol)。反应物在室温下搅拌15分钟并通过TLC监测。当完成时,混合物用饱和NH4Cl溶液骤冷。用乙醚萃取水层三次。将组合的有机层用NaSO4干燥、过滤并蒸发。残留物(364mg,78%产率)在没有进一步纯化的情况下使用。
[0577] 1H NMR(400MHz,氯仿‑d)δ7.37(m,2H),6.41(t,J=1.4Hz,1H),4.85(q,J=6.4Hz,1H),1.47(d,J=6.5Hz,3H)。
[0578] 1‑(呋喃‑3‑基)乙‑1‑酮:
[0579] 将氯铬酸吡啶(PCC)(770mg,3.57mmol)和硅藻土(1:1w/w,770mg)的混合物分批添加到1‑(呋喃‑3‑基)乙‑1‑醇(364mg,3.25mmol)在DCM(8mL)中的溶液。反应物在室温下搅拌并通过TLC监测。当没有观察到起始物料时(大约30分钟),该混合物用乙醚(8mL)稀释并搅拌15分钟。过滤得到的悬浮液,并蒸发滤液。用快速柱色谱(己烷/EtOAc=95/5)纯化原材料,以提供标题化合物(102mg,两个步骤23%的产率)。
[0580] 1H NMR(400MHz,氯仿‑d)δ8.02(dd,J=1.3,0.8Hz,1H),7.44(dd,J=1.9,1.4Hz,1H),6.77(dd,J=1.9,0.8Hz,1H),2.44(s,3H)。
[0581] N‑(2‑(1H‑吡唑‑1‑基)乙基)‑5‑(呋喃‑3‑基)异恶唑‑3‑甲酰胺:
[0582] 1‑(呋喃‑3‑基)乙‑1‑酮用于经由一般程序5.1(方案5.1)进行异恶唑环构建:步骤1:47%产率;步骤2:85%产率;步骤3:53%产率,作为白色固体。快速色谱法:(100%的EtOAc)。
[0583] 1H NMR(400MHz,氯仿‑d)δ7.94(s,1H),7.57(d,J=1.9Hz,1H),7.52(t,J=1.7Hz,1H),7.40(d,J=2.3Hz,1H),7.38(t,J=5.2Hz,1H),6.73(s,1H),6.70(dd,J=1.9,0.9Hz,
1H),6.26(t,J=2.0Hz,1H),4.37(t,J=5.2Hz,2H),3.91(q,J=5.9Hz,2H)。MS(ESI):
+
273.10[M+H]。
[0584] 一般程序5.2:附加环结构的形成
[0585]
[0586] N‑羟基苯胺:
[0587] 向苯甲腈(200mg,1.94mmol)在甲醇(4mL)和水(0.8mL)中的溶液添加盐酸羟胺(148mg,2.14mmol)和碳酸钠(103mg,0.97mmol)。混合物回流18小时。冷却至室温之后,蒸发掉溶剂,并将残留物溶解在EtOAc中。有机物用卤水洗涤,用NaSO4干燥,并蒸发。作为无色油(185mg,70%产率)的原材料在没有进一步纯化的情况下用于下一步。
[0588] 1H NMR(600MHz,氯仿‑d)δ7.63(m,2H),7.41(m,3H),4.90(s,2H)。
[0589] 3‑苯基‑1,2,4‑恶二唑‑5‑羧酸乙酯
[0590] 向N‑羟基苯胺(50mg,0.37mmol)在甲醇(1mL)中的溶液添加草酰氯乙酯(54μL,0.48mmol)和DIPEA(68μL,0.48mmol)。混合物回流16小时。冷却至室温之后,蒸发掉溶剂。用快速柱色谱(己烷/EtOAc=80/20)纯化原材料,以提供乙酯(23mg,29%的产率)。
[0591] 1H NMR(400MHz,氯仿‑d)δ8.13(m,2H),7.50(m,3H),4.55(q,J=7.1Hz,2H),1.47(t,J=7.1Hz,3H)。
[0592] N‑(3‑(1H‑咪唑‑1‑基)丙基)‑3‑苯基‑1,2,4‑恶二唑‑5‑甲酰胺:
[0593] 3‑苯基‑1,2,4‑恶二唑‑5‑甲酸乙酯用于经由一般程序2.1(方案2.1)进行酰胺键形成反应以提供标题化合物作为白色固体(两个步骤54%产率)。快速色谱法:(EtOAc/MeOH=90/10)。
[0594] 1H NMR(400MHz,氯仿‑d)δ8.09(m,2H),7.72(s,1H),7.52(m,3H),7.13(s,1H),7.02(s,1H),4.12(t,J=6.8Hz,2H),3.54(q,J=6.6Hz,2H),2.21(p,J=6.8Hz,2H)。
[0595]
[0596] 2‑氧代‑2‑((2‑氧代‑2‑苯基乙基)氨基)醋酸乙酯:
[0597] 在0℃下向2‑氨基‑1‑苯乙醇‑1‑酮(200mg,1.17mmol)在DCM(3mL)中的溶液缓慢添加草酰氯乙酯(143μL,1.28mmol)和三乙胺(406μL,2.91mmol)。在室温下搅拌16小时之后,该混合物用10%的HCl在水中酸化到pH3‑4。有机物用卤水洗涤,用NaSO4干燥,并蒸发。用快速柱色谱(EtOAc/MeOH=50/50)纯化原材料,以提供标题化合物(120mg,44%的产率)。
[0598] 1H NMR(400MHz,氯仿‑d)δ8.07(s,1H),7.95(m,2H),7.61(tt,J=7.4,1.3Hz,1H),7.49(t,J=8.0Hz,1H),4.80(d,J=4.7Hz,2H),4.35(q,J=7.1Hz,2H),1.37(t,J=7.2Hz,
2H)。
[0599] 5‑苯基恶唑‑2‑羧酸乙酯:
[0600] 2‑氧代‑2‑((2‑氧代‑2‑苯基乙基)氨基)醋酸乙酯(50mg,0.21mmol)在三氯氧磷(1mL)中的溶液回流16小时。冷却至室温之后,蒸发掉溶剂,并将残留物溶解在DCM中。有机物用5%的NaHCO3和水洗涤,然后用NaSO4干燥,过滤并蒸发。用快速柱色谱(EtOAc/MeOH=70/30)纯化原材料,以提供标题化合物(33mg,71%的产率)。
[0601] 1H NMR(400MHz,氯仿‑d)δ7.76(m,2H),7.52(s,1H),7.44(m,3H),4.49(q,J=7.2Hz,2H),1.45(t,J=7.2Hz,3H)。
[0602] N‑(3‑(1H‑咪唑‑1‑基)丙基)‑5‑苯基恶唑‑2‑甲酰胺:
[0603] 3‑苯基‑1,2,4‑恶二唑‑5‑甲酸乙酯用于经由一般程序2.1(方案2.1)进行酰胺键形成反应以提供标题化合物作为无色油(两个步骤30%产率)。快速色谱法:(EtOAc/MeOH=90/10)。
[0604] 1H NMR(400MHz,氯仿‑d)δ7.75(dd,J=7.5,1.8Hz,2H),7.69(s,1H),7.45(t,J=7.3Hz,2H),7.40(m,2H),7.31(t,J=6.2Hz,1H),7.11(s,1H),7.02(s,1H),4.09(t,J=
6.9Hz,2H),3.49(q,J=6.5Hz,2H),2.15(p,J=6.8Hz,2H)。
[0605]
[0606] 5‑苯基‑1,3,4‑恶二唑‑2‑羧酸乙酯:
[0607] 在0℃下向苯甲酰肼(200mg,1.47mmol)在DCM(4mL)中的溶液缓慢添加三乙胺(615μL,4.41mmol)和草酰氯乙酯(164μL,1.47mmol)。在0℃下搅拌1小时之后,分批添加对甲苯磺酰氯(280mg,1.47mmol)。将反应物加温至室温并搅拌16小时。得到的混合物用饱和NaHCO3和水洗涤,用NaSO4干燥,过滤并蒸发。用快速柱色谱(EtOAc/MeOH=80/20)纯化原材料,以提供标题化合物(108mg,34%的产率)作为浅黄色固体。
[0608] 1H NMR(600MHz,氯仿‑d)δ8.14(m,2H),7.58(m,1H),7.52(m,2H),4.54(q,J=7.2Hz,2H),1.47(t,J=7.2Hz,3H)。
[0609] N‑(3‑(1H‑咪唑‑1‑基)丙基)‑5‑苯基‑1,3,4‑恶二唑‑2‑甲酰胺:
[0610] 5‑苯基‑1,3,4‑恶二唑‑2‑甲酸乙酯用于经由一般程序2.1(方案2.1)进行酰胺键形成反应以提供标题化合物作为白色固体(两个步骤40%产率)。快速色谱法:(EtOAc/MeOH=90/10)。
[0611] 1H NMR(400MHz,氯仿‑d)δ8.13(d,J=7.1Hz,2H),7.95(t,J=6.2Hz,1H),7.68(s,1H),7.58(m,1H),7.52(m,2H),7.10(s,1H),7.01(s,1H),4.11(t,J=6.9Hz,2H),3.55(q,J=6.6Hz,2H),2.20(p,J=6.9Hz,2H)。
[0612]
[0613] 2‑(2‑苯甲酰肼基)‑2‑氧代乙酸乙酯:
[0614] 在0℃下向苯甲酰肼(200mg,1.47mmol)在DCM(4mL)中的溶液缓慢添加三乙胺(615μL,4.41mmol)和草酰氯乙酯(164μL,1.47mmol)。反应物在室温下搅拌1小时并通过TLC监测。得到的混合物用水洗涤,用NaSO4干燥,过滤并蒸发。用快速柱色谱(100%的EtOAc)纯化原材料,以提供标题化合物(121mg,35%的产率)。
[0615] 1H NMR(400MHz,氯仿‑d)δ9.83(d,J=6.7Hz,1H),8.86(s,1H),7.84(dd,J=7.4,1.9Hz,2H),7.59(t,J=7.3Hz,1H),7.49(t,J=7.6Hz,2H),5.30(m,6H),4.43(q,J=7.5Hz,
2H),1.42(t,J=7.1Hz,2H)。
[0616] 5‑苯基‑1,3,4‑噻二唑‑2‑羧酸乙酯:
[0617] 向2‑(2‑苯甲酰肼基)‑2‑氧代乙酸乙酯(121mg,0.51mmol)在THF(2mL)中的溶液添加劳森试剂(269mg,0.66mmol)。混合物回流18小时。冷却至室温之后,蒸发掉溶剂。用快速柱色谱(EtOAc/MeOH=80/20)纯化残留物,以提供标题化合物(92mg,77%的产率)。
[0618] 1H NMR(400MHz,氯仿‑d)δ7.99(m,2H),7.51(m,1H),7.47(ddd,J=8.5,6.5,1.5Hz,2H),4.51(q,J=7.1Hz,2H),1.45(t,J=7.1Hz,3H)。
[0619] N‑(3‑(1H‑咪唑‑1‑基)丙基)‑5‑苯基‑1,3,4‑噻二唑‑2‑甲酰胺:
[0620] 5‑苯基‑1,3,4‑噻二唑‑2‑甲酸乙酯用于经由一般程序2.1(方案2.1)进行酰胺键形成反应以提供标题化合物作为白色固体(两个步骤37%产率)。快速色谱法:(EtOAc/MeOH=90/10)。
[0621] 1H NMR(400MHz,氯仿‑d)δ7.99(d,J=6.7Hz,2H),7.86(s,1H),7.65(t,J=5.9Hz,1H),7.53(m,3H),7.26(s,1H),7.15(s,1H),7.05(s,1H),4.14(t,J=6.9Hz,2H),3.55(q,J=6.6Hz,2H),2.20(p,J=6.8Hz,2H)。
[0622] 利用独特程序进行附加合成
[0623]
[0624] 3‑(1H‑吡唑‑1‑基)苯胺:
[0625] 向吡唑(102mg,1.5mmol)、3‑碘苯胺(219mg,1mmol)和氢氧化钠(112mg,2mmol)在DMSO中的溶液添加(I)氧化物(14.3mg,0.1mmol)并在125℃下搅拌16小时。得到的溶液通过硅藻土过滤并用EtOAc萃取三次。组合的有机物用饱和卤水洗涤,并用Na2SO4干燥。快速色谱法(己烷/EtOAc:至多50%的EtOAc),以产生36.3mg的产物(22.8%)作为黑色油。
[0626] 1H NMR(400MHz,氯仿‑d)δ7.88(dq,J=2.4,0.8Hz,1H),7.69(dt,J=1.8,0.9Hz,1H),7.20(tt,J=8.0,0.9Hz,1H),7.10(td,J=2.2,0.8Hz,1H),7.00(ddq,J=8.0,1.8,
0.9Hz,1H),6.59(ddq,J=7.9,2.6,0.9Hz,1H),6.43(ddd,J=2.6,1.7,0.8Hz,1H)。
[0627] N‑(3‑(1H‑吡唑‑1‑基)苯基)‑5‑(呋喃‑2‑基)异恶唑‑3‑甲酰胺:
[0628] 在0℃下向5‑(呋喃‑2‑基)异恶唑‑3‑羧酸(43mg,0.234mmol)在DCM中的溶液缓慢添加2M的草酰氯在DCM中的溶液(117μL,0.234mmol)和10μL的DMF。混合物在冷却至0℃之前回流2小时。向冷却的混合物添加3‑(1H‑吡唑‑1‑基)苯胺和二异丙基乙胺(61.3μL,0.352mmol)。该混合物在用快速色谱法(己烷/EtOAc:至多75%的EtOAc)纯化之前回流3小时。28.5%的产率(21.4mg),作为灰白色固体。
[0629] 1H NMR(400MHz,氯仿‑d)δ8.66(s,1H),8.14(t,J=2.1Hz,1H),7.98(d,J=2.5Hz,1H),7.74(d,J=1.8Hz,1H),7.63‑7.51(m,3H),7.46(t,J=8.0Hz,1H),7.00(d,J=3.5Hz,
1H),6.95(s,1H),6.58(dd,J=3.5,1.8Hz,1H),6.49(t,J=2.4Hz,1H)。
[0630] 小鼠。C57BL/6J(JAX股票#000664)、B6.129(Cg)‑Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB‑tdTomato,‑EGFP)Luo/J(mTmG,JAX股票#007676)、B6.129S‑Cybbtm1Din/J(gp91phox‑,JAX股票#002365)、NOD.Cg‑Prkdcscid Il2rgtm1Wjl(NSG,JAX股票#05557)和B6J.129(Cg)‑Gt(ROSA)26Sortm1.1(CAG‑cas9*,‑EGFP)Fezh/J(CAG‑Cas9‑EGFP,JAX股票#026179)小鼠购自Jackson实验室。全部小鼠(雄性和雌性)均在6至12周龄之间使用。所有动物实验均按照南加州大学动物护理和使用委员会批准的方案进行。向动物(每个笼子≤5只小鼠)提供食物和水,并维持12小时的有规律的明暗循环。NSG小鼠在无菌条件下饲养
[0631] CGD小鼠模型。gp91phox小鼠(CGD小鼠)用致死剂量(950cGy)辐照并且仅经由尾静6 4
脉注射移植5×10个tdTomato阳性GMP和2.5×10个gp91phox全骨髓细胞(辅助细胞)或2.5
4 8
×10 个辅助细胞。移植两天后,小鼠腹膜内注射2×10 株金黄色葡萄球菌502A(ATCC号
27217;ATCC)或200株洋葱伯克霍尔德氏菌杆菌(ATCC号25609;ATCC)。接种物中的细菌数量
6
通过连续稀释和接种来确认。接种细菌后立即经由尾静脉注射PBS或5×10个tdTomato阳性GMP,此后每3天重复注射一次。每天对小鼠进行检查,如果奄奄一息或腹膜攻击7天后对其实施安乐死。通过肉眼检查来评估腹膜内脓肿的存在。在一些实验中,从尾静脉血液样本中获得血液培养物,并通过平板培养定量菌血症。
[0632] 培养基和试剂。DMEM/F‑12(12400024)和Neurobasal(21103049)培养基购自赛默飞世尔科技公司。人胰岛素(91077C‑250MG)、人全转铁蛋白(T0665‑100MG)、腐胺(P5780‑5G)、亚硒酸钠(S9133‑1MG)、亚油酸(L1012‑100MG)、DL‑α生育酚(维生素E,T3251‑5G)和牛血清白蛋白(A8806‑5G)购自西格玛。重组鼠SCF(250‑03)、重组人M‑CSF(300‑25)和重组人G‑CSF(300‑23)购自派普泰克。GDC‑0879(S1104)和SKL2001(S8302)购自赛力克。
[0633] 为了制备B7培养基,将500ml的DMEM/F‑12和500mL的Neurobasal培养基混合并补充4mg人胰岛素、20mg人全转铁蛋白、16mg腐胺、12.5μg亚硒酸钠、1mg亚油酸、1mg维生素E和2.5g牛血清白蛋白。胰岛素不易溶解;将胰岛素在无菌的0.01M HCl中于4℃下过夜溶解,以产生10mg/mL储备溶液。在‑20℃下储存在1mL等分试样中。悬浮液在等分前充分混合。
[0634] 小鼠GMP衍生、扩增和分化。将细胞在37℃下在5%CO2隔水式恒温培养箱(赛默科6
技)中培养。从C57BL/6J、mTmG或CAG‑Cas9‑EGFP小鼠分离的骨髓细胞以2×10个细胞/孔的密度接种到6孔板中并且在补充有50ng/mL SCF、1μM GDC‑0879和10μM SKL2001(SCF/2i)的
6
2mL B7培养基中培养。3‑4天后,通过上下移液将细胞分离成单细胞悬浮液并以2×10个细胞/孔的密度重新接种到6孔板中并在补充有SCF/2i的2mL B7培养基中培养。在SCF/2i中进行2次传代后,大部分细胞为GMP。每3天对GMP进行常规传代。为了诱导分化,将GMP接种到
10cm的组织培养皿中,并在含有10%FBS并补充有20ng/mL M‑CSF(用于巨噬细胞分化)或
20ng/mL G‑CSF(用于粒细胞分化)的RPMI‑1640培养基中培养。在第7天收获GMP源巨噬细胞(在第4天更换培养基一次),在第3天收获GMP源粒细胞并用于进一步的实验。
[0635] 为了生成骨髓源巨噬细胞,将从C57BL/6J小鼠分离的2×106个骨髓细胞接种到10cm的组织培养皿中,并在含有10%FBS和20ng/ml M‑CSF的RPMI‑1640培养基中培养。在第
4天更换培养基,并在第7天收获细胞。
[0636] 在tdTomato阳性GMP移植后立即向小鼠腹膜腔中注射1mL的2%Bio‑Gel P‑100(Bio‑Rad,1504174),然后在4天后用无菌PBS进行腹膜灌洗,从而生成腹膜巨噬细胞。从腹膜腔收集的细胞用于荧光成像和流式细胞术分析。
[0637] 人GMP细胞的衍生和扩增。从StemCyte(鲍德温公园市,加利福尼亚)获得人脐带血样本,从Stemcell科技(Cat#70502.2)购买人全骨髓,并从StemExpress(Cat#MLE4GCSF5)购TM买人动员外周血。使用Ficoll‑Paque PLUS试剂盒分离单核细胞(GE医疗生命科学部,17‑
1440‑03)。简言之,用PBS以1:3的比例稀释血液,并将其加入预加载15ml的Ficoll‑TM TM
Paque PLUS的SepMate ‑50试管(Stemcell科技,85460)。在室温下以1200g离心20分钟后,收集顶层,并在4℃下以300xg离心10分钟。通过使用ACK裂解缓冲液去除残留的红细胞。细胞立即使用或在液氮中冷冻保存。
[0638] 为了扩增人GMP,从分离自脐带血、全骨髓或动员外周血的单核细胞分选Lin‑+ + + 4(CD3、CD14、CD19和CD56)CD34CD38CD45RAGMP。分选出的人GMP以4×10个细胞/孔的密度接种到96孔板中,并在补充有人SCF(50ng/mL。AF‑300‑07,派普泰克)、GDC‑0879(1μM)和TN‑
5
2‑30(5μM)(修饰的SCF/2i)的B6培养基中培养。初始接种5天后,通过将人GMP以1×10个细胞/孔的密度重新接种到48孔板中并在修饰的SCF/2i中培养,每3天对人GMP进行常规传代。
用SB590885(0.5μM。S2220,赛力克)替换GDC‑0879可能稍微提高人GMP增殖率。为了制备B6培养基,将500mL的DMEM/F‑12和500ml的Neurobasal培养基混合并补充4mg人胰岛素、20mg人全转铁蛋白、12.5μg亚硒酸钠、1mg亚油酸、1mg维生素E和2.5g人血清白蛋白。
[0639] 人白血病细胞衍生。临床标本取自成人B细胞急性淋巴细胞白血病(B‑ALL)患者。+ +
通过对人CD45和CD19细胞进行分选,从B‑ALL患者的骨髓吸出物中分离出人B‑ALL细胞。用GFP慢病毒转导人B‑ALL细胞。将细胞移植到NSG小鼠中,并在移植6周后从小鼠脾脏中分选+
GFP白血病细胞。
[0640] GMP移植。GMP来源于mTmG小鼠,并在SCF/2i中培养。3次传代后,经由尾静脉注射将7
体外扩增的GMP以1×10个细胞/小鼠的密度移植到C57BL/6J小鼠中。在指定的时间点收集来自血液、脾脏和骨髓的细胞,并用DAPI、CD11b‑FITC、Ly6G‑PerCP‑Cy5.5和CD115‑PE‑Cy7抗体染色,并通过流式细胞术进行分析。收获、固定和切片肝组织进行免疫染色。
[0641] 流式细胞术分析和细胞分选。收集SCF/2i GMP并用cKit、FcgR、Sca1、CD34、B220、Ter119、CD3和CD11b抗体染色,并通过FACS‑AriaII(BD Biosciences)进行分析。
[0642] 使用含有2%(v/v)FBS的PBS从小鼠粉碎的骨头获得小鼠骨髓细胞。使用Histopaque 1119(西格玛)通过密度梯度离心去除骨碎片。然后用CD117/cKit微珠
(Miltenyi Biotec)和IL7Rα抗体富集细胞,然后用抗大鼠IgG微珠(Miltenyi Biotec)富集细胞。用单克隆抗体染色后,使用FACS‑AriaII仪器对干细胞和祖细胞群体进行分选。每个干细胞/祖细胞谱系的细胞表面标志物总结如下:
[0643] HSC(造血干细胞):谱系(CD3、CD4、CD8、B220、Gr1、Mac1、Ter119)‑/cKit+/Sca1+/+ ‑ +Flk2/CD34/CD150。
[0644] CLP(普通淋巴祖细胞):lin‑/IL7Rα+/Flk2+。
[0645] CMP(普通髓系祖细胞):lin‑/IL7Rα‑/ckit+/Sca1‑/CD34+/FcgR‑。
[0646] MEP(巨核/红系祖细胞):lin‑/IL7Rα‑/ckit+/Sca1‑/CD34‑/FcgR‑。
[0647] GMP(粒细胞/巨噬细胞祖细胞):lin‑/IL7Rα‑/ckit+/Sca1‑/CD34+/FcgR+。
[0648] 从6‑8周龄的C57BL/6J小鼠收集血液样本。通过ACK(铵‑氯‑钾)裂解缓冲液(赛默飞世尔,A1049201)去除红细胞。对白细胞进行染色和分选。每个细胞类型的细胞表面标志物总结如下:
[0649] 单核细胞/巨噬细胞:CD3‑/B220‑/CD11b+/CD115+。
[0650] 嗜中性粒细胞:CD3‑/B220‑/CD11b+/Ly6G+/CD115‑。
[0651] T细胞:CD3+/TCRab+/B220‑/CD11b‑。
[0652] B细胞:B220+/CD19+/CD3‑/CD11b‑。
[0653] 从eBioscience(赛默飞世尔的一部分)和BioLegend获得抗体(参见表1获得完整抗体列表)。使用FlowJo软件10.4.2版(Tree Start)和Diva软件8.0.1版(BD Biosciences)分析流式细胞术数据。
[0654] 表1资源
[0655]
[0656]
[0657]
[0658]
[0659]
[0660]
[0661]
[0662]
[0663]
[0664]
[0665] 单细胞RNA‑seq文库制备。FACS分选的单细胞悬浮液用PBS中的冰冷的0.04%(w/v)BSA洗涤,然后根据铬单细胞3'文库(10X Genomics,V2)的制造商方案加载到3'文库芯片上。10×基因组文库首先在Illumina NextSeq 500上进行测序,目标是每个细胞覆盖5000个原始读数,以估计细胞数量,然后在Illumina HiSeq 2500上进行更深入的测序,目标是每个细胞覆盖50000个原始读数(配对端;读数1:26个循环;i7指数:8个循环;读数2:98个循环)。
[0666] 单细胞RNA‑seq数据分析。使用Cell Ranger流水线(10×基因组,v 2.1.0)预处理原始测序数据。简而言之,“cell ranger计数”函数用于UMI定量。将读数与Cell Ranger提供的mm10参考基因组进行比对。以下指标用于排除质量较差的细胞:1)检测到的基因的数量小于200,2)检测到的基因的数量大于6000,或3)与线粒体比对的读数的百分比大于10%。在每种细胞类型中,在少于10个细胞中检测到的基因也被排除在外。
[0667] 通过Seurat3 R软件包对不同细胞类型的原始计数数据集进行整合和分析。简而言之,对单个细胞中每个基因的计数进行归一化和缩放,并使用Seurat3中嵌入的t‑SNE降维方法分析整个数据集。通过比较一种细胞类型与其他细胞类型进行差异基因表达分析。从五种原代细胞类型中的每一种中选择前50个表达最高的基因,并用于通过热图进行分析。一些基因在两种或多种细胞类型中高度表达。
[0668] 集落形成测定。直接从新鲜骨髓分离的SCF/2i GMP或GMP以一个细胞/孔的密度沉TM积到含有100μl MethoCult GF M3434培养基(Stem Cell科技,03434)的96孔板中。拍摄了图片,并且在培养7天后对集落进行视觉评分。
[0669] 免疫荧光染色。SCF/2i GMP源巨噬细胞接种到48孔板中。24小时后,用4%(w/v)PFA固定细胞15分钟。用CD11b‑FITC(赛默飞世尔,#11‑0112‑82)和F4/80‑eFlour 570(赛默飞世尔,#41‑4801‑82)抗体对细胞进行染色。用抗RFP(Abcam,#ab62341)、抗F4/80(赛默飞世尔,#14‑4801‑82)和相关二抗对肝切片(4μm)进行染色。DAPI用于核复染色,并使用Keyence BZ‑X710荧光显微镜(Keyence)拍摄图片。
[0670] 吉姆萨染色和核型分析。将SCF/2i GMP和SCF/2i GMP源粒细胞扩散到载玻片上。TM
固定后,用10%KaryoMAX 吉姆萨染色溶液(赛默飞世尔,10092013)对细胞染色5分钟。在自来水下清洗载玻片,并使用Keyence BZ‑X710荧光显微镜(400×)拍摄图片。为了核型分析,GMP在SCF/2i培养基中扩增8代。用100ng/mL秋水仙酰胺(西格玛,10295892001)处理细胞2小时,然后收获细胞以用于通过标准方法进行中期制备。GWT显带法用于染色体分析,如Hsieh,C.L.(Basic cytogenetic techniques:culture,slidemaking and banding.In Cell Biology:A Laboratory Handbook,第二版,JE Cells,ed.(纽约:学术出版社),391‑
396)中所述。
[0671] ELISA。将骨髓源巨噬细胞、SCF/2i GMP源巨噬细胞、血液粒细胞和SCF/2i GMP源5
粒细胞以1×10 个细胞/孔的密度接种到48孔板中,并在补充有10%FBS的RPMI 1640培养基中培养。在开始用TLR配体刺激之前,过夜培养巨噬细胞:500ng/mL LPS‑EK(InvivoGen,tlrl‑eklps)。接种后立即刺激粒细胞。刺激6小时后收获细胞培养物上清,并使用Ready‑SET‑Go!测量TNFα、IL‑6和IL‑10。ELISA试剂盒(赛默飞世尔)。
[0672] 髓过氧化物酶(MPO)测定。将SCF/2i GMP、血液中性粒细胞和SCF/2i GMP源粒细胞4
以2×10个细胞/孔的密度接种到96孔板中,并在补充有10%FBS的100μl RPMI 1640培养基中培养。在使用或不使用MPO抑制剂4‑氨基苯甲酰肼(ABH)的情况下用100nM PMA刺激细胞2小时。收获上清,并根据制造商的说明使用嗜中性粒细胞MPO活性测定试剂盒(Cayman,
600620)测量MPO活性。
[0673] 吞噬作用测定。使用吞噬作用测定试剂盒(Cayman,500290)执行乳胶珠的吞噬作4
用。简而言之,将tdTomato阳性SCF/2i小鼠GMP源巨噬细胞以5×10 个细胞/孔的密度接种到48孔板中,并在DMEM/10%FBS中过夜培养。将乳胶珠‑兔子IgG‑FITC复合物添加到细胞培养物(1:100稀释)中,并在一小时后洗出游离的珠。收获细胞以用于流式细胞术分析,或固定细胞以用于DAPI染色和显微镜可视化
[0674] 为了细菌的吞噬作用,用TOPO‑GFP质粒转化DH5α大肠杆菌细胞,并用氨苄青霉素选择将所述细胞接种到LB琼脂平板上。挑选GFP阳性细菌集落,并在16小时后在PBS中稀释。5
源自tdTomato阳性SCF/2i小鼠GMP的巨噬细胞以1×10个细胞/孔的密度接种到24孔板中,
8
并在DMEM/10%FBS中过夜培养,之后,将1×10个GFP阳性细菌添加到每个孔中。每30秒使用Zeiss LSM‑780或Keyence BZ‑X710显微镜拍摄连续图像。
[0675] 对于抗体处理组,用20μg/ml小鼠IgG2a(Bio‑Rad,MCA929)或抗CD47(Bio‑Rad,MCA911)抗体预孵育人B‑ALL细胞30分钟,然后添加到巨噬细胞培养物中。每2.5分钟使用Keyence BZ‑X710显微镜拍摄连续图像。用Keyence显微镜分析器创建视频。为了分析吞噬能力,洗涤、胰蛋白酶化并通过流式细胞术分析巨噬细胞。GFP和RFP双阳性细胞被认为对吞噬作用有效,并且吞噬作用百分比通过将双阳性细胞的数量除以RFP阳性细胞的总数来计算。
[0676] 用于造血干细胞/祖细胞的长期体外扩增的限定条件的开发。为了开发造血系统的干细胞或祖细胞的长期扩增的条件,进行筛选以鉴定可以促进它们的体外扩增的小分子和生长因子/细胞因子(参见图3A)。具体地,从成年C57BL/6小鼠分离的骨髓细胞接种到无血清N2B27培养基中的96孔板中。然后进行第一轮小分子筛选。有人认为,如果一个小分子可以阻断干细胞的分化或促进干细胞的扩增,这些干细胞应该形成具有均匀细胞形态的集落。筛选出375种小分子抑制剂中的5种(见表1),在培养物(GDC‑0879、SB590885、A‑8301、SB203580和IWR1)中7天后观察到集落簇的形成(参见图3B)。然而,传代时,在用5种小分子抑制剂中的任何一种的培养物中都没有形成新的集落。进行第二轮筛选以鉴定可能进一步改善集落的扩增的生长因子/细胞因子。在筛选的32种生长因子/细胞因子中(见表1),发现干细胞因子(SCF)与GDC‑0879或SB590885(这两种都是有效的B‑Raf抑制剂)结合时,可以使细胞以均匀的细胞形态扩增3‑4代(参见图3C),之后,它们逐渐分化并停止增殖。
[0677] 然后在SCF和GDC‑0879存在的情况下对剩余的373种小分子进行第三轮筛选,证明在细胞扩增方面,这种组合略优于SCF和SB590885。SKL2001是一种已报道的Wnt/β‑连环蛋白通路的调节因子,鉴定出当与SCF和GDC‑0879结合时,它可以长期扩增均匀明亮的圆形细胞群体。N2B27培养基含有22种关键组分(见表1)。N2B27培养基进一步精制,发现22种组分中仅7种组分的组合优于N2B27。这7种组分为:牛血清白蛋白、胰岛素、转铁蛋白、腐胺、亚油酸、亚硒酸钠和维生素E。在这7种基础组分存在的情况下(指的是B7培养基),当补充有SCF、GDC‑0879和SKL2001(下文为SCF/2i)时,均匀的细胞群体以指数方式扩增,同时保持核型正常(参见图3D‑F)。更重要的是,这些细胞可能在克隆密度下有力地扩增(参见图3G)。SCF/2i对长期扩增很重要,因为去除三种因子中的任何一种都会导致细胞死亡和分化(参见图3D)。
[0678] SCF/2i扩增的细胞为GMP。为了确定在SCF/2i中扩增的细胞的身份,通过荧光活化细胞分选(FACS)从小鼠骨髓中分离不同的细胞群体。然后将分离的细胞在SCF/2i中培养。造血干细胞(HSC)、普通髓系祖细胞(CMP)和GMP形成具有可以持续扩增的均匀明亮的圆形细胞的集落,但普通淋巴细胞祖细胞(CLP)、单核细胞、粒细胞、T细胞和B细胞不会。这表明‑
在SCF/2i中扩增的细胞可能属于髓系。进一步的免疫表型分析表明,SCF/2i细胞为lin+ ‑ + +
cKitSca1FcRγ CD34(参见图4A),指示了GMP身份。
[0679] 为了进一步确认细胞的身份,对在SCF/2i中扩增的细胞和新近分选的造血干细胞和祖细胞执行单细胞RAN测序(scRNA‑seq),发现SCF/2i细胞的转录组与新近分选的GMP的转录组重叠(参见图4B)。SCF/2i细胞与GMP共享相似的基因表达谱,但不与其他造血细胞谱系共享(参见图4C‑D)。这些结果进一步支持SCF/2i细胞为GMP。
[0680] SCF/2i扩增的GMP可以在体外高效分化成功能性巨噬细胞和粒细胞。进行体外分化测定以对SCF/2i GMP进行功能评估。巨噬细胞集落刺激因子(M‑CSF)是一种巨噬细胞分化因子,其处理有效地诱导SCF/2i GMP分化为表达F4/80和CD11b这两个关键巨噬细胞标志物的大而扁平的细胞(参见图5A)。分化的细胞的流式细胞术分析表明,超过99%的细胞对F4/80和CD11b两者呈阳性(参见图5A)。巨噬细胞的关键特征之一是当用脂多糖(LPS)(巨噬细胞的强力活化剂)刺激时炎性细胞因子的分泌。LPS刺激后,衍生自SCF/2i GMP和骨髓两者的巨噬细胞产生丰富的细胞因子,包括肿瘤坏死因子(TNF)‑α、白介素(IL)‑6和IL‑10(参见图5B)。与骨髓源巨噬细胞相比,SCF/2i GMP源巨噬细胞产生的促炎细胞因子TNF‑α和IL‑6明显更多,但抗炎细胞因子IL‑10更少。这表明SCF/2i GMP源巨噬细胞主要表现出促炎(M1)表型。
[0681] 巨噬细胞的另一个关键特征是通过吞噬作用去除病原体和细胞碎片的能力。通过孵育异硫氰酸荧光素(FITC)标记的乳胶珠与衍生自SCF/2i GMP的巨噬细胞进行吞噬作用测定。孵育一小时后,90%以上的细胞吞噬了荧光珠(参见图5C)。此外,SCF/2i GMP源巨噬细胞在吞噬和杀灭细菌方面也非常高效(参见图5D)。
[0682] 为了测试它们分化成粒细胞的潜力,用粒细胞集落刺激因子(G‑CSF)处理SCF/2i GMP,并进行表型测定和功能测定。用G‑CSF处理3天后,SCF/2i GMP分化成具有分段核(粒细+胞的特点)的细胞(参见图5E,上图)。流式细胞术分析表明,这些细胞中的80%以上为Ly6G‑
CD115,这是粒细胞的独特表型(参见图5E,下图)。为了评估SCF/2i GMP源粒细胞是否是功能性的,评估它们响应于LPS刺激而分泌炎性细胞因子的能力。发现SCF/2i GMP源粒细胞响应于LPS刺激产生了丰富的TNF‑α和IL‑10,这与新近分离的外周血中性粒细胞(粒细胞的主要类型)相媲美(参见图5F)。粒细胞的另一特点是释放髓过氧化物酶(MPO),所述髓过氧化物酶为在活化时介导微生物的杀灭的含有血红素的过氧化物酶。经蛋白激酶C(PKC)激动剂乙酸肉豆蔻佛波醇(PMA)活化后,MPO活性在SCF/2i GMP源粒细胞和血液中性粒细胞两者中显著增加(参见图5F)。此外,这些细胞中PMA诱导的MPO活性通过强力MPO抑制剂4‑氨基苯甲酰肼(ABH)阻断(参见图5F)。
[0683] 为了更严格地测试SCF/2i GMP的分化潜力,通过将SCF/2i GMP和新近分离的GMP以每孔一个细胞的密度沉积到96孔板中来进行集落形成单位(CFU)测定。在由单个SCF/2i GMP形成的所有集落中,粒细胞/巨噬细胞集落、仅粒细胞集落和仅巨噬细胞集落分别占41.39±5.45%、25.47±6.68%和33.14±4.46%。这些结果表明分化潜力类似于从骨髓分离的GMP的分化潜力(参见图3G)。
[0684] 总之,上述结果证明,体外扩增的SCF/2i GMP能够高效地分化成表型和功能性粒细胞和巨噬细胞。
[0685] SCF/2i扩增的GMP可以在体内高效分化成粒细胞和巨噬细胞。为了确定体外扩增的SCF/2iGMP是否在体内保留分化为粒细胞和巨噬细胞的能力,从广泛表达红色荧光蛋白变体tdTomato的小鼠中提取SCF/2i GMP,并经由尾静脉注射将其移植到C57BL/6小鼠中(17
×10个细胞/小鼠)。移植后1、4和7天采集的小鼠外周血的流式细胞术分析显示,分别有
7.4±3.2%、6.6±0.6%和1.7±0.6%(n=6只小鼠)的白细胞呈tdTomato阳性。在第1天tdTomato阳性细胞中,巨噬细胞和粒细胞分别占12.4±3.0%和7.5±2.6%。在第4天,10.0±3.3%为巨噬细胞,49.9±6.1%为粒细胞;在第7天,大多数tdTomato阳性细胞分化为巨噬细胞(19.2±6.2%)或粒细胞(80.5±6.7%)(参见图6A)。
[0686] 尽管移植后很容易检测到,但如上所示,移植的GMP及其衍生物在外周血中的比例相对较低。研究了是否可以通过移植前全身辐照等调节方案来增加移植细胞的比例。在移7
植tdTomato阳性GMP(1×10个细胞/小鼠)之前,用亚致死性辐照预处理受体小鼠,并分析移植后4天从小鼠收集的外周血。tdTomato阳性细胞在外周血中的比例明显地提高到了占+ +
全部白细胞的35.6±4.9%(参见图6B)。在tdTomato阳性细胞中,巨噬细胞(CD11bCD115)+ ‑ +
和粒细胞(CD11b CD115Ly6G)分别占14.5±2.7%和43.1±8.3%。还在受体小鼠的肝脏、腹膜腔、骨髓以及脾脏中识别到了tdTomato阳性巨噬细胞(参见图6C‑6E),表明移植的GMP也可以分化成组织巨噬细胞。
[0687] SCF/2i扩增的GMP在细菌感染的小鼠模型中显示出疗效。使用慢性肉芽肿性疾病(CGD)小鼠模型评估SCF/2i GMP的疗效(参见图7A)。由于粒细胞和巨噬细胞在吞噬细胞杀微生物活性中的缺陷,CGD小鼠易受感染。SCF/2i GMP的输注显著降低了肝脓肿的数量(参见图7B),减小了脾脏的大小(参见图7C),并降低了接种金黄色葡萄球菌的CGD小鼠的死亡率(参见图7D)。还观察到了SCF/2i GMP在接种另一细菌株(洋葱伯克霍尔德氏菌)的CGD小鼠中有相似的疗效(参见图7E‑F)。
[0688] 总之,这些结果表明,体外扩增的SCF/2i GMP在移植后保留分化为功能性粒细胞和巨噬细胞的能力。
[0689] 人GMP在修饰的SCF/2i培养基中扩增。为了确定人GMP是否也可能体外扩增,从人‑ + + +脐带血中分选了linCD34CD38CD45RA GMP,并在存在SCF和小分子的情况下培养它们。分选的人GMP能够在SCF/GDC‑0879中传代2‑3次,之后,它们停止增殖并分化(参见图8A),与小鼠GMP类似(参见图3D),这指明SCF/GDC‑0879保持它们在人GMP上的活性。然而,SKL2001的添加仅略微地改善了人GMP的扩增(参见图8A)。
[0690] 接下来,我们研究了为什么小鼠和人的GMP对SKL2001有不同的反应。CHIR99021,Wnt激动剂1和Wnt3a,三种经典的Wnt/β‑连环蛋白活化剂,不能模拟SKL2001对小鼠GMPs扩增的作用。Wnt/β‑连环蛋白信号传导抑制剂IWR1和FH535也不影响小鼠GMP在SCF/2i中的扩增。此外,β‑连环蛋白敲除小鼠GMP的扩增仍然需要添加SKL2001。这些结果表明,SKL2001通过Wnt/β‑连环蛋白非依赖性机制促进GMP的扩增。
[0691] 人GMP对SKL2001也有反应来用于扩增,尽管与小鼠GMP相比要弱得多,这一结果仍令人鼓舞,人们认为,通过系统地修饰SKL2001结构,可以鉴定出更有效的类似物来扩增人GMP。共合成并表征了50个SKL2001类似物。与SKL2001相比,新的SKL2001类似物之一,TN‑2‑30(参见图8B)显著改善了人GMP的扩增(参见图8A)。人GMP在修饰的SCF/2i(TN‑2‑30代替SKL2001)中以指数方式扩增(参见图8A‑C),同时保持高效分化成表型和功能性粒细胞和巨噬细胞的能力(参见图8D‑8H)。
[0692] 人GMP的表征。为了表征培养的GMP,首先分离新鲜的骨髓细胞,然后用流式细胞仪‑ + + ‑ ‑分选出不同的造血干细胞/祖细胞,包括造血干细胞(HSC)(LincKitSca1Flk2 CD34Slam+ ‑ + ‑ + + + + ‑ ‑ +
)、GMPs(LincKit Sca1 CD34 FcgR)、单核细胞(Mac1 CD115 B220 TCRab)、粒细胞(Mac1‑ + ‑ ‑ + ‑ ‑ ‑ + + ‑ ‑
CD115Gr1 B220 TCRab)、T细胞(TCRab Gr Ma1c B220 )和B细胞(B220 CD19 Gr1 Mac1‑
TCRab)。用本公开的组合物培养这些不同类型的细胞,以确定哪些类型的细胞可以被扩增并产生GMP。HSC和GMP形成相同的细胞集落,并且当使用本公开的组合物时,这些细胞能够自我更新以进行长期扩增。传代3次后,收获细胞,并在染色后通过流式细胞仪检查细胞表+ ‑ + +
面标志物。cKit Sca1 CD34 FcgR 的细胞表明它们是GMP。GMP可以产生粒细胞、巨噬细胞和树突细胞。接下来,进行体外分化测定以进一步表征这些体外扩增的GMP。
[0693] 长期体外扩增的GMP能够分化成功能性和成熟的巨噬细胞。为了引导分化为成熟5
的巨噬细胞,每孔接种1×10个体外扩增的GMP到6孔板中,并在RPMI 1640+10%FBS+20ng/mL MCSF中培养。细胞增殖、开始附着并在接种3天后分化。到第7天,细胞的总细胞数增加到
6 5
约2×10个。细胞传代,并以每孔1×10个细胞重新接种到24孔板中。接种24小时后,固定细胞并用巨噬细胞标志物CD11b和F4/80以及细胞核的DAPI染色。细胞表达CD11b和F4/80两者,表明GMP已被诱导分化为巨噬细胞。巨噬细胞作为一种主要的先天免疫细胞,通过吞噬作用和分泌炎性细胞因子来发挥其功能。众所周知,巨噬细胞表达高水平的toll样受体4(TLR4),并且LPS对TLR4的活化显著增加了炎性细胞因子的产生。为了测试来源于GMP的巨噬细胞是否能分泌炎性细胞因子,将GMP源巨噬细胞(GMPM)或骨髓源巨噬细胞(BMM)以1×
5
10个细胞/孔的密度接种到48孔板中,然后用500ng/mL LPS刺激。在6小时或24小时后,收获上清,并通过ELISA测量炎性细胞因子TNFα、IL6和IL10的浓度。
[0694] 长期体外扩增的GMP能够分化成功能性和成熟的粒细胞。粒细胞集落刺激因子(G‑CSF)是一种调节骨髓中性粒细胞产生的造血生长因子。G‑CSF用于诱导小鼠GMP向中性粒细+胞谱系分化。在E7 SCF/GDC/CHIR条件下培养3周后,将GMP重新接种在RPMI 1640+10%FBS培养基中,并用20ng/mL的GCSF刺激。用GCSF刺激72小时后,GMP分化为形态上类似粒细胞的细胞。为了进一步验证这些细胞的身份,收获细胞并用Gr1和CD115抗体染色,并通过流式细+ ‑
胞仪进行分析。粒细胞为Gr1和CD115。
[0695] 髓过氧化物酶(MPO)从粒细胞/中性粒细胞中释放出来,以降解入侵的病原体,为先天免疫提供了最早的防线之一。为了功能性评价小鼠GMP衍生的粒细胞,使用MPO活性测定试剂盒(Cayman化学公司)测量MPO活性。使用BD Arial I流式细胞仪从全血中分选小鼠+ + ‑中性粒细胞(Gr1CD11bCD115)并用作阳性对照。将GMP、GMP衍生的粒细胞和源自血液的中
5
性粒细胞在含有1%BSA的RPMI 1640培养基中以1×10个细胞/孔接种到96孔板中。然后用
100nM乙酸肉豆蔻佛波醇(PMA)刺激细胞2小时,并按照制造商的方案测量上清中的MPO活性。4‑氨基苯甲酰肼(ABH)是MPO的特异性抑制剂,用于确定测定的特异性。未分化的GMP中的MPO活性无法检测到,而GMP衍生的粒细胞和血液中性粒细胞在PMA刺激或没有PMA刺激的情况下具有相似的MPO活性。
[0696] 由于中性粒细胞也表达高水平的TLR4,用LPS刺激GMP衍生的粒细胞以进一步评估其细胞因子生成能力。将GMP、GMP衍生的粒细胞和血液中性粒细胞在含有10%FBS的RPMI 5
1640培养基中以1×10 个细胞/孔接种到96孔板中。用500ng/mL LPS刺激细胞。24小时后,收集上清,并用ELISA测量炎性细胞因子TNFα、IL6和IL10。
[0697] 体外扩增的GMP的基因修饰。在成熟的巨噬细胞和粒细胞中进行基因修饰是困难的。本文介绍了在GMP中进行高效基因修饰的方法。描述了一种在GMP中过表达或敲除基因的非常高效的方案。用GFP mRNA转染的GMP中,95%以上为GFP阳性的。GFP和toll样受体4(TLR4)基因被CRISPR/Cas9系统敲除。指导RNA是专门设计和合成的,以靶向GFP或toll样受体4(TLR4)基因。将靶向GFP的gRNA引入到GMP中。用GFP gRNA转染的GMP中,约91.1%在转染48小时后变成GFP阴性的。在敲除GMP中的TLR4基因方面实现了类似的效率。将GFP‑GMP敲除和TLR4‑GMP敲除分化为成熟的巨噬细胞,并用Poly I:C和LPS刺激。24小时后,收获上清,通过ELISA测量细胞分泌的炎性细胞因子的量。
[0698] 应当理解,在不脱离本公开的精神和范围的情况下可以进行各种修改。因此,其他实施例在以下权利要求的范围内。