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己酮糖激酶（KHK）iRNA组合物及其使用方法
申请号 CN202280027340.6 申请日 2022-02-18 公开(公告)号 CN117751187A 公开(公告)日 2024-03-22
申请人 阿尔尼拉姆医药品有限公司; 发明人 L·诺茨利; J·D·麦金因克; F·特伦布莱; M·K·施勒加尔; A·卡斯托雷诺;
摘要 本 发明 涉及靶向己 酮 糖激酶(KHK)基因的RNAi药剂，例如dsRNA药剂。本发明还涉及使用此类RNAi药剂来抑制KHK基因的表达的方法，并且涉及 治疗 或 预防 受试者的KHK相关病症的方法。
权利要求

1.一种用于抑制细胞中的己酮糖激酶(KHK)的表达的双链核糖核酸(dsRNA)药剂，其中
所述dsRNA包括形成双链区的有义链和反义链，其中所述反义链包括与编码KHK的mRNA互补的区域，并且其中所述互补区包括与表2、3、5、6和8‑13中的任一者中的任一个反义核苷酸序列相差不超过3个核苷酸的至少15个连续核苷酸。
2.根据权利要求1所述的dsRNA药剂，其中所述dsRNA药剂包括有义链和反义链，所述有义链包括与表2、3、5、6和8‑13中的任一者中的任一个有义链核苷酸序列相差不超过三个核苷酸的至少15个连续核苷酸，并且所述反义链包括与表2、3、5、6和8‑13中的任一者中的任一个反义链核苷酸序列相差不超过三个核苷酸的至少15个连续核苷酸。
3.根据权利要求1所述的dsRNA药剂，其中所述dsRNA药剂包括有义链和反义链，所述有义链包括与表2、3、5、6和8‑13中的任一者中的任一个有义链核苷酸序列相差不超过两个核苷酸的至少15个连续核苷酸，并且所述反义链包括与表2、3、5、6和8‑13中的任一者中的任一个反义链核苷酸序列相差不超过两个核苷酸的至少15个连续核苷酸。
4.根据权利要求1所述的dsRNA药剂，其中所述dsRNA药剂包括有义链和反义链，所述有义链包括与表2、3、5、6和8‑13中的任一者中的任一个有义链核苷酸序列相差不超过一个核苷酸的至少15个连续核苷酸，并且所述反义链包括与表2、3、5、6和8‑13中的任一者中的任一个反义链核苷酸序列相差不超过一个核苷酸的至少15个连续核苷酸。
5.根据权利要求1所述的dsRNA药剂，其中所述dsRNA药剂包括有义链和反义链，所述有义链包括选自由表2、3、5、6和8‑13中的任一者中的任一个有义链核苷酸序列组成的组的核苷酸序列，并且所述反义链包括选自由表2、3、5、6和8‑13中的任一者中的任一个反义链核苷酸序列组成的组的核苷酸序列。
6.一种用于抑制细胞中的己酮糖激酶(KHK)的表达的双链核糖核酸(dsRNA)药剂，其中
所述dsRNA包括形成双链区的有义链和反义链，其中所述有义链包括与SEQ ID NO:1的核苷酸120‑162；164‑188；181‑207；193‑217；209‑231；283‑306；508‑546；568‑603；596‑632；
640‑674；746‑806；806‑835；917‑942；936‑084；1016‑1041；1100‑1123；1149‑1175；1160‑
1193；1205‑1229；1252‑1283；1334‑1356；1407‑1429；1472‑1497；1506‑1533；1539‑1561；
1704‑1727；1747‑1787；1850‑1873；1936‑1964；1960‑1990；2015‑2048；2060‑2095；2090‑
2118；2124‑2160；2181‑2200；2221‑2262的任一个核苷酸序列相差不超过三个核苷酸的至少15个连续核苷酸，并且所述反义链包括与SEQ ID NO:2的相对应核苷酸序列相差不超过三个核苷酸的至少15个连续核苷酸。
7.一种用于抑制细胞中的己酮糖激酶(KHK)的表达的双链核糖核酸(dsRNA)药剂，其中
所述dsRNA包括形成双链区的有义链和反义链，其中所述有义链包括与SEQ ID NO:1的核苷酸517‑539；521‑543；524‑546；517‑546；581‑603；610‑632；747‑769；749‑771；752‑774；
755‑777；757‑779；758‑780；764‑786；776‑798；781‑803；747‑803；920‑942；941‑963；944‑
966；950‑972；962‑984；920‑984；1149‑1171；1161‑1183；1165‑1187；1171‑1193；1149‑
1193；1205‑1227；1206‑1228；1205‑1228；1334‑1356；1472‑1494；1475‑1497；1472‑1497的任一个核苷酸序列相差不超过三个核苷酸的至少15个连续核苷酸，并且所述反义链包括与SEQ ID NO:2的相对应核苷酸序列相差不超过三个核苷酸的至少15个连续核苷酸。
8.一种用于抑制细胞中的己酮糖激酶(KHK)的表达的双链核糖核酸(dsRNA)药剂，其中
所述dsRNA包括形成双链区的有义链和反义链，其中所述有义链包括与SEQ ID NO:1的核苷酸517‑539；524‑546；517‑546；753‑775；757‑779；753‑779；764‑786；767‑789；768‑790；
769‑791；764‑791；773‑795；781‑803；773‑803；753‑803；808‑830；937‑959；941‑963；944‑
966；941‑966；948‑970；950‑972；948‑972；1160‑1182；1161‑1183；1160‑1183；和1207‑1229的任一个核苷酸序列相差不超过三个核苷酸的至少15个连续核苷酸，并且所述反义链包括与SEQ ID NO:2的相对应核苷酸序列相差不超过三个核苷酸的至少15个连续核苷酸。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的dsRNA药剂，其中所述反义链包括与双链体的任
一个反义链核苷酸序列相差不超过三个核苷酸的至少15个连续核苷酸，所述双链体选自由以下组成的组：AD‑1613400；AD‑1613243；AD‑1290757.3；AD‑1290878.3；AD‑1290969.3；AD‑
1423317.2；AD‑1423327.2；AD‑1423336.2；AD‑1290599.3；AD‑1523172.1；AD‑1290837.3；
AD‑1523173.1；AD‑1290884.3；AD‑1523174.1；AD‑1290959.3；AD‑1523175.1；AD‑
1423311.2；AD‑1423324.2；AD‑1523176.1；AD‑1423329.2；AD‑1423333.2；AD‑1423330.2；
AD‑1523177.1；AD‑1290885.3；AD‑1523178.1；AD‑1423334.2；AD‑1523179.1；AD‑
1523180.1；AD‑1290539.3；和AD‑1523181.1。
10.一种用于抑制细胞中的己酮糖激酶(KHK)的表达的双链核糖核酸(dsRNA)药剂，其
中所述dsRNA包括形成双链区的有义链和反义链，其中所述有义链包括与SEQ ID NO:1的核苷酸495‑517、492‑517、500‑529、514‑551、517‑539、524‑546、517‑548、614‑643、625‑647、
625‑660、642‑664、642‑672、753‑811、754‑780、762‑791、764‑786、772‑800、781‑803、805‑
827、808‑830、809‑831、792‑838、931‑982、944‑966、947‑969、948‑970、948‑982、1011‑
1035、1021‑1043、1019‑1050、1063‑1091、1150‑1192、1152‑1176、1160‑1192、1160‑1182、
1162‑1184、1198‑1230、1198‑1221和1202‑1230的任一个核苷酸序列相差不超过三个核苷酸的至少15个连续核苷酸，并且所述反义链包括与SEQ ID NO:2的相对应核苷酸序列相差不超过三个核苷酸的至少15个连续核苷酸。
11.一种用于抑制细胞中的己酮糖激酶(KHK)的表达的双链核糖核酸(dsRNA)药剂，其
中所述dsRNA包括形成双链区的有义链和反义链，其中所述有义链包括与SEQ ID NO:1的核苷酸513‑556、753‑813、936‑981、1155‑1193、1200‑1229、1704‑1727、1747‑1787、1850‑
1873、1936‑1964、1960‑1990、1936‑1990、2015‑2048、2060‑2095、2090‑2118、2060‑2118、
2124‑2160、2181‑2220、2221‑2249、2181‑2249、2240‑2262、2221‑2262和2181‑2262的任一个核苷酸序列相差不超过三个核苷酸的至少15个连续核苷酸，并且所述反义链包括与SEQ ID NO:2的相对应核苷酸序列相差不超过三个核苷酸的至少15个连续核苷酸。
12.一种用于抑制细胞中的己酮糖激酶(KHK)的表达的双链核糖核酸(dsRNA)药剂，其
中所述dsRNA包括形成双链区的有义链和反义链，其中所述有义链包括与SEQ ID NO:1的核苷酸1207‑1229或937‑959的核苷酸序列相差不超过三个核苷酸的至少15个连续核苷酸，并且所述反义链包括与SEQ ID NO:2的相对应核苷酸序列相差不超过三个核苷酸的至少15个连续核苷酸。
13.根据权利要求12所述的dsRNA药剂，其中所述有义链包括与SEQ ID NO:1的核苷酸
1207‑1229的核苷酸序列相差不超过三个核苷酸的至少15个连续核苷酸，并且所述反义链包括与SEQ ID NO:2的相对应核苷酸序列相差不超过三个核苷酸的至少15个连续核苷酸。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的dsRNA药剂，其中所述dsRNA药剂包括至少一个
经修饰的核苷酸。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的dsRNA药剂，其中所述有义链的基本上所有核
苷酸；所述反义链的基本上所有核苷酸都包括修饰；或所述有义链的基本上所有核苷酸和所述反义链的基本上所有核苷酸都包括修饰。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的dsRNA药剂，其中所述有义链的所有核苷酸都
包括修饰；所述反义链的所有核苷酸都包括修饰；或所述有义链的所有核苷酸和所述反义链的所有核苷酸都包括修饰。
17.根据权利要求14至16中任一项所述的dsRNA药剂，其中所述经修饰的核苷酸中的至
少一个选自由以下组成的组：脱氧核苷酸、3'末端脱氧胸腺嘧啶(dT)核苷酸、2'‑O‑甲基修饰的核苷酸、2'‑氟修饰的核苷酸、2'‑脱氧修饰的核苷酸、锁定核苷酸、解锁核苷酸、构象限制性核苷酸、约束乙基核苷酸、无碱基核苷酸、2'‑氨基修饰的核苷酸、2'‑O‑烯丙基修饰的核苷酸、2'‑C‑烷基修饰的核苷酸、2'‑羟基修饰的核苷酸、2'‑甲氧基乙基修饰的核苷酸、
2'‑O‑烷基修饰的核苷酸、吗啉代核苷酸、氨基磷酸酯、包括核苷酸的非天然碱基、四氢吡喃修饰的核苷酸、1,5‑脱水己糖醇修饰的核苷酸、环己烯基修饰的核苷酸、包括硫代磷酸酯基的核苷酸、包括甲基膦酸酯基的核苷酸、包括5'‑磷酸酯的核苷酸、包括5'‑磷酸酯模拟物的核苷酸、包括2'磷酸酯的核苷酸、热不稳定核苷酸、乙二醇修饰的核苷酸(GNA)、包括2'磷酸酯的核苷酸和2‑O‑(N‑甲基乙酰胺)修饰的核苷酸；以及其组合。
18.根据权利要求14至16中任一项所述的dsRNA药剂，其中所述核苷酸上的所述修饰选
自由以下组成的组：LNA、HNA、CeNA、2′‑甲氧基乙基、2′‑O‑烷基、2′‑O‑烯丙基、2′‑C‑烯丙基、2′‑氟、2′‑脱氧、2'‑羟基和乙二醇；以及其组合。
19.根据权利要求14至16中任一项所述的dsRNA药剂，其中所述经修饰的核苷酸中的至
少一个选自由以下组成的组：脱氧核苷酸、2'‑O‑甲基修饰的核苷酸、2'‑氟修饰的核苷酸、
2'‑脱氧修饰的核苷酸、乙二醇修饰的核苷酸(GNA)、包括2'磷酸酯的核苷酸、乙烯基膦酸酯核苷酸；以及其组合。
20.根据权利要求14至16中任一项所述的dsRNA药剂，其中所述核苷酸上的所述修饰中
的至少一种是热不稳定核苷酸修饰。
21.根据权利要求20所述的dsRNA药剂，其中所述热不稳定核苷酸修饰选自由以下组成
的组：无碱基修饰；与所述双链体中的相对核苷酸的错配；以及不稳定糖修饰、2'‑脱氧修饰、无环核苷酸、解锁核酸(UNA)和甘油核酸(GNA)。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的dsRNA药剂，其中所述双链区的长度为19至30
个核苷酸对。
23.根据权利要求22所述的dsRNA药剂，其中所述双链区的长度为19至25个核苷酸对。
24.根据权利要求22所述的dsRNA药剂，其中所述双链区的长度为19至23个核苷酸对。
25.根据权利要求22所述的dsRNA药剂，其中所述双链区的长度为23至27个核苷酸对。
26.根据权利要求22所述的dsRNA药剂，其中所述双链区的长度为21至23个核苷酸对。
27.根据权利要求1至26中任一项所述的dsRNA药剂，其中每条链的长度独立地不超过
30个核苷酸。
28.根据权利要求1至27中任一项所述的dsRNA药剂，其中所述有义链的长度为21个核
苷酸，并且所述反义链的长度为23个核苷酸。
29.根据权利要求1至28中任一项所述的dsRNA药剂，其中所述互补区的长度为至少17
个核苷酸。
30.根据权利要求1至29中任一项所述的dsRNA药剂，其中所述互补区的长度介于19与
23个核苷酸之间。
31.根据权利要求1至30中任一项所述的dsRNA药剂，其中所述互补区的长度为19个核
苷酸。
32.根据权利要求1至31中任一项所述的dsRNA药剂，其中至少一条链包括至少1个核苷
酸的3'突出端。
33.根据权利要求1至31中任一项所述的dsRNA药剂，其中至少一条链包括至少2个核苷
酸的3'突出端。
34.根据权利要求1至33中任一项所述的dsRNA药剂，其进一步包括配体。
35.根据权利要求34所述的dsRNA药剂，其中所述配体与所述dsRNA药剂的所述有义链
的3'端缀合。
36.根据权利要求34或35所述的dsRNA药剂，其中所述配体是N‑乙酰基半乳糖胺
(GalNAc)衍生物。
37.根据权利要求34至36中任一项所述的dsRNA药剂，其中所述配体是通过单价、二价
或三价支链接头连接的一种或多种GalNAc衍生物。
38.根据权利要求36或37所述的dsRNA药剂，其中所述配体是
39.根据权利要求38所述的dsRNA药剂，其中所述dsRNA药剂与所述配体缀合，如以下示意图所示
并且其中X为O或S。
40.根据权利要求39所述的dsRNA药剂，其中所述X为O。
41.根据权利要求1至40中任一项所述的dsRNA药剂，其中所述dsRNA药剂进一步包括至
少一个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键。
42.根据权利要求41所述的dsRNA药剂，其中所述硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键
位于一条链的3'末端处。
43.根据权利要求42所述的dsRNA药剂，其中所述链是所述反义链。
44.根据权利要求42所述的dsRNA药剂，其中所述链是所述有义链。
45.根据权利要求41所述的dsRNA药剂，其中所述硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键
位于一条链的5'末端处。
46.根据权利要求45所述的dsRNA药剂，其中所述链是所述反义链。
47.根据权利要求45所述的dsRNA药剂，其中所述链是所述有义链。
48.根据权利要求41所述的dsRNA药剂，其中所述硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键
位于一条链的5'和3'末端两者处。
49.根据权利要求48所述的dsRNA药剂，其中所述链是所述反义链。
50.根据权利要求1至49中任一项所述的dsRNA药剂，其中在所述双链体的所述反义链
的5′端的1位置处的碱基对是AU碱基对。
51.一种用于抑制细胞中的己酮糖激酶(KHK)的表达的双链核糖核酸(dsRNA)药剂或其
药学上可接受的盐，其包括形成双链区的有义链和反义链，其中
a)所述有义链的核苷酸序列与核苷酸序列5'‑gscsaggaagCfAfCfugagauucgu‑3'相差
不超过4个碱基，并且所述反义链的核苷酸序列与核苷酸序列5'‑asdCsgadAudCucagdTgCfuuccugcsasc‑3'相差不超过4个碱基，
其中a、g、c和u为2′‑O‑甲基(2′‑OMe)A、G、C和U；Cf和Uf为2′‑脱氧‑2'‑氟(2'‑F)C和U；
dC、dA和dT为2′‑脱氧C、A和T；并且s为硫代磷酸酯键；或
b)所述有义链的所述核苷酸序列与核苷酸序列5'‑csusacggagAfCfGfugguguuugu‑3'
相差不超过4个碱基，并且所述反义链的所述核苷酸序列与核苷酸序列5'‑asdCsaadAcdAccacdGuCfuccguagscsc‑3'相差不超过4个碱基，
其中a、g、c和u为2′‑O‑甲基(2′‑OMe)A、G、C和U；Cf和Uf为2′‑脱氧‑2'‑氟(2'‑F)C和U；
dC、dA和dG为2′‑脱氧C、A和G；并且s为硫代磷酸酯键。
52.根据权利要求51所述的dsRNA药剂，其中
a)所述有义链的所述核苷酸序列与所述核苷酸序列5'‑
gscsaggaagCfAfCfugagauucgu‑3'相差不超过3个碱基，并且所述反义链的所述核苷酸序列与所述核苷酸序列5'‑asdCsgadAudCucagdTgCfuuccugcsasc‑3'相差不超过3个碱基，其中a、g、c和u为2′‑O‑甲基(2′‑OMe)A、G、C和U；Cf和Uf为2′‑脱氧‑2'‑氟(2'‑F)C和U；
dC、dA和dT为2′‑脱氧C、A和T；并且s为硫代磷酸酯键；或
b)所述有义链的所述核苷酸序列与所述核苷酸序列5'‑
csusacggagAfCfGfugguguuugu‑3'相差不超过3个碱基，并且所述反义链的所述核苷酸序列与所述核苷酸序列5'‑asdCsaadAcdAccacdGuCfuccguagscsc‑3'相差不超过3个碱基，其中a、g、c和u为2′‑O‑甲基(2′‑OMe)A、G、C和U；Cf和Uf为2′‑脱氧‑2'‑氟(2'‑F)C和U；
dC、dA和dG为2′‑脱氧C、A和G；并且s为硫代磷酸酯键。
53.根据权利要求51所述的dsRNA药剂，其中
a)所述有义链的所述核苷酸序列与所述核苷酸序列5'‑
gscsaggaagCfAfCfugagauucgu‑3'相差不超过2个碱基，并且所述反义链的所述核苷酸序列与所述核苷酸序列5'‑asdCsgadAudCucagdTgCfuuccugcsasc‑3'相差不超过2个碱基，其中a、g、c和u为2′‑O‑甲基(2′‑OMe)A、G、C和U；Cf和Uf为2′‑脱氧‑2'‑氟(2'‑F)C和U；
dC、dA和dT为2′‑脱氧C、A和T；并且s为硫代磷酸酯键；或
b)所述有义链的所述核苷酸序列与所述核苷酸序列5'‑
csusacggagAfCfGfugguguuugu‑3'相差不超过2个碱基，并且所述反义链的所述核苷酸序列与所述核苷酸序列5'‑asdCsaadAcdAccacdGuCfuccguagscsc‑3'相差不超过2个碱基，其中a、g、c和u为2′‑O‑甲基(2′‑OMe)A、G、C和U；Cf和Uf为2′‑脱氧‑2'‑氟(2'‑F)C和U；
dC、dA和dG为2′‑脱氧C、A和G；并且s为硫代磷酸酯键。
54.根据权利要求51所述的dsRNA药剂，其中
a)所述有义链的所述核苷酸序列与所述核苷酸序列5'‑
gscsaggaagCfAfCfugagauucgu‑3'相差不超过1个碱基，并且所述反义链的所述核苷酸序列与所述核苷酸序列5'‑asdCsgadAudCucagdTgCfuuccugcsasc‑3'相差不超过1个碱基，其中a、g、c和u为2′‑O‑甲基(2′‑OMe)A、G、C和U；Cf和Uf为2′‑脱氧‑2'‑氟(2'‑F)C和U；
dC、dA和dT为2′‑脱氧C、A和T；并且s为硫代磷酸酯键；或
b)所述有义链的所述核苷酸序列与所述核苷酸序列5'‑
csusacggagAfCfGfugguguuugu‑3'相差不超过1个碱基，并且所述反义链的所述核苷酸序列与所述核苷酸序列5'‑asdCsaadAcdAccacdGuCfuccguagscsc‑3'相差不超过1个碱基，其中a、g、c和u为2′‑O‑甲基(2′‑OMe)A、G、C和U；Cf和Uf为2′‑脱氧‑2'‑氟(2'‑F)C和U；
dC、dA和dG为2′‑脱氧C、A和G；并且s为硫代磷酸酯键。
55.根据权利要求51所述的dsRNA药剂，其中
a)所述有义链的所述核苷酸序列包括所述核苷酸序列5'‑
gscsaggaagCfAfCfugagauucgu‑3'，并且所述反义链的所述核苷酸序列包括所述核苷酸序列5'‑asdCsgadAudCucagdTgCfuuccugcsasc‑3'，
其中a、g、c和u为2′‑O‑甲基(2′‑OMe)A、G、C和U；Cf和Uf为2′‑脱氧‑2'‑氟(2'‑F)C和U；
dC、dA和dT为2′‑脱氧C、A和T；并且s为硫代磷酸酯键；或
b)所述有义链的所述核苷酸序列包括所述核苷酸序列5'‑
csusacggagAfCfGfugguguuugu‑3'，并且所述反义链的所述核苷酸序列包括所述核苷酸序列5'‑asdCsaadAcdAccacdGuCfuccguagscsc‑3'，
其中a、g、c和u为2′‑O‑甲基(2′‑OMe)A、G、C和U；Cf和Uf为2′‑脱氧‑2'‑氟(2'‑F)C和U；
dC、dA和dG为2′‑脱氧C、A和G；并且s为硫代磷酸酯键。
56.根据权利要求50至55中任一项所述的dsRNA药剂，其进一步包括配体。
57.根据权利要求56所述的dsRNA药剂，其中所述配体与所述dsRNA药剂的所述有义链
的3'端缀合。
58.根据权利要求56或57所述的dsRNA药剂，其中所述配体是N‑乙酰基半乳糖胺
(GalNAc)衍生物。
59.根据权利要求56至58中任一项所述的dsRNA药剂，其中所述配体是通过单价、二价
或三价支链接头连接的一种或多种GalNAc衍生物。
60.根据权利要求58或59所述的dsRNA药剂，其中所述配体是
61.根据权利要求60所述的dsRNA药剂，其中所述dsRNA药剂与所述配体缀合，如以下示意图所示
并且其中X为O或S。
62.根据权利要求61所述的dsRNA药剂，其中所述X为O。
63.一种细胞，其含有根据权利要求1至62中任一项所述的dsRNA药剂。
64.一种用于抑制编码己酮糖激酶(KHK)的基因的表达的药物组合物，所述药物组合物
包括根据权利要求1至62中任一项所述的dsRNA药剂。
65.根据权利要求64所述的药物组合物，其中dsRNA药剂在未缓冲的溶液中。
66.根据权利要求65所述的药物组合物，其中所述未缓冲的溶液为盐水或水。
67.根据权利要求64所述的药物组合物，其中所述dsRNA药剂在缓冲溶液中。
68.根据权利要求67所述的药物组合物，其中所述缓冲溶液包括乙酸盐、柠檬酸盐、醇溶蛋白、碳酸盐或磷酸盐或其任何组合。
69.根据权利要求68所述的药物组合物，其中所述缓冲溶液是磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
70.一种抑制细胞中的己酮糖激酶(KHK)基因的表达的方法，所述方法包括使所述细胞
与根据权利要求1至62中任一项所述的dsRNA药剂或根据权利要求64至69中任一项所述的药物组合物接触，由此抑制所述细胞中的所述KHK基因的表达。
71.根据权利要求70所述的方法，其中所述细胞在受试者体内。
72.根据权利要求71所述的方法，其中所述受试者是人。
73.根据权利要求71或72所述的方法，其中所述受试者患有KHK相关病症。
74.根据权利要求73所述的方法，其中所述KHK相关病症是肝病，所述肝病选自由以下
组成的组：非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。
75.根据权利要求73所述的方法，其中所述KHK相关病症是血脂异常，所述血脂异常选
自由以下组成的组：高脂血症、高LDL胆固醇、低HDL胆固醇、高甘油三酯血症、餐后高甘油三酯血症、脂肪细胞功能障碍、内脏脂肪沉积、肥胖和代谢综合征。
76.根据权利要求73所述的方法，其中所述KHK相关病症是血糖控制病症，所述血糖控
制病症选自由以下组成的组：胰岛素抵抗、2型糖尿病和葡萄糖不耐受。
77.根据权利要求73所述的方法，其中所述KHK相关病症是心血管疾病，所述心血管疾
病选自由以下组成的组：高血压和内皮细胞功能障碍。
78.根据权利要求73所述的方法，其中所述KHK相关病症是肾病，所述肾病选自由以下
组成的组：急性肾病症、小管功能障碍、近端小管的促炎性变化和慢性肾病。
79.根据权利要求73所述的方法，其中所述KHK相关病症是高尿酸血症。
80.根据权利要求73所述的方法，其中所述KHK相关病症是痛风。
81.根据权利要求56至66中任一项所述的方法，其中使所述细胞与所述dsRNA药剂接触
将KHK的所述表达抑制了至少50％、60％、70％、80％、90％或95％。
82.根据权利要求70至81中任一项所述的方法，其中抑制KHK的表达使所述受试者的血
清中的KHK蛋白水平降低至少50％、60％、70％、80％、90％或95％。
83.一种治疗患有将受益于己酮糖激酶(KHK)表达减少的疾病或病症的受试者的方法，
其包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1至62中任一项所述的dsRNA药剂或根据权利要求64至69中任一项所述的药物组合物，由此治疗患有所述将受益于KHK表达减少的病症的所述受试者。
84.一种预防患有将受益于己酮糖激酶(KHK)表达减少的病症的受试者的至少一种症
状的方法，其包括向所述受试者施用预防有效量的根据权利要求1至62中任一项所述的dsRNA药剂或根据权利要求64至69中任一项所述的药物组合物，由此预防患有所述将受益于KHK表达减少的病症的所述受试者的至少一种症状。
85.根据权利要求83或84所述的方法，其中所述病症是KHK相关病症。
86.根据权利要求85所述的方法，其中所述KHK相关病症是肝病，所述肝病选自由以下
组成的组：非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。
87.根据权利要求85所述的方法，其中所述KHK相关病症是血脂异常，所述血脂异常选
自由以下组成的组：高脂血症、高LDL胆固醇、低HDL胆固醇、高甘油三酯血症、餐后高甘油三酯血症、脂肪细胞功能障碍、内脏脂肪沉积、肥胖和代谢综合征。
88.根据权利要求85所述的方法，其中所述KHK相关病症是血糖控制病症，所述血糖控
制病症选自由以下组成的组：胰岛素抵抗、2型糖尿病和葡萄糖不耐受。
89.根据权利要求85所述的方法，其中所述KHK相关病症是心血管疾病，所述心血管疾
病选自由以下组成的组：高血压和内皮细胞功能障碍。
90.根据权利要求85所述的方法，其中所述KHK相关病症是肾病，所述肾病选自由以下
组成的组：急性肾病症、小管功能障碍、近端小管的促炎性变化和慢性肾病。
91.根据权利要求85所述的方法，其中所述KHK相关病症是高尿酸血症。
92.根据权利要求85所述的方法，其中所述KHK相关病症是痛风。
93.根据权利要求83至92中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
94.根据权利要求93所述的方法，其中所述受试者患有或易于患有肾功能受损。
95.根据权利要求83至94中任一项所述的方法，其中所述dsRNA药剂向所述受试者的施
用引起一种或多种血清脂质的降低和/或KHK蛋白累积的降低。
96.根据权利要求83至95中任一项所述的方法，其中所述dsRNA药剂向所述受试者的施
用引起果糖代谢的降低。
97.根据权利要求83至96中任一项所述的方法，其中所述dsRNA药剂以约0.01mg/kg至
约50mg/kg的剂量施用于所述受试者。
98.根据权利要求83至97中任一项所述的方法，其中所述dsRNA药剂皮下施用于所述受
试者。
99.根据权利要求83至98中任一项所述的方法，其进一步包括确定来自所述受试者的
样品中的KHK的水平。
100.根据权利要求99所述的方法，其中所述受试者样品中的所述KHK的水平是血液或
血清样品中的KHK蛋白水平。
101.根据权利要求83至100中任一项所述的方法，其进一步包括确定来自所述受试者
的样品中的果糖代谢的水平。
102.根据权利要求83至101中任一项所述的方法，其进一步包括确定来自所述受试者
的样品中的尿酸的水平。
103.根据权利要求83至102中任一项所述的方法，其进一步包括确定来自所述受试者
的样品中的血清脂质的水平。
104.根据权利要求83至103中任一项所述的方法，其进一步包括向所述受试者施用用
于治疗KHK相关病症的另外的治疗剂。
105.一种试剂盒，其包括根据权利要求1至62中任一项所述的dsRNA药剂或根据权利要
求64至69中任一项所述的药物组合物。
106.一种小瓶，其包括根据权利要求1至62中任一项所述的dsRNA药剂或根据权利要求
64至69中任一项所述的药物组合物。
107.一种注射器，其包括根据权利要求1至62中任一项所述的dsRNA药剂或根据权利要
求64至69中任一项所述的药物组合物。
108.一种RNA诱导的沉默复合物(RISC)，其包括根据权利要求1至62所述的dsRNA药剂
中的任一种的反义链。
说明书全文

己酮糖激酶(KHK)iRNA组合物及其使用方法

[0001] 相关申请交叉引用
[0002] 本申请要求2021年2月26日提交的美国临时申请第63/154,005号、2021年7月20日提交的美国临时申请第63/223,581号和2021年11月18日提交的美国临时申请第63/280,
668号的优先权的权益。前述申请中的每个申请的全部内容通过引用并入本文。
[0003] 序列表
[0004] 本申请含有已经以ASCII格式电子提交的序列表，并且特此以全文引用的方式并入。所述ASCII副本创建于2022年2月16日，命名为121301_14720_SL.txt，并且其大小为
572,214字节。

背景技术

[0005] 流行病学研究已表明，西方饮食是现代肥胖大流行的主要原因之一。果糖摄取量的增加，与富含果糖的软饮料和加工食品的使用有关，被认为是所述流行病的一个主要因
素。到1967年，高果糖玉米甜味剂开始在食品行业广泛使用。尽管葡萄糖和果糖的每分子热
量值相同，但两种糖以不同的方式代谢并且利用不同的GLUT转运蛋白。果糖几乎完全在肝
中代谢，并且与葡萄糖代谢途径不同，果糖代谢途径不受产物的反馈抑制调节(Khaitan Z
等人,(2013)《营养与新陈代谢杂志(J.Nutr.Metab.)》2013,文章ID 682673,1‑12)。虽然己
糖激酶和磷酸果糖激酶(PFK)调节由葡萄糖、果糖激酶或己酮糖激酶(KHK)产生的甘油醛‑
3‑P的产生，所述甘油醛‑3‑P负责在肝中将果糖磷酸化为果糖‑1‑磷酸盐，但其不因果糖‑1‑磷酸盐的浓度增加而下调。因此，进入细胞的所有果糖被快速磷酸化。(Cirillo P.等人,
(2009)《美国肾脏病学会杂志(J.Am.Soc.Nephrol.)》20:545‑553)。继续利用ATP将果糖磷
酸化为果糖‑1‑磷酸盐，导致细胞内磷酸盐耗减、ATP耗减、AMP脱氨酶的活化和尿酸的形成
(Khaitan Z.等人,(2013)《营养与新陈代谢杂志》文章ID 682673,1‑12)。增加的尿酸进一
步刺激KHK的上调(Lanaspa M.A.等人,(2012)《公共科学图书馆·综合(PLOS ONE)》7(10):
1‑11)，并且引起内皮细胞和脂肪细胞功能障碍。果糖‑1‑磷酸盐随后通过醛缩酶B的作用转
化为甘油醛，并且被磷酸化为甘油醛‑3‑磷酸盐。后者向下游前进至糖酵解途径，以形成进
入柠檬酸循环的丙酮酸盐，从此在供给充足的条件下，柠檬酸盐从线粒体输出到胞质溶胶，
从而提供乙酰基辅酶A用于脂肪生成(图1)。
[0006] KHK对果糖的磷酸化和随后的脂肪生成活化导致例如脂肪肝、高甘油三酯血症、血脂异常和胰岛素抵抗。还已经表明，肾近端小管细胞中的促炎性变化由KHK活性诱导
(Cirillo P.等人,(2009)《美国肾脏病学会杂志》20:545‑553)。KHK对果糖的磷酸化与疾
病、病症或病状相关，如肝病(例如，脂肪肝、脂肪性肝炎)、血脂异常(例如，高脂血症、高LDL胆固醇、低HDL胆固醇、高甘油三酯血症、餐后高甘油三酯血症)、血糖控制病症(例如，胰岛
素抵抗、2型糖尿病)、心血管疾病(例如，高血压、内皮细胞功能障碍)、肾病(例如，急性肾病症、小管功能障碍、近端小管的促炎性变化、慢性肾病)、代谢综合征、脂肪细胞功能障碍、内脏脂肪沉积、肥胖、高尿酸血症、痛风、进食障碍和糖渴求过度。因此，本领域需要用于治疗
与KHK活性相关的疾病、病症和病状的组合物和方法。
发明内容
[0007] 本发明提供了iRNA组合物，所述组合物影响对编码己酮糖激酶(KHK)的基因的RNA转录物的RNA诱导的沉默复合物(RISC)介导的切割。KHK基因可以在细胞，例如受试者(如人
受试者)体内的细胞内。
[0008] 在一方面中，本发明提供了一种用于抑制细胞中的己酮糖激酶(KHK)的表达的双链核糖核酸(dsRNA)药剂，其中所述dsRNA药剂包括形成双链区的有义链和反义链，其中所
述有义链包括与SEQ ID NO:1的核苷酸序列相差不超过0、1、2或3个核苷酸的至少15个，例
如15、16、17、18、19、20或21个连续核苷酸，并且所述反义链包括与SEQ ID NO:2的核苷酸序列相差不超过1、2或3个核苷酸的至少15个，例如15、16、17、18、19、20、21、22或23个连续核苷酸。在一个实施例中，所述dsRNA药剂包括至少一个热不稳定核苷酸修饰，例如无碱基修
饰；与双链体中的相对核苷酸的错配；以及不稳定糖修饰、2'‑脱氧修饰、无环核苷酸、解锁
核酸(UNA)或甘油核酸(GNA)，例如，所述反义链包括至少一个热不稳定核苷酸修饰。
[0009] 在另一方面中，本发明提供了一种用于抑制细胞中的己酮糖激酶(KHK)的表达的双链核糖核酸(dsRNA)，其中所述dsRNA包括形成双链区的有义链和反义链，其中所述反义
链包括与编码KHK的mRNA互补的区域，并且其中所述互补区包括与表2、3、5、6和8‑13中的任
一者中的任一个反义核苷酸序列相差不超过0、1、2或3个核苷酸的至少15个，例如15、16、
17、18、19、20、21、22或23个连续核苷酸。
[0010] 在一个实施例中，所述dsRNA药剂包括有义链和反义链，所述有义链包括在其整个长度上与表2、3、5、6和8‑13中的任一者中的任一个有义链核苷酸序列具有至少85％，例如
85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核苷酸序列同一性的连续核苷酸序列，并且所述反义链包括在其整个长度上与表2、3、5、6和8‑13中的任一者
中的任一个反义链核苷酸序列具有至少85％，例如85％、90％、91％、92％、93％、94％、
95％、96％、97％、98％、99％或100％核苷酸序列同一性的连续核苷酸序列。
[0011] 在一个实施例中，所述dsRNA药剂包括有义链和反义链，所述有义链包括与表2、3、5、6和8‑13中的任一者中的任一个有义链核苷酸序列相差不超过三个核苷酸的至少15个，
例如15、16、17、18、19、20或21个连续核苷酸，并且所述反义链包括与表2、3、5、6和8‑13中的任一者中的任一个反义链核苷酸序列相差不超过三个核苷酸的至少15个，例如15、16、17、
18、19、20、21、22或23个连续核苷酸。
[0012] 在一个实施例中，所述dsRNA药剂包括有义链和反义链，所述有义链包括与表2、3、5、6和8‑13中的任一者中的任一个有义链核苷酸序列相差不超过两个核苷酸的至少15个，
例如15、16、17、18、19、20或21个连续核苷酸，并且所述反义链包括与表2、3、5、6和8‑13中的任一者中的任一个反义链核苷酸序列相差不超过两个核苷酸的至少15个，例如15、16、17、
18、19、20、21、22或23个连续核苷酸。
[0013] 在一个实施例中，所述dsRNA药剂包括有义链和反义链，所述有义链包括与表2、3、5、6和8‑13中的任一者中的任一个有义链核苷酸序列相差不超过一个核苷酸的至少15个，
例如15、16、17、18、19、20或21个连续核苷酸，并且所述反义链包括与表2、3、5、6和8‑13中的任一者中的任一个反义链核苷酸序列相差不超过一个核苷酸的至少15个，例如15、16、17、
18、19、20、21、22或23个连续核苷酸。
[0014] 在一个实施例中，所述dsRNA药剂包括有义链和反义链，所述有义链包括选自由表2、3、5、6和8‑13中的任一者中的任一个有义链核苷酸序列组成的组的核苷酸序列或由其组
成，并且所述反义链包括选自由表2、3、5、6和8‑13中的任一者中的任一个反义链核苷酸序
列组成的组的核苷酸序列或由其组成。
[0015] 在一方面中，本发明提供了一种用于抑制细胞中的己酮糖激酶(KHK)的表达的双链核糖核酸(dsRNA)，其中所述dsRNA包括形成双链区的有义链和反义链，其中所述有义链
包括与SEQ ID NO:1的核苷酸120‑162；164‑188；181‑207；193‑217；209‑231；283‑306；508‑
546；568‑603；596‑632；640‑674；746‑806；806‑835；917‑942；936‑084；1016‑1041；1100‑
1123；1149‑1175；1160‑1193；1205‑1229；1252‑1283；1334‑1356；1407‑1429；1472‑1497；
1506‑1533；1539‑1561；1704‑1727；1747‑1787；1850‑1873；1936‑1964；1960‑1990；2015‑
2048；2060‑2095；2090‑2118；2124‑2160；2181‑2200；2221‑2262的任一个核苷酸序列相差不超过0、1、2或3个核苷酸的至少15个，例如15、16、17、18、19、20或21个连续核苷酸，并且所述反义链包括与SEQ ID NO:2的相对应核苷酸序列相差不超过三个，例如3、2、1或0个的至
少15个，例如15、16、17、18、19、20、21、22或23个连续核苷酸。
[0016] 在一方面中，本发明提供了一种用于抑制细胞中的己酮糖激酶(KHK)的表达的双链核糖核酸(dsRNA)，其中所述dsRNA包括形成双链区的有义链和反义链，其中所述有义链
包括与SEQ ID NO:1的核苷酸517‑539；521‑543；524‑546；517‑546；581‑603；610‑632；747‑
769；749‑771；752‑774；755‑777；757‑779；758‑780；764‑786；776‑798；781‑803；747‑803；
920‑942；941‑963；944‑966；950‑972；962‑984；920‑984；1149‑1171；1161‑1183；1165‑
1187；1171‑1193；1149‑1193；1205‑1227；1206‑1228；1205‑1228；1334‑1356；1472‑1494；
1475‑1497；1472‑1497的任一个核苷酸序列相差不超过0、1、2或3个核苷酸的至少15个，例
如15、16、17、18、19、20或21个连续核苷酸，并且所述反义链包括与SEQ ID NO:2的相对应核苷酸序列相差不超过三个，例如3、2、1或0个的至少15个，例如15、16、17、18、19、20、21、22或
23个连续核苷酸。
[0017] 在一方面中，本发明提供了一种用于抑制细胞中的己酮糖激酶(KHK)的表达的双链核糖核酸(dsRNA)，其中所述dsRNA包括形成双链区的有义链和反义链，其中所述有义链
包括与SEQ ID NO:1的核苷酸517‑539；524‑546；517‑546；753‑775；757‑779；753‑779；764‑
786；767‑789；768‑790；769‑791；764‑791；773‑795；781‑803；773‑803；753‑803；808‑830；
937‑959；941‑963；944‑966；941‑966；948‑970；950‑972；948‑972；1160‑1182；1161‑1183；
1160‑1183；和1207‑1229的任一个核苷酸序列相差不超过0、1、2或3个核苷酸的至少15个，
例如15、16、17、18、19、20或21个连续核苷酸，并且所述反义链包括与SEQ ID NO:2的相对应核苷酸序列相差不超过三个，例如3、2、1或0个的至少15个，例如15、16、17、18、19、20、21、22或23个连续核苷酸。
[0018] 在一个实施例中，其中所述反义链包括与双链体的任一个反义链核苷酸序列相差不超过0、1、2或3个核苷酸的至少15个，例如15、16、17、18、19、20、21、22或23个连续核苷酸，所述双链体选自由以下组成的组：AD‑1613400；AD‑1613243；AD‑1290757.3；AD‑1290878.3；
AD‑1290969.3；AD‑1423317.2；AD‑1423327.2；AD‑1423336.2；AD‑1290599.3；AD‑
1523172.1；AD‑1290837.3；AD‑1523173.1；AD‑1290884.3；AD‑1523174.1；AD‑1290959.3；
AD‑1523175.1；AD‑1423311.2；AD‑1423324.2；AD‑1523176.1；AD‑1423329.2；AD‑
1423333.2；AD‑1423330.2；AD‑1523177.1；AD‑1290885.3；AD‑1523178.1；AD‑1423334.2；
AD‑1523179.1；AD‑1523180.1；AD‑1290539.3；和AD‑1523181.1。
[0019] 在另一方面中，本发明提供了一种用于抑制细胞中的己酮糖激酶(KHK)的表达的双链核糖核酸(dsRNA)药剂，其中所述dsRNA包括形成双链区的有义链和反义链，其中所述
有义链包括与SEQ ID NO:1的核苷酸495‑517、492‑517、500‑529、514‑551、517‑539、524‑
546、517‑548、614‑643、625‑647、625‑660、642‑664、642‑672、753‑811、754‑780、762‑791、
764‑786、772‑800、781‑803、805‑827、808‑830、809‑831、792‑838、931‑982、944‑966、947‑
969、948‑970、948‑982、1011‑1035、1021‑1043、1019‑1050、1063‑1091、1150‑1192、1152‑
1176、1160‑1192、1160‑1182、1162‑1184、1198‑1230、1198‑1221和1202‑1230的任一个核苷酸序列相差不超过三个，例如3、2、1或0个核苷酸的至少15个，例如15、16、17、18、19、20或21个连续核苷酸，并且所述反义链包括与SEQ ID NO:2的相对应核苷酸序列相差不超过3个，
例如3、2、1或0个核苷酸的至少15个，例如15、16、17、18、19、20、21、22或23个连续核苷酸。
[0020] 在一方面中，本发明提供了一种用于抑制细胞中的己酮糖激酶(KHK)的表达的双链核糖核酸(dsRNA)药剂，其中所述dsRNA包括形成双链区的有义链和反义链，其中所述有
义链包括与SEQ ID NO:1的核苷酸513‑556、753‑813、936‑981、1155‑1193、1200‑1229、
1704‑1727、1747‑1787、1850‑1873、1936‑1964、1960‑1990、1936‑1990、2015‑2048、2060‑
2095、2090‑2118、2060‑2118、2124‑2160、2181‑2220、2221‑2249、2181‑2249、2240‑2262、
2221‑2262和2181‑2262的任一个核苷酸序列相差不超过三个，例如3、2、1或0个核苷酸的至
少15个，例如15、16、17、18、19、20或21个连续核苷酸，并且所述反义链包括与SEQ ID NO:2的相对应核苷酸序列相差不超过3个，例如3、2、1或0个核苷酸的至少15个，例如15、16、17、
18、19、20、21、22或23个连续核苷酸。
[0021] 在一方面中，本发明提供了一种用于抑制细胞中的己酮糖激酶(KHK)的表达的双链核糖核酸(dsRNA)药剂，其中所述dsRNA包括形成双链区的有义链和反义链，其中所述有
义链包括与SEQ ID NO:1的核苷酸1207‑1229或937‑959的核苷酸序列相差不超过3个，例如
3、2、1或0个核苷酸的至少15个，例如15、16、17、18、19、20或21个连续核苷酸，并且所述反义链包括与SEQ ID NO:2的相对应核苷酸序列相差不超过3个，例如3、2、1或0个的至少15个，
例如15、16、17、18、19、20、21、22或23个连续核苷酸。
[0022] 在一个实施例中，所述有义链包括与SEQ ID NO:1的核苷酸1207‑1229的核苷酸序列相差不超过三个，例如3、2、1或0个核苷酸的至少15个，例如15、16、17、18、19、20或21个连续核苷酸，并且所述反义链包括与SEQ ID NO:2的相对应核苷酸序列相差不超过3个，例如
3、2、1或0个的至少15个，例如15、16、17、18、19、20、21、22或23个连续核苷酸。
[0023] 在一个实施例中，所述dsRNA药剂包括至少一个经修饰的核苷酸。
[0024] 在一个实施例中，所述有义链的基本上所有核苷酸；所述反义链的基本上所有核苷酸都包括修饰；或所述有义链的基本上所有核苷酸和所述反义链的基本上所有核苷酸都
包括修饰。
[0025] 在一个实施例中，所述有义链的所有核苷酸都包括修饰；所述反义链的所有核苷酸都包括修饰；或所述有义链的所有核苷酸和所述反义链的所有核苷酸都包括修饰。
[0026] 在一个实施例中，所述经修饰的核苷酸中的至少一个选自由以下组成的组：脱氧核苷酸、3'末端脱氧胸腺嘧啶(dT)核苷酸、2'‑O‑甲基修饰的核苷酸、2'‑氟修饰的核苷酸、
2'‑脱氧修饰的核苷酸、锁定核苷酸、解锁核苷酸、构象限制性核苷酸、约束乙基核苷酸、无
碱基核苷酸、2'‑氨基修饰的核苷酸、2'‑O‑烯丙基修饰的核苷酸、2'‑C‑烷基修饰的核苷酸、
2'‑羟基修饰的核苷酸、2'‑甲氧基乙基修饰的核苷酸、2'‑O‑烷基修饰的核苷酸、吗啉代核苷酸、氨基磷酸酯、包括核苷酸的非天然碱基、四氢吡喃修饰的核苷酸、1,5‑脱水己糖醇修
饰的核苷酸、环己烯基修饰的核苷酸、包括硫代磷酸酯基的核苷酸、包括甲基膦酸酯基的核
苷酸、包括5'‑磷酸酯的核苷酸、包括5'‑磷酸酯模拟物的核苷酸、热不稳定核苷酸、乙二醇
修饰的核苷酸(GNA)、包括2'磷酸酯的核苷酸和2‑O‑(N‑甲基乙酰胺)修饰的核苷酸；以及其
组合。
[0027] 在一个实施例中，所述核苷酸上的所述修饰选自由以下组成的组：LNA、HNA、CeNA、2′‑甲氧基乙基、2′‑O‑烷基、2′‑O‑烯丙基、2′‑C‑烯丙基、2′‑氟、2′‑脱氧、2'‑羟基和乙二醇；以及其组合。
[0028] 在一个实施例中，所述经修饰的核苷酸中的至少一个选自由以下组成的组：脱氧核苷酸、2'‑O‑甲基修饰的核苷酸、2'‑氟修饰的核苷酸、2'‑脱氧修饰的核苷酸、乙二醇修饰的核苷酸(GNA)，例如Ggn、Cgn、Tgn或Agn、包括2'磷酸酯的核苷酸，例如G2p、C2p、A2p、U2p、乙烯基膦酸酯核苷酸；以及其组合。
[0029] 在另一个实施例中，所述核苷酸上的至少一个所述修饰是热不稳定核苷酸修饰。
[0030] 在一些实施例中，所述热不稳定核苷酸修饰选自由以下组成的组：无碱基修饰；与所述双链体中的相对核苷酸的错配；以及不稳定糖修饰、2'‑脱氧修饰、无环核苷酸、解锁核
酸(UNA)和甘油核酸(GNA)。
[0031] 在一些实施例中，所述经修饰的核苷酸包括3'末端脱氧胸腺嘧啶核苷酸(dT)的短序列。
[0032] 在一些实施例中，所述核苷酸上的修饰是2'‑O‑甲基、GNA和2'氟修饰。
[0033] 在一些实施例中，所述dsRNA药剂进一步包括至少一个硫代磷酸酯核苷酸间键。在一些实施例中，所述dsRNA药剂包括6个至8个硫代磷酸酯核苷酸间键。在一个实施例中，所
述硫代磷酸酯或甲基膦酸酯的核苷酸间键位于一条链的3'末端处。任选地，所述链是所述
反义链。在另一个实施例中，所述链是所述有义链。在一个相关实施例中，所述硫代磷酸酯
或甲基膦酸酯核苷酸间键位于一条链的5'末端处。任选地，所述链是所述反义链。在另一个
实施例中，所述链是所述有义链。在另一个实施例中，所述硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸
间键位于一条链的5'和3'末端两者处。任选地，所述链是所述反义链。在另一个实施例中，
所述链是所述有义链。
[0034] 双链区可以是长度为19个至30个核苷酸对；长度为19个至25个核苷酸对；长度为19个至23个核苷酸对；长度为23个至27个核苷酸对；或长度为21个至23个核苷酸对。
[0035] 在一个实施例中，每条链的长度独立地不超过30个核苷酸。
[0036] 在一个实施例中，所述有义链的长度为21个核苷酸，并且所述反义链的长度为23个核苷酸。
[0037] 所述互补区的长度可以为至少17个核苷酸；介于19与23个核苷酸之间；或19个核苷酸。
[0038] 在一个实施例中，至少一条链包括至少1个核苷酸的3'突出端。在另一个实施例中，至少一条链包括至少2个核苷酸的3'突出端。
[0039] 在一个实施例中，所述dsRNA药剂进一步包括配体。
[0040] 在一个实施例中，所述配体与所述dsRNA药剂的所述有义链的3'端缀合。
[0041] 在一个实施例中，所述配体是N‑乙酰基半乳糖胺(GalNAc)衍生物。
[0042] 在一个实施例中，所述配体是通过单价、二价或三价支链接头连接的一种或多种GalNAc衍生物。
[0043] 在一个实施例中，所述配体是
[0044]
[0045] 在一个实施例中，所述dsRNA药剂与所述配体缀合，如以下示意图所示
[0046]
[0047] 并且其中X为O或S。
[0048] 在一个实施例中，所述X为O。
[0049] 在一个实施例中，所述dsRNA药剂进一步包括至少一个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键。
[0050] 在一个实施例中，所述硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键位于一条链，例如所述反义链或所述有义链的3'末端处。
[0051] 在另一个实施例中，所述硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键位于一条链，例如所述反义链或所述有义链的5'末端处。
[0052] 在一个实施例中，所述硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键位于一条链的5'和3'末端两者处。在一个实施例中，所述链是反义链。
[0053] 在一个实施例中，在所述双链体的所述反义链的5′‑端的1位置处的碱基对是AU碱基对。
[0054] 一方面，本发明提供了一种用于抑制细胞中的己酮糖激酶(KHK)的表达的双链状核糖核酸(dsRNA)药剂或其药学上可接受的盐，其包括形成双链区的有义链和反义链，其中
[0055] a)所述有义链的核苷酸序列与核苷酸序列5'‑gscsaggaagCfAfCfugagauucgu‑3'相差不超过4个碱基，并且所述反义链的核苷酸序列与核苷酸序列5'‑asdCsgadAudCucagd
TgCfuuccugcsasc‑3'相差不超过4个碱基，其中a、g、c和u为2′‑O‑甲基(2′‑OMe)A、G、C和U；
Cf和Uf为2′‑脱氧‑2'‑氟(2'‑F)C和U；dC、dA和dT为2′‑脱氧C、A和T；并且s为硫代磷酸酯键；
或
[0056] b)所述有义链的核苷酸序列与核苷酸序列5'‑csusacggagAfCfGfugguguuugu‑3'相差不超过4个碱基，并且所述反义链的核苷酸序列与核苷酸序列5'‑asdCsaadAcdAccacd
GuCfuccguagscsc‑3'相差不超过4个碱基，其中a、g、c和u为2′‑O‑甲基(2′‑OMe)A、G、C和U；
Cf和Uf为2′‑脱氧‑2'‑氟(2'‑F)C和U；dC、dA和dG为2′‑脱氧C、A和G；并且s为硫代磷酸酯键。
[0057] 在一个实施例中，
[0058] a)所述有义链的核苷酸序列与核苷酸序列5'‑gscsaggaagCfAfCfugagauucgu‑3'相差不超过3个碱基，并且所述反义链的核苷酸序列与核苷酸序列5'‑asdCsgadAudCucagd
TgCfuuccugcsasc‑3'相差不超过3个碱基，其中a、g、c和u为2′‑O‑甲基(2′‑OMe)A、G、C和U；
Cf和Uf为2′‑脱氧‑2'‑氟(2'‑F)C和U；dC、dA和dT为2′‑脱氧C、A和T；并且s为硫代磷酸酯键；
或
[0059] b)所述有义链的核苷酸序列与核苷酸序列5'‑csusacggagAfCfGfugguguuugu‑3'相差不超过3个碱基，并且所述反义链的核苷酸序列与核苷酸序列5'‑asdCsaadAcdAccacd
GuCfuccguagscsc‑3'相差不超过3个碱基，其中a、g、c和u为2′‑O‑甲基(2′‑OMe)A、G、C和U；
Cf和Uf为2′‑脱氧‑2'‑氟(2'‑F)C和U；dC、dA和dG为2′‑脱氧C、A和G；并且s为硫代磷酸酯键。
[0060] 在一个实施例中，
[0061] a)所述有义链的核苷酸序列与核苷酸序列5'‑gscsaggaagCfAfCfugagauucgu‑3'相差不超过2个碱基，并且所述反义链的核苷酸序列与核苷酸序列5'‑asdCsgadAudCucagd
TgCfuuccugcsasc‑3'相差不超过2个碱基，其中a、g、c和u为2′‑O‑甲基(2′‑OMe)A、G、C和U；
Cf和Uf为2′‑脱氧‑2'‑氟(2'‑F)C和U；dC、dA和dT为2′‑脱氧C、A和T；并且s为硫代磷酸酯键；
或
[0062] b)所述有义链的核苷酸序列与核苷酸序列5'‑csusacggagAfCfGfugguguuugu‑3'相差不超过2个碱基，并且所述反义链的核苷酸序列与核苷酸序列5'‑asdCsaadAcdAccacd
GuCfuccguagscsc‑3'相差不超过2个碱基，其中a、g、c和u为2′‑O‑甲基(2′‑OMe)A、G、C和U；
Cf和Uf为2′‑脱氧‑2'‑氟(2'‑F)C和U；dC、dA和dG为2′‑脱氧C、A和G；并且s为硫代磷酸酯键。
[0063] 在一个实施例中，
[0064] a)所述有义链的核苷酸序列与核苷酸序列5'‑gscsaggaagCfAfCfugagauucgu‑3'相差不超过1个碱基，并且所述反义链的核苷酸序列与核苷酸序列5'‑asdCsgadAudCucagd
TgCfuuccugcsasc‑3'相差不超过1个碱基，其中a、g、c和u为2′‑O‑甲基(2′‑OMe)A、G、C和U；
Cf和Uf为2′‑脱氧‑2'‑氟(2'‑F)C和U；dC、dA和dT为2′‑脱氧C、A和T；并且s为硫代磷酸酯键；
或
[0065] b)所述有义链的核苷酸序列与核苷酸序列5'‑csusacggagAfCfGfugguguuugu‑3'相差不超过1个碱基，并且所述反义链的核苷酸序列与核苷酸序列5'‑asdCsaadAcdAccacd
GuCfuccguagscsc‑3'相差不超过1个碱基，其中a、g、c和u为2′‑O‑甲基(2′‑OMe)A、G、C和U；
Cf和Uf为2′‑脱氧‑2'‑氟(2'‑F)C和U；dC、dA和dG为2′‑脱氧C、A和G；并且s为硫代磷酸酯键。
[0066] 在一个实施例中，
[0067] a)所述有义链的核苷酸序列包括核苷酸序列5'‑gscsaggaagCfAfCfugagauucgu‑3'，并且所述反义链的核苷酸序列包括核苷酸序列5'‑asdCsgadAudCucagdTgCfuuccugcsa
sc‑3'，其中a、g、c和u为2′‑O‑甲基(2′‑OMe)A、G、C和U；Cf和Uf为2′‑脱氧‑2'‑氟(2'‑F)C和U；dC、dA和dT为2′‑脱氧C、A和T；并且s为硫代磷酸酯键；或
[0068] b)所述有义链的核苷酸序列包括核苷酸序列5'‑csusacggagAfCfGfugguguuugu‑3'，并且所述反义链的核苷酸序列包括核苷酸序列5'‑asdCsaadAcdAccacdGuCfuccguagsc
sc‑3'，其中a、g、c和u为2′‑O‑甲基(2′‑OMe)A、G、C和U；Cf和Uf为2′‑脱氧‑2'‑氟(2'‑F)C和U；dC、dA和dG为2′‑脱氧C、A和G；并且s为硫代磷酸酯键。
[0069] 在一个实施例中，所述dsRNA药剂进一步包括配体。
[0070] 在一个实施例中，所述配体与所述dsRNA药剂的所述有义链的3'端缀合。
[0071] 在一个实施例中，所述配体是N‑乙酰基半乳糖胺(GalNAc)衍生物。
[0072] 在一个实施例中，所述配体是通过单价、二价或三价支链接头连接的一种或多种GalNAc衍生物。
[0073] 在一个实施例中，所述配体是
[0074]
[0075] 在一个实施例中，所述dsRNA药剂与所述配体缀合，如以下示意图所示
[0076]
[0077] 并且其中X为O或S。
[0078] 在一个实施例中，X为O。
[0079] 本发明还提供了含有本发明的任何dsRNA药剂的细胞和包括本发明任何dsRNA药剂的药物组合物。
[0080] 本发明的药物组合物可以包含dsRNA药剂，所述dsRNA药剂在未缓冲的溶液，例如盐水或水中，或本发明的药物组合物可以包含dsRNA药剂，所述dsRNA药剂在缓冲溶液，例如
包括乙酸盐、柠檬酸盐、醇溶蛋白、碳酸盐或磷酸盐或其任何组合的缓冲溶液：或磷酸盐缓
冲盐水(PBS)中。
[0081] 一方面，本发明提供了一种抑制细胞中的己酮糖激酶(KHK)基因的表达的方法。所述方法包含使所述细胞与本发明的任何dsRNA药剂或本发明的任何药物组合物接触，由此
抑制所述细胞中的所述KHK基因的表达。
[0082] 在一个实施例中，所述细胞在受试者，例如人受试者体内，受试者例如患有己酮糖激酶(KHK)相关病症，如选自由以下组成的组的KHK相关病症：肝病(例如，脂肪肝、脂肪性肝
炎、非酒精性脂肪性肝炎(NASH))、血脂异常(例如，高脂血症、高LDL胆固醇、低HDL胆固醇、
高甘油三酯血症、餐后高甘油三酯血症)、血糖控制病症(例如，胰岛素抵抗、2型糖尿病)、心
血管疾病(例如，高血压、内皮细胞功能障碍)、肾病(例如，急性肾病症、小管功能障碍、近端小管的促炎性变化、慢性肾病)、代谢综合征、脂肪细胞功能障碍、内脏脂肪沉积、肥胖、高尿酸血症、痛风、进食障碍和糖渴求过度。
[0083] 在一个实施例中，使所述细胞与所述dsRNA药剂接触将KHK的表达抑制了至少50％、60％、70％、80％、90％或95％。
[0084] 在一个实施例中，抑制KHK的表达使所述受试者的血清中的KHK蛋白水平降低至少50％、60％、70％、80％、90％或95％。
[0085] 一方面，本发明提供了一种治疗患有将受益于己酮糖激酶(KHK)表达减少的病症的受试者的方法。所述方法包含向所述受试者施用治疗有效量的本发明的任何dsRNA或本
发明的任何药物组合物，由此治疗患有所述将受益于KHK表达减少的病症的所述受试者。
[0086] 另一方面，本发明提供了一种预防患有将受益于己酮糖激酶(KHK)表达减少的病症的受试者的至少一种症状的方法。所述方法包含向所述受试者施用预防有效量的本发明
的任何dsRNA或本发明的任何药物组合物，由此预防患有所述将受益于KHK表达减少的病症
的所述受试者的至少一种症状。
[0087] 在某些实施例中，所述KHK相关病症是肝病，例如脂肪性肝病，如NAFLD或NASH。在某些实施例中，所述KHK相关病症是血脂异常，例如高血清甘油三酯、高血清LDL、高血清胆
固醇、低血清HDL、餐后高甘油三酯血症。在另一个实施例中，所述KHK相关病症是血糖控制
病症，例如并非由针对胰岛素的免疫反应引起的胰岛素抵抗、葡萄糖抵抗、2型糖尿病。在某
些实施例中，所述KHK相关病症是心血管疾病，例如高血压、内皮细胞功能障碍。在某些实施
例中，所述KHK相关病症是肾病，例如急性肾病症、小管功能障碍、近端小管的促炎性变化、
慢性肾病。在某些实施例中，所述疾病是代谢综合征。在某些实施例中，所述KHK相关病症是
脂质沉积或功能障碍疾病，例如内脏脂肪沉积、脂肪肝、肥胖。在某些实施例中，所述KHK相
关病症是高尿酸疾病，例如痛风、高尿酸血症。在某些实施例中，所述KHK相关病症是进食障
碍，如糖渴求过度。
[0088] 在某些实施例中，所述dsRNA向所述受试者的施用引起果糖代谢的降低。在某些实施例中，所述dsRNA的施用引起所述受试者体内的KHK，特别是肝KHK，特别是患有高KHK的受
试者体内的KHK‑C的水平的降低。在某些实施例中，所述dsRNA的施用引起所述受试者体内
的果糖代谢的降低。在某些实施例中，所述dsRNA的施用引起尿酸，例如患有高血清尿酸(例
如，与痛风相关的高血清尿酸)的受试者体内的血清尿酸的水平的降低。在某些实施例中，
所述dsRNA的施用引起患有至少一种血清脂质水平异常的受试者体内的血清脂质，例如包
含餐后甘油三酯在内的甘油三酯、LDL、HDL或胆固醇的正常化。在某些实施例中，所述dsRNA
的施用引起脂质沉积的正常化，例如肝中的脂质沉积的减少(例如，NAFLD或NASH的减少)、
内脏脂肪沉积的减少、体重的减少。在某些实施例中，所述dsRNA的施用引起患有与胰岛素
免疫反应非相关的胰岛素反应异常或葡萄糖反应异常的受试者体内的胰岛素或葡萄糖反
应的正常化。在某些实施例中，所述dsRNA的施用引起肾功能的改善，或肾功能丧失的停止
或速率的降低。在某些实施例中，所述dsRNA引起高血压(hypertension/elevated blood 
pressure)的降低。
[0089] 在某些实施例中，本发明的方法进一步包括向患有KHK相关疾病的受试者施用另外的药剂。在某些实施例中，本领域已知的各种KHK相关疾病的治疗与本发明的RNAi药剂组
合使用。下文讨论此类治疗。
[0090] 在一个实施例中，所述受试者是人。
[0091] 在一个实施例中，所述dsRNA药剂以约0.01mg/kg至约50mg/kg的剂量向所述受试者施用。
[0092] 在一个实施例中，向所述受试者皮下施用所述dsRNA药剂。
[0093] 在一个实施例中，本发明的方法包含进一步确定来自所述受试者的样品中KHK的水平。
[0094] 在一个实施例中，所述受试者样品中KHK的水平是血液或血清样品中的KHK蛋白水平。
[0095] 在一个实施例中，本发明的方法进一步包括测量所述受试者体内的尿酸水平，特别是血清尿酸水平。在一个实施例中，本发明的方法进一步包括测量所述受试者体内的尿
果糖水平。在一个实施例中，本发明的方法进一步包括测量受试者体内的血清脂质水平。在
某些实施例中，本发明的方法进一步包括测量受试者体内的胰岛素或葡萄糖敏感性。在某
些实施例中，果糖代谢的表达或活性水平的降低指示所述KHK相关疾病正在被治疗或预防。
[0096] 本发明还提供了试剂盒，其包括本发明的任何dsRNA或本发明的任何药物组合物和任选的使用说明。
[0097] 本发明进一步提供了RNA诱导的沉默复合物(RISC)，所述RISC包括本发明的任何dsRNA药剂的反义链。
[0098] 在另一个实施例中，所述RNAi药剂是其药学上可接受的盐。本文中RNAi药剂中的每一种的“药学上可接受的盐”包含但不限于钠盐、钙盐、锂盐、钾盐、铵盐、镁盐以及其混合物。本领域技术人员将理解，当所述RNAi药剂以聚阳离子盐的形式提供时，所述聚阳离子盐
在任选地经修饰的磷酸二酯主链和/或任何其它酸性修饰(例如，5'末端膦酸酯基团)的每
个游离酸基团具有一个阳离子。例如，长度为“n”个核苷酸的寡核苷酸含有n‑1个任选地经
修饰的二磷酸酯，因此长度为21nt的寡核苷酸可以作为具有至多20个阳离子(例如，20个钠
阳离子)的盐提供。类似地，可以以具有至多42个阳离子(例如，42个钠阳离子)的盐的形式
提供具有长度为21nt的有义链和长度为23nt的反义链的RNAi药剂。在前述实例中，其中所
述RNAi药剂还包含5'末端磷酸酯或5'末端乙烯基膦酸酯基，所述RNAi药剂可以以具有至多
44个阳离子(例如，44个钠阳离子)的盐的形式提供。
[0099] 通过以下详细描述和附图进一步说明本发明。

附图说明

[0100] 图1描绘了果糖的经典和替代脂肪生成途径。在经典途径中，甘油三酯(TG)是通过包含醛缩酶B(Aldo B)和脂肪酸合酶(FAS)在内的多种酶的作用的果糖代谢的直接产物。在
替代途径中，由果糖磷酸化为果糖‑1‑磷酸盐(F‑1‑P)期间发生的核苷酸周转产生的尿酸导
致线粒体氧化应激(mtROS)的生成，这引起克雷布斯循环中的顺乌头酸酶(ACO2)的活性的
降低。因此，ACO2底物柠檬酸盐累积并释放到胞质溶胶中，其中其充当通过ATP柠檬酸盐裂
解酶(ACL)和脂肪酸合酶的活化进行TG合成的底物。AMPD2，AMP脱氨酶2；IMP，肌苷单磷酸
盐；PO4，磷酸盐(来自Johnson等人(2013)《糖尿病(Diabetes)》.62:3307‑3315)。
[0101] 图2是描绘了单次3mg/kg剂量的指示双链体的施用对给药后第29天的KHK mRNA和KHK蛋白水平的影响的图。mRNA和蛋白质的水平被描绘为相对于mRNA和蛋白质的给药前水
平归一化的剩余％。
[0102] 图3是描绘了单次3mg/kg剂量的指示双链体的施用对给药后第50天的KHK mRNA水平的影响的图。mRNA的水平被描绘为相对于mRNA的给药前水平归一化的剩余％。
[0103] 图4是描绘了单次3mg/kg剂量的指示双链体的施用对给药后第78天的KHK mRNA水平的影响的图。mRNA的水平被描绘为相对于mRNA的给药前水平归一化的剩余％。

具体实施方式

[0104] 本发明提供了iRNA组合物，其影响对己酮糖激酶(KHK)基因的RNA转录物的RNA诱导的沉默复合物(RISC)介导的切割。所述基因可以在细胞内，例如受试者(如人)体内的细
胞。这些iRNA的使用使得能够在哺乳动物中靶向降解相对应基因(KHK基因)的mRNA。
[0105] 本发明的iRNA已被设计成靶向人己酮糖激酶(KHK)基因，包含在其它哺乳动物物种的己酮糖激酶(KHK)直系同源物中保守的基因部分。不旨在受理论的限制，据信上述特性
和特定靶位点的组合或子组合或这些iRNA的特定修饰赋予本发明的iRNA改进的功效、稳定
性、效力、耐久性和安全性。
[0106] 因此，本发明提供了用于使用iRNA组合物来治疗和预防己酮糖激酶(KHK)相关病症的方法，所述病症例如肝病(例如，脂肪肝、脂肪性肝炎、非酒精性脂肪性肝炎(NASH))、血
脂异常(例如，高脂血症、高LDL胆固醇、低HDL胆固醇、高甘油三酯血症、餐后高甘油三酯血
症)、血糖控制病症(例如，胰岛素抵抗、2型糖尿病)、心血管疾病(例如，高血压、内皮细胞功能障碍)、肾病(例如，急性肾病症、小管功能障碍、近端小管的促炎性变化、慢性肾病)、代谢综合征、脂肪细胞功能障碍、内脏脂肪沉积、肥胖、高尿酸血症、痛风、进食障碍和糖渴求过
度，所述组合物影响对KHK基因的RNA转录物的RNA诱导的沉默复合物(RISC)介导的切割。
[0107] 本发明的iRNA包含RNA链(反义链)，其具有长度为至多约30个核苷酸或更少，例如长度为19‑30、19‑29、19‑28、19‑27、19‑26、19‑25、19‑24、19‑23、19‑22、19‑21、19‑20、20‑
30、20‑29、20‑28、20‑27、20‑26、20‑25、20‑24、20‑23、20‑22、20‑21、21‑30、21‑29、21‑28、
21‑27、21‑26、21‑25、21‑24、21‑23或21‑22个核苷酸的区域，所述区域与KHK基因的mRNA转录物的至少一部分基本互补。
[0108] 在某些实施例中，本发明的双链RNAi药剂的一条或两条链的长度为至多66个核苷酸，例如长度为36‑66、26‑36、25‑36、31‑60、22‑43、27‑53个核苷酸，具有与KHK基因的mRNA转录物的至少一部分基本互补的至少19个连续核苷酸的区域。在一些实施例中，此类具有
较长长度的反义链的iRNA药剂可以例如包含长度为20‑60个核苷酸的第二RNA链(有义链)，
其中有义链和反义链形成18‑30个连续核苷酸的双链体。
[0109] 本发明的iRNA的使用使得能够在哺乳动物中靶向降解相对应基因(KHK基因)的mRNA。使用体外测定，发明人已经证明靶向KHK基因的iRNA可以强效地介导RNAi，从而显著
抑制KHK基因的表达。因此，包含这些iRNA的方法和组合物可用于治疗患有KHK相关病症的
受试者，所述病症例如肝病(例如，脂肪肝、脂肪性肝炎、非酒精性脂肪性肝炎(NASH))、血脂
异常(例如，高脂血症、高LDL胆固醇、低HDL胆固醇、高甘油三酯血症、餐后高甘油三酯血
症)、血糖控制病症(例如，胰岛素抵抗、2型糖尿病)、心血管疾病(例如，高血压、内皮细胞功能障碍)、肾病(例如，急性肾病症、小管功能障碍、近端小管的促炎性变化、慢性肾病)、代谢综合征、脂肪细胞功能障碍、内脏脂肪沉积、肥胖、高尿酸血症、痛风、进食障碍和糖渴求过
度。
[0110] 因此，本发明提供了用于使用使用iRNA组合物来治疗患有将受益于抑制或减少KHK基因表达的病症的受试者的方法和组合疗法，所述病症例如KHK相关病症，如肝病(例
如，脂肪肝、脂肪性肝炎、非酒精性脂肪性肝炎(NASH))、血脂异常(例如，高脂血症、高LDL胆固醇、低HDL胆固醇、高甘油三酯血症、餐后高甘油三酯血症)、血糖控制病症(例如，胰岛素
抵抗、2型糖尿病)、心血管疾病(例如，高血压、内皮细胞功能障碍)、肾病(例如，急性肾病
症、小管功能障碍、近端小管的促炎性变化、慢性肾病)、代谢综合征、脂肪细胞功能障碍、内脏脂肪沉积、肥胖、高尿酸血症、痛风、进食障碍和糖渴求过度，所述组合物影响对KHK基因
的RNA转录物的RNA诱导的沉默复合物(RISC)介导的切割。
[0111] 本发明还提供了用于预防患有将受益于抑制或减少KHK基因表达的病症的受试者的至少一种症状的方法，所述病症例如肝病(例如，脂肪肝、脂肪性肝炎、非酒精性脂肪性肝
炎(NASH))、血脂异常(例如，高脂血症、高LDL胆固醇、低HDL胆固醇、高甘油三酯血症、餐后
高甘油三酯血症)、血糖控制病症(例如，胰岛素抵抗、2型糖尿病)、心血管疾病(例如，高血
压、内皮细胞功能障碍)、肾病(例如，急性肾病症、小管功能障碍、近端小管的促炎性变化、
慢性肾病)、代谢综合征、脂肪细胞功能障碍、内脏脂肪沉积、肥胖、高尿酸血症、痛风、进食障碍和糖渴求过度。
[0112] 以下详细描述公开了如何制备和使用含有iRNA的组合物来抑制KHK基因的表达，以及用于治疗将受益于KHK基因的表达的抑制和/或减少的受试者的组合物、用途和方法，
所述受试者例如易患或被诊断为患有KHK相关病症的受试者。
[0113] I.定义
[0114] 为了更容易理解本发明，首先定义某些术语。另外，应该注意的是，每当引用参数的值或值的范围时，意图是所引用的值中间的值和范围也旨在是本发明的一部分。
[0115] 冠词“一个/一种(a/an)”在本文中指代冠词的一个/种或多于一个/种(即，至少一个/种)语法宾语。举例来说，“要素”是指一个要素或多于一个要素，例如，多个要素。
[0116] 术语“包含”在本文中用于意指短语“包含但不限于”，并且可与之互换使用。
[0117] 除非上下文另外清楚地指出，否则术语“或”在本文中用于意指术语“和/或”，并且可与之互换使用。例如，“有义链或反义链”被理解为“有义链、反义链或有义链和反义链”。
[0118] 术语“约”在本文中用于意指在本领域的典型公差范围内。例如，“约”可以被理解为平均值的约2个标准偏差。在某些实施例中，约意指±10％。在某些实施例中，约意指±
5％。当“约”出现在一系列数字或范围之前时，应当理解“约”可以修饰所述系列或范围中的数字中的每个数字。
[0119] 一个数字或一系列数字之前的术语“至少”、“不少于”或“或更多”被理解为包含与术语“至少”相邻的数字，以及逻辑上可以包含的所有后续数字或整数，如从上下文中可以清楚地看出的。例如，核酸分子中的核苷酸数量必须是整数。例如，“21个核苷酸的核酸分子
中的至少19个核苷酸”意指19个、20个或21个核苷酸具有所指示的特性。当“至少”出现在一
系列数字或范围之前时，应当理解，“至少”可以修饰所述系列或范围中的数字中的每个数
字。
[0120] 如本文所使用，“不超过”或“或更少”被理解为与短语相邻的值和逻辑上较低的值或整数，从上下文来看逻辑上低至零。例如，具有“不超过2个核苷酸”的突出端的双链体具
有2个、1个或0个核苷酸突出端。当“不超过”出现在一系列数字或范围之前时，应当理解，
“不超过”可以修饰所述系列或范围中的数字中的每个数字。如本文所使用的，范围包含上
限和下限两者。
[0121] 如本文所使用的，检测方法可以包含确定存在的分析物的量低于所述方法的检测水平。
[0122] 在指示的靶位点与有义链或反义链的核苷酸序列之间发生冲突的情况下，指示的序列优先。
[0123] 在序列与其在转录物或其它序列上的指示位点之间发生冲突的情况下，以说明书中所述的核苷酸序列为准。
[0124] 如本文所使用，与术语“KHK”可互换使用的“己酮糖激酶”是指编码催化果糖向果糖‑1‑磷酸盐的转化的酶的天然存在的基因。此基因的产物是异化饮食果糖的途径中的第
一酶。已标识出编码不同异构体的可变剪接转录物变体。所述基因也被称为果糖激酶。
[0125] 可以发现KHK的示例性核苷酸和氨基酸序列，例如GenBank登录号XM_017004061.1(智人KHK；SEQ ID NO:1；反向互补序列，SEQ ID NO:2)；NM_006488.3(智人KHK；SEQ ID NO:
3；反向互补序列，SEQ ID NO:4)；NM_000221.3(智人KHK；SEQ ID NO:5；反向互补序列，SEQ ID NO:6)；GenBank登录号NM_001310524.1(小家鼠KHK；SEQ ID NO:7；反向互补序列，SEQ 
ID NO:8)；GenBank登录号NM_031855.3(褐家鼠KHK；SEQ ID NO:9；反向互补序列，SEQ ID 
NO:10)；GenBank登录号XM_005576322.2(食蟹猴KHK，SEQ ID NO:11；反向互补序列，SEQ ID 
NO:12)。
[0126] KHK(己酮糖激酶)基因位于染色体2p23上，并且编码己酮糖激酶，也被称为果糖激酶。KHK是以醇作为磷酸盐受体的磷酸转移酶。KHK属于碳水化合物激酶的核糖激酶家族
(Trinh等人《,结晶学学报(ACTA Cryst.)》,D65:201‑211)。已标识出己酮糖激酶的两种异
构体，KHK‑A和KHK‑C，其由全长mRNA的可变剪接产生。这些异构体的不同之处在于包含外显
子3a或3c，以及位置72和115之间的32个氨基酸。KHK‑C mRNA以高水平表达，主要在肝、肾和
小肠中。KHK‑C具有比KHK‑A低得多的果糖结合Km，并且因此在磷酸化饮食果糖中是高度有
效的。人KHK‑C mRNA转录物的序列可以在例如GenBank登录号NM_006488.3(智人KHK；SEQ 
ID NO:3)中找到。人KHK‑A mRNA转录物的序列可以在例如GenBank登录号NM_000221.3；SEQ 
ID NO:5)中找到。全长人KHK mRNA的序列以GenBank登录号GI:XM_017004061.1(SEQ ID 
NO:1)提供。
[0127] 本文提供的iRNA药剂能够使一种或两种KHK异构体沉默。
[0128] 通过例如GenBank、UniProt、OMIM和Macaca基因组计划网站可以很容易地获得KHK mRNA序列的另外的实例。
[0129] 关于KHK的另外的信息，可以在例如www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/？term＝khk找到。
[0130] 截至提交本申请之日，上述GenBank登录号和基因数据库号中的每一个的全部内容通过引用并入本文。
[0131] 如本文所使用，术语KHK也指KHK基因的变型，包含SNP数据库中提供的变体。KHK基因内的许多序列变型已被标识，并且可以在例如NCBI dbSNP和UniProt中找到(参见例如
www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/？term＝KHK，截至提交本申请之日，其全部内容通过引用并入
本文。
[0132] 如本文所使用，“靶序列”是指在KHK基因转录期间形成的mRNA分子的核苷酸序列的连续部分，包含作为初级转录产物的RNA加工产物的mRNA。序列的靶部分将至少足够长，
以在KHK基因转录期间形成的mRNA分子的核苷酸序列的所述部分处或附近用作iRNA定向切
割的底物。在一个实施例中，靶序列位于KHK的蛋白质编码区内。
[0133] 靶序列的长度可以为约19个至36个核苷酸，例如长度为约19个至30个核苷酸。例如，靶序列的长度可以为约19‑30个核苷酸、19‑30、19‑29、19‑28、19‑27、19‑26、19‑25、19‑
24、19‑23、19‑22、19‑21、19‑20、20‑30、20‑29、20‑28、20‑27、20‑26、20‑25、20‑24、20‑23、
20‑22、20‑21、21‑30、21‑29、21‑28、21‑27、21‑26、21‑25、21‑24、21‑23或21‑22个核苷酸。在某些实施例中，靶序列的长度为19个至23个核苷酸，任选地长度为21个至23个核苷酸上述
范围和长度中间的范围和长度也被认为是本公开的一部分。
[0134] 如本文所使用的，术语“包括序列的链”是指包括核苷酸链的寡核苷酸，所述核苷酸链通过使用标准核苷酸命名法指代的序列描述。
[0135] “G”、“C”、“A”、“T”和“U”通常分别代表含有鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶作为碱基的核苷酸。然而，可以理解的是，术语“核糖核苷酸”或“核苷酸”也可以指经修饰的核苷酸，如下文进一步详述的，或替代的替代部分(参见例如，表1)。本领域技术人员清楚地知道，鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶可以被其它部分取代，而不会实质性改变包括
含有此类替代部分的核苷酸的寡核苷酸的碱基配对特性。例如但不限于，包括肌苷作为其
碱基的核苷酸可以与含有腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶的核苷酸碱基配对。因此，在本发明特征
的dsRNA的核苷酸序列中，含有尿嘧啶、鸟嘌呤或腺嘌呤的核苷酸可以被含有例如肌苷的核
苷酸取代。在另一个实例中，寡核苷酸中任何位置的腺嘌呤和胞嘧啶都可以分别被鸟嘌呤
和尿嘧啶取代，以与靶mRNA形成G‑U摆动碱基配对。含有此类取代部分的序列适合用于本发
明特征的组合物和方法。
[0136] 如本文可互换使用的术语“iRNA”、“RNAi药剂”、“iRNA药剂”和“RNA干扰剂”是指含有如本文所定义的RNA的药剂，并且其通过RNA诱导的沉默复合物(RISC)通路介导RNA转录物的靶向切割。iRNA通过一种称为RNA干扰(RNAi)的过程指导mRNA的序列特异性降解。iRNA
调节，例如抑制细胞，例如受试者(如哺乳动物受试者)体内的细胞中的KHK基因的表达。
[0137] 在一个实施例中，本发明的RNAi药剂包含单链RNA，其与靶RNA序列，例如KHK靶mRNA序列相互作用以引导靶RNA的切割。不希望受理论束缚，据信引入细胞中的长双链RNA
被称为Dicer的III型核酸内切酶分解为siRNA(Sharp等人(2001)《基因与发育(Genes 
Dev.)》15:485)。Dicer，即核糖核酸酶‑III样酶使用特性两个碱基3'突出端将dsRNA加工成
19‑23个碱基对短干扰RNA(Bernstein等人,(2001)《自然(Nature)》409:363)。然后将siRNA
掺入到RNA诱导的沉默复合物(RISC)中，其中一种或多种解旋酶解开siRNA双链体，从而使
互补的反义链能够指导靶表识别(Nykanen等人,(2001)《细胞(Cell)》107:309)。在与适当
的靶mRNA结合后，RISC内的一种或多种核酸内切酶切割靶表以诱导沉默(Elbashir等人,
(2001)《基因与发育(Genes Dev.)》15:188)。因此，一方面，本发明涉及在细胞内生成的单
链RNA(siRNA)，并且其促进RISC复合物的形成以影响靶基因，即KHK基因的沉默。因此，术语
“siRNA”在本文中也用于指如上所述的iRNA。
[0138] 在某些实施例中，RNAi药剂可以是单链siRNA(ssRNAi)，其被引入细胞或生物体中以抑制靶mRNA。单链RNAi药剂与RISC核酸内切酶Argonaute 2结合，然后所述核酸内切酶切
割靶mRNA。单链siRNA通常为15个至30个核苷酸，并且经过化学修饰。单链siRNA的设计和测
试在美国专利第8,101,348号和Lima等人,(2012)《细胞(Cell)》150:883‑894中进行了描
述，所述文献中每一个的全部内容由此通过引用并入本文。本文所描述的任何反义核苷酸
序列可以作为本文所描述的单链siRNA使用，或通过Lima等人,(2012)《细胞(Cell)》150:
883‑894中所描述的方法进行化学修饰。
[0139] 在某些实施例中，用于本发明的组合物、用途和方法的“iRNA”是双链RNA，并且在本文中称为“双链RNA药剂”、“双链RNA(dsRNA)分子”、“dsRNA药剂”或“dsRNA”。术语“dsRNA”是指核糖核酸分子的复合物，具有双链体结构，所述双链体结构包括两条反平行且基本互
补的核酸链，相对于靶RNA，即KHK基因具有“有义”和“反义”取向。在本发明的一些实施例
中，双链RNA(dsRNA)通过本文中称为RNA干扰或RNAi的转录后基因沉默机制触发靶RNA(例
如，mRNA)的降解。
[0140] 一般来说，dsRNA分子的每条链的大多数核苷酸是核糖核苷酸，但如本文所详细描述，每条链或两条链也可以包含一种或多种非核糖核苷酸，例如脱氧核糖核苷酸或经修饰
的核苷酸。另外，如本说明中所使用，“iRNA”可以包含具有化学修饰的核糖核苷酸；iRNA可
以包含在多个核苷酸处的实质性修饰。如本文所使用的，术语“经修饰的核苷酸”是指独立
地具有经修饰的糖部分、经修饰的核苷酸间键或经修饰的核碱基或其任何组合的核苷酸。
因此，术语经修饰的核苷酸涵盖对核苷间键、糖部分或核碱基的取代、添加或去除，例如官
能团或原子。适合用于本发明的药剂的修饰包含本文公开的或本领域已知的所有类型的修
饰。出于本说明书和权利要求的目的，如在siRNA类型分子中使用的，任何此类修饰都被
“iRNA”或“RNAi药剂”涵盖。
[0141] 在本公开的某些实施例中，如果存在于RNAi药剂内，则包含脱氧核苷酸可以被认为构成经修饰的核苷酸。
[0142] 双链体区可以具有允许通过RISC途径特异性降解期望的靶RNA的任何长度，并且所述长度可以在约19至36个碱基对的范围内，例如其长度为约19‑30个碱基对，例如其长度
为约9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、
33、34、35或36个碱基对，如其长度为约19‑30、19‑29、19‑28、19‑27、19‑26、19‑25、19‑24、
19‑23、19‑22、19‑21、19‑20、20‑30、20‑29、20‑28、20‑27、20‑26、20‑25、20‑24、20‑23、20‑
22、20‑21、21‑30、21‑29、21‑28、21‑27、21‑26、21‑25、21‑24、21‑23或21‑22个碱基对。在某些实施例中，双链体区的长度为19个至21个碱基对，例如，长度为21个碱基对。上述范围和
长度中间的范围和长度也被认为是本公开的一部分。
[0143] 形成双链体结构的两条链可以是一个较大RNA分子的不同部分，或其可以是单独的RNA分子。如果这两条链是一个较大分子的一部分，并且因此在一条链的3'端和形成双链
体结构的相应的另一条链的5'端之间通过不间断的核苷酸链连接，则连接的RNA链被称为
“发夹环”发夹环可以包括至少一个未配对的核苷酸。在一些实施例中，发夹环可以包括至
少2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、23个或更多个未配对的核苷酸。在一些实施例中，发夹环可以是10个或更少个核苷酸。在一些实施例中，发夹环可以是8个或更少个未配对的核苷酸。在
一些实施例中，发夹环可以是4个至10个未配对的核苷酸。在一些实施例中，发夹环可以是4
个至8个核苷酸。
[0144] 在dsRNA的两条基本上互补的链由单独的RNA分子构成的情况下，那些分子不必但可以共价连接。当两条链通过除一条链的3'端与形成双链体结构的相应的另一条链的5'端
之间的不间断核苷酸链以外的其它方式共价连接时，连接结构被称为“接头”RNA链可以具
有相同或不同数量的核苷酸。碱基对的最大数量是dsRNA的最短链中的核苷酸数量减去双
链体中存在的任何突出端。除了双链体结构外，RNAi可以包括一个或多个核苷酸突出端。在
RNAi药剂的一个实施例中，至少一条链包括至少1个核苷酸的3'突出端。在另一个实施例
中，至少一条链包括至少2个核苷酸的3'突出端，例如，2个、3个、4个、5个、6个、7个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或15个核苷酸。在其它实施例中，RNAi药剂的至少一条链包括至
少1个核苷酸的5'突出端。在某些实施例中，至少一条链包括至少2个核苷酸的5'突出端，例
如2个、3个、4个、5个、6个、7个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或15个核苷酸。在其它实施例中，RNAi药剂的一条链的3'端和5'端两者都包括至少1个核苷酸的突出端。
[0145] 在某些实施例中，本发明的iRNA药剂是dsRNA，其每条链包括19‑23个核苷酸，其与靶RNA序列，例如KHK基因相互作用，以直接切割靶RNA。
[0146] 在一些实施例中，本发明的iRNA是24‑30个核苷酸的dsRNA，其与靶RNA序列，例如KHK靶mRNA序列相互作用，以引导靶RNA的切割。
[0147] 如本文所使用的，术语“核苷酸突出端”是指从双链iRNA的双链体结构突出的至少一个未配对的核苷酸。例如，当dsRNA的一条链的3'端延伸超过另一条链的5'端时，反之亦
然，则存在核苷酸突出端。dsRNA可以包括至少一个核苷酸的突出端；可替代地，突出端可以
包括至少两个核苷酸、至少三个核苷酸、至少四个核苷酸、至少五个核苷酸或更多。核苷酸
突出端可以包括以下或由以下组成：核苷酸/核苷类似物，包含脱氧核苷酸/核苷。突出端可
以在有义链、反义链或其任何组合上。此外，突出端的核苷酸可以存在于dsRNA的反义链或
有义链的5'端、3'端或两端上。
[0148] 在一个实施例中，dsRNA的反义链在3'端或5'端处的突出端具有1个至10个核苷酸，例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个核苷酸。在一个实施例中，dsRNA的有义链在3'端或5'端处的突出端具有1个至10个核苷酸，例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个核苷酸。在另一个实施例中，突出端中的一个或多个核苷酸被核苷硫代
磷酸盐替代。
[0149] 在某些实施例中，dsRNA的反义链在3'端或5'端处的突出端具有1个至10个核苷酸，例如0个至3个、1个至3个、2个至4个、2个至5个、4个至10个、5个至10个，例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个核苷酸。在一个实施例中，dsRNA的有义链在3'端或5'端处的突出端具有1个至10个核苷酸，例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个核苷酸。在另一个实施例中，突出端中的一个或多个核苷酸被核苷硫代磷酸盐替代。
[0150] 在某些实施例中，dsRNA的反义链在3'端或5'端处的突出端具有1个至10个核苷酸，例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个核苷酸。在某些实施例中，有义链或反义链或两者上的突出端可以包含长度长于10个核苷酸的延伸长度，例如长度为1个至
30个核苷酸、2个至30个核苷酸，10个至30个核苷酸、10个至25个核苷酸、10个至20个核苷酸
或10个至15个核苷酸。在某些实施例中，延伸的突出端在双链体的有义链上。在某些实施例
中，在双链体的有义链的3'端上存在延伸的突出端。在某些实施例中，在双链体的有义链的
5'端上存在延伸的突出端。在某些实施例中，延伸的突出端在双链体的反义链上。在某些实
施例中，在双链体的反义链的3'端上存在延伸的突出端。在某些实施例中，在双链体的反义
链的5'端上存在延伸的突出端。在某些实施例中，延伸的突出端中的一个或多个核苷酸被
核苷硫代磷酸盐替代。在某些实施例中，突出端包含自互补部分，使得突出端能够形成在生
理条件下稳定的发夹结构。
[0151] “钝”或“钝端”意指在双链RNA药剂的末端没有未配对的核苷酸，即没有核苷酸突出端。“钝端”双链RNA药剂在其整个长度上是双链的，即在分子的任一端都没有核苷酸突出
端。本发明的RNAi药剂包含在一端没有核苷酸突出端(即具有一个突出端和一个钝端的药
剂)或在两端都没有核苷酸突出端的RNAi药剂。最常见的此类分子将在其整个长度上是双
链的。
[0152] 术语“反义链”或“引导链”是指iRNA，例如dsRNA的链，其包含与靶序列，例如KHK mRNA基本互补的区域。
[0153] 如本文所使用，术语“互补区”是指反义链上与本文所定义的序列，例如靶序列，例如KHK核苷酸序列基本互补的区域。在互补区与靶序列不完全互补的情况下，错配可以处于
分子的内部或末端区中。通常，最可容忍的错配在末端区域，例如在iRNA的5'‑或3'端的5
个、4个或3个核苷酸内。在一些实施例中，本发明的双链RNA药剂包含反义链中的核苷酸错
配。在一些实施例中，本发明的双链RNA药剂的反义链包含与靶mRNA的不超过4个错配，例
如，反义链包含与靶mRNA的4个、3个、2个、1个或0个错配。在一些实施例中，本发明的反义链双链RNA药剂包含与有义链的不超过4个错配，例如，反义链包含与有义链的4个、3个、2个、1
个或0个错配。在一些实施例中，本发明的双链RNA药剂包含有义链中的核苷酸错配。在一些
实施例中，本发明的双链RNA药剂的有义链包含与反义链的不超过4个错配，例如，有义链包
含与反义链的4个、3个、2个、1个或0个错配。在一些实施例中，核苷酸错配在例如距离iRNA
的3'端5个、4个、3个核苷酸内。在另一个实施例中，核苷酸错配在例如在iRNA药剂的3'末端
核苷酸中。在一些实施例中，错配不在种子区中。
[0154] 因此，如本文所描述的RNAi药剂可以含有与靶序列的一个或多个错配。在一个实施例中，如本文所描述的RNAi药剂含有不超过3个错配(即3个、2个、1个或0个错配)。在一个
实施例中，如本文所描述的RNAi药剂含有不超过2个错配。在一个实施例中，如本文所描述
的RNAi药剂含有不超过1个错配。在一个实施例中，如本文所描述的RNAi药剂含有0个错配。
在某些实施例中，如果RNAi药剂的反义链含有与靶序列的错配，则错配可以任选地被限制
在距互补区的5'‑或3'端的最后5个核苷酸内。例如，在此类实施例中，对于23个核苷酸的
RNAi药剂，与KHK基因的区域互补的链通常在中心13个核苷酸内不含有任何错配。本文所述
的方法或本领域已知的方法可以用于确定含有与靶序列的错配的RNAi药剂是否有效抑制
KHK基因的表达。考虑具有错配的RNAi药剂在抑制KHK基因表达方面的功效很重要，特别是
如果已知KHK基因中的特定互补区在群体内具有多态性序列变异。
[0155] 如本文所使用的，术语“有义链”或“随从链”是指包含与如本文所定义的术语的反义链的区域基本上互补的区域的iRNA链。
[0156] 如本文所使用，“基本所有核苷酸都经修饰”是大部分但不是全部经修饰，并且可以包含不超过5、4、3、2或1个未经修饰的核苷酸。
[0157] 如本文所使用的，术语“切割区”是指紧邻切割位点的区。切割位点是靶上发生切割的位点。在一些实施例中，切割区在切割位点的任一端上并紧邻切割位点包括三个碱基。
在一些实施例中，切割区在切割位点的任一端上并紧邻切割位点包括两个碱基。在一些实
施例中，切割位点特异性地出现在反义链的核苷酸10和11结合的位点处，并且切割区包括
核苷酸11、12和13。
[0158] 如本文所使用的，并且除非另外指明，否则术语“互补”当用于相对于第二核苷酸序列描述第一核苷酸序列时是指包括第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在某些条件
下与包括第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸杂交并且形成双链体结构的能力，如技术
人员将理解的。例如，此类条件可以是严格条件，其中严格条件可以包含：400mM NaCl，40mM PIPES pH 6.4，1mM EDTA，50℃或70℃，持续12‑16小时，然后洗涤(参见例如《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)》,Sambrook等人(1989)冷泉港实验
室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press))。例如，此类条件可以是“严格条件”，
其中严格条件可以包含：400mM NaCl，40mM PIPES pH 6.4，1mM EDTA，50℃或70℃，持续12‑
16小时，然后洗涤(参见例如《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory 
Manual)》,Sambrook等人.(1989)冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory 
Press))。可以应用其它条件，如生物体内部可能遇到的生理学上相关的条件。技术人员将
能够根据杂交核苷酸的最终应用确定最适合于两个序列的互补性测试的条件集。
[0159] iRNA内，例如如本文所描述的dsRNA内的互补序列包含包括第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸与包括第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在一个或两个核苷酸序
列的全长上的碱基配对。此类序列在本文中可以被称为彼此“完全互补”。然而，当第一序列
在本文中被称为相对于第二序列“基本互补”时，这两个序列可以是完全互补的，或其可以
形成一个或多个，但通常不超过5、4、3或2个杂交后错配的碱基对用于至多30个碱基对的双
链体，同时保留在与其最终应用最相关的条件下杂交的能力，例如在体外或体内抑制基因
表达。然而，在两个寡核苷酸被设计以在杂交时形成一个或多个单链突出端的情况下，此类
突出端不应视为相对于互补性的确定的错配。例如，包括一个长度为21个核苷酸的寡核苷
酸和另一个长度为23个核苷酸的寡核苷酸的dsRNA，其中较长的寡核苷酸包括与较短的寡
核苷酸完全互补的21个核苷酸的序列，仍可以被称为出于本文所描述的目的“完全互补”。
[0160] 如本文所使用的，“互补”序列还可以包含非沃森‑克里克碱基对(non‑Watson‑Crick base pair)或由非天然和经修饰的核苷酸形成的碱基对，或完全由其形成，只要满
足关于其杂交能力的以上要求即可。此类非沃森‑克里克碱基对包含但不限于G:U摆动碱基
配对或胡斯坦碱基配对(Hoogsteen base pairing)。
[0161] 本文中的术语“互补”、“完全互补”和“基本互补”可以相对于dsRNA的有义链和反义链之间的碱基匹配，或两个寡核苷酸或多核苷酸(如双链RNA药剂的反义链和靶序列)之
间的碱基匹配使用，如根据其使用的上下文所理解的。
[0162] 如本文所使用，与信使RNA(mRNA)的“至少部分基本互补”的多核苷酸是指与所关注的mRNA(例如，编码KHK的mRNA)的连续部分基本互补的多核苷酸。例如，如果序列与编码
KHK的mRNA的不间断部分基本互补，则多核苷酸与KHK mRNA的至少一部分互补。
[0163] 因此，在一些实施例中，本文公开的反义多核苷酸与靶KHK序列完全互补。在其它实施例中，本文公开的反义多核苷酸与靶KHK序列基本互补，并且包括连续核苷酸序列，所
述连续核苷酸序列在其整个长度上与SEQ ID NO:1、3、5、7、9或11中的任一个的核苷酸序列
或SEQ ID NO:1、3、5、7、9或11中的任一个的片段的等效区域至少80％互补，如约85％、约
90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％互补。
[0164] 在一些实施例中，本文公开的反义多核苷酸与KHK序列的片段基本互补，并且包括连续核苷酸序列，所述连续核苷酸序列在其整个长度上与选自SEQ ID NO:1的核苷酸120‑
162；164‑188；181‑207；193‑217；209‑231；283‑306；508‑546；568‑603；596‑632；640‑674；
746‑806；806‑835；917‑942；936‑084；1016‑1041；1100‑1123；1149‑1175；1160‑1193；1205‑
1229；1252‑1283；1334‑1356；1407‑1429；1472‑1497；1506‑1533；1539‑1561；1704‑1727；
1747‑1787；1850‑1873；1936‑1964；1960‑1990；2015‑2048；2060‑2095；2090‑2118；2124‑
2160；2181‑2200；2221‑2262的组的SEQ ID NO:1的片段至少80％互补，如约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％互补。
[0165] 在一些实施例中，本文公开的反义多核苷酸与靶KHK序列的片段基本互补，并且包括连续核苷酸序列，所述连续核苷酸序列在其整个长度上与选自SEQ ID NO:1的核苷酸
517‑539；521‑543；524‑546；517‑546；581‑603；610‑632；747‑769；749‑771；752‑774；755‑
777；757‑779；758‑780；764‑786；776‑798；781‑803；747‑803；920‑942；941‑963；944‑966；
950‑972；962‑984；920‑984；1149‑1171；1161‑1183；1165‑1187；1171‑1193；1149‑1193；
1205‑1227；1206‑1228；1205‑1228；1334‑1356；1472‑1494；1475‑1497；1472‑1497的组的SEQ ID NO:1的片段至少80％互补，如约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约
95％、约96％、约97％、约98％或约99％互补。
[0166] 在一些实施例中，本文公开的反义多核苷酸与靶KHK序列的片段基本互补，并且包括连续核苷酸序列，所述连续核苷酸序列在其整个长度上与选自SEQ ID NO:1的核苷酸
517‑539；524‑546；517‑546；753‑775；757‑779；753‑779；764‑786；767‑789；768‑790；769‑
791；764‑791；773‑795；781‑803；773‑803；753‑803；808‑830；937‑959；941‑963；944‑966；
941‑966；948‑970；950‑972；948‑972；1160‑1182；1161‑1183；1160‑1183；和1207‑1229的组的SEQ ID NO:1的片段至少80％互补，如约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％互补。
[0167] 在一些实施例中，本文公开的反义多核苷酸与靶KHK序列的片段基本互补，并且包括连续核苷酸序列，所述连续核苷酸序列在其整个长度上与选自SEQ ID NO:1的核苷酸
495‑517、492‑517、500‑529、514‑551、517‑539、524‑546、517‑548、614‑643、625‑647、625‑
660、642‑664、642‑672、753‑811、754‑780、762‑791、764‑786、772‑800、781‑803、805‑827、
808‑830、809‑831、792‑838、931‑982、944‑966、947‑969、948‑970、948‑982、1011‑1035、
1021‑1043、1019‑1050、1063‑1091、1150‑1192、1152‑1176、1160‑1192、1160‑1182、1162‑
1184、1198‑1230、1198‑1221和1202‑1230的组的SEQ ID NO:1的片段至少80％互补，如约
85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％互补。
[0168] 在一些实施例中，本文公开的反义多核苷酸与靶KHK序列的片段基本互补，并且包括连续核苷酸序列，所述连续核苷酸序列在其整个长度上与选自SEQ ID NO:1的核苷酸
513‑556、753‑813、936‑981、1155‑1193、1200‑1229、1704‑1727、1747‑1787、1850‑1873、
1936‑1964、1960‑1990、1936‑1990、2015‑2048、2060‑2095、2090‑2118、2060‑2118、2124‑
2160、2181‑2220、2221‑2249、2181‑2249、2240‑2262、2221‑2262和2181‑2262的组的SEQ ID NO:1的片段至少80％互补，如约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约
96％、约97％、约98％或约99％互补。
[0169] 在其它实施例中，本文公开的反义多核苷酸与靶KHK序列基本互补，并且包括连续核苷酸序列，所述连续核苷酸序列在其整个长度上与表2、3、5、6和8‑13中的任一个的任一
个中的任一个有义链核苷酸序列或表2、3、5、6和8‑13中的任一个中的任一个有义链核苷酸
序列的片段至少约80％互补，如约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％互补。
[0170] 在一个实施例中，本公开的RNAi药剂包含与反义多核苷酸基本互补的有义链，所述有义链反过来与靶KHK序列相同，并且其中所述有义链多核苷酸包括连续核苷酸序列，所
述连续核苷酸序列在其整个长度上与SEQ ID NO:2、4、6、8、10或12的核苷酸序列或SEQ ID 
NO:2、4、6、8、10或12中的任一个的片段至少约80％互补，如约85％、约90％、约91％、约
92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％互补。
[0171] 在一些实施例中，本发明的iRNA包含与反义多核苷酸基本互补的有义链，所述有义链反过来与靶KHK序列互补，并且其中所述有义链多核苷酸包括连续核苷酸序列，所述连
续核苷酸序列在其整个长度上与表2、3、5、6和8‑13中的任一个的任一个中的任一个反义链
核苷酸序列或表2、3、5、6和8‑13中的任一个中的任一个反义链核苷酸序列的片段至少约
80％互补，如约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约
98％、约99％或100％互补。
[0172] 在某些实施例中，所述有义链和反义链选自以下双链体中的任一个；AD‑1613400；AD‑1613243；AD‑1290757.3；AD‑1290878.3；AD‑1290969.3；AD‑1423317.2；AD‑1423327.2；
AD‑1423336.2；AD‑1290599.3；AD‑1523172.1；AD‑1290837.3；AD‑1523173.1；AD‑
1290884.3；AD‑1523174.1；AD‑1290959.3；AD‑1523175.1；AD‑1423311.2；AD‑1423324.2；
AD‑1523176.1；AD‑1423329.2；AD‑1423333.2；AD‑1423330.2；AD‑1523177.1；AD‑
1290885.3；AD‑1523178.1；AD‑1423334.2；AD‑1523179.1；AD‑1523180.1；AD‑1290539.3；和AD‑1523181.1。
[0173] 一般来说，“iRNA”包含具有化学修饰的核糖核苷酸。此类修饰可以包含本文所公开的或本领域已知的所有类型的修饰。出于本说明书和权利要求的目的，如在dsRNA分子中
所使用，任何此类修饰都被“iRNA”涵盖。
[0174] 在本公开的某些实施例中，如果存在于RNAi药剂内，则包含脱氧核苷酸可以被认为构成经修饰的核苷酸。
[0175] 在本发明的一个方面，用于本发明的方法和组合物中的药剂是经由反义抑制机制抑制靶mRNA的单链反义寡核苷酸分子。单链反义寡核苷酸分子与靶mRNA内的序列互补。单
链反义寡核苷酸可以通过与mRNA的碱基配对而以化学计量方式抑制翻译，并且物理上阻碍
翻译机制，参见Dias,N.等人,(2002)《分子癌症治疗(Mol Cancer Ther)》1:347‑355。单链
反义寡核苷酸分子的长度可以为约14至约30个核苷酸，并且具有与靶序列互补的序列。例
如，单链反义寡核苷酸分子可以包括来自本文所述的任一个反义序列的至少约14、15、16、
17、18、19、20个或更多个连续核苷酸的序列。
[0176] 如本文所用的，短语“使细胞与iRNA(如dsRNA)接触”包含通过任何可能的方式接触细胞。使细胞与iRNA接触包含使细胞在体外与iRNA接触或使细胞在体内与iRNA接触。可
以直接或间接地进行接触。因此，例如可以通过执行所述方法的个体使iRNA与细胞物理接
触，或可替代地，可以使iRNA处于允许或使其随后与细胞接触的情况。
[0177] 体外接触细胞可以通过例如将细胞与iRNA一起温育来进行。体内接触细胞可以通过例如将iRNA注射到细胞所在的组织中或其附近，或通过将iRNA注射到另一个区域中，例
如血流或皮下空间，使得药剂随后到达待接触细胞所在的组织来进行。例如，iRNA可以含有
配体(例如，GalNAc)或与配体偶联，所述配体将iRNA引导到所关注的位点，例如肝脏。体外
和体内接触方法的组合也是可能的。例如，细胞也可以与iRNA体外接触，并且随后移植到受
试者体内。
[0178] 在某些实施例中，使细胞与iRNA接触包含通过促进或影响细胞的摄取或吸收来“引入”或“将iRNA递送到细胞中”。iRNA的吸收或摄取可以通过无辅助的扩散或活性细胞过
程发生，或通过辅助剂或装置发生。将iRNA引入细胞中可以是体外的或体内的。例如，对于
体内引入，可以将iRNA注射到组织部位中或全身施用。体外引入细胞包含本领域已知的方
法，如电穿孔和脂质转染。另外的方法在下文中描述或在本领域中是已知的。
[0179] 术语“脂质纳米颗粒”或“LNP”是包括脂质层的囊泡，所述脂质层封装药物活性分子，如核酸分子，例如iRNA或从其转录iRNA的质粒。LNP在例如美国专利第6,858,225号、第
6,815,432号、第8,158,601号和第8,058,069号中进行了描述，所述美国专利的全部内容特
此通过引用并入本文。
[0180] 如本文所使用，“受试者”是内源性或异源性表达靶基因的动物，如哺乳动物，包含灵长类动物(如人、非人灵长类动物，例如猴子和黑猩猩)、非灵长类动物(如牛、猪、马、羊、兔子、绵羊、仓鼠、豚鼠、猫、狗、大鼠或小鼠)或鸟类。在一个实施例中，受试者是人，如正在治疗或评估将受益于KHK表达减少的疾病或病症的人；处于将受益于KHK表达减少的疾病或
病症风险中的人；患有将受益于KHK表达减少的疾病或病症的人；或正在治疗将受益于如本
文所描述的KHK表达减少的疾病或病症的人。在一些实施例中，受试者是女性人类。在其它
实施例中，受试者是男性人类。在一个实施例中，受试者是成年受试者。在另一个实施例中，
受试者是儿科受试者。
[0181] 如本文所使用，术语“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指有益或期望的结果，如减少受试者的KHK相关病症的至少一种体征或症状。治疗还包含减少与不期望的
KHK表达相关的一种或多种体征或症状；减轻不期望的KHK激活或稳定的程度；改善或缓和
不期望的KHK激活或稳定。“治疗”还可以意指与在没有治疗的情况下的预期存活相比延长
存活。在受试者的KHK水平或疾病标志物或症状的上下文中，术语“较低”是指此类水平的统
计学显著降低。降低可以是例如至少10％、15％、20％、25％、30％、％、40％、45％、50％、
55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多。在某些实施例中，降低为至少
20％。在某些实施例中，疾病标志物，例如蛋白质或基因表达水平的降低为至少50％。受试
者的KHK水平的“较低”是降低到没有此类病症的个体的正常范围内的被接受的水平。在某
些实施例中，“较低”是患有疾病的受试者的标志物或症状的水平与个体在正常范围内接受
的水平之间的差异的降低，例如，肥胖个体与具有在正常范围内接受的体重的个体之间的
体重降低的水平。
[0182] 如本文所使用，当关于疾病、病症或病状使用时，“预防(prevention)”或“预防(preventing)”可以通过KHK基因表达减少来治疗或改善，是指降低受试者将发展出与此类
疾病、病症或病状相关的症状的可能性，所述症状例如不期望的或过量的KHK表达和/或活
性，例如果糖代谢增加、高尿酸和脂质水平。不受机制的束缚，已知由KHK催化以形成果糖‑
1‑磷酸盐的果糖磷酸化不受反馈抑制调节，所述反馈抑制可能导致ATP和胞内磷酸盐的耗
减和AMP水平的增加，这会导致尿酸的产生。此外，果糖‑1‑磷酸盐被代谢为甘油醛，其馈送
到柠檬酸循环中，从而增加刺激脂肪酸合成的乙酰基Co‑A的产生。与高尿酸和脂肪酸合成
相关的疾病和病状包含例如肝病(例如，脂肪肝、脂肪性肝炎，包含非酒精性脂肪性肝炎
(NASH))、血脂异常(例如，高脂血症、高LDL胆固醇、低HDL胆固醇、高甘油三酯血症、餐后高
甘油三酯血症)、血糖控制病症(例如，与胰岛素免疫反应非相关的胰岛素抵抗、2型糖尿
病)、心血管疾病(例如，高血压、内皮细胞功能障碍)、肾病(例如，急性肾病症、小管功能障
碍、近端小管的促炎性变化、慢性肾病)、代谢综合征、脂质沉积或功能障碍疾病(例如，脂肪
细胞功能障碍、内脏脂肪沉积、肥胖)、高尿酸疾病(例如，高尿酸血症、痛风)和进食障碍，如糖渴求过度。未能发展出疾病、病症或病状，或与此类疾病、病症或病状相关的症状发展减
少(例如，在所述疾病或病症的临床接受的量表上减少至少约10％)，或延迟体征或症状或
疾病进展的表现(例如，几天、几周、几个月或几年)被认为是有效的预防。
[0183] 如本文所使用，术语“己酮糖激酶(KHK)相关疾病”或“KHK相关病症”是由KHK基因表达或KHK蛋白产生引起的或与其相关的疾病或病症。术语“KHK相关疾病”包含将受益于
KHK基因表达、复制或蛋白质活性减少的疾病、病症或病状。KHK相关疾病的非限制性实例包
含例如肝病(例如，脂肪肝、脂肪性肝炎，包含非酒精性脂肪性肝炎(NASH))、血脂异常(例
如，高脂血症、高LDL胆固醇、低HDL胆固醇、高甘油三酯血症、餐后高甘油三酯血症)、血糖控制病症(例如，与胰岛素免疫反应非相关的胰岛素抵抗、2型糖尿病)、心血管疾病(例如，高
血压、内皮细胞功能障碍)、肾病(例如，急性肾病症、小管功能障碍、近端小管的促炎性变
化、慢性肾病)、代谢综合征、脂质沉积或功能障碍疾病(例如，脂肪细胞功能障碍、内脏脂肪
沉积、肥胖)、高尿酸疾病(例如，高尿酸血症、痛风)和进食障碍，如糖渴求过度。
[0184] 在某些实施例中，KHK相关疾病与高尿酸(例如，高尿酸血症、痛风)相关。
[0185] 在某些实施例中，KHK相关疾病与高脂质水平(例如，脂肪肝、脂肪性肝炎，包含非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、血脂异常)相关。
[0186] 如本文所使用，“治疗有效量”旨在包含当向患有KHK相关疾病的受试者施用时足以影响疾病的治疗(例如，通过减少、改善或维持现有疾病或一种或多种疾病症状)的RNAi
药剂的量。“治疗有效量”可能因RNAi药剂、药剂如何施用、疾病和其严重程度以及病史、年
龄、体重、家族史、基因组成、先前或伴随治疗的类型(如果有的话)以及待治疗受试者的其
它个体特征而异。
[0187] 如本文所使用，“预防有效量”旨在包含当向患有KHK相关病症的受试者施用时足以预防或改善疾病或所述疾病的一种或多种症状的RNAi药剂的量。改善疾病包含减缓疾病
的进程或降低后发疾病的严重程度。“预防有效量”可能因RNAi药剂、药剂如何施用、疾病的
风险程度以及病史、年龄、体重、家族史、基因组成、先前或伴随治疗的类型(如果有的话)以
及待治疗患者的其它个体特征而异。
[0188] “治疗有效量”或“预防有效量”还包含一定量的RNAi药剂，所述药剂以适用于任何治疗的合理收益/风险比产生一些期望的效果。本发明的方法中采用的iRNA可以以足够的
量施用，以产生适用于此类治疗的合理益处/风险比。
[0189] 短语“药学上可接受的”在本文中用于指在正确医学判断的范围内适合于与人受试者和动物受试者的组织接触使用而不会产生过多毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并
发症的、与合理的益处/风险比相称的那些化合物(包含盐)、材料、组合物或剂型。
[0190] 如本文所使用的，短语“药学上可接受的载体”是指药学上可接受的材料、组合物或媒剂，如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、制造助剂(例如，润滑剂、滑石镁、硬脂酸钙或硬脂酸锌、或硬脂酸)、或溶剂封装材料(涉及将主题化合物从身体的一个器官或部分携
带或运送到身体的另一个器官或部分)。在与调配物的其它成分相容并且对被治疗的受试
者无害的意义上来讲，每种载体必须是“可接受的”。此类载体在本领域中是已知的。药学上
可接受的载体包含用于通过注射施用的载体。
[0191] 在受试者或疾病标志物或症状中的KHK基因表达或KHK蛋白质产生水平的上下文中，术语“较低”是指此类水平在统计学显著降低。所述降低可以是例如至少20％、25％、
30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％，或低于检测方法的检测水平。在某些实施例中，靶标的表达被归一化，即降低到没有此类病症的个
体的正常范围内的被接受的水平，例如体重、血压或血清脂质水平的归一化，或朝此方向降
低。如此处所使用，受试者中的“较低”可以指受试者的细胞中的基因表达或蛋白质产生的
降低，不需要降低受试者的所有细胞或组织中的表达。例如，如本文所使用的，受试者中的
降低可以包含受试者肝脏中基因表达或蛋白质产生的降低。
[0192] 术语“较低”也可以相关于使疾病或病状的症状正常化，即将患有KHK相关疾病的受试者的水平与未患有KHK相关疾病的正常受试者的水平之间的差异减小而使用。例如，如
果正常体重为70kg的受试者在治疗前体重90kg(20kg超重)并且在治疗后体重80kg(10kg超
重)，则受试者体重朝正常体重降低了50％(10/20x 100％)。类似地，如果女性的HDL水平从
50mg/dL(较差)增加到57mg/dL，其中正常水平为60mg/dL，则受试者先前水平和正常水平之
间的差值减小了70％(受试者水平和正常水平之间的10mg/dL差值减小了7mg/dL，7/10x 
100％)。如本文所使用的，如果疾病与症状的升高值相关，“正常”被认为是正常的上限。如
果疾病与症状的下降值相关，“正常”被认为是正常的下限。
[0193] 如本文所使用的，术语“样品”包含从受试者分离的类似流体、细胞或组织的集合，以及受试者体内存在的流体、细胞和组织。生物流体的实例包含血液、血清和浆膜流体、血
浆、脑脊液、眼流体、淋巴、尿液、唾液等。组织样品可以包含来自组织、器官或局部区域的样品。例如，样品可以源自特定的器官、器官的一部分或这些器官内的液体或细胞。在某些实
施例中，样品可以源自肝脏(例如，整个肝脏或肝脏的某些部分或肝脏中的某些类型的细
胞，例如，肝细胞)。在一些实施例中，“源自受试者的样品”是指从受试者获得的尿液。“源自受试者的样品”可以指从受试者抽取的血液(其可以容易地转变为血浆或血清)。
[0194] II.本发明的iRNA
[0195] 本发明提供了抑制KHK基因的表达的iRNA。在某些实施例中，iRNA包含双链核糖核酸(dsRNA)分子，用于抑制细胞(如受试者(例如，哺乳动物，如易患KHK相关疾病的人)体内
的细胞)中的KHK基因的表达。dsRNAi药剂包含具有互补区的反义链，所述互补区与在KHK基
因的表达中形成的mRNA的至少一部分互补。互补区的长度为约30个核苷酸或更少(例如，长
度为约30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19或18个核苷酸或更少)。在与表达KHK基因的细胞接触时，iRNA抑制KHK基因(例如，人、灵长类动物、非灵长类动物或大KHK基因)的表
达至少约50％，如通过例如PCR或基于支链DNA(bDNA)的方法或通过基于蛋白质的方法(如
通过免疫荧光分析，使用例如蛋白质印迹或流式细胞术技术)所测定。在某些实施例中，通
过本文实例中提供的qPCR方法，在其中提供的合适的生物体细胞或细胞系中，用例如10nM
浓度的siRNA确定表达的抑制。在一些实施例中，体内表达的抑制是通过在表达人基因的啮
齿类动物，例如表达人靶基因的小鼠或AAV感染的小鼠中敲低人基因来确定的，例如当以单
剂量施用时，例如在RNA表达的最低点以3mg/kg施用。
[0196] dsRNA包含两条互补并且在将使用dsRNA的条件下杂交以形成双链体结构的RNA链。dsRNA的一条链(反义链)包含与靶序列基本上互补且通常完全互补的互补区。靶序列可
以源自在KHK基因表达期间形成的mRNA的序列。另一条链(有义链)包含与反义链互补的区，
使得两条链在适当条件下组合时杂交并形成双链体结构。如本文中其它地方所描述且如本
领域已知的，dsRNA的互补序列相对于位于单独寡核苷酸上还可以作为单一核酸分子的自
身互补区被包含在内。
[0197] 通常，双链体结构的长度为15至30个碱基对，例如长度为15‑29、15‑28、15‑27、15‑26、15‑25、15‑24、15‑23、15‑22、15‑21、15‑20、15‑19、15‑18、15‑17、18‑30、18‑29、18‑28、
18‑27、18‑26、18‑25、18‑24、18‑23、18‑22、18‑21、18‑20、19‑30、19‑29、19‑28、19‑27、19‑
26、19‑25、19‑24、19‑23、19‑22、19‑21、19‑20、20‑30、20‑29、20‑28、20‑27、20‑26、20‑25、
20‑24、20‑23、20‑22、20‑21、21‑30、21‑29、21‑28、21‑27、21‑26、21‑25、21‑24、21‑23或21‑
22个碱基对。在某些实施例中，双链体结构的长度为18个至25个碱基对，例如，长度为18个
至25个、18个至24个、18个至23个、18个至22个、18个至21个、18个至20个、19个至25个、19个至24个、19个至23个、19个至22个、19个至21个、19个至20个、20个至25个、20个至24、20个至
23个、20个至22个、20个至21个、21个至25个、21个至24个、21个至23个、21个至22个、22个至
25个、22个至24个、22个至23个、23个至25个、23个至24个或24个至25个碱基对，例如长度为
19个至21个碱基对。上述范围和长度中间的范围和长度也被认为是本公开的一部分。
[0198] 类似地，靶序列的互补区的长度为15至30个核苷酸，例如长度为15‑29、15‑28、15‑27、15‑26、15‑25、15‑24、15‑23、15‑22、15‑21、15‑20、15‑19、15‑18、15‑17、18‑30、18‑29、
18‑28、18‑27、18‑26、18‑25、18‑24、18‑23、18‑22、18‑21、18‑20、19‑30、19‑29、19‑28、19‑
27、19‑26、19‑25、19‑24、19‑23、19‑22、19‑21、19‑20、20‑30、20‑29、20‑28、20‑27、20‑26、
20‑25、20‑24、20‑23、20‑22、20‑21、21‑30、21‑29、21‑28、21‑27、21‑26、21‑25、21‑24、21‑23或21‑22个核苷酸，例如长度为19‑23个核苷酸或长度为21‑23个核苷酸。上述范围和长度中
间的范围和长度也被认为是本公开的一部分。
[0199] 在一些实施例中，双链体结构的长度为19个至30个碱基对。类似地，与靶序列互补的区域的长度为19个至30个核苷酸。
[0200] 在一些实施例中，dsRNA的长度为约19个至约23个核苷酸，或长度为约25个至约30个核苷酸。一般来说，dsRNA足够长以用作Dicer酶的底物。例如，本领域众所周知，长度超过
约21个至23个核苷酸的dsRNA可以用作Dicer的底物。如普通技术人员还将认识到的，靶向
切割的RNA的区域通常将是较大RNA分子的部分，通常是mRNA分子。在相关情况下，mRNA靶的
一“部分”是mRNA靶的连续序列，其长度足以使其成为RNAi定向切割(即通过RISC通路切割)
的底物。
[0201] 本领域的技术人员还将认识到，双链体区是dsRNA的主要功能部分，例如约19至约30个碱基对，例如约19‑30、19‑29、19‑28、19‑27、19‑26、19‑25、19‑24、19‑23、19‑22、19‑21、
19‑20、20‑30、20‑29、20‑28、20‑27、20‑26、20‑25、20‑24、20‑23、20‑22、20‑21、21‑30、21‑
29、21‑28、21‑27、21‑26、21‑25、21‑24、21‑23或21‑22个碱基对的双链体区。因此，在一个实施例中，在其被加工成靶向所需RNA进行切割的例如15个至30个碱基对的功能性双链体的
程度上，具有大于30个碱基对的双链体区的RNA分子或RNA分子复合物是dsRNA。因此，普通
技术人员将认识到，在一个实施例中，miRNA是dsRNA。在另一个实施例中，dsRNA不是天然存
在的miRNA。在另一个实施例中，可用于靶向KHK基因表达的iRNA药剂不是通过切割较大的
dsRNA在靶细胞中生成的。
[0202] 如本文所描述的dsRNA可以进一步包含一个或多个单链核苷酸突出端，例如，1个至4个、2个至4个、1个至3个、2个至3个、1个、2个、3个或4个核苷酸。具有至少一个核苷酸突出端的dsRNA相对于其钝端对应物具有更好的抑制特性。核苷酸突出端可以包括以下或由
以下组成：核苷酸/核苷类似物，包含脱氧核苷酸/核苷。突出端可以在有义链、反义链或其
任何组合上。此外，突出端的核苷酸可以存在于dsRNA的反义链或有义链的5'端、3'端或两
端上。
[0203] dsRNA可以通过本领域已知的标准方法合成。本发明的双链RNAi化合物可以使用两步程序制备。首先，单独制备双链RNA分子的单个链。然后，对组分链进行退火。siRNA化合
物的单个链可以使用溶液相或固相有机合成或两者制备。有机合成提供的优点是可以容易
地制备包括非天然或经修饰的核苷酸的寡核苷酸链。类似地，本发明的单链寡核苷酸可以
使用溶液相或固相有机合成或两者制备。
[0204] 一方面，本发明的dsRNA包含至少两个核苷酸序列，有义序列和反义序列。有义链选自表2、3、5、6和8‑13中的任一者中提供的序列的组，并且有义链的相对应反义链选自表
2、3、5、6和8‑13中的任一者中的序列的组。在这方面，两个序列中的一个与两个序列中的另一个互补，其中所述序列中的一个与在KHK基因表达中生成的mRNA序列基本互补。因此，在
这方面，dsRNA将包含两个寡核苷酸，其中一个寡核苷酸被描述为表2、3、5、6和8‑13中的任
一者中的有义链，并且第二个寡核苷酸被描述为表2、3、5、6和8‑13中的任一者中的有义链
的相对应反义链。
[0205] 在某些实施例中，dsRNA的基本互补序列包含在分离的寡核苷酸上。在其它实施例中，dsRNA的基本互补序列含在单个寡核苷酸上。
[0206] 在某些实施例中，有义链或反义链选自以下任一个双链体的有义链或反义链：AD‑517197.2；AD‑517258.2；AD‑516748.2；AD‑516851.2；AD‑519351.2；AD‑519754.2；AD‑
519828.2；AD‑520018.2；AD‑520035.2；AD‑520062.2；AD‑520064.2；AD‑520065.2；AD‑
520067.2；AD‑75289.2；AD‑520069.2；AD‑520099.2；AD‑67575.7；AD‑520101.2；AD‑
1193323.1；AD‑1193344.1；AD‑1193350.1；AD‑1193365.1；AD‑1193379.1；AD‑1193407.1；
AD‑1193421.1；AD‑1193422.1；AD‑1193429.1；AD‑1193437.1；AD‑1193443.1；AD‑
1193471.1；AD‑1193481.1或AD‑67605.7。
[0207] 在一些实施例中，有义链或反义链选自以下任一个双链体的有义链或反义链：AD‑519345.1、AD‑519346.1、AD‑519347.1、AD‑67554.7、AD‑519752.3、AD‑1010731.1、AD‑
1010732.1、AD‑519343.1、AD‑519344.1、AD‑519349.1、AD‑519350.1、AD‑519753.2、AD‑
519932.1、AD‑519935.2、AD‑520018.6、AD‑517837.2、AD‑805635.2、AD‑519329.2、AD‑
520063.2、AD‑519757.2、AD‑805631.2、AD‑516917.2、AD‑516828.2、AD‑518983.2、AD‑
805636.2、AD‑519754.7、AD‑520062.2、AD‑67575.9、AD‑518923.3、AD‑520053.4、AD‑
519667.2、AD‑519773.2、AD‑519354.2、AD‑520060.4、AD‑520061.4、AD‑1010733.2、AD‑
1010735.2、AD‑1193323.1；AD‑1193344.1；AD‑1193350.1；AD‑1193365.1；AD‑1193379.1；
AD‑1193407.1；AD‑1193421.1；AD‑1193422.1；AD‑1193429.1；AD‑1193437.1；AD‑
1193443.1；AD‑1193471.1；或AD‑1193481.1。
[0208] 在一些实施例中，有义链或反义链选自双链体AD‑519351的有义链或反义链。
[0209] 将理解，尽管例如表2、5、8和10中的序列没有被描述为经修饰的或缀合的序列，但本发明的iRNA的RNA，例如本发明的dsRNA可以包括表2、3、5、6和8‑13中的任一者中所述的
未修饰、未缀合或以与其中所述不同的方式修饰或缀合的序列中的任一个。换言之，本发明
涵盖表2、3、5、6和8‑13的dsRNA，其是未修饰、未缀合、经修饰的或缀合的，如本文所描述。
[0210] 本领域技术人员充分了解，具有约20至23个碱基对(例如，21个碱基对)的双链体结构的dsRNA已被誉为在诱导RNA干扰方面特别有效(Elbashir等人《, 欧洲分子生物学组织
杂志(EMBO)》2001,20:6877‑6888)。然而，其它人已经发现，较短或较长的RNA双链体结构也
可以是有效的(Chu和Rana(2007)《RNA》14:1714‑1719；Kim等人.(2005)《自然生物技术(Nat Biotech)》23:222‑226)。在上述实施例中，由于表2、3、5、6和8‑13中的任一者中提供的寡核苷酸序列的性质，本文所描述的dsRNA可以包含至少一条长度为最少21个核苷酸的链。可以
合理地预期，与上述dsRNA相比，具有表2、3、5、6和8‑13中的任一者的序列中的任一个在一
端或两端仅减去很少核苷酸的较短的双链体可以类似地有效。因此，具有源自表2、3、5、6和
8‑13中的任一者的序列中的任一个的至少19、20、21、22、23个或更多个连续核苷酸的序列，并且其抑制KHK基因表达的能力与包括完整序列的dsRNA相差不超过约5％、10％、15％、
20％、25％或30％的抑制的dsRNA，被认为在本发明的范围内。
[0211] 另外，表2、3、5、6和8‑13中的任一者中提供的RNA标识了KHK转录物中对RISC介导的切割敏感的位点。因此，本发明的进一步特征在于靶向在这些位点之一内的iRNA。如本文
所使用的，如果iRNA促进转录物在所述特定位点内任何位置的切割，则iRNA被称为靶向RNA
转录物的特定位点内。此类iRNA通常包含来自表2、3、5、6和8‑13中的任一者中提供的序列
中的任一个的至少约19个连续核苷酸，其与取自KHK基因中所选序列的连续区域的另外的
核苷酸序列偶联。
[0212] III.本发明的经修饰的iRNA
[0213] 在某些实施例中，本发明的iRNA的RNA，例如dsRNA，是未修饰的，并且不包括例如本领域已知的和本文所描述的化学修饰或缀合。在其它实施例中，本发明的iRNA的RNA，例
如dsRNA被化学修饰以增强稳定性或其它有益特性。在本发明的某些实施例中，本发明的
iRNA的基本上所有核苷酸都被修饰。在本发明的其它实施例中，iRNA的所有核苷酸或iRNA
的基本上所有核苷酸都被修饰，即在iRNA的链中存在不超过5、4、3、2或1个未修饰的核苷
酸。
[0214] 本发明特征的核酸可以通过本领域公认的方法合成或修饰，例如“核酸化学中的当前实验方案(Current protocols in nucleic acid chemistry),”Beaucage,S.L等人,
(编辑),美国纽约州纽约的约翰威利父子公司(John Wiley&Sons,Inc.,New York,NY,USA)
中描述的那些方法，所述方法特此通过引用并入本文。修饰包含例如端修饰，例如5'端修饰
(磷酸化、缀合、反向连接等)、3'端修饰(缀合、DNA核苷酸、反向连接等)；碱基修饰，例如，用稳定碱基、去稳定碱基或与扩展的伙伴库碱基配对的碱基替换、去除碱基(无碱基核苷酸)
或缀合的碱基；糖修饰(例如，在2'位置或4'位置处)或糖的置换；或主链修饰，包含磷酸二
酯键的修饰或置换。可用于本文描述的实施例的iRNA化合物的具体实例包含但不限于含有
经修饰的主链或不含天然核苷间键的RNA。除此之外，具有经修饰的主链的RNA包含在主链
中不具有磷原子的那些。出于本说明书的目的，并且如本领域中有时提及的，在其核苷间主
链中不具有磷原子的经修饰的RNA也可以被视为寡核苷。在一些实施例中，经修饰的iRNA将
在其核苷间主链中具有磷原子。
[0215] 经修饰的RNA主链包含例如硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其它烷基膦酸酯(包含3'‑亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯)、次
膦酸酯、氨基磷酸酯(包含3'‑氨基磷酰胺酯和氨基烷基磷酸胺酯)、硫代羰基磷酰胺酯、硫
代羰基烷基膦酸酯、硫代羰基烷基磷酸三酯、以及具有正常3'‑5'键的硼烷磷酸酯、这些酯
的2'‑5'连接类似物、以及具有反向极性的那些酯，其中相邻对的核苷单位以3'‑5'至5'‑3'
或2'‑5'至5'‑2'连接。也包含了各种盐、混合盐和游离酸形式。在本发明的一些实施例中，
本发明的dsRNA药剂是游离酸形式。在本发明的其它实施例中，本发明的dsRNA药剂是盐形
式。在一个实施例中，本发明的dsRNA药剂是钠盐形式。在某些实施例中，当本发明的dsRNA
药剂为钠盐形式时，钠离子作为药剂中存在的基本上所有磷酸二酯和/或硫代磷酸酯基团
的抗衡离子存在于药剂中。其中基本上所有的磷酸二酯和/或硫代磷酸酯键都具有钠抗衡
离子的药剂包含不超过5个、4个、3个、2个或1个不具有钠抗衡离子的磷酸二酯键和/或硫代
磷酸酯键。在一些实施例中，当本发明的dsRNA药剂为钠盐形式时，钠离子作为药剂中存在
的所有磷酸二酯和/或硫代磷酸酯基团的抗衡离子存在于药剂中。
[0216] 教导制备上述含磷键的代表性美国专利包含但不限于美国专利第3,687,808号；第4,469,863号；第4,476,301号；第5,023,243号；第5,177,195号；第5,188,897号；第5,
264,423号；第5,276,019号；第5,278,302号；第5,286,717号；第5,321,131号；第5,399,676
号；第5,405,939号；第5,453,496号；第5,455,233号；第5,466,677号；第5,476,925号；第5,
519,126号；第5,536,821号；第5,541,316号；第5,550,111号；第5,563,253号；第5,571,799
号；第5,587,361号；第5,625,050号；第6,028,188号；第6,124,445号；第6,160,109号；第6,
169,170号；第6,172,209号；第6,239,265号；第6,277,603号；第6,326,199号；第6,346,614
号；第6,444,423号；第6,531,590号；第6,534,639号；第6,608,035号；第6,683,167号；第6,
858,715号；第6,867,294号；第6,878,805号；第7,015,315号；第7,041,816号；第7,273,933
号；第7,321,029号；以及美国专利RE39464，所述美国专利中的每一个的全部内容由此通过
引用并入本文。
[0217] 其中不包含磷原子的经修饰的RNA主链具有由以下形成的主链：短链烷基或环烷基核苷间键、混合杂原子和烷基或环烷基核苷间键或一个或多个短链杂原子或杂环核苷间
键。这些包含具有吗啉代键的那些(部分地由核苷的糖部分形成)；硅氧烷主链；硫化物、亚
砜和砜主链；甲酰乙酰基和硫代甲酰乙酰基主链；亚甲基甲酰乙酰基和硫代甲酰乙酰基主
链；含烯烃的主链；氨基磺酸酯主链；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基主链；磺酸酯和磺酰胺主
链；酰胺主链；和其它具有混合的N、O、S和CH2组分部分的主链。
[0218] 教导制备上述寡核苷的代表性美国专利包含但不限于美国专利第5,034,506号；第5,166,315号；第5,185,444号；第5,214,134号；第5,216,141号；第5,235,033号；第5,64,
562号；第5,264,564号；第5,405,938号；第5,434,257号；第5,466,677号；第5,470,967号；
第5,489,677号；第5,541,307号；第5,561,225号；第5,596,086号；第5,602,240号；第5,
608,046号；第5,610,289号；第5,618,704号；第5,623,070号；第5,663,312号；第5,633,360
号；第5,677,437号；以及第5,677,439号，所述美国专利中的每一个的全部内容特此通过引
用并入本文。
[0219] 考虑在本文提供的iRNA中使用合适的RNA模拟物，其中核苷酸单元的糖和核苷间键，即主链被新基团替代。维持碱基单元以与适当的核酸靶化合物杂交。一种此类寡聚化合
物(其中已示出具有极佳杂交特性的RNA模拟物)被称作肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，RNA
的糖主链被含酰胺的主链替代，尤其是氨基乙基甘氨酸主链。核碱基被保留并且直接或间
接地与主链的酰胺部分的氮杂氮原子结合。教导PNA化合物的制备的代表性美国专利包含
但不限于美国专利第5,539,082号；第5,714,331号；以及第5,719,262号，所述美国专利中
的每一个的全部内容特此通过引用并入本文。适合用于本发明iRNA的另外的PNA化合物在
例如Nielsen等人《, 科学(Science)》,1991,254,1497‑1500中进行了描述。
[0220] 本发明特征的一些实施例包含具有硫代磷酸酯主链的RNA和具有杂原子主链的寡核苷，特别是上文引用的美国专利第5,489,677号的‑‑CH2‑‑NH‑‑CH2‑、‑‑CH2‑‑N(CH3)‑‑O‑‑CH2‑‑[称为亚甲基(甲基亚氨基)或MMI主链]、‑‑CH2‑‑O‑‑N(CH3)‑‑CH2‑‑、‑‑CH2‑‑N(CH3)‑‑N(CH3)‑‑CH2—和‑‑N(CH3)‑‑CH2‑‑CH2‑‑，以及上文引用的美国专利第5,602,240号的酰胺主链。在一些实施例中，本文特征的RNA具有上文引用的美国专利第5,034,506号的吗啉代主
链结构。天然磷酸二酯主链可以表示为O‑P(O)(OH)‑OCH2‑。
[0221] 经修饰的RNA还可以包括一个或多个经取代的糖部分。本文特征的iRNA，例如dsRNA可以在2'位置处包含以下之一：OH；F；O‑、S‑或N‑烷基；O‑、S‑或N‑烯基；O‑、S‑或N‑炔基；或O‑烷基‑O‑烷基，其中烷基、烯基和炔基可以是经取代的或未经取代的C1至C10烷基或C2至C10烯基和炔基。示例性合适的修饰包含O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2).nOCH3、O(CH2)nNH2、O
(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2和O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2，其中n和m为1至约10。在其它实施例中，dsRNA在2'位置处包含以下之一：C1至C10低级烷基、经取代的低级烷基、烷芳基、芳烷基、O‑烷芳基或O‑芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基、经取代的甲硅烷基、RNA切割基团、报告基
团、嵌入子、用于改善iRNA的药代动力学特性的基团、或用于改善iRNA的药效动力学特性的
基团以及具有类似特性的其它取代基。在一些实施例中，修饰包含2'‑甲氧基乙氧基(2'‑
O‑‑CH2CH2OCH3，也称为2'‑O‑(2‑甲氧基乙基)或2'‑MOE)(Martin等人《, 瑞士化学学报
(Helv.Chim.Acta)》,1995,78:486‑504)，即烷氧基‑烷氧基基团。另一个示例性修饰是2'‑
二甲氨基氧基乙氧基，即O(CH2)2ON(CH3)2基团，也称为2'‑DMAOE，如下文实例中所描述，以
及2'‑二甲基氨基乙氧基乙氧基(在本领域中也称为2'‑O‑二甲基氨基乙氧基乙基或2'‑
DMAEOE)，即2'‑O‑‑CH2‑‑O‑‑CH2‑‑N(CH3)2。另外的示例性修饰包含：5'‑Me‑2'‑F核苷酸、5'‑Me‑2'‑OMe核苷酸、5'‑Me‑2'‑脱氧核苷酸(这三个家族中的R和S异构体两者)；2'‑烷氧基烷基；以及2'‑NMA(N‑甲基乙酰胺)。
[0222] 其它修饰包含2'‑甲氧基(2'‑OCH3)、2'‑氨基丙氧基(2'‑OCH2CH2CH2NH2)和2'‑氟(2'‑F)。类似修饰也可以在iRNA的RNA上的其它位置处进行，特别是糖在3'末端核苷酸上的
3'位置或在2'‑5'连接的dsRNA和5'末端核苷酸的5'位置上。iRNA也可以具有糖模拟物，如
替代戊呋喃糖基糖的环丁基部分。教导此类经修饰的糖结构的制备的代表性美国专利包含
但不限于美国专利第4,981,957号；第5,118,800号；第5,319,080号；第5,359,044号；第5,
393,878号；第5,446,137号；第5,466,786号；第5,514,785号；第5,519,134号；第5,567,811
号；第5,576,427号；第5,591,722号；第5,597,909号；第5,610,300号；第5,627,053号；第5,
639,873号；第5,646,265号；第5,658,873号；第5,670,633号；以及第5,700,920号，所述美
国专利中的某些是本申请所共有的。上述各项的全部内容特此通过引用并入本文。
[0223] iRNA还可以包含核碱基(在本领域中通常被简称为“碱基”)修饰或取代。如本文所使用的，“未经修饰的”或“天然”核碱基包含嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱
基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。经修饰的核碱基包含其它合成和天然核碱基，如
脱氧胸腺嘧啶(dT)、5‑甲基胞嘧啶(5‑me‑C)、5‑羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2‑氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6‑甲基和其它烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2‑丙基和其它烷基
衍生物、2‑硫尿嘧啶、2‑硫代胸腺嘧啶和2‑硫代胞嘧啶、5‑卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5‑丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶、6‑偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5‑尿嘧啶(假尿嘧啶)、4‑硫代尿嘧啶、
8‑卤基、8‑氨基、8‑巯基、8‑硫代烷基、8‑羟基和其它8‑取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5‑卤基，具体地5‑溴、5‑三氟甲基和其它5‑取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7‑甲基鸟嘌呤和7‑甲基腺嘌呤、8‑氮杂鸟嘌呤和8‑氮杂腺嘌呤、7‑脱氮鸟嘌呤和7‑脱氮腺嘌呤以及3‑脱氮鸟嘌呤和3‑脱氮腺嘌呤。另外的核碱基包含美国专利第3,687,808号中公开的那些，在《生物化学、生物技术和
医学中经修饰的核苷(Modified Nucleosides in Biochemistry,Biotechnology and 
Medicine)》,Herdewijn,P.编辑,Wiley‑VCH出版社(Wiley‑VCH),2008年中公开的那些；在
《聚合物科学与工程化简明百科全书(The Concise Encyclopedia Of Polymer Science 
And Engineering)》,第858‑859页,Kroschwitz,J.L编辑,约翰威利父子公司(John Wiley&
Sons),1990中公开的那些，Englisch等人《, 化学应用国际版(Angewandte Chemie,
International Edition)》,1991,30,613中公开的那些，以及Sanghvi,Y S.,第15章,
《dsRNA研究与应用(dsRNA Research and Applications)》,第289‑302页,Crooke,S.T.和
Lebleu,B.编辑,CRC出版社(CRC Press),1993中公开的那些。这些核碱基中的某些核碱基
对提高本发明特征的寡聚化合物的结合亲和力特别有用。这些包含5‑取代的嘧啶、6‑氮杂
嘧啶和N‑2、N‑6和0‑6取代的嘌呤，包含2‑氨基丙基腺嘌呤、5‑丙炔基尿嘧啶和5‑丙炔基胞嘧啶。已经示出5‑甲基胞嘧啶取代使核酸双链体稳定性提高0.6℃至1.2℃(Sanghvi,Y.S.,
Crooke,S.T.和Lebleu,B.编辑《,dsRNA研究与应用》,CRC出版社,波卡拉顿(Boca Raton),
1993，第276‑278页)，并且是示例性碱基取代，甚至更具体地在与2'‑O‑甲氧基乙基糖修饰
组合时。
[0224] 教导制备某些上述经修饰的核碱基以及其它经修饰的核碱基的代表性美国专利包含但不限于上述美国专利第3,687,808号、第4,845,205号；第5,130,30号；第5,134,066
号；第5,175,273号；第5,367,066号；第5,432,272号；第5,457,187号；第5,459,255号；第5,
484,908号；第5,502,177号；第5,525,711号；第5,552,540号；第5,587,469号；第5,594,121
号、第5,596,091号；第5,614,617号；第5,681,941号；第5,750,692号；第6,015,886号；第6,
147,200号；第6,166,197号；第6,222,025号；第6,235,887号；第6,380,368号；第6,528,640
号；第6,639,062号；第6,617,438号；第7,045,610号；第7,427,672号；以及第7,495,088号，所述美国专利中的每一个的全部内容由此通过引用并入本文。
[0225] 本公开的iRNA药剂也可以被修饰以包含一个或多个双环糖部分。“双环糖”是由两个碳(无论是相邻的或是非相邻的)桥接形成的环修饰的呋喃糖基环。“双环核苷”(“BNA”)
是一种具有糖部分的核苷，搜书糖部分包括通过桥接糖环的两个碳(无论是相邻的或是非
相邻的)而形成的环，由此形成双环系统。在某些实施例中，桥任选地通过2'‑无环氧原子连
接糖环的4'‑碳和2'‑碳。因此，在一些实施例中，本发明的药剂可以包含一种或多种锁定核
酸(LNA)。锁定核酸是具有经修饰的核糖部分的核苷酸，其中核糖部分包括连接2'和4'碳的
额外桥。换言之，LNA是包括双环糖部分的核苷酸，所述双环糖部分包括4'‑CH2‑O‑2'桥。这种结构有效地将核糖“锁定”在3'‑内结构构象中。向siRNA中添加锁定核酸已被证明可增加
血清中的siRNA稳定性并且减少脱靶效应(Elmen,J.等人,(2005)《核酸研究(Nucleic 
Acids Research)》33(1):439‑447；Mook,OR.等人,(2007)《分子癌症治疗(Mol Canc 
Ther)》6(3):833‑843；Grunweller,A.等人,(2003)《核酸研究(Nucleic Acids Research)》
31(12):3185‑3193)。用于本发明的多核苷酸的双环核苷的实例包含但不限于包括4'和2'
核糖基环原子之间的桥的核苷。在某些实施例中，本发明的反义多核苷酸药剂包含一种或
多种包括4'至2'桥的双环核苷。
[0226] 锁核苷可以由以下结构表示(省略立体化学)，
[0227]
[0228] 其中B是核碱基或经修饰的核碱基，并且L是将核糖环的2'‑碳与4'‑碳连接的连接基团。此类4'至2'桥接的双环核苷的实例包含但不限于4′‑(CH2)—O‑2′(LNA)；4′‑(CH2)—S‑2′；4′‑(CH2)2—O‑2′(ENA)；4′‑CH(CH3)—O‑2′(也称为“约束乙基”或“cEt”)和4′‑CH(CH2OCH3)—O‑2′(以及其类似物；参见例如美国专利第7,399,845号)；4′‑C(CH3)(CH3)—O‑
2′(以及其类似物；参见例如美国专利第8,278,283号)；4′‑CH2—N(OCH3)‑2′(以及其类似物；参见例如美国专利第8,278,425号)；4′‑CH2—O—N(CH3)‑2′(参见例如美国专利公开第
2004/0171570号)；4′‑CH2—N(R)—O‑2′，其中R为H、C1‑C12烷基或氮保护基团(参见例如美国专利第7,427,672号)；4′‑CH2—C(H)(CH3)‑2′(参见例如Chattopadhyaya等人《, 有机化学杂志(J.Org.Chem.)》,2009,74,118‑134)；以及4′‑CH2—C(═CH2)‑2′(以及其类似物；参见例如美国专利第8,278,426号)。上述各项的全部内容特此通过引用并入本文。
[0229] 教导制备锁定核酸核苷酸的其它代表性美国专利和美国专利公开包含但不限于以下：美国专利第6,268,490号；第6,525,191号；第6,670,461号；第6,770,748号；第6,794,
499号；第6,998,484号；第7,053,207号；第7,034,133；7,084,125号；第7,399,845号；第7,
427,672号；第7,569,686号；第7,741,457号；第8,022,193号；第8,030,467号；第8,278,425
号；第8,278,426号；第8,278,283号；US2008/0039618；以及US2009/0012281，所述美国专利
中的每一个的全部内容特此通过引用并入本文。
[0230] 可以制备具有一种或多种立体化学糖构型的任何前述双环核苷，包含例如α‑L‑呋喃核糖和β‑D‑呋喃核糖(参见WO 99/14226)。
[0231] iRNA的RNA也可以被修饰以包含一个或多个约束乙基核苷酸。如本文所使用的，“约束乙基核苷酸”或“cEt”为包括包含4'‑CH(CH3)‑O‑2'桥(即前述结构中的L)的双环糖部分的锁定核酸。在一个实施例中，约束乙基核苷酸处于本文中称为“S‑cEt”的S构象。
[0232] 本发明的iRNA还可以包含一个或多个“构象限制性核苷酸”(“CRN”)。CRN是具有连接核糖的C2'和C4'碳或核糖的C3和‑C5'碳的接头的核苷酸类似物。CRN将核糖环锁定为稳
定的构象，并且增加对mRNA的杂交亲和力。接头具有足够的长度以将氧放置在稳定性和亲
和力的最佳位置，从而导致较少的核糖环褶皱。
[0233] 教导上述某些CRN的制备的代表性出版物包含但不限于美国专利公开第2013/0190383号；以及PCT公开WO 2013/036868，所述文献中的每一个的全部内容特此通过引用
并入本文。
[0234] 在一些实施例中，本发明的iRNA包括一种或多种为UNA(解锁核酸)核苷酸的单体。UNA是未锁定的无环核酸，其中糖的任何键都已被去除，形成未锁定的“糖”残基。在一个实
例中，UNA还涵盖C1'‑C4'之间的键已被去除的单体(即C1'与C4'碳之间的共价碳‑氧‑碳
键)。在另一个实例中，糖的C2'‑C3'键(即C2'和C3'碳之间的共价碳‑碳键)已被去除(参见
《核酸研讨会丛刊(Nuc.Acids Symp.Series)》,52,133‑134(2008)和Fluiter等人《, 分子生
物系统(Mol.Biosyst.)》,2009,10,1039，由此通过引用并入)。
[0235] 教导UNA的制备的代表性美国公开包含但不限于美国专利第8,314,227号；以及美国专利公开第2013/0096289号；第2013/0011922号；和第2011/0313020号，所述文献中的每
一个的全部内容特此通过引用并入本文。
[0236] 对RNA分子末端的潜在稳定修饰可以包含N‑(乙酰氨基己酰基)‑4‑羟脯氨醇(Hyp‑C6‑NHAc)、N‑(己酰基‑4‑羟脯氨醇)(Hyp‑C6)、N‑(乙酰基‑4‑羟脯氨醇)(Hyp‑NHAc)、胸苷‑
2'‑O‑脱氧胸苷(醚)、N‑(氨基己酰基)‑4‑羟脯氨醇(Hyp‑C6‑氨基)、2‑二十二烷酰基‑尿苷‑
3'‑磷酸酯、反向2'‑脱氧修饰的核糖核苷酸，如反向dT(idT)、反向dA(idA)和反向无碱基
2'‑脱氧核糖核苷酸(iAb)等。此修饰的公开内容可以在WO 2011/005861中找到。
[0237] 在一个实例中，寡核苷酸的3'或5'末端与反向2'‑脱氧修饰的核糖核苷酸连接，如反向dT(idT)、反向dA(idA)或反向无碱基2'‑脱氧核糖核苷酸(iAb)。在一个特定实例中，反
向2'‑脱氧修饰的核糖核苷酸与寡核苷酸的3'端连接，如本文所描述的有义链的3'端，其中
连接是通过3'‑3'磷酸二酯键或3'‑3'‑硫代磷酸酯键。
[0238] 在另一个实例中，有义链的3'端通过3'‑3'‑硫代磷酸酯键与反向无碱基核糖核苷酸(iAb)连接。在另一个实例中，有义链的3'端通过3'‑3'‑硫代磷酸酯键与反向dA(idA)连
接。
[0239] 在一个特定实例中，反向2'‑脱氧修饰的核糖核苷酸与寡核苷酸的3'端连接，如本文所描述的有义链的3'端，其中连接是通过3'‑3'磷酸二酯键或3'‑3'‑硫代磷酸酯键。
[0240] 在另一个实例中，有义链的3'末端核苷酸是反向dA(idA)，并且通过3'‑3'‑键(例如，3'‑3'‑硫代磷酸酯键)与前述核苷酸连接。
[0241] 本发明的iRNA的核苷酸的其它修饰包含5'磷酸酯或5'磷酸酯模拟物，例如iRNA的反义链上的5'末端磷酸酯或磷酸酯模拟物。合适的磷酸酯模拟物公开于例如美国专利公开
第2012/0157511号中，所述美国专利公开的全部内容通过引用并入本文。
[0242] A.包括本发明的基序的经修饰的iRNA
[0243] 在本发明的某些方面，本发明的双链RNA药剂包含具有化学修饰的试剂，如在例如WO2013/075035中公开的，所述文献中的每一个的全部内容通过引用并入本文。如本文和
WO2013/075035所示，在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的一个或多个基序可以引入
dsRNAi药剂的有义链或反义链，特别是在切割位点处或附近。在一些实施例中，dsRNAi药剂
的有义链和反义链可以以其它方式被完全修饰。这些基序的引入中断了有义或反义链的修
饰模式(如果存在的话)。dsRNAi药剂可以任选地与GalNAc衍生物配体缀合，例如在有义链
上。
[0244] 更具体地，当双链RNA药剂的有义链和反义链被完全修饰为在dsRNAi药剂的至少一条链的切割位点处或附近的三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的一个或多个基序时，
观察到dsRNAi药剂的基因沉默活性。
[0245] 因此，本发明提供了能够在体内抑制靶基因(即KHK基因)的表达的双链RNA药剂。RNAi药剂包括有义链和反义链。RNAi药剂的每条链可以是，例如，长度为17个至30个核苷
酸、长度为25个至30个核苷酸、长度为27个至30个核苷酸、长度为19个至25个核苷酸、长度
为19个至23个核苷酸、长度为19个至21个核苷酸、长度为21个至25个核苷酸或长度为21个
至23个核苷酸。
[0246] 有义链和反义链通常形成双链体双链RNA(“dsRNA”)，本文也称为“dsRNAi药剂”dsRNAi药剂的双链体区可以是，例如，双链体区的长度可以为27个至30个核苷酸对、长度为
19个至25个核苷酸对、长度为19个至23个核苷酸对、长度为19个至21个核苷酸对、长度为21
个至25个核苷酸对或长度为21个至23个核苷酸对。在另一个实例中，双链体区的长度选自
19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个和27个核苷酸。
[0247] 在某些实施例中，dsRNAi药剂可以在一条或两条链的3'端、5'端或两端含有一个或多个突出端区或封端基团。突出端的长度可以独立地为1个至6个核苷酸，例如长度为2个
至6个核苷酸、长度为1个至5个核苷酸、长度为2个至5个核苷酸、长度为1个至4个核苷酸、长
度为2个至4个核苷酸、长度为1个至3个核苷酸、长度为2个至3个核苷酸或长度为1个至2个
核苷酸。在某些实施例中，突出端区可以包含如上提供的延伸的突出端区。突出端可以是一
条链比另一条链长的结果，或是两条相同长度的链交错的结果。突出端可以与靶mRNA形成
错配，或其可以与被靶向的基因序列互补，或可以是另一个序列。第一链和第二链也可以连
接，例如通过另外的碱基形成发夹，或通过其它非碱基接头。
[0248] 在某些实施例中，dsRNAi药剂的突出端区中的核苷酸可以各自独立地是经修饰或未经修饰的核苷酸，包含但不限于2'‑糖修饰的，如2'‑F、2'‑O‑甲基、胸苷(T)、2`‑O‑甲氧基乙基‑5‑甲基尿苷(Teo)、2`‑O‑甲氧基乙基腺苷(Aeo)、2`‑O‑甲氧基乙基‑5‑甲基胞苷
(m5Ceo)以及其任何组合。
[0249] 例如，TT可以是任一条链上任一端的突出端序列。突出端可以与靶mRNA形成错配，或其可以与被靶向的基因序列互补，或可以是另一个序列。
[0250] dsRNAi药剂的有义链、反义链或两条链上的5'‑或3'‑突出端可以被磷酸化。在一些实施例中，突出端区含有在两个核苷酸之间具有硫代磷酸酯的两个核苷酸，其中两个核
苷酸可以是相同的或不同的。在一些实施例中，突出端存在于有义链、反义链或两条链的3'
端处。在一些实施例中，这种3'‑突出端存在于反义链中。在一些实施例中，这种3'‑突出端
存在于有义链中。
[0251] dsRNAi药剂可能只含有单个突出端，这可以增强RNAi的干扰活性，而不会影响其整体稳定性。例如，单链突出端可以位于有义链的3'端处，或可替代地，位于反义链的3'端
处。RNAi也可能具有钝端，位于反义链的5'端(或有义链的3'端)处，反之亦然。通常，dsRNAi
药剂的反义链在3'端处有核苷酸突出端，并且5'端是钝的。虽然不希望受理论的束缚，但反
义链5'端的不对称钝端和反义链3'端突出端有利于引导链装载到RISC过程中。
[0252] 在某些实施例中，dsRNAi药剂是长度为19个核苷酸的双端钝化剂，其中所述有义链含有在从5'端开始的位置7、8、9处的三个连续核苷酸上具有三个2'‑F修饰的至少一个基
序。所述反义链含有在从5'端开始的位置11、12、13处的三个连续核苷酸上具有三个2'‑O‑
甲基修饰的至少一个基序。
[0253] 在其它实施例中，dsRNAi药剂是长度为20个核苷酸的双端钝化剂，其中所述有义链含有在从5'端开始的位置8、9、10的三个连续核苷酸上具有三个2'‑F修饰的至少一个基
序。所述反义链含有在从5'端开始的位置11、12、13处的三个连续核苷酸上具有三个2'‑O‑
甲基修饰的至少一个基序。
[0254] 在又其它实施例中，dsRNAi药剂是长度为21个核苷酸的双端钝化剂，其中所述有义链含有在从5'端开始的位置9、10、11处的三个连续核苷酸上具有三个2'‑F修饰的至少一
个基序。所述反义链含有在从5'端开始的位置11、12、13处的三个连续核苷酸上具有三个
2'‑O‑甲基修饰的至少一个基序。
[0255] 在某些实施例中，dsRNAi药剂包括21个核苷酸的有义链和23个核苷酸的反义链，其中所述有义链含有在从5'端开始的位置9、10、11处的三个连续核苷酸上具有三个2'‑F修
饰的至少一个基序；所述反义链含有在从5'端开始的位置11、12、13处的三个连续核苷酸上
具有三个2'‑O‑甲基修饰的至少一个基序，其中所述RNAi药剂的一端是钝的，而另一端包括
两个核苷酸的突出端。在一些实施例中，两个核苷酸的突出端位于反义链的3'端处。
[0256] 当两个核苷酸的突出端位于反义链的3'端处时，在末端三个核苷酸之间可能存在两个硫代磷酸酯核苷酸间键，其中所述三个核苷酸中的两个是突出端核苷酸，并且第三个
核苷酸是紧挨着突出端核苷酸的配对核苷酸。在一个实施例中，RNAi药剂在有义链的5'端
和反义链的5'端两者的末端三个核苷酸之间另外具有两个硫代磷酸核苷酸间键。在某些实
施例中，dsRNAi药剂的有义链和反义链中的每个核苷酸，包含为基序一部分的核苷酸，都是
经修饰的核苷酸。在某些实施例中，每个残基用2'‑O‑甲基或2'‑氟独立地修饰，例如在交替基序中。任选地，dsRNAi药剂进一步包括配体(如GalNAc3)。
[0257] 在某些实施例中，dsRNAi药剂包括有义链和反义链，其中所述有义链的长度为25个至30个核苷酸残基，其中从第一链的5'末端核苷酸(位置1)位置1至23开始，包括至少8个
核糖核苷酸；反义链的长度为36个至66个核苷酸残基，并且从3'末端核苷酸开始，在与有义
链的位置1至23配对以形成双链体的位置中包括至少8个核糖核苷酸；其中至少反义链的3'
末端核苷酸与有义链不配对，并且至多6个连续3'末端核苷酸与有义链不配对，由此形成1
个至6个核苷酸的3'单链突出端；其中反义链的5'末端包括10个至30个与有义链不配对的
连续核苷酸，由此形成10个至30个核苷酸单链5'突出端；其中当有义链和反义链比对以获
得最大互补性时，至少有义链5'末端和3'末端核苷酸与反义链的核苷酸碱基配对，由此在
有义链与反义链之间形成基本上双链的区域；并且反义链沿着反义链长度的至少19个核糖
核苷酸与靶RNA充分互补，以在将双链核酸引入哺乳动物细胞时减少靶基因表达；并且其中
所述有义链含有在三个连续核苷酸上的三个2'‑F修饰的至少一个基序，其中至少一个所述
基序出现在切割位点处或附近。反义链在切割位点处或其附近的三个连续核苷酸上含有三
个2'‑O‑甲基修饰的至少一个基序。
[0258] 在某些实施例中，dsRNAi药剂包括有义链和反义链，其中dsRNAi药剂包括长度为至少25个和最多29个核苷酸的第一链和长度为最多30个核苷酸的第二链，在从5'端起的位
置11、12、13处的三个连续核苷酸上具有三个2'‑O‑甲基修饰的至少一个基序；其中所述第
一链的3'端和所述第二链的5'端形成钝端，并且所述第二链在其3'端处比所述第一链长1
个至4个核苷酸，其中所述双链体区的长度为至少25个核苷酸，并且所述第二链沿着所述第
二链长度的至少19个核苷酸与靶mRNA充分互补，以在将所述RNAi药剂引入哺乳动物细胞中
时减少靶基因表达，并且其中所述dsRNAi药剂的Dicer切割产生包括所述第二链的3'端的
siRNA，由此减少所述靶基因在哺乳动物中的表达。任选地，dsRNAi药剂进一步包括配体。
[0259] 在某些实施例中，dsRNAi药剂的有义链含有在三个连续核苷酸上的三个相同修饰的至少一个基序，其中一个基序出现在有义链中的切割位点处。
[0260] 在某些实施例中，dsRNAi药剂的反义链也可以含有在三个连续核苷酸上的三个相同修饰的至少一个基序，其中一个基序出现在反义链中的切割位点处或附近。
[0261] 对于具有长度为19个至23个核苷酸的双链体区的dsRNAi药剂，反义链的切割位点通常在距离5'端的10、11和12位置附近。因此，具有三个相同修饰的基序可以出现在反义链
的9、10、11位置；10、11、12位置；11、12、13位置；12、13、14位置；或13、14、15位置，计数从反义链的5'端的第一个核苷酸开始，或计数从反义链的5'端双链体区内的第一个配对核苷酸
开始。反义链中的切割位点也可以根据dsRNAi药剂的双链体区从5'端开始的长度而改变。
[0262] dsRNAi药剂的有义链可以在链的切割位点处的三个连续核苷酸上含有三个相同修饰的至少一个基序；并且反义链可以在链的切割位点处或附近的三个连续核苷酸上具有
三个相同修饰的至少一个基序。当有义链和反义链形成dsRNA双链体时，有义链与反义链可
以如此排列，使得有义链上的三个核苷酸的一个基序与反义链上的三个核苷酸的一个基序
具有至少一个核苷酸重叠，即有义链中的基序的三个核苷酸中的至少一个与反义链中基序
的三个核苷酸中的至少一个形成碱基对。可替代地，至少两个核苷酸可以重叠，或所有三个
核苷酸都可以重叠。
[0263] 在一些实施例中，dsRNAi药剂的有义链可以含有在三个连续核苷酸上的三个相同修饰的多于一个的基序。第一个基序可以出现在链的切割位点处或附近，并且其它基序可
以是翼修饰。本文中的术语“翼修饰”是指出现在链的另一部分处的基序，所述部分在同一
链的切割位点处或附近与基序分离。翼修饰要么与第一基序相邻，或被至少一个或多个核
苷酸分开。当基序彼此紧邻时，则基序的化学性质彼此不同，并且当基序由一个或多个核苷
酸分开时，化学性质可以相同或不同。可能存在两个或更多个翼修饰。例如，当存在两个翼
修饰时，每个翼修饰可以出现在相对于第一基序的一端，所述第一基序位于切割位点处或
附近，或在前导基序的任一侧。
[0264] 与有义链一样，dsRNAi药剂的反义链可以含有在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的多于一个基序，其中所述基序中的至少一个出现在链的切割位点处或附近。此反义
链还可以含有与可能存在于有义链上的翼修饰相似的排列的一个或多个翼修饰。
[0265] 在一些实施例中，dsRNAi药剂的有义链或反义链上的翼修饰通常不包含链的3'端、5'端或两端处的第一个或前两个末端核苷酸。
[0266] 在其它实施例中，dsRNAi药剂的有义链或反义链上的翼修饰通常不包含链的3'端、5'端或两端处双链体区内的第一个或前两个配对核苷酸。
[0267] 当dsRNAi药剂的有义链和反义链各自含有至少一个翼修饰时，翼修饰可以落在双链体区的同一端，并且具有一个、两个或三个核苷酸的重叠。
[0268] 当dsRNAi药剂的有义链和反义链各自含有至少两个翼修饰时，有义链和反义链可以如此排列，使得各自来自一条链的两个修饰落在双链体区的一端，具有一个、两个或三个
核苷酸的重叠；各自来自一条链的两个修饰落在双链体区的另一端，具有一个、两个或三个
核苷酸的重叠；两个修饰一条链落在前导基序的每一侧，在双链体区中具有一个、两个或三
个核苷酸的重叠。
[0269] 在一些实施例中，dsRNAi药剂的有义链和反义链中的每个核苷酸，包含为基序一部分的核苷酸，可以是经修饰的。每个核苷酸可以用相同或不同的修饰进行修饰，所述修饰
可以包含一个或两个非连接磷酸酯氧或一个或多个连接磷酸酯氧的一种或多种改变；核糖
的成分的改变，例如，核糖上的2′‑羟基的改变；用“去磷酸”接头大规模取代磷酸酯部分；天然存在的碱基的修饰或替换；以及核糖‑磷酸酯主链的替换或修饰。
[0270] 由于核酸是亚基的聚合物，许多修饰发生在核酸内重复的位置，例如碱基或磷酸酯部分的修饰，或磷酸酯部分的非连接O。在一些情况下，修饰将发生在核酸中的所有主体
位置，但在许多情况下不会。例如，修饰可以仅发生在3'‑或5'末端位置，可以仅发生于末端
区域，例如，在末端核苷酸上的位置处或在链的最后2个、3个、4个、5个或10个核苷酸中。修
饰可以发生在双链区、单链区或两者中。修饰可以只发生在RNA的双链区中，或可以只发生
于RNA的单链区中。例如，非连接O位置处的硫代磷酸酯修饰可以仅发生在一个或两个末端
处，可以仅发生于末端区中，例如，在末端核苷酸上的位置处或在链的最后2个、3个、4个、5
个或10个核苷酸中，或可以发生在双链和单链区中，特别是在末端处。一个或多个5'端可以
被磷酸化。
[0271] 例如，为增强稳定性，可以在突出端中包含特定的碱基，或在单链突出端中，例如在5'‑或3'‑突出端中或在两者中包含经修饰的核苷酸或核苷酸替代物。例如，在突出端中
包含嘌呤核苷酸是期望的。在一些实施例中，3'‑或5'‑突出端中的所有或一些碱基可以被
修饰，例如，通过本文所描述的修饰。修饰可以包含，例如使用本领域已知的修饰在核糖糖
的2'位置处的修饰，例如，用脱氧核糖核苷酸、2'‑脱氧‑2'‑氟(2'‑F)或2'‑O‑甲基修饰代替核碱基的核糖，以及磷酸酯基团的修饰，例如硫代磷酸酯修饰。突出端不需要与靶序列同
源。
[0272] 在一些实施例中，有义链和反义链的每个残基独立地用LNA、CRN、cET、UNA、HNA、CeNA、2'‑甲氧基乙基、2'‑O‑甲基、2'‑O‑烯丙基、2'‑C‑烯丙基、2'‑脱氧、2'‑羟基或2'‑氟修饰。链可以含有多于一种修饰。在一个实施例中，有义链和反义链的每个残基独立地用2'‑
O‑甲基或2'‑氟修饰。
[0273] 在有义链和反义链上通常存在至少两种不同的修饰。这两种修饰可以是2'‑O‑甲基或2'‑氟修饰，或其它修饰。
[0274] 在某些实施例中，Na或Nb包括交替模式的修饰。如本文所使用的，术语“交替基序”是指具有一个或多个修饰的基序，每个修饰发生在一条链的交替核苷酸上。交替核苷酸可
以指每隔一个核苷酸一个或每三个核苷酸一个，或类似的模式。例如，如果A、B和C各自表示
核苷酸的一种修饰类型，则交替基序可以是“ABABABABABAB…”、“AABBAABBAABB…”、
“AABAABAABAAB…”、“AAABAAABAAAB…”、“AAABBBAAABBB…”或“ABCABCABCABC…”等。
[0275] 包含在交替基序中的修饰的类型可以是相同的或不同的。例如，如果A、B、C、D各自表示核苷酸上的一种修饰类型，则交替模式，即每隔一个核苷酸上的修饰可以是相同的，但
每个有义链或反义链可以选自交替基序内的若干种修饰可能性，如“ABABAB…”、
“ACACAC…”、“BDBDBD…”或“CDCDCD…”等。
[0276] 在一些实施例中，本发明的dsRNAi药剂包括相对于反义链上的交替基序的修饰模式，有义链上交替基序的修饰模式发生了偏移。所述偏移可以使得有义链的核苷酸的经修
饰的基团对应于反义链的核苷酸的不同经修饰的基团，并且反之亦然。例如，当与dsRNA双
链体中的反义链配对时，有义链中的交替基序可以从链的5'到3'以“ABABAB”开始，并且反
义链中的交替基序可以在双链体区内从链的5'到3'以“BABABA”开始。作为另一个实例，有
义链中的交替基序可以从链的5'到3'以“AABBAABB”开始，并且反义链中的交替基序在双链
体区内可以从链5'到3'以“BBAABBAA”开始，因此在有义链与反义链之间存在修饰模式的完
全或部分转移。
[0277] 在一个特定实例中，有义链中的交替基序是从链的5'到3'的“ABABAB”，其中每个A是未经修饰的核糖核苷酸，并且每个B是2'‑O甲基修饰的核苷酸。
[0278] 在一个特定实例中，有义链中的交替基序是从链的5'到3'的“ABABAB”，其中每个A是2'‑脱氧‑2'‑氟修饰的核糖核苷酸，并且每个B是2'‑O甲基修饰的核苷酸。
[0279] 在另一个特定实例中，反义链中的交替基序是从链的3'到5'的“BABABA”，其中每个A是2'‑脱氧‑2'‑氟修饰的核糖核苷酸，并且每个B是2'‑O甲基修饰的核苷酸。
[0280] 在一个特定实例中，有义链中的交替基序是从链的5'到3'的“ABABAB”，并且反义链中的交替基序是从链的3'到5'的“BABABA”，其中每个A是未经修饰的核糖核苷酸，并且每
个B是2'‑O甲基修饰的核苷酸。
[0281] 在一个特定实例中，有义链中的交替基序是从链的5'到3'的“ABABAB”，并且反义链中的交替基序是从链的3'到5'的“BABABA”，其中每个A是2'‑脱氧‑2'‑氟修饰的核糖核苷酸，并且每个B是2'‑O甲基修饰的核苷酸。
[0282] 在一些实施例中，dsRNAi药剂包括2'‑O‑甲基修饰和2'‑F修饰的交替基序在有义链上的模式最初相对于反义链上2'‑O‑甲基修饰和2'‑F修饰的交替基序的模式具有偏移，
即有义链碱基上的2'‑O‑甲基修饰的核苷酸与反义链上的2'‑F修饰的核苷酸配对，并且反
之亦然。有义链的1位置可以从2'‑F修饰开始，并且反义链的1位置可以从2'‑O‑甲基修饰开
始。
[0283] 将在三个连续核苷酸上的三个相同修饰的一个或多个基序引入有义链或反义链中断了存在于有义链或者反义链中的初始修饰模式。通过将在三个连续核苷酸上的三个相
同修饰的一个或多个基序引入有义链或反义链来中断有义链或反义链的修饰模式，可以增
强针对靶基因的基因沉默活性。
[0284] 在一些实施例中，当三个连续核苷酸上的三个相同修饰的基序被引入任何链时，基序旁边的核苷酸的修饰是与基序的修饰不同的修饰。例如，含有基序的序列部分是“…
NaYYYNb…”，其中“Y”表示对三个连续核苷酸上的三个相同修饰的基序的修饰，并且“Na”和“Nb”表示对基序“YYY”旁边的核苷酸的不同于Y的修饰的修饰，并且其中Na和Nb可以是相同
或不同的修饰。可替代地，当存在翼修饰时，Na或Nb可以存在或不存在。
[0285] iRNA可以进一步包括至少一个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键。硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键修饰可以发生在链的任何位置中的有义链、反义链或两条链的任
何核苷酸上。例如，核苷酸间键修饰可以发生在有义链或反义链上的每个核苷酸上；每个核
苷酸间键修饰可以在有义链或反义链上以交替模式发生；或有义链或反义链可以以交替模
式含有两种核苷酸间键修饰。有义链上的核苷酸间键修饰的交替模式可以与反义链相同或
不同，并且有义链上核苷酸间键修饰的交替模式可以相对于反义链上核苷酸间键的交替模
式具有偏移。在一个实施例中，双链RNAi药剂包括6个至8个硫代磷酸酯核苷酸间键。在一些
实施例中，反义链在5'端处包括两个硫代磷酸酯核苷酸间键，并且在3'端处包括两个硫代
磷酸酯核苷酸间键，并且有义链在5'端或3'端处包括至少两个硫代磷酸酯核苷酸间键。
[0286] 在一些实施例中，dsRNAi药剂包括突出端区中的硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键修饰。例如，突出端区可以含有两个核苷酸，所述两个核苷酸之间具有硫代磷酸酯或甲
基膦酸酯核苷酸间键。还可以进行核苷酸间键修饰，以将突出端核苷酸与双链体区内的末
端配对核苷酸连接。例如，至少2个、3个、4个或所有突出端核苷酸可以通过硫代磷酸酯或甲
基膦酸酯核苷酸间键连接，并且任选地，可以存在另外的硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核酸间
键，将突出端核苷酸与紧挨着突出端核苷酸的配对核苷酸连接。例如，在末端三个核苷酸之
间可能存在至少两个硫代磷酸酯核苷酸间键，其中三个核苷酸中的两个是突出端核苷酸，
并且第三个是与突出端核苷酸相邻的配对核苷酸。这些末端三个核苷酸可以位于反义链的
3'端、有义链的3'端、反义链5'端或反义链5'端。
[0287] 在一些实施例中，2‑核苷酸突出端位于反义链的3'端处时，并且在末端三个核苷酸之间有两个硫代磷酸核苷酸间键，其中所述三个核苷酸中的两个是突出端核苷酸，并且
第三个核苷酸是紧挨着突出端核苷酸的配对核苷酸。任选地，dsRNAi药剂在有义链的5'端
和反义链的5'端两者的末端三个核苷酸之间可以另外具有两个硫代磷酸核苷酸间键。
[0288] 在一个实施例中，dsRNAi药剂包括与靶标、在双链体内或其组合的错配。所述错配可能发生在突出端区或双链体区中。碱基对可以基于其促进解离或熔化的倾向进行排序
(例如，根据特定配对的缔合或离解的自由能，最简单的方法是在单个配对的基础上检查配
对，尽管也可以使用下一个临近点或类似分析)。在促进解离方面：A:U优于G:C；G:U优于G:
C；并且I:C优于G:C(I＝肌苷)。错配，例如非规范或规范外配对(如本文其它地方所述)优于
规范(A:T、A:U、G:C)配对；并且包含通用碱基的配对优于规范配对。
[0289] 在某些实施例中，dsRNAi药剂在反义链5'端的双链体区内包括前1个、2个、3个、4个或5个碱基对中的至少一个，所述双链体区独立地选自：A：U、G:U、I:C和错配对，例如非规范或规范外配对或包含通用碱基的配对，以促进双链体的5'端处反义链的解离。
[0290] 在某些实施例中，反义链中从5'端开始的双链体区内1位置处的核苷酸选自A、dA、dU、U和dT。可替代地，从反义链的5'端开始的双链体区内的前1个、2个或3个碱基对中的至
少一个是AU碱基对。例如，从反义链5'端起的双链体区内的第一个碱基对是AU碱基对。
[0291] 在其它实施例中，有义链的3'端处的核苷酸是脱氧胸腺嘧啶(dT)，或反义链的3'端处的核苷酸是脱氧胸腺嘧啶(dT)。例如，存在脱氧胸腺嘧啶核苷酸的短序列，例如，在有
义链、反义链或两条链的3'端上有两个dT核苷酸。
[0292] 在某些实施例中，有义链序列可以由式(I)表示：
[0293] 5'np‑Na‑(X X X)i‑Nb‑Y Y Y‑Nb‑(Z Z Z)j‑Na‑nq 3'(I)
[0294] 其中：
[0295] i和j各自独立地为0或1；
[0296] p和q各自独立地为0至6；
[0297] 每个Na独立地表示包括0个至25个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列每个序列包括至少两个不同修饰的核苷酸；
[0298] 每个Nb独立地表示包括0个至10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列；
[0299] 每个np和nq独立地表示突出端核苷酸；
[0300] 其中Nb和Y不具有相同的修饰；并且
[0301] XXX、YYY和ZZZ各自独立地表示在三个连续核苷酸上的三个相同修饰的一个基序。在一些实施例中，YYY是所有2'‑F修饰的核苷酸。
[0302] 在一些实施例中，Na或Nb包括交替模式的修饰。
[0303] 在一些实施例中，YYY基序出现在有义链的切割位点处或附近。例如，当dsRNAi药剂具有长度为17个至23个核苷酸的双链体区时，YYY基序可以出现在有义链的切割位点处
或附近(例如，可以出现在位置6、7、8；7、8、9；8、9、10；9、10、11；10、11、12；或11、12、13处)，计数从第一个核苷酸开始，从5'端开始；或任选地，计数从5'端开始，从双链体区内的第一
配对核苷酸开始。
[0304] 在一个实施例中，i是1并且j是0，或者i是0并且j是1，或i和j两者都是1。因此，有义链可以由下式表示：
[0305] 5'np‑Na‑YYY‑Nb‑ZZZ‑Na‑nq 3'  (Ib)；
[0306] 5'np‑Na‑XXX‑Nb‑YYY‑Na‑nq 3'  (Ic)；或
[0307] 5'np‑Na‑XXX‑Nb‑YYY‑Nb‑ZZZ‑Na‑nq 3'  (Id)。
[0308] 当有义链由式(Ib)表示时，Nb表示包括0个至10个、0个至7个、0个至5个、0个至4个、0个至2个或0个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na可以独立地表示包括2个至20
个、2个至15个或2个至10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
[0309] 当有义链表示为式(Ic)时，Nb表示包括0个至10个、0个至7个、0个至10个、0个至7个、0个至5个、0个至4个、0个至2个或0个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na可以独立
地表示包括2个至20个、2个至15个或2个至10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
[0310] 当有义链表示为式(Id)时，每个Nb独立地表示包括0个至10个、0个至7个、0个至5个、0个至4个、0个至2个或0个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。在一些实施例中，Nb是0、1、
2、3、4、5或6。每个Na可以独立地表示包括2‑20、2‑15或2‑10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
[0311] X、Y和Z中的每一个可以彼此相同或不同。
[0312] 在其它实施例中，i是0并且j是0，并且有义链可以由下式表示：
[0313] 5'np‑Na‑YYY‑Na‑nq 3'  (Ia)。
[0314] 当有义链由式(Ia)表示时，每个Na可以独立地表示包括2个至20个、2个至15个或2个至10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
[0315] 在一个实施例中，RNAi的反义链序列可以由式(II)表示：
[0316] 5'nq'‑Na′‑(Z'Z′Z′)k‑Nb′‑Y′Y′Y′‑Nb′‑(X′X′X′)l‑N′a‑np′3'  (II)[0317] 其中：
[0318] k和l各自独立地为0或1；
[0319] p'和q'各自独立地为0至6；
[0320] 每个Na′独立地表示包括0个至25个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列，每个序列包括至少两个不同修饰的核苷酸；
[0321] 每个Nb′独立地表示包括0个至10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列；
[0322] 每个np′和nq′独立地表示突出端核苷酸；
[0323] 其中Nb'和Y'不具有相同的修饰；并且
[0324] X′X′X′、Y′Y′Y′和Z′Z′Z′各自独立地表示在三个连续核苷酸上的三个相同修饰的一个基序。
[0325] 在一些实施例中，Na'或Nb'包括交替模式的修饰。
[0326] Y′Y′Y′基序出现在反义链的切割位点处或附近。例如，当dsRNAi药剂具有长度为17个至23个核苷酸的双链体区时，Y′Y′Y′基序可以出现在反义链的位置9、10、11；10、11、
12；11、12、13；12、13、14；或13、14、15处，计数从第一个核苷酸开始，从5'端开始；或任选地，计数从5'端开始，从双链体区内的第一配对核苷酸开始。在一些实施例中，Y′Y′Y′基序出现在位置11、12、13处。
[0327] 在某些实施例中，Y′Y′Y′基序全部是2'‑OMe修饰的核苷酸。
[0328] 在某些实施例中，k是1并且l是0，或k是0并且l是1，或k和l两者都是1。
[0329] 因此，反义链可以由下式表示：
[0330] 5'nq'‑Na′‑Z′Z′Z′‑Nb′‑Y′Y′Y′‑Na′‑np'3'  (IIb)；
[0331] 5'nq'‑Na′‑Y′Y′Y′‑Nb′‑X′X′X′‑np'3'(IIc)；或
[0332] 5'nq'‑Na′‑Z′Z′Z′‑Nb′‑Y′Y′Y′‑Nb′‑X′X′X′‑Na′‑np'3'  (IId)。
[0333] 当反义链表示由式(IIb)表示时，Nb'表示包括0个至10个、0个至7个、0个至10个、0个至7个、0个至5个、0个至4个、0个至2个或0个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na'独
立地表示包括2个至20个、2个至15个或2个至10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
[0334] 当反义链表示为式(IIc)时，Nb表示包括0个至10个、0个至7个、0个至10个、0个至7个、0个至5个、0个至4个、0个至2个或0个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na'独立地
表示包括2个至20个、2个至15个或2个至10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
[0335] 当反义链表示为式(IId)时，每个Nb'独立地表示包括0个至10个、0个至7个、0个至10个、0个至7个、0个至5个、0个至4个、0个至2个或0个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。每
个Na'独立地表示包括2个至20个、2个至15个或2个至10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序
列。在一些实施例中，Nb为0、1、2、3、4、5或6。
[0336] 在其它实施例中，k是0并且l是0，并且反义链可以由下式表示：
[0337] 5'np'‑Na'‑Y'Y'Y'‑Na'‑nq'3'  (Ia)。
[0338] 当反义链表示为式(IIa)时，每个Na'独立地表示包括2个至20个、2个至15个或2个至10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
[0339] X′、Y′和Z′中的每一个可以彼此相同或不同。
[0340] 有义链和反义链的每个核苷酸可以独立地用LNA、CRN、UNA、cEt、HNA、CeNA、2'‑甲氧基乙基、2'‑O‑甲基、2'‑O‑烯丙基、2'‑C‑烯丙基、2'‑羟基或2'‑氟修饰。例如，有义链和反义链的每个核苷酸独立地用2'‑O‑甲基或2'‑氟修饰。特别地，每个X、Y、Z、X′、Y′和Z′可以表示2'‑O‑甲基修饰或2'‑氟修饰。
[0341] 在一些实施例中，当双链体区为21nt时，dsRNAi药剂的有义链可以含有出现在链的9、10和11位置处的YYY基序，计数从5'端的第一个核苷酸开始，或任选地，计数从5'端的
双链体区内的第一配对核苷酸开始；并且Y表示2'‑F修饰。有义链可以另外含有XXX基序或
ZZZ基序作为在双链体区的相对端处的翼修饰；并且XXX和ZZZ各自独立地表示2'‑OMe修饰
或2'‑F修饰。
[0342] 在一些实施例中，反义链可以含有出现在链的11、12、13位处的Y′Y′Y′基序，计数从5'端的第一个核苷酸开始，或任选地，计数从5'端的双链体区内的第一配对核苷酸开始；
并且Y表示2'‑O‑甲基修饰。反义链可以另外含有X′X′X′基序或Z′Z′Z′基序作为在双链体区的相对端处的翼修饰；并且X′X′X′和Z′Z′Z′各自独立地表示2'‑OMe修饰或2'‑F修饰。
[0343] 由上述式(Ia)、(Ib)、(Ic)和(Id)中的任一个表示的有义链与分别由式(IIa)、(IIb)、(IIc)和(IId)中的任一个表示的反义链形成双链体。
[0344] 因此，用于本发明方法的dsRNAi药剂可以包括有义链和反义链，每条链具有14个至30个核苷酸，iRNA双链体由式(III)表示：
[0345] 有义：5'np‑Na‑(X X X)i‑Nb‑Y Y Y‑Nb‑(Z Z Z)j‑Na‑nq 3'
[0346] 反义：3'np'‑Na'‑(X'X′X′)k‑Nb'‑Y′Y′Y′‑Nb'‑(Z′Z′Z′)l‑Na'‑nq'5'[0347] (III)
[0348] 其中：
[0349] i、j、k和l各自独立地为0或1；
[0350] p、p′、q和q′各自独立地为0至6；
[0351] 每个Na和Na'独立地表示包括0个至25个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列，每个序列包括至少两个不同修饰的核苷酸；
[0352] 每个Nb和Nb'独立地表示包括0个至10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列；
[0353] 其中每个可能存在或不存在的np'、np、nq'和nq独立地表示突出端核苷酸；并且
[0354] XXX、YYY、ZZZ、X′X′X′、Y′Y′Y′和Z′Z′Z′各自独立地表示在三个连续核苷酸上的三个相同修饰的一个基序。
[0355] 在一个实施例中，i是0并且j是0；或i是1并且j是0；或i是0并且j是1；或i和j两者都是0；或i和j两者都是1。在另一个实施例中，k是0并且l是0；或k是1并且l是0；k是0并且l
是1；或k和l两者都是0；或k和l两者都是1。
[0356] 形成iRNA双链体的有义链和反义链的示例性组合包含下式：
[0357] 5'np‑Na‑Y Y Y‑Na‑nq 3'
[0358] 3'np'‑Na'‑Y′Y′Y′‑Na'nq'5'
[0359] (IIIa)
[0360] 5'np‑Na‑Y Y Y‑Nb‑Z Z Z‑Na‑nq 3'
[0361] 3'np'‑Na'‑Y′Y′Y′‑Nb'‑Z′Z′Z′‑Na'nq'5'
[0362] (IIIb)
[0363] 5'np‑Na‑X X X‑Nb‑Y Y Y‑Na‑nq 3'
[0364] 3'np'‑Na'‑X′X′X′‑Nb'‑Y′Y′Y′‑Na'‑nq'5'
[0365] (IIIc)
[0366] 5'np‑Na‑X X X‑Nb‑Y Y Y‑Nb‑Z Z Z‑Na‑nq 3'
[0367] 3'np'‑Na'‑X′X′X′‑Nb'‑Y′Y′Y′‑Nb'‑Z′Z′Z′‑Na‑nq'5'
[0368] (IIId)
[0369] 当dsRNAi药剂由式(IIIa)表示时，每个Na独立地表示包括2个至20个、2个至15个或2个至10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
[0370] 当dsRNAi药剂由式(IIIb)表示时，每个Nb独立地表示包括1个至10个、1个至7个、1个至5个或1个至4个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na独立地表示包括2个至20个、2
个至15个或2个至10个经饰修的核苷酸的寡核苷酸序列。
[0371] 当dsRNAi药剂表示为式(IIIc)时，每个Nb、Nb'独立地表示包括0个至10个、0个至7个、0个至10个、0个至7个、0个至5个、0个至4个、0个至2个或0个经修饰的核苷酸的寡核苷酸
序列。每个Na独立地表示包括2个至20个、2个至15个或2个至10个经饰修的核苷酸的寡核苷
酸序列。
[0372] 当dsRNAi药剂表示为式(IIId)时，每个Nb、Nb'独立地表示包括0个至10个、0个至7个、0个至10个、0个至7个、0个至5个、0个至4个、0个至2个或0个经修饰的核苷酸的寡核苷酸
序列。每个Na、Na'独立地表示包括2个至20个、2个至15个或2个至10个经修饰的核苷酸的寡
核苷酸序列。Na、Na'、Nb和Nb'中的每一个独立地包括交替模式的修饰。
[0373] 式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)和(IIId)中的X、Y和Z中的每一个可以彼此相同或不同。
[0374] 当dsRNAi药剂由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)和(IIId)表示时，至少一个Y核苷酸可以与至少一个Y′核苷酸形成碱基对。可替代地，至少两个Y核苷酸与对应的Y′核苷酸
形成碱基对；或所有三个Y核苷酸都与相应的Y′核苷酸形成碱基对。
[0375] 当dsRNAi药剂由式(IIIb)或(IIId)表示时，至少一个Z核苷酸可以与一个Z′核苷酸形成碱基对。可替代地，至少两个Z核苷酸与对应的Z′核苷酸形成碱基对；或所有三个Z核
苷酸都与相应的Z′核苷酸形成碱基对。
[0376] 当dsRNAi药剂表示为式(IIIc)或(IIId)时，至少一个X核苷酸可以与一个X′核苷酸形成碱基对。可替代地，至少两个X核苷酸与对应的X′核苷酸形成碱基对；或所有三个X核
苷酸都与相应的X′核苷酸形成碱基对。
[0377] 在某些实施例中，Y核苷酸上的修饰不同于Y'核苷酸上的修饰，Z核苷酸上的修饰不同于Z'核苷酸上的修饰，或X核苷酸上的修饰不同于X'核苷酸上的修饰。
[0378] 在某些实施例中，当dsRNAi药剂由式(IIId)表示时，Na修饰是2′‑O‑甲基或2′‑氟修饰。在其它实施例中，当RNAi药剂由式(IIId)表示时，Na修饰是2′‑O‑甲基或2′‑氟修饰，并且np′>0，并且至少一个np′通过硫代磷酸酯键与相邻核苷酸a连接。在又其它实施例中，当RNAi药剂由式(IIId)表示时，Na修饰是2′‑O‑甲基或2′‑氟修饰，np′>0，并且至少一个np′经由硫代磷酸酯键与相邻核苷酸连接，并且有义链与通过二价或三价支链接头(下文描述)连
接的一种或多种GalNAc衍生物缀合。在其它实施例中，当RNAi药剂由式(IIId)表示时，Na修
饰是2′‑O‑甲基或2′‑氟修饰，np′>0，并且至少一个np′经由硫代磷酸酯键与相邻核苷酸连接，有义链包括至少一个硫代磷酸键，并且有义链与通过二价或三价支链接头连接的一种
或多种GalNAc衍生物缀合。
[0379] 在一些实施例中，当dsRNAi药剂由式(IIIa)表示时，Na修饰是2′‑O‑甲基或2′‑氟修饰，np′>0，并且至少一个np′经由硫代磷酸酯键与相邻核苷酸连接，有义链包括至少一个
硫代磷酸键，并且有义链与通过二价或三价支链接头连接的一种或多种GalNAc衍生物缀
合。
[0380] 在一些实施例中，dsRNAi药剂是含有至少两个由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)和(IIId)表示的双链体的多聚体，其中所述双链体通过接头连接。接头可以是可切割的或
不可切割的。任选地，多聚体进一步包括配体。每个双链体可以靶向相同的基因或两个不同
的基因；或每个双链体可以靶向两个不同的靶位点处的相同的基因。
[0381] 在一些实施例中，dsRNAi药剂是含有三个、四个、五个、六个或更多个由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)和(IIId)表示的双链体的多聚体，其中所述双链体通过接头连接。
接头可以是可切割的或不可切割的。任选地，多聚体进一步包括配体。每个双链体可以靶向
相同的基因或两个不同的基因；或每个双链体可以靶向两个不同的靶位点处的相同的基
因。
[0382] 在一个实施例中，由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)和(IIId)中的至少一个表示的两种dsRNAi药剂在5'端处以及一个或两个3'处彼此连接，并且任选地与配体缀合。每种
药剂可以靶向相同的基因或两个不同的基因；或每种药剂可以靶向两个不同的靶位点处的
相同的基因。
[0383] 在某些实施例中，本发明的RNAi药剂可以含有少量含有2'‑氟修饰的核苷酸，例如，10个或更少个具有2'‑氟修饰的核苷酸。例如，RNAi药剂可以含有10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个、1个或0个具有2'‑氟修饰的核苷酸。在具体实施例中，本发明的RNAi药剂含有10个具有2'‑氟修饰的核苷酸，例如，4个在有义链中具有2'‑氟修饰的核苷酸和6
个在反义链中具有2'‑氟修饰的核苷酸。在另一个具体实施例中，本发明的RNAi药剂含有6
个具有2'‑氟修饰的核苷酸，例如，4个在有义链中具有2'‑氟修饰的核苷酸和2个在反义链
中具有2'‑氟修饰的核苷酸。
[0384] 在其它实施例中，本发明的RNAi药剂可以含有超低量的含有2'‑氟修饰的核苷酸，例如，2个或更少个含有2'‑氟修饰的核苷酸。例如，RNAi药剂可以含有具有2'‑氟修饰的0个
核苷酸中的2个、1个。在具体实施例中，RNAi药剂可以含有2个具有2'‑氟修饰的核苷酸，例
如，0个在有义链中具有2‑氟修饰的核苷酸和2个在反义链中具有2'‑氟修饰的核苷酸。
[0385] 各种出版物描述了可以用于本发明的方法的多聚体iRNA。此类出版物包含WO2007/091269、美国专利第7,858,769号、WO2010/141511、WO2007/117686、WO2009/014887
和WO2011/031520，所述文献中的每一个的全部内容特此通过引用并入本文。
[0386] 在某些实施例中，本公开的组合物和方法包含如本文所描述的RNAi药剂的膦酸乙烯酯(VP)修饰。在示例性实施例中，本公开的膦酸5'‑乙烯酯修饰的核苷酸具有以下结构：
[0387]
[0388] 其中X为O或S；
[0389] R是氢、羟基、氟或C1‑20烷氧基(例如，甲氧基或正十六烷氧基)；
[0390] R5'是＝C(H)‑P(O)(OH)2，并且C5'碳与R5'之间的双键处于E或Z方向(例如，E方向)；并且
[0391] B是核碱基或经修饰的核碱基，任选地其中B是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶。
[0392] 本公开的膦酸乙烯酯可以与本公开的dsRNA的反义链或有义链连接。在某些实施例中，本公开的膦酸乙烯酯与dsRNA的反义链连接，任选地在dsRNA反义链的5'端处。
[0393] 膦酸乙烯酯修饰也设想用于本公开的组合物和方法。示例性膦酸乙烯酯结构包含前述结构，其中R5'为＝C(H)‑OP(O)(OH)2，并且C5'碳和R5'之间的双键处于E或Z方向(例
如，E方向)。
[0394] 如下文更详细描述的，含有一个或多个碳水化合物部分与iRNA的缀合的iRNA可以优化iRNA的一个或多个特性。在许多情况下，碳水化合物部分将与iRNA的经修饰的亚基连
接。例如，iRNA的一个或多个核糖核苷酸亚基的核糖糖可以被另一个部分替代，例如与碳水
化合物配体连接的非碳水化合物(如环状)载体。其中亚基的核糖糖已经被如此替代的核糖
核苷酸亚基在本文中被称为核糖替代修饰亚基(RRMS)。环状载体可以是碳环系统，即所有
环原子都是碳原子，或杂环系统，即一个或多个环原子可以是杂原子，例如氮、氧、硫。环状
载体可以是单环系统，或可以含有两个或多个环，例如稠环。环状载体可以是完全饱和的环
系统，或其可以含有一个或多个双键。
[0395] 配体可以通过载体与多核苷酸连接。载体包含(i)至少一个“主链连接点”，如两个“主链连接点”以及(ii)至少一个“系链连接点”如本文所使用的，“主链连接点”是指官能
团，例如羟基，或通常是可用于并适合将载体结合到主链中的键，例如核糖核酸的磷酸酯或
经修饰的磷酸酯(例如，含硫)骨架。在一些实施例中，“系链连接点”(TAP)是指连接所选部
分的环状载体的组成环原子，例如碳原子或杂原子(不同于提供主链连接点的原子)。所述
部分可以是例如碳水化合物，例如单糖、二糖、三糖、四糖、寡糖或多糖。任选地，所选择的部分通过中间系链与环状载体连接。因此，环状载体将通常包含官能团，例如氨基，或通常提
供适合于另一个化学实体(例如，组成环的配体)的结合或系留的键。
[0396] iRNA可以通过载体与配体缀合，其中载体可以是环状基团或无环基团。在一些实施例中，环状基团选自吡咯烷基、吡唑啉基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、哌啶基、哌嗪
基、[1,3]二氧戊环、噁唑烷基、异噁唑烷基、吗啉基、噻唑烷基、异噻唑烷基、喹喔啉基、哒嗪酮基、四氢呋喃基和十氢化萘。在一些实施例中，无环基团是丝氨醇主链或二乙醇胺主链。
[0397] i.热不稳定修饰
[0398] 在某些实施例中，dsRNA分子可以通过在反义链的种子区掺入热不稳定修饰来优化RNA干扰。如本文所使用，“种子区”意指在引用链的5'末的位置2‑9处或引用链的5'端的
位置2‑8处。例如，热不稳定修饰可以掺入反义链的种子区域中，以减少或抑制脱靶基因沉
默。
[0399] 术语“热不稳定修饰”包含将导致dsRNA的总熔融温度(Tm)低于没有此类修饰的dsRNA的Tm的修饰。例如，热不稳定修饰可以将dsRNA的Tm降低1℃至4℃，如一摄氏度、二摄
氏度、三摄氏度或四摄氏度。并且，术语“热不稳定核苷酸”是指含有一个或多个热不稳定修
饰的核苷酸。
[0400] 已经发现，具有反义链的dsRNA具有降低脱靶基因沉默活性的作用，所述反义链包括前9个核苷酸位置内的双链体的至少一个热不稳定修饰，从所述反义链的5'端开始计数。
因此，在一些实施例中，反义链在反义链的5'区的前9个核苷酸位置内包括至少一个(例如，
一个、两个、三个、四个、五个或更多个)双链体的热不稳定修饰。在一些实施例中，双链体的一个或多个热不稳定修饰位于从反义链5'端起的位置2‑9，如位置4‑8中。在一些另外的实
施例中，双链体的热不稳定修饰位于从反义链的5'端起的位置6、7或8处。在仍一些另外的
实施例中，双链体的热不稳定修饰位于从反义链的5'端起的位置7处。在一些实施例中，双
链体的热不稳定修饰位于从反义链的5'端起的位置2、3、4、5或9处。
[0401] iRNA药剂包括有义链和反义链，每条链具有14个至40个核苷酸。RNAi药剂可以由式(L)表示：
[0402]
[0403] 在式(L)中，B1、B2、B3、B1'、B2'、B3'和B4'各自独立地为含有选自由以下组成的组的修饰的核苷酸：2'‑O‑烷基、2'‑取代的烷氧基、2'‑取代的烷基、2'‑卤基、ENA和BNA/LNA。
在一个实施例中，B1、B2、B3、B1'、B2'、B3'和B4'各自含有2'‑OMe修饰。在一个实施例中，B1、B2、B3、B1'、B2'、B3'和B4'各自含有2'‑OMe或2'‑F修饰。在一个实施例中，B1、B2、B3、B1'、B2'、B3'和B4'中的至少一个含有2'‑O‑N‑甲基乙酰氨基(2'‑O‑NMA，2'O‑CH2C(O)N(Me)H)修饰。
[0404] C1是一种热不稳定核苷酸，位于与反义链的种子区相对的位点处(即位于反义链的5'端的位置2‑8处或引用链的5'端的位置2‑9处)。例如，C1位于有义链的一个位置处，所
述位置与反义链的5'端的位置2至8处的核苷酸配对。在一个实例中，C1位于从有义链的5'
端起的位置15处。C1核苷酸具有热不稳定修饰，所述热不稳定修饰可以包含无碱基修饰；与
双链体中的相对核苷酸的错配；以及糖修饰，如2'‑脱氧修饰或无环核苷酸，例如解锁核酸
(UNA)或甘油核酸(GNA)；以及2'‑5'连接核糖核苷酸(“3'‑RNA”)。在一个实施例中，C1具有选自由以下组成的组的热不稳定修饰：i)与反义链中的相对核苷酸的错配；ii)选自由以下
组成的组的无碱基修饰：
[0405] 以及iii)选自由以下组成的组的糖修饰：
[0406]
[0407] 其中B是经修饰或未修饰的核碱基，R1和R2独立地为H、卤素、OR3或烷基；并且R3是H、烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或糖。在一个实施例中，C1中的热不稳定修饰是选自由以下组成的组的错配：G:G、G:A、G:U、G:T、A:A、A:C、C:C、C:U、C:T、U:U、T:
T和U:T；并且任选地，错配对中的至少一个核碱基是2'‑脱氧核碱基。在一个实例中，C1中的
热不稳定修饰是GNA或
[0408] T1、T1'、T2'和T3'各自独立地表示包括修饰的核苷酸，所述修饰为核苷酸提供小于或等于2'‑OMe修饰的空间体积的空间体积。空间体积是指修饰的空间效应的总和。用于
确定核苷酸修饰的空间效应的方法是本领域技术人员已知的。修饰可以在核苷酸的核糖糖
的2'位置处，或对非核糖核苷酸、无环核苷酸的修饰，或与核糖糖的2'位置相似或等效的核
苷酸的主链，并且为核苷酸提供小于或等于2'‑OMe修饰的空间体积的空间体积。例如，T1、
T1'、T2'和T3'各自独立地选自DNA、RNA、LNA、2'‑F和2'‑F‑5'‑甲基。在一个实施例中，T1是DNA。在一个实施例中，T1'是DNA、RNA或LNA。在一个实施例中，T2'是DNA或RNA。在一个实施
例中，T3'是DNA或RNA。
[0409] n1、n3和q1的长度独立地为4个至15个核苷酸。
[0410] n5、q3和q7的长度独立地为1个至6个核苷酸。
[0411] n4、q2和q6的长度独立地为1个至3个核苷酸；可替代地，n4是0。
[0412] q5的长度独立地为0个至10个核苷酸。
[0413] n2和q4的长度独立地为0个至3个核苷酸。
[0414] 可替代地，n4的长度为0个至3个核苷酸。
[0415] 在一个实施例中，n4可以是0。在一个实例中，n4是0，并且q2和q6是1。在另一个实例4 2 6
中，n 是0，并且q 和q 是1，在有义链的位置1至5(从有义链的5'端开始计数)内有两个硫代
磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在位置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反
义链的位置18至23(从反义链的5'端开始计数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。
[0416] 在一个实施例中，n4、q2和q6各自为1。
[0417] 在一个实施例中，n2、n4、q2、q4和q6各自为1。
[0418] 在一个实施例中，当有义链的长度为19个至22个核苷酸，并且n4为1时，C1位于有义链的5'端的位置14至17处。在一个实施例中，C1位于有义链的5'端的位置15处
[0419] 在一个实施例中，T3'从反义链的5'端的位置2处开始。在一个实例中，T3'位于从6
反义链的5'端起的位置2处，并且q等于1。
[0420] 在一个实施例中，T1'从反义链的5'端的位置14处开始。在一个实例中，T1'位于从2
反义链的5'端起的位置14处，并且q等于1。
[0421] 在一个示例性实施例中，T3'从反义链的5'端中的位置2开始，并且T1'从反义链的6
5'端中的位置14开始。在一个实例中，T3'从反义链的5'端中的位置2开始，并且q等于1，并
2
且T1'从反义链的5'端中的位置14开始，并且q等于1。
[0422] 在一个实施例中，T1'和T3'以11个核苷酸的长度分开(即不计数T1'和T3'核苷酸)。
[0423] 在一个实施例中，T1'位于从反义链的5'端起的位置14处。在一个实例中，T1'位于2
从反义链的5'端起的位置14处，并且q等于1，并且修饰位于2'位置处或提供比2'‑OMe核糖
更少的空间体积的非核糖、无环或主链中的位置处。
[0424] 在一个实施例中，T3'位于从反义链的5'端起的位置2处。在一个实例中，T3'位于6
从反义链的5'端起的位置2处，并且q等于1，并且修饰位于2'位置处或提供比2'‑OMe核糖
更少或相等的空间体积的非核糖、无环或主链中的位置处。
[0425] 在一个实施例中，T1位于有义链的切割位点处。在一个实例中，当有义链的长度为2
19个至22个核苷酸，并且n为1时，T1位于从有义链的5'端起的位置11处。在一个示例性实
2
施例中，当有义链长度为19个至22个核苷酸，并且n为1时，T1位于从有义链的5'端起的位
置11处的有义链切割位点处，
[0426] 在一个实施例中，T2'从反义链的5'端的位置6处开始。在一个实例中，T2'位于从4
反义链的5'端起的位置6至10处，并且q为1。
[0427] 在一个示例性实施例中，当有义链长度为19个至22个核苷酸，并且n2为1时，T1位于有义链的切割位点处，例如，在从有义链的5'端起的位置11处；T1'位于从反义链的5'端
2
起的位置14处，并且q 等于1，并且对T1'的修饰位于核糖糖的2'位置处，或位于提供比2'‑
OMe核糖更少的空间体积的非核糖、无环或主链中位置处；T2'位于从反义链的5'端起的位
4 6
置6至10处，并且q为1；并且T3'位于从反义链的5'端起的位置2处，并且q等于1，并且对T3'
的修饰位于2'位置处或提供比2'‑OMe核糖更少或相等的空间体积的非核糖、无环或主链中
的位置处。
[0428] 在一个实施例中，T2'从反义链的5'端的位置8处开始。在一个实例中，T2'从反义4
链的5'端的位置8开始，并且q为2。
[0429] 在一个实施例中，T2'从反义链的5'端的位置9处开始。在一个实例中，T2'位于从4
反义链的5'端起的位置9处，并且q为1。
[0430] 在一个实施例中，B1'是2'‑OMe或2'‑F，q1是9，T1'是2'‑F，q2是1，B2'是2'‑OMe或3 4 5 6
2'‑F，q 是4，T2'是2'‑F，q 是1，B3'是2'‑OMe或2'‑F，q 是6，T3'是2'‑F，q 是1，B4'是2'‑
7
OMe，并且q 是1；在有义链的位置1至5(从有义链的5'端开始计数)内具有两个硫代磷酸酯
核苷酸间键修饰，并且在位置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的
位置18至23(从反义链的5'端开始计数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。
[0431] 在一个实施例中，n4是0，B3是2'‑OMe，n5是3，B1'是2'‑OMe或2'‑F，q1是9，T1'是2'‑2 3 4 5
F，q是1，B2'是2'‑OMe或2'‑F，q 是4，T2'是2'‑F，q是1，B3'是2'‑OMe或2'‑F，q 是6，T3'是
6 7
2'‑F，q 是1，B4'是2'‑OMe，并且q是1；在有义链的位置1至5(从有义链的5'端开始计数)内
具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在位置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修
饰，并且在反义链的位置18至23(从反义链的5'端开始计数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间
键修饰。
[0432] 在一个实施例中，B1是2'‑OMe或2'‑F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'‑OMe，n3是7，4 5 1 2
n是0，B3是2'OMe，n是3，B1'是2'‑OMe或2'‑F，q 是9，T1'是2'‑F，q 是1，B2'是2'‑OMe或2'‑
3 4 5 6
F，q是4，T2'是2'‑F，q 是2'，B3'是2'‑OMe或2'‑F，q是5，T3'是2'‑F，q 是1，B4'是2'‑OMe，
7
并且q是1。
[0433] 在一个实施例中，B1是2'‑OMe或2'‑F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'‑OMe，n3是7，4 5 1 2
n是0，B3是2'‑OMe，n是3，B1'是2'‑OMe或2'‑F，q 是9，T1'是2'‑F，q是1，B2'是2'‑OMe或
3 4 5 6
2'‑F，q 是4，T2'是2'‑F，q 是2，B3'是2'‑OMe或2'‑F，q 是5，T3'是2'‑F，q 是1，B4'是2'‑
7
OMe，并且q 是1；在有义链的位置1至5(从有义链的5'端开始计数)内具有两个硫代磷酸酯
核苷酸间键修饰，并且在位置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的
位置18至23(从反义链的5'端开始计数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。
[0434] 在一个实施例中，B1是2'‑OMe或2'‑F，n1是6，T1是2'F，n2是3，B2是2'‑OMe，n3是7，4 5 1 2
n是0，B3是2'OMe，n是3，B1'是2'‑OMe或2'‑F，q 是7，T1'是2'‑F，q 是1，B2'是2'‑OMe或2'‑
3 4 5 6
F，q是4，T2'是2'‑F，q 是2'，B3'是2'‑OMe或2'‑F，q是5，T3'是2'‑F，q 是1，B4'是2'‑OMe，
7
并且q是1。
[0435] 在一个实施例中，B1是2'‑OMe或2'‑F，n1是6，T1是2'F，n2是3，B2是2'‑OMe，n3是7，4 5 1 2
n是0，B3是2'‑OMe，n是3，B1'是2'‑OMe或2'‑F，q 是7，T1'是2'‑F，q是1，B2'是2'‑OMe或
3 4 5 6
2'‑F，q 是4，T2'是2'‑F，q 是2，B3'是2'‑OMe或2'‑F，q 是5，T3'是2'‑F，q 是1，B4'是2'‑
7
OMe，并且q 是1；在有义链的位置1至5(从有义链的5'端开始计数)内具有两个硫代磷酸酯
核苷酸间键修饰，并且在位置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的
位置18至23(从反义链的5'端开始计数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。
[0436] 在一个实施例中，B1是2'‑OMe或2'‑F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'‑OMe，n3是7，4 5 1 2
n是0，B3是2'OMe，n是3，B1'是2'‑OMe或2'‑F，q 是9，T1'是2'‑F，q 是1，B2'是2'‑OMe或2'‑
3 4 5 6
F，q是4，T2'是2'‑F，q是1，B3'是2'‑OMe或2'‑F，q 是6，T3'是2'‑F，q 是1，B4'是2'‑OMe，并
7
且q是1。
[0437] 在一个实施例中，B1是2'‑OMe或2'‑F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'‑OMe，n3是7，4 5 1 2
n是0，B3是2'‑OMe，n是3，B1'是2'‑OMe或2'‑F，q 是9，T1'是2'‑F，q是1，B2'是2'‑OMe或
3 4 5 6
2'‑F，q 是4，T2'是2'‑F，q 是1，B3'是2'‑OMe或2'‑F，q 是6，T3'是2'‑F，q 是1，B4'是2'‑
7
OMe，并且q 是1；在有义链的位置1至5(从有义链的5'端开始计数)内具有两个硫代磷酸酯
核苷酸间键修饰，并且在位置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的
位置18至23(从反义链的5'端开始计数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。
[0438] 在一个实施例中，B1是2'‑OMe或2'‑F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'‑OMe，n3是7，4 5 1 2
n是0，B3是2'OMe，n是3，B1'是2'‑OMe或2'‑F，q 是9，T1'是2'‑F，q 是1，B2'是2'‑OMe或2'‑
3 4 5 6
F，q是5，T2'是2'‑F，q是1，B3'是2'‑OMe或2'‑F，q 是5，T3'是2'‑F，q 是1，B4'是2'‑OMe，并
7
且q是1；任选地在反义链的3'端处具有至少2个另外的TT。
[0439] 在一个实施例中，B1是2'‑OMe或2'‑F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'‑OMe，n3是7，4 5 1 2
n是0，B3是2'‑OMe，n是3，B1'是2'‑OMe或2'‑F，q 是9，T1'是2'‑F，q是1，B2'是2'‑OMe或
3 4 5 6
2'‑F，q 是5，T2'是2'‑F，q 是1，B3'是2'‑OMe或2'‑F，q 是5，T3'是2'‑F，q 是1，B4'是2'‑
7
OMe，并且q 是1；任选地在反义链的3'端具有至少2个另外的TT；在有义链的位置1至5(从有
义链的5'端开始计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在位置1和2处有两个
硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置18至23(从反义链的5'端开始计数)内有
两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。
[0440] 在一个实施例中，B1是2'‑OMe或2'‑F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'‑OMe，n3是7，4 5 1 2
n是0，B3是2'OMe，n是3，B1'是2'‑OMe或2'‑F，q 是9，T1'是2'‑F，q 是1，B2'是2'‑OMe或2'‑
3 4 5 6 7
F，q是4，q是0，B3'是2'‑OMe或2'‑F，q是7，T3'是2'‑F，q是1，B4'是2'‑OMe，并且q是1。
[0441] 在一个实施例中，B1是2'‑OMe或2'‑F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'‑OMe，n3是7，4 5 1 2
n是0，B3是2'‑OMe，n是3，B1'是2'‑OMe或2'‑F，q 是9，T1'是2'‑F，q是1，B2'是2'‑OMe或
3 4 5 6 7
2'‑F，q是4，q是0，B3'是2'‑OMe或2'‑F，q是7，T3'是2'‑F，q是1，B4'是2'‑OMe，并且q 是1；
在有义链的位置1至5(从5'端开始计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在位
置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置18至23(从5'端开始计
数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。
[0442] 在一个实施例中，B1是2'‑OMe或2'‑F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'‑OMe，n3是7，4 5 1 2
n是0，B3是2'OMe，n是3，B1'是2'‑OMe或2'‑F，q 是9，T1'是2'‑F，q 是1，B2'是2'‑OMe或2'‑
3 4 5 6
F，q是4，T2'是2'‑F，q 是2'，B3'是2'‑OMe或2'‑F，q是5，T3'是2'‑F，q 是1，B4'是2'‑F，并
7
且q是1。
[0443] 在一个实施例中，B1是2'‑OMe或2'‑F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'‑OMe，n3是7，4 5 1 2
n是0，B3是2'‑OMe，n是3，B1'是2'‑OMe或2'‑F，q 是9，T1'是2'‑F，q是1，B2'是2'‑OMe或
3 4 5 6
2'‑F，q 是4，T2'是2'‑F，q是2，B3'是2'‑OMe或2'‑F，q 是5，T3'是2'‑F，q 是1，B4'是2'‑F，
7
并且q 是1；在有义链的位置1至5(从有义链的5'端开始计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷
酸间键修饰，并且在位置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置
18至23(从反义链的5'端开始计数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。
[0444] 在一个实施例中，B1是2'‑OMe或2'‑F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'‑OMe，n3是7，4 5 1 2
n是0，B3是2'OMe，n是3，B1'是2'‑OMe或2'‑F，q 是9，T1'是2'‑F，q 是1，B2'是2'‑OMe或2'‑
3 4 5 6 7
F，q是4，q是0，B3'是2'‑OMe或2'‑F，q是7，T3'是2'‑F，q是1，B4'是2'‑F，并且q是1。
[0445] 在一个实施例中，B1是2'‑OMe或2'‑F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'‑OMe，n3是7，4 5 1 2
n是0，B3是2'‑OMe，n是3，B1'是2'‑OMe或2'‑F，q 是9，T1'是2'‑F，q是1，B2'是2'‑OMe或
3 4 5 6 7
2'‑F，q是4，q是0，B3'是2'‑OMe或2'‑F，q是7，T3'是2'‑F，q是1，B4'是2'‑F，并且q 是1；在有义链的位置1至5(从有义链的5'端开始计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并
且在位置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置18至23(从反义
链的5'端开始计数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。
[0446] RNAi药剂可以在有义链或反义链的5'端包括含磷基团。5'端含磷基团可以是5'端磷酸酯(5'‑P)、5'端硫代磷酸酯(5'‑PS)、5'端二硫代磷酸酯(5'‑PS2)、5'端乙烯基膦酸酯
(5'‑VP)、5'端甲基膦酸酯(MePhos)或5'‑脱氧‑5'‑C‑丙二酰基 当5'
端含磷基团是5'端基乙烯基膦酸酯(5'‑VP)时，5'‑VP可以是5'‑E‑VP异构体(即反式乙烯基
膦酸酯， )、5'‑Z‑VP异构体(即顺式乙烯基磷酸酯， )或其混合
物。
[0447] 在一个实施例中，RNAi药剂包括在有义链的5'端处的含磷基团。在一个实施例中，RNAi药剂包括在反义链的5'端处的含磷基团。
[0448] 在一个实施例中，RNAi药剂包括5'‑P。在一个实施例中，RNAi药剂包括反义链中的5'‑P。
[0449] 在一个实施例中，RNAi药剂包括5'‑PS。在一个实施例中，RNAi药剂包括在反义链中的5'‑PS。
[0450] 在一个实施例中，RNAi药剂包括5'‑VP。在一个实施例中，RNAi药剂包括在反义链中的5'‑VP。在一个实施例中，RNAi药剂包括在反义链中的5'‑E‑VP。在一个实施例中，RNAi药剂包括在反义链中的5'‑Z‑VP。
[0451] 在一个实施例中，RNAi药剂包括5'‑PS2。在一个实施例中，RNAi药剂包括在反义链中的5'‑PS2。
[0452] 在一个实施例中，RNAi药剂包括5'‑PS2。在一个实施例中，RNAi药剂包括在反义链中的5'‑脱氧‑5'‑C‑丙二酰。
[0453] 在一个实施例中，B1是2'‑OMe或2'‑F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'‑OMe，n3是7，4 5 1 2
n是0，B3是2'OMe，n是3，B1'是2'‑OMe或2'‑F，q 是9，T1'是2'‑F，q 是1，B2'是2'‑OMe或2'‑
3 4 5 6
F，q是4，T2'是2'‑F，q 是2'，B3'是2'‑OMe或2'‑F，q是5，T3'是2'‑F，q 是1，B4'是2'‑OMe，
7
并且q是1。RNAi药剂还包括5'‑PS。
[0454] 在一个实施例中，B1是2'‑OMe或2'‑F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'‑OMe，n3是7，4 5 1 2
n是0，B3是2'OMe，n是3，B1'是2'‑OMe或2'‑F，q 是9，T1'是2'‑F，q 是1，B2'是2'‑OMe或2'‑
3 4 5 6
F，q是4，T2'是2'‑F，q 是2'，B3'是2'‑OMe或2'‑F，q是5，T3'是2'‑F，q 是1，B4'是2'‑OMe，
7
并且q是1。RNAi药剂还包括5'‑P。
[0455] 在一个实施例中，B1是2'‑OMe或2'‑F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'‑OMe，n3是7，4 5 1 2
n是0，B3是2'OMe，n是3，B1'是2'‑OMe或2'‑F，q 是9，T1'是2'‑F，q 是1，B2'是2'‑OMe或2'‑
3 4 5 6
F，q是4，T2'是2'‑F，q 是2'，B3'是2'‑OMe或2'‑F，q是5，T3'是2'‑F，q 是1，B4'是2'‑OMe，
7
并且q是1。RNAi药剂还包括5'‑VP。5'‑VP可以是5'‑E‑VP、5'‑Z‑VP或其组合。
[0456] 在一个实施例中，B1是2'‑OMe或2'‑F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'‑OMe，n3是7，4 5 1 2
n是0，B3是2'OMe，n是3，B1'是2'‑OMe或2'‑F，q 是9，T1'是2'‑F，q 是1，B2'是2'‑OMe或2'‑
3 4 5 6
F，q是4，T2'是2'‑F，q 是2'，B3'是2'‑OMe或2'‑F，q是5，T3'是2'‑F，q 是1，B4'是2'‑OMe，
7
并且q是1。RNAi药剂还包括5'‑PS2。
[0457] 在一个实施例中，B1是2'‑OMe或2'‑F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'‑OMe，n3是7，4 5 1 2
n是0，B3是2'OMe，n是3，B1'是2'‑OMe或2'‑F，q 是9，T1'是2'‑F，q 是1，B2'是2'‑OMe或2'‑
3 4 5 6
F，q是4，T2'是2'‑F，q 是2'，B3'是2'‑OMe或2'‑F，q是5，T3'是2'‑F，q 是1，B4'是2'‑OMe，
7
并且q是1。RNAi药剂还包括5'‑脱氧‑5'‑C‑丙二酰。
[0458] 在一个实施例中，B1是2'‑OMe或2'‑F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'‑OMe，n3是7，4 5 1 2
n是0，B3是2'‑OMe，n是3，B1'是2'‑OMe或2'‑F，q 是9，T1'是2'‑F，q是1，B2'是2'‑OMe或
3 4 5 6
2'‑F，q 是4，T2'是2'‑F，q 是2，B3'是2'‑OMe或2'‑F，q 是5，T3'是2'‑F，q 是1，B4'是2'‑
7
OMe，并且q 是1；在有义链的位置1至5(从有义链的5'端开始计数)内具有两个硫代磷酸酯
核苷酸间键修饰，并且在位置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的
位置18至23(从反义链的5'端开始计数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi药剂还
包括5'‑P。
[0459] 在一个实施例中，B1是2'‑OMe或2'‑F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'‑OMe，n3是7，4 5 1 2
n是0，B3是2'‑OMe，n是3，B1'是2'‑OMe或2'‑F，q 是9，T1'是2'‑F，q是1，B2'是2'‑OMe或
3 4 5 6
2'‑F，q 是4，T2'是2'‑F，q 是2，B3'是2'‑OMe或2'‑F，q 是5，T3'是2'‑F，q 是1，B4'是2'‑
7
OMe，并且q 是1；在有义链的位置1至5(从有义链的5'端开始计数)内具有两个硫代磷酸酯
核苷酸间键修饰，并且在位置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的
位置18至23(从反义链的5'端开始计数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi药剂还
包括5'‑PS。
[0460] 在一个实施例中，B1是2'‑OMe或2'‑F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'‑OMe，n3是7，4 5 1 2
n是0，B3是2'‑OMe，n是3，B1'是2'‑OMe或2'‑F，q 是9，T1'是2'‑F，q是1，B2'是2'‑OMe或
3 4 5 6
2'‑F，q 是4，T2'是2'‑F，q 是2，B3'是2'‑OMe或2'‑F，q 是5，T3'是2'‑F，q 是1，B4'是2'‑
7
OMe，并且q 是1；在有义链的位置1至5(从有义链的5'端开始计数)内具有两个硫代磷酸酯
核苷酸间键修饰，并且在位置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的
位置18至23(从反义链的5'端开始计数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi药剂还
包括5'‑VP。5'‑VP可以是5'‑E‑VP、5'‑Z‑VP或其组合。
[0461] 在一个实施例中，B1是2'‑OMe或2'‑F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'‑OMe，n3是7，4 5 1 2
n是0，B3是2'‑OMe，n是3，B1'是2'‑OMe或2'‑F，q 是9，T1'是2'‑F，q是1，B2'是2'‑OMe或
3 4 5 6
2'‑F，q 是4，T2'是2'‑F，q 是2，B3'是2'‑OMe或2'‑F，q 是5，T3'是2'‑F，q 是1，B4'是2'‑
7
OMe，并且q 是1；在有义链的位置1至5(从有义链的5'端开始计数)内具有两个硫代磷酸酯
核苷酸间键修饰，并且在位置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的
位置18至23(从反义链的5'端开始计数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi药剂还
包括5'‑PS2。
[0462] 在一个实施例中，B1是2'‑OMe或2'‑F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'‑OMe，n3是7，4 5 1 2
n是0，B3是2'‑OMe，n是3，B1'是2'‑OMe或2'‑F，q 是9，T1'是2'‑F，q是1，B2'是2'‑OMe或
3 4 5 6
2'‑F，q 是4，T2'是2'‑F，q 是2，B3'是2'‑OMe或2'‑F，q 是5，T3'是2'‑F，q 是1，B4'是2'‑
7
OMe，并且q 是1；在有义链的位置1至5(从有义链的5'端开始计数)内具有两个硫代磷酸酯
核苷酸间键修饰，并且在位置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的
位置18至23(从反义链的5'端开始计数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi药剂还
包括5'‑脱氧‑5'‑C‑丙二酰。
[0463] 在一个实施例中，B1是2'‑OMe或2'‑F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'‑OMe，n3是7，4 5 1 2
n是0，B3是2'OMe，n是3，B1'是2'‑OMe或2'‑F，q 是9，T1'是2'‑F，q 是1，B2'是2'‑OMe或2'‑
3 4 5 6 7
F，q 是4，q是0，B3'是2'‑OMe或2'‑F，q 是7，T3'是2'‑F，q 是1，B4'是2'‑OMe，并且q 是1。
RNAi药剂还包括5'‑P。
[0464] 在一个实施例中，B1是2'‑OMe或2'‑F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'‑OMe，n3是7，4 5 1 2
n是0，B3是2'OMe，n是3，B1'是2'‑OMe或2'‑F，q 是9，T1'是2'‑F，q 是1，B2'是2'‑OMe或2'‑
3 4 5 6 7
F，q 是4，q是0，B3'是2'‑OMe或2'‑F，q 是7，T3'是2'‑F，q 是1，B4'是2'‑OMe，并且q 是1。
dsRNA药剂还包括5'‑PS。
[0465] 在一个实施例中，B1是2'‑OMe或2'‑F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'‑OMe，n3是7，4 5 1 2
n是0，B3是2'OMe，n是3，B1'是2'‑OMe或2'‑F，q 是9，T1'是2'‑F，q 是1，B2'是2'‑OMe或2'‑
3 4 5 6 7
F，q 是4，q是0，B3'是2'‑OMe或2'‑F，q 是7，T3'是2'‑F，q 是1，B4'是2'‑OMe，并且q 是1。
RNAi药剂还包括5'‑VP。5'‑VP可以是5'‑E‑VP、5'‑Z‑VP或其组合。
[0466] 在一个实施例中，B1是2'‑OMe或2'‑F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'‑OMe，n3是7，4 5 1 2
n是0，B3是2'OMe，n是3，B1'是2'‑OMe或2'‑F，q 是9，T1'是2'‑F，q 是1，B2'是2'‑OMe或2'‑
3 4 5 6 7
F，q 是4，q是0，B3'是2'‑OMe或2'‑F，q 是7，T3'是2'‑F，q 是1，B4'是2'‑OMe，并且q 是1。
RNAi药剂还包括5'‑PS2。
[0467] 在一个实施例中，B1是2'‑OMe或2'‑F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'‑OMe，n3是7，4 5 1 2
n是0，B3是2'OMe，n是3，B1'是2'‑OMe或2'‑F，q 是9，T1'是2'‑F，q 是1，B2'是2'‑OMe或2'‑
3 4 5 6 7
F，q 是4，q是0，B3'是2'‑OMe或2'‑F，q 是7，T3'是2'‑F，q 是1，B4'是2'‑OMe，并且q 是1。
RNAi药剂还包括5'‑脱氧‑5'‑C‑丙二酰。
[0468] 在一个实施例中，B1是2'‑OMe或2'‑F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'‑OMe，n3是7，4 5 1 2
n是0，B3是2'‑OMe，n是3，B1'是2'‑OMe或2'‑F，q 是9，T1'是2'‑F，q是1，B2'是2'‑OMe或
3 4 5 6 7
2'‑F，q是4，q是0，B3'是2'‑OMe或2'‑F，q是7，T3'是2'‑F，q是1，B4'是2'‑OMe，并且q 是1；
在有义链的位置1至5(从5'端开始计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在位
置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置18至23(从5'端开始计
数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi药剂还包括5'‑P。
[0469] 在一个实施例中，B1是2'‑OMe或2'‑F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'‑OMe，n3是7，4 5 1 2
n是0，B3是2'‑OMe，n是3，B1'是2'‑OMe或2'‑F，q 是9，T1'是2'‑F，q是1，B2'是2'‑OMe或
3 4 5 6 7
2'‑F，q是4，q是0，B3'是2'‑OMe或2'‑F，q是7，T3'是2'‑F，q是1，B4'是2'‑OMe，并且q 是1；
在有义链的位置1至5(从5'端开始计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在位
置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置18至23(从5'端开始计
数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi药剂还包括5'‑PS。
[0470] 在一个实施例中，B1是2'‑OMe或2'‑F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'‑OMe，n3是7，4 5 1 2
n是0，B3是2'‑OMe，n是3，B1'是2'‑OMe或2'‑F，q 是9，T1'是2'‑F，q是1，B2'是2'‑OMe或
3 4 5 6 7
2'‑F，q是4，q是0，B3'是2'‑OMe或2'‑F，q是7，T3'是2'‑F，q是1，B4'是2'‑OMe，并且q 是1；
在有义链的位置1至5(从5'端开始计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在位
置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置18至23(从5'端开始计
数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi药剂还包括5'‑VP。5'‑VP可以是5'‑E‑VP、
5'‑Z‑VP或其组合。
[0471] 在一个实施例中，B1是2'‑OMe或2'‑F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'‑OMe，n3是7，4 5 1 2
n是0，B3是2'‑OMe，n是3，B1'是2'‑OMe或2'‑F，q 是9，T1'是2'‑F，q是1，B2'是2'‑OMe或
3 4 5 6 7
2'‑F，q是4，q是0，B3'是2'‑OMe或2'‑F，q是7，T3'是2'‑F，q是1，B4'是2'‑OMe，并且q 是1；
在有义链的位置1至5(从5'端开始计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在位
置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置18至23(从5'端开始计
数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi药剂还包括5'‑PS2。
[0472] 在一个实施例中，B1是2'‑OMe或2'‑F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'‑OMe，n3是7，4 5 1 2
n是0，B3是2'‑OMe，n是3，B1'是2'‑OMe或2'‑F，q 是9，T1'是2'‑F，q是1，B2'是2'‑OMe或
3 4 5 6 7
2'‑F，q是4，q是0，B3'是2'‑OMe或2'‑F，q是7，T3'是2'‑F，q是1，B4'是2'‑OMe，并且q 是1；
在有义链的位置1至5(从5'端开始计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在位
置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置18至23(从5'端开始计
数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi药剂还包括5'‑脱氧‑5'‑C‑丙二酰。
[0473] 在一个实施例中，B1是2'‑OMe或2'‑F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'‑OMe，n3是7，4 5 1 2
n是0，B3是2'OMe，n是3，B1'是2'‑OMe或2'‑F，q 是9，T1'是2'‑F，q 是1，B2'是2'‑OMe或2'‑
3 4 5 6
F，q是4，T2'是2'‑F，q 是2'，B3'是2'‑OMe或2'‑F，q是5，T3'是2'‑F，q 是1，B4'是2'‑F，并
7
且q是1。RNAi药剂还包括5'‑P。
[0474] 在一个实施例中，B1是2'‑OMe或2'‑F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'‑OMe，n3是7，4 5 1 2
n是0，B3是2'OMe，n是3，B1'是2'‑OMe或2'‑F，q 是9，T1'是2'‑F，q 是1，B2'是2'‑OMe或2'‑
3 4 5 6
F，q是4，T2'是2'‑F，q 是2'，B3'是2'‑OMe或2'‑F，q是5，T3'是2'‑F，q 是1，B4'是2'‑F，并
7
且q是1。RNAi药剂还包括5'‑PS。
[0475] 在一个实施例中，B1是2'‑OMe或2'‑F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'‑OMe，n3是7，4 5 1 2
n是0，B3是2'OMe，n是3，B1'是2'‑OMe或2'‑F，q 是9，T1'是2'‑F，q 是1，B2'是2'‑OMe或2'‑
3 4 5 6
F，q是4，T2'是2'‑F，q 是2'，B3'是2'‑OMe或2'‑F，q是5，T3'是2'‑F，q 是1，B4'是2'‑F，并
7
且q是1。RNAi药剂还包括5'‑VP。5'‑VP可以是5'‑E‑VP、5'‑Z‑VP或其组合。
[0476] 在一个实施例中，B1是2'‑OMe或2'‑F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'‑OMe，n3是7，4 5 1 2
n是0，B3是2'OMe，n是3，B1'是2'‑OMe或2'‑F，q 是9，T1'是2'‑F，q 是1，B2'是2'‑OMe或2'‑
3 4 5 6
F，q是4，T2'是2'‑F，q 是2'，B3'是2'‑OMe或2'‑F，q是5，T3'是2'‑F，q 是1，B4'是2'‑F，并
7
且q是1。dsRNAi RNA药剂还包括5'‑PS2。
[0477] 在一个实施例中，B1是2'‑OMe或2'‑F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'‑OMe，n3是7，4 5 1 2
n是0，B3是2'OMe，n是3，B1'是2'‑OMe或2'‑F，q 是9，T1'是2'‑F，q 是1，B2'是2'‑OMe或2'‑
3 4 5 6
F，q是4，T2'是2'‑F，q 是2'，B3'是2'‑OMe或2'‑F，q是5，T3'是2'‑F，q 是1，B4'是2'‑F，并
7
且q是1。RNAi药剂还包括5'‑脱氧‑5'‑C‑丙二酰。
[0478] 在一个实施例中，B1是2'‑OMe或2'‑F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'‑OMe，n3是7，4 5 1 2
n是0，B3是2'‑OMe，n是3，B1'是2'‑OMe或2'‑F，q 是9，T1'是2'‑F，q是1，B2'是2'‑OMe或
3 4 5 6
2'‑F，q 是4，T2'是2'‑F，q是2，B3'是2'‑OMe或2'‑F，q 是5，T3'是2'‑F，q 是1，B4'是2'‑F，
7
并且q 是1；在有义链的位置1至5(从有义链的5'端开始计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷
酸间键修饰，并且在位置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置
18至23(从反义链的5'端开始计数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi药剂还包括
5'‑P。
[0479] 在一个实施例中，B1是2'‑OMe或2'‑F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'‑OMe，n3是7，4 5 1 2
n是0，B3是2'‑OMe，n是3，B1'是2'‑OMe或2'‑F，q 是9，T1'是2'‑F，q是1，B2'是2'‑OMe或
3 4 5 6
2'‑F，q 是4，T2'是2'‑F，q是2，B3'是2'‑OMe或2'‑F，q 是5，T3'是2'‑F，q 是1，B4'是2'‑F，
7
并且q 是1；在有义链的位置1至5(从有义链的5'端开始计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷
酸间键修饰，并且在位置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置
18至23(从反义链的5'端开始计数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi药剂还包括
5'‑PS。
[0480] 在一个实施例中，B1是2'‑OMe或2'‑F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'‑OMe，n3是7，4 5 1 2
n是0，B3是2'‑OMe，n是3，B1'是2'‑OMe或2'‑F，q 是9，T1'是2'‑F，q是1，B2'是2'‑OMe或
3 4 5 6
2'‑F，q 是4，T2'是2'‑F，q是2，B3'是2'‑OMe或2'‑F，q 是5，T3'是2'‑F，q 是1，B4'是2'‑F，
7
并且q 是1；在有义链的位置1至5(从有义链的5'端开始计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷
酸间键修饰，并且在位置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置
18至23(从反义链的5'端开始计数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi药剂还包括
5'‑VP。5'‑VP可以是5'‑E‑VP、5'‑Z‑VP或其组合。
[0481] 在一个实施例中，B1是2'‑OMe或2'‑F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'‑OMe，n3是7，4 5 1 2
n是0，B3是2'‑OMe，n是3，B1'是2'‑OMe或2'‑F，q 是9，T1'是2'‑F，q是1，B2'是2'‑OMe或
3 4 5 6
2'‑F，q 是4，T2'是2'‑F，q是2，B3'是2'‑OMe或2'‑F，q 是5，T3'是2'‑F，q 是1，B4'是2'‑F，
7
并且q 是1；在有义链的位置1至5(从有义链的5'端开始计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷
酸间键修饰，并且在位置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置
18至23(从反义链的5'端开始计数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi药剂还包括
5'‑PS2。
[0482] 在一个实施例中，B1是2'‑OMe或2'‑F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'‑OMe，n3是7，4 5 1 2
n是0，B3是2'‑OMe，n是3，B1'是2'‑OMe或2'‑F，q 是9，T1'是2'‑F，q是1，B2'是2'‑OMe或
3 4 5 6
2'‑F，q 是4，T2'是2'‑F，q是2，B3'是2'‑OMe或2'‑F，q 是5，T3'是2'‑F，q 是1，B4'是2'‑F，
7
并且q 是1；在有义链的位置1至5(从有义链的5'端开始计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷
酸间键修饰，并且在位置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置
18至23(从反义链的5'端开始计数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi药剂还包括
5'‑脱氧‑5'‑C‑丙二酰。
[0483] 在一个实施例中，B1是2'‑OMe或2'‑F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'‑OMe，n3是7，4 5 1 2
n是0，B3是2'OMe，n是3，B1'是2'‑OMe或2'‑F，q 是9，T1'是2'‑F，q 是1，B2'是2'‑OMe或2'‑
3 4 5 6 7
F，q是4，q 是0，B3'是2'‑OMe或2'‑F，q是7，T3'是2'‑F，q是1，B4'是2'‑F，并且q是1。RNAi药剂还包括5'‑P。
[0484] 在一个实施例中，B1是2'‑OMe或2'‑F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'‑OMe，n3是7，4 5 1 2
n是0，B3是2'OMe，n是3，B1'是2'‑OMe或2'‑F，q 是9，T1'是2'‑F，q 是1，B2'是2'‑OMe或2'‑
3 4 5 6 7
F，q是4，q 是0，B3'是2'‑OMe或2'‑F，q是7，T3'是2'‑F，q是1，B4'是2'‑F，并且q是1。RNAi药剂还包括5'‑PS。
[0485] 在一个实施例中，B1是2'‑OMe或2'‑F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'‑OMe，n3是7，4 5 1 2
n是0，B3是2'OMe，n是3，B1'是2'‑OMe或2'‑F，q 是9，T1'是2'‑F，q 是1，B2'是2'‑OMe或2'‑
3 4 5 6 7
F，q是4，q 是0，B3'是2'‑OMe或2'‑F，q是7，T3'是2'‑F，q是1，B4'是2'‑F，并且q是1。RNAi药剂还包括5'‑VP。5'‑VP可以是5'‑E‑VP、5'‑Z‑VP或其组合。
[0486] 在一个实施例中，B1是2'‑OMe或2'‑F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'‑OMe，n3是7，4 5 1 2
n是0，B3是2'OMe，n是3，B1'是2'‑OMe或2'‑F，q 是9，T1'是2'‑F，q 是1，B2'是2'‑OMe或2'‑
3 4 5 6 7
F，q是4，q 是0，B3'是2'‑OMe或2'‑F，q是7，T3'是2'‑F，q是1，B4'是2'‑F，并且q是1。RNAi药剂还包括5'‑PS2。
[0487] 在一个实施例中，B1是2'‑OMe或2'‑F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'‑OMe，n3是7，4 5 1 2
n是0，B3是2'OMe，n是3，B1'是2'‑OMe或2'‑F，q 是9，T1'是2'‑F，q 是1，B2'是2'‑OMe或2'‑
3 4 5 6 7
F，q是4，q 是0，B3'是2'‑OMe或2'‑F，q是7，T3'是2'‑F，q是1，B4'是2'‑F，并且q是1。RNAi药剂还包括5'‑脱氧‑5'‑C‑丙二酰。
[0488] 在一个实施例中，B1是2'‑OMe或2'‑F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'‑OMe，n3是7，4 5 1 2
n是0，B3是2'‑OMe，n是3，B1'是2'‑OMe或2'‑F，q 是9，T1'是2'‑F，q是1，B2'是2'‑OMe或
3 4 5 6 7
2'‑F，q是4，q是0，B3'是2'‑OMe或2'‑F，q是7，T3'是2'‑F，q是1，B4'是2'‑F，并且q 是1；在有义链的位置1至5(从有义链的5'端开始计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并
且在位置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置18至23(从反义
链的5'端开始计数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi药剂还包括5'‑P。
[0489] 在一个实施例中，B1是2'‑OMe或2'‑F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'‑OMe，n3是7，4 5 1 2
n是0，B3是2'‑OMe，n是3，B1'是2'‑OMe或2'‑F，q 是9，T1'是2'‑F，q是1，B2'是2'‑OMe或
3 4 5 6 7
2'‑F，q是4，q是0，B3'是2'‑OMe或2'‑F，q是7，T3'是2'‑F，q是1，B4'是2'‑F，并且q 是1；在有义链的位置1至5(从有义链的5'端开始计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并
且在位置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置18至23(从反义
链的5'端开始计数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi药剂还包括5'‑PS。
[0490] 在一个实施例中，B1是2'‑OMe或2'‑F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'‑OMe，n3是7，4 5 1 2
n是0，B3是2'‑OMe，n是3，B1'是2'‑OMe或2'‑F，q 是9，T1'是2'‑F，q是1，B2'是2'‑OMe或
3 4 5 6 7
2'‑F，q是4，q是0，B3'是2'‑OMe或2'‑F，q是7，T3'是2'‑F，q是1，B4'是2'‑F，并且q 是1；在有义链的位置1至5(从有义链的5'端开始计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并
且在位置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置18至23(从反义
链的5'端开始计数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi药剂还包括5'‑VP。5'‑VP可
以是5'‑E‑VP、5'‑Z‑VP或其组合。
[0491] 在一个实施例中，B1是2'‑OMe或2'‑F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'‑OMe，n3是7，4 5 1 2
n是0，B3是2'‑OMe，n是3，B1'是2'‑OMe或2'‑F，q 是9，T1'是2'‑F，q是1，B2'是2'‑OMe或
3 4 5 6 7
2'‑F，q是4，q是0，B3'是2'‑OMe或2'‑F，q是7，T3'是2'‑F，q是1，B4'是2'‑F，并且q 是1；在有义链的位置1至5(从有义链的5'端开始计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并
且在位置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置18至23(从反义
链的5'端开始计数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi药剂还包括5'‑PS2。
[0492] 在一个实施例中，B1是2'‑OMe或2'‑F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'‑OMe，n3是7，4 5 1 2
n是0，B3是2'‑OMe，n是3，B1'是2'‑OMe或2'‑F，q 是9，T1'是2'‑F，q是1，B2'是2'‑OMe或
3 4 5 6 7
2'‑F，q是4，q是0，B3'是2'‑OMe或2'‑F，q是7，T3'是2'‑F，q是1，B4'是2'‑F，并且q 是1；在有义链的位置1至5(从有义链的5'端开始计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并
且在位置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置18至23(从反义
链的5'端开始计数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi药剂还包括5'‑脱氧‑5'‑C‑
丙二酰。
[0493] 在一个实施例中，B1是2'‑OMe或2'‑F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'‑OMe，n3是7，4 5 1 2
n是0，B3是2'‑OMe，n是3，B1'是2'‑OMe或2'‑F，q 是9，T1'是2'‑F，q是1，B2'是2'‑OMe或
3 4 5 6
2'‑F，q 是4，T2'是2'‑F，q 是2，B3'是2'‑OMe或2'‑F，q 是5，T3'是2'‑F，q 是1，B4'是2'‑
7
OMe，并且q 是1；在有义链的位置1至5(从有义链的5'端开始计数)内具有两个硫代磷酸酯
核苷酸间键修饰，并且在位置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的
位置18至23(从反义链的5'端开始计数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi药剂还
包括5'‑P和靶向配体。在一个实施例中，5'‑P位于反义链的5'端处，并且靶向配体位于有义
链的3'端处。
[0494] 在一个实施例中，B1是2'‑OMe或2'‑F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'‑OMe，n3是7，4 5 1 2
n是0，B3是2'‑OMe，n是3，B1'是2'‑OMe或2'‑F，q 是9，T1'是2'‑F，q是1，B2'是2'‑OMe或
3 4 5 6
2'‑F，q 是4，T2'是2'‑F，q 是2，B3'是2'‑OMe或2'‑F，q 是5，T3'是2'‑F，q 是1，B4'是2'‑
7
OMe，并且q 是1；在有义链的位置1至5(从有义链的5'端开始计数)内具有两个硫代磷酸酯
核苷酸间键修饰，并且在位置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的
位置18至23(从反义链的5'端开始计数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi药剂还
包括5'‑PS和靶向配体。在一个实施例中，5'‑PS位于反义链的5'端处，并且靶向配体位于有
义链的3'端处。
[0495] 在一个实施例中，B1是2'‑OMe或2'‑F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'‑OMe，n3是7，4 5 1 2
n是0，B3是2'‑OMe，n是3，B1'是2'‑OMe或2'‑F，q 是9，T1'是2'‑F，q是1，B2'是2'‑OMe或
3 4 5 6
2'‑F，q 是4，T2'是2'‑F，q 是2，B3'是2'‑OMe或2'‑F，q 是5，T3'是2'‑F，q 是1，B4'是2'‑
7
OMe，并且q 是1；在有义链的位置1至5(从有义链的5'端开始计数)内具有两个硫代磷酸酯
核苷酸间键修饰，并且在位置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的
位置18至23(从反义链的5'端开始计数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi药剂还
包括5'‑VP(例如，5'‑E‑VP、5'‑Z‑VP或其组合)以及靶向配体。
[0496] 在一个实施例中，5'‑VP位于反义链的5'端处，并且靶向配体位于有义链的3'端处。
[0497] 在一个实施例中，B1是2'‑OMe或2'‑F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'‑OMe，n3是7，4 5 1 2
n是0，B3是2'‑OMe，n是3，B1'是2'‑OMe或2'‑F，q 是9，T1'是2'‑F，q是1，B2'是2'‑OMe或
3 4 5 6
2'‑F，q 是4，T2'是2'‑F，q 是2，B3'是2'‑OMe或2'‑F，q 是5，T3'是2'‑F，q 是1，B4'是2'‑
7
OMe，并且q 是1；在有义链的位置1至5(从有义链的5'端开始计数)内具有两个硫代磷酸酯
核苷酸间键修饰，并且在位置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的
位置18至23(从反义链的5'端开始计数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi药剂还
包括5'‑PS2和靶向配体。在一个实施例中，5'‑PS2位于反义链的5'端处，并且靶向配体位于
有义链的3'端处。
[0498] 在一个实施例中，B1是2'‑OMe或2'‑F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'‑OMe，n3是7，4 5 1 2
n是0，B3是2'‑OMe，n是3，B1'是2'‑OMe或2'‑F，q 是9，T1'是2'‑F，q是1，B2'是2'‑OMe或
3 4 5 6
2'‑F，q 是4，T2'是2'‑F，q 是2，B3'是2'‑OMe或2'‑F，q 是5，T3'是2'‑F，q 是1，B4'是2'‑
7
OMe，并且q 是1；在有义链的位置1至5(从有义链的5'端开始计数)内具有两个硫代磷酸酯
核苷酸间键修饰，并且在位置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的
位置18至23(从反义链的5'端开始计数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi药剂还
包括5'‑脱氧‑5'‑C‑丙二酰和靶向配体。在一个实施例中，5'‑脱氧‑5'‑C‑丙二酰位于反义链的5'端处，并且靶向配体位于有义链的3'端处。
[0499] 在一个实施例中，B1是2'‑OMe或2'‑F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'‑OMe，n3是7，4 5 1 2
n是0，B3是2'‑OMe，n是3，B1'是2'‑OMe或2'‑F，q 是9，T1'是2'‑F，q是1，B2'是2'‑OMe或
3 4 5 6 7
2'‑F，q是4，q是0，B3'是2'‑OMe或2'‑F，q是7，T3'是2'‑F，q是1，B4'是2'‑OMe，并且q 是1；
在有义链的位置1至5(从5'端开始计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在位
置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置18至23(从5'端开始计
数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi药剂还包括5'‑P和靶向配体。在一个实施例
中，5'‑P位于反义链的5'端处，并且靶向配体位于有义链的3'端处。
[0500] 在一个实施例中，B1是2'‑OMe或2'‑F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'‑OMe，n3是7，4 5 1 2
n是0，B3是2'‑OMe，n是3，B1'是2'‑OMe或2'‑F，q 是9，T1'是2'‑F，q是1，B2'是2'‑OMe或
3 4 5 6 7
2'‑F，q是4，q是0，B3'是2'‑OMe或2'‑F，q是7，T3'是2'‑F，q是1，B4'是2'‑OMe，并且q 是1；
在有义链的位置1至5(从5'端开始计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在位
置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置18至23(从5'端开始计
数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi药剂还包括5'‑PS和靶向配体。在一个实施
例中，5'‑PS位于反义链的5'端处，并且靶向配体位于有义链的3'端处。
[0501] 在一个实施例中，B1是2'‑OMe或2'‑F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'‑OMe，n3是7，4 5 1 2
n是0，B3是2'‑OMe，n是3，B1'是2'‑OMe或2'‑F，q 是9，T1'是2'‑F，q是1，B2'是2'‑OMe或
3 4 5 6 7
2'‑F，q是4，q是0，B3'是2'‑OMe或2'‑F，q是7，T3'是2'‑F，q是1，B4'是2'‑OMe，并且q 是1；
在有义链的位置1至5(从5'端开始计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在位
置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置18至23(从5'端开始计
数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi药剂还包括5'‑VP(例如，5'‑E‑VP、5'‑Z‑VP或其组合)以及靶向配体。在一个实施例中，5'‑VP位于反义链的5'端处，并且靶向配体位于
有义链的3'端处。
[0502] 在一个实施例中，B1是2'‑OMe或2'‑F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'‑OMe，n3是7，4 5 1 2
n是0，B3是2'‑OMe，n是3，B1'是2'‑OMe或2'‑F，q 是9，T1'是2'‑F，q是1，B2'是2'‑OMe或
3 4 5 6 7
2'‑F，q是4，q是0，B3'是2'‑OMe或2'‑F，q是7，T3'是2'‑F，q是1，B4'是2'‑OMe，并且q 是1；
在有义链的位置1至5(从5'端开始计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在位
置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置18至23(从5'端开始计
数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi药剂还包括5'‑PS2和靶向配体。在一个实施
例中，5'‑PS2位于反义链的5'端处，并且靶向配体位于有义链的3'端处。
[0503] 在一个实施例中，B1是2'‑OMe或2'‑F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'‑OMe，n3是7，4 5 1 2
n是0，B3是2'‑OMe，n是3，B1'是2'‑OMe或2'‑F，q 是9，T1'是2'‑F，q是1，B2'是2'‑OMe或
3 4 5 6 7
2'‑F，q是4，q是0，B3'是2'‑OMe或2'‑F，q是7，T3'是2'‑F，q是1，B4'是2'‑OMe，并且q 是1；
在有义链的位置1至5(从5'端开始计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在位
置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置18至23(从5'端开始计
数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi药剂还包括5'‑脱氧‑5'‑C‑丙二酰和靶向配
体。在一个实施例中，5'‑脱氧‑5'‑C‑丙二酰位于反义链的5'端处，并且靶向配体位于有义链的3'端处。
[0504] 在一个实施例中，B1是2'‑OMe或2'‑F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'‑OMe，n3是7，4 5 1 2
n是0，B3是2'‑OMe，n是3，B1'是2'‑OMe或2'‑F，q 是9，T1'是2'‑F，q是1，B2'是2'‑OMe或
3 4 5 6
2'‑F，q 是4，T2'是2'‑F，q是2，B3'是2'‑OMe或2'‑F，q 是5，T3'是2'‑F，q 是1，B4'是2'‑F，
7
并且q 是1；在有义链的位置1至5(从有义链的5'端开始计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷
酸间键修饰，并且在位置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置
18至23(从反义链的5'端开始计数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi药剂还包括
5'‑P和靶向配体。在一个实施例中，5'‑P位于反义链的5'端处，并且靶向配体位于有义链的
3'端处。
[0505] 在一个实施例中，B1是2'‑OMe或2'‑F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'‑OMe，n3是7，4 5 1 2
n是0，B3是2'‑OMe，n是3，B1'是2'‑OMe或2'‑F，q 是9，T1'是2'‑F，q是1，B2'是2'‑OMe或
3 4 5 6
2'‑F，q 是4，T2'是2'‑F，q是2，B3'是2'‑OMe或2'‑F，q 是5，T3'是2'‑F，q 是1，B4'是2'‑F，
7
并且q 是1；在有义链的位置1至5(从有义链的5'端开始计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷
酸间键修饰，并且在位置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置
18至23(从反义链的5'端开始计数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi药剂还包括
5'‑PS和靶向配体。在一个实施例中，5'‑PS位于反义链的5'端处，并且靶向配体位于有义链
的3'端处。
[0506] 在一个实施例中，B1是2'‑OMe或2'‑F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'‑OMe，n3是7，4 5 1 2
n是0，B3是2'‑OMe，n是3，B1'是2'‑OMe或2'‑F，q 是9，T1'是2'‑F，q是1，B2'是2'‑OMe或
3 4 5 6
2'‑F，q 是4，T2'是2'‑F，q是2，B3'是2'‑OMe或2'‑F，q 是5，T3'是2'‑F，q 是1，B4'是2'‑F，
7
并且q 是1；在有义链的位置1至5(从有义链的5'端开始计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷
酸间键修饰，并且在位置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置
18至23(从反义链的5'端开始计数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi药剂还包括
5'‑VP(例如，5'‑E‑VP、5'‑Z‑VP或其组合)以及靶向配体。在一个实施例中，5'‑VP位于反义链的5'端处，并且靶向配体位于有义链的3'端处。
[0507] 在一个实施例中，B1是2'‑OMe或2'‑F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'‑OMe，n3是7，4 5 1 2
n是0，B3是2'‑OMe，n是3，B1'是2'‑OMe或2'‑F，q 是9，T1'是2'‑F，q是1，B2'是2'‑OMe或
3 4 5 6
2'‑F，q 是4，T2'是2'‑F，q是2，B3'是2'‑OMe或2'‑F，q 是5，T3'是2'‑F，q 是1，B4'是2'‑F，
7
并且q 是1；在有义链的位置1至5(从有义链的5'端开始计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷
酸间键修饰，并且在位置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置
18至23(从反义链的5'端开始计数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi药剂还包括
5'‑PS2和靶向配体。在一个实施例中，5'‑PS2位于反义链的5'端处，并且靶向配体位于有义
链的3'端处。
[0508] 在一个实施例中，B1是2'‑OMe或2'‑F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'‑OMe，n3是7，4 5 1 2
n是0，B3是2'‑OMe，n是3，B1'是2'‑OMe或2'‑F，q 是9，T1'是2'‑F，q是1，B2'是2'‑OMe或
3 4 5 6
2'‑F，q 是4，T2'是2'‑F，q是2，B3'是2'‑OMe或2'‑F，q 是5，T3'是2'‑F，q 是1，B4'是2'‑F，
7
并且q 是1；在有义链的位置1至5(从有义链的5'端开始计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷
酸间键修饰，并且在位置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置
18至23(从反义链的5'端开始计数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi药剂还包括
5'‑脱氧‑5'‑C‑丙二酰和靶向配体。在一个实施例中，5'‑脱氧‑5'‑C‑丙二酰位于反义链的
5'端处，并且靶向配体位于有义链的3'端处。
[0509] 在一个实施例中，B1是2'‑OMe或2'‑F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'‑OMe，n3是7，4 5 1 2
n是0，B3是2'‑OMe，n是3，B1'是2'‑OMe或2'‑F，q 是9，T1'是2'‑F，q是1，B2'是2'‑OMe或
3 4 5 6 7
2'‑F，q是4，q是0，B3'是2'‑OMe或2'‑F，q是7，T3'是2'‑F，q是1，B4'是2'‑F，并且q 是1；在有义链的位置1至5(从有义链的5'端开始计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并
且在位置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置18至23(从反义
链的5'端开始计数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi药剂还包括5'‑P和靶向配
体。在一个实施例中，5'‑P位于反义链的5'端处，并且靶向配体位于有义链的3'端处。
[0510] 在一个实施例中，B1是2'‑OMe或2'‑F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'‑OMe，n3是7，4 5 1 2
n是0，B3是2'‑OMe，n是3，B1'是2'‑OMe或2'‑F，q 是9，T1'是2'‑F，q是1，B2'是2'‑OMe或
3 4 5 6 7
2'‑F，q是4，q是0，B3'是2'‑OMe或2'‑F，q是7，T3'是2'‑F，q是1，B4'是2'‑F，并且q 是1；在有义链的位置1至5(从有义链的5'端开始计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并
且在位置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置18至23(从反义
链的5'端开始计数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi药剂还包括5'‑PS和靶向配
体。在一个实施例中，5'‑PS位于反义链的5'端处，并且靶向配体位于有义链的3'端处。
[0511] 在一个实施例中，B1是2'‑OMe或2'‑F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'‑OMe，n3是7，4 5 1 2
n是0，B3是2'‑OMe，n是3，B1'是2'‑OMe或2'‑F，q 是9，T1'是2'‑F，q是1，B2'是2'‑OMe或
3 4 5 6 7
2'‑F，q是4，q是0，B3'是2'‑OMe或2'‑F，q是7，T3'是2'‑F，q是1，B4'是2'‑F，并且q 是1；在有义链的位置1至5(从有义链的5'端开始计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并
且在位置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置18至23(从反义
链的5'端开始计数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi药剂还包括5'‑VP(例如，
5'‑E‑VP、5'‑Z‑VP或其组合)以及靶向配体。在一个实施例中，5'‑VP位于反义链的5'端处，并且靶向配体位于有义链的3'端处。
[0512] 在一个实施例中，B1是2'‑OMe或2'‑F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'‑OMe，n3是7，4 5 1 2
n是0，B3是2'‑OMe，n是3，B1'是2'‑OMe或2'‑F，q 是9，T1'是2'‑F，q是1，B2'是2'‑OMe或
3 4 5 6 7
2'‑F，q是4，q是0，B3'是2'‑OMe或2'‑F，q是7，T3'是2'‑F，q是1，B4'是2'‑F，并且q 是1；在有义链的位置1至5(从有义链的5'端开始计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并
且在位置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置18至23(从反义
链的5'端开始计数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi药剂还包括5'‑PS2和靶向
配体。在一个实施例中，5'‑PS2位于反义链的5'端处，并且靶向配体位于有义链的3'端处。
[0513] 在一个实施例中，B1是2'‑OMe或2'‑F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'‑OMe，n3是7，4 5 1 2
n是0，B3是2'‑OMe，n是3，B1'是2'‑OMe或2'‑F，q 是9，T1'是2'‑F，q是1，B2'是2'‑OMe或
3 4 5 6 7
2'‑F，q是4，q是0，B3'是2'‑OMe或2'‑F，q是7，T3'是2'‑F，q是1，B4'是2'‑F，并且q 是1；在有义链的位置1至5(从有义链的5'端开始计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并
且在位置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置18至23(从反义
链的5'端开始计数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi药剂还包括5'‑脱氧‑5'‑C‑
丙二酰和靶向配体。在一个实施例中，5'‑脱氧‑5'‑C‑丙二酰位于反义链的5'端处，并且靶向配体位于有义链的3'端处。
[0514] 在一个特定实施例中，本发明的RNAi药剂包括：
[0515] (a)有义链，所述有义链具有：
[0516] (i)21个核苷酸的长度；
[0517] (ii)与3'端连接的ASGPR配体，其中所述ASGPR配体包括通过三价支链接头连接的三种GalNAc衍生物；以及
[0518] (iii)位置1、3、5、7、9至11、13、17、19和21处的2'‑F修饰，以及位置2、4、6、8、12、14至16、18和20处的2'‑OMe修饰(从5'端开始计数)；
[0519] 以及
[0520] (b)反义链，所述反义链具有：
[0521] (i)23个核苷酸的长度；
[0522] (ii)位置1、3、5、9、11至13、15、17、19、21和23处的2'‑OMe修饰，以及位置2、4、6至8、10、14、16、18、20和22处的2'F修饰(从5'端开始计数)；以及
[0523] (iii)核苷酸位置21与22之间以及核苷酸位置22与23之间的硫代磷酸酯核苷酸间键(从5'端开始计数)；
[0524] 其中dsRNA药剂在反义链的3'端处具有两个核苷酸突出端，并且在反义链的5'端处具有钝端。
[0525] 在另一个特定实施例中，本发明的RNAi药剂包括：
[0526] (a)有义链，所述有义链具有：
[0527] (i)21个核苷酸的长度；
[0528] (ii)与3'端连接的ASGPR配体，其中所述ASGPR配体包括通过三价支链接头连接的三种GalNAc衍生物；
[0529] (iii)位置1、3、5、7、9至11，13、15、17、19和21处的2'‑F修饰，以及位置2、4、6、8、12、14、16、18和20处的2'‑OMe修饰(从5'端开始计数)；以及
[0530] (iv)核苷酸位置1与2之间以及核苷酸位置2与3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键(从5'端开始计数)；
[0531] 以及
[0532] (b)反义链，所述反义链具有：
[0533] (i)23个核苷酸的长度；
[0534] (ii)位置1、3、5、7、9、11至13、15、17、19以及21至23处的2'‑OMe修饰，以及位置2、4、6、8、10、14、16、18和20处的2'F修饰(从5'端开始计数)；以及
[0535] (iii)核苷酸位置1与2之间、核苷酸位置2与3之间、核苷酸位置21与22之间以及核苷酸位置22与23之间的硫代磷酸酯核苷酸间键(从5'端开始计数)；
[0536] 其中RNAi药剂在反义链的3'端处具有两个核苷酸突出端，并且在反义链的5'端处具有钝端。
[0537] 在另一个特定实施例中，本发明的RNAi药剂包括：
[0538] (a)有义链，所述有义链具有：
[0539] (i)21个核苷酸的长度；
[0540] (ii)与3'端连接的ASGPR配体，其中所述ASGPR配体包括通过三价支链接头连接的三种GalNAc衍生物；
[0541] (iii)位置1至6、8、10以及12至21处的2'‑OMe修饰，位置7和9处的2'‑F修饰，以及位置11处的脱氧核苷酸(例如，dT)(从5'端开始计数)；以及
[0542] (iv)核苷酸位置1与2之间以及核苷酸位置2与3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键(从5'端开始计数)；
[0543] 以及
[0544] (b)反义链，所述反义链具有：
[0545] (i)23个核苷酸的长度；
[0546] (ii)位置1、3、7、9、11、13、15、17以及19至23处的2'‑OMe修饰，以及位置2、4至6、8、10、12、14、16和18处的2'‑F修饰(从5'端开始计数)；以及
[0547] (iii)核苷酸位置1和2之间、核苷酸位置2和3之间、核苷酸位置21和22之间以及核苷酸位置22和23之间的硫代磷酸酯核苷酸间键(从5'端开始计数)；
[0548] 其中RNAi药剂在反义链的3'端处具有两个核苷酸突出端，并且在反义链的5'端处具有钝端。
[0549] 在另一个特定实施例中，本发明的RNAi药剂包括：
[0550] (a)有义链，所述有义链具有：
[0551] (i)21个核苷酸的长度；
[0552] (ii)与3'端连接的ASGPR配体，其中所述ASGPR配体包括通过三价支链接头连接的三种GalNAc衍生物；
[0553] (iii)位置1至6、8、10、12、14以及16至21处的2'‑OMe修饰，以及位置7、9、11、13和15处的2'‑F修饰；以及
[0554] (iv)核苷酸位置1与2之间以及核苷酸位置2与3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键(从5'端开始计数)；
[0555] 以及
[0556] (b)反义链，所述反义链具有：
[0557] (i)23个核苷酸的长度；
[0558] (ii)位置1、5、7、9、11、13、15、17、19以及21至23处的2'‑OMe修饰，以及位置2至4、6、8、10、12、14、16、18和20处的2'‑F修饰(从5'端开始计数)；以及
[0559] (iii)核苷酸位置1与2之间、核苷酸位置2与3之间、核苷酸位置21与22之间以及核苷酸位置22与23之间的硫代磷酸酯核苷酸间键(从5'端开始计数)；
[0560] 其中RNAi药剂在反义链的3'端处具有两个核苷酸突出端，并且在反义链的5'端处具有钝端。
[0561] 在另一个特定实施例中，本发明的RNAi药剂包括：
[0562] (a)有义链，所述有义链具有：
[0563] (i)21个核苷酸的长度；
[0564] (ii)与3'端连接的ASGPR配体，其中所述ASGPR配体包括通过三价支链接头连接的三种GalNAc衍生物；
[0565] (iii)位置1至9和12至21处的2'‑OMe修饰，以及位置10和11处的2'‑F修饰；以及
[0566] (iv)核苷酸位置1与2之间以及核苷酸位置2与3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键(从5'端开始计数)；
[0567] 以及
[0568] (b)反义链，所述反义链具有：
[0569] (i)23个核苷酸的长度；
[0570] (ii)位置1、3、5、7、9、11至13、15、17、19以及21至23处的2'‑OMe修饰，以及位置2、4、6、8、10、14、16、18和20处的2'‑F修饰(从5'端开始计数)；以及
[0571] (iii)核苷酸位置1与2之间、核苷酸位置2与3之间、核苷酸位置21与22之间以及核苷酸位置22与23之间的硫代磷酸酯核苷酸间键(从5'端开始计数)；
[0572] 其中RNAi药剂在反义链的3'端处具有两个核苷酸突出端，并且在反义链的5'端处具有钝端。
[0573] 在另一个特定实施例中，本发明的RNAi药剂包括：
[0574] (a)有义链，所述有义链具有：
[0575] (i)21个核苷酸的长度；
[0576] (ii)与3'端连接的ASGPR配体，其中所述ASGPR配体包括通过三价支链接头连接的三种GalNAc衍生物；
[0577] (iii)位置1、3、5、7、9至11和13处的2'‑F修饰，以及位置2、4、6、8、12以及14至21处的2'‑OMe修饰；以及
[0578] (iv)核苷酸位置1与2之间以及核苷酸位置2与3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键(从5'端开始计数)；
[0579] 以及
[0580] (b)反义链，所述反义链具有：
[0581] (i)23个核苷酸的长度；
[0582] (ii)位置1、3、5至7、9、11至13、15、17至19以及21至23处的2'‑OMe修饰，以及位置2、4、8、10、14、16和20处的2'‑F修饰(从5'端开始计数)；以及
[0583] (iii)核苷酸位置1与2之间、核苷酸位置2与3之间、核苷酸位置21与22之间以及核苷酸位置22与23之间的硫代磷酸酯核苷酸间键(从5'端开始计数)；
[0584] 其中RNAi药剂在反义链的3'端处具有两个核苷酸突出端，并且在反义链的5'端处具有钝端。
[0585] 在另一个特定实施例中，本发明的RNAi药剂包括：
[0586] (a)有义链，所述有义链具有：
[0587] (i)21个核苷酸的长度；
[0588] (ii)与3'端连接的ASGPR配体，其中所述ASGPR配体包括通过三价支链接头连接的三种GalNAc衍生物；
[0589] (iii)位置1、2、4、6、8、12、14、15、17以及19至21处的2'‑OMe修饰，以及位置3、5、7、9至11、13、16和18处的2'‑F修饰；以及
[0590] (iv)核苷酸位置1与2之间以及核苷酸位置2与3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键(从5'端开始计数)；
[0591] 以及
[0592] (b)反义链，所述反义链具有：
[0593] (i)25个核苷酸的长度；
[0594] (ii)位置1、4、6、7、9、11至13、15、17以及19至23处的2'‑OMe修饰、位置2、3、5、8、10、14、16和18处的2'‑F修饰，以及位置24和25处的脱氧核苷酸(例如，dT)(从5'端开始计
数)；以及
[0595] (iii)核苷酸位置1与2之间、核苷酸位置2与3之间、核苷酸位置21与22之间以及核苷酸位置22与23之间的硫代磷酸酯核苷酸间键(从5'端开始计数)；
[0596] 其中RNAi药剂在反义链的3'端处具有四个核苷酸突出端，并且在反义链的5'端处具有钝端。
[0597] 在另一个特定实施例中，本发明的RNAi药剂包括：
[0598] (a)有义链，所述有义链具有：
[0599] (i)21个核苷酸的长度；
[0600] (ii)与3'端连接的ASGPR配体，其中所述ASGPR配体包括通过三价支链接头连接的三种GalNAc衍生物；
[0601] (iii)位置1至6、8和12至21处的2'‑OMe修饰，以及位置7和9至11处的2'‑F修饰；以及
[0602] (iv)核苷酸位置1与2之间以及核苷酸位置2与3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键(从5'端开始计数)；
[0603] 以及
[0604] (b)反义链，所述反义链具有：
[0605] (i)23个核苷酸的长度；
[0606] (ii)位置1、3至5、7、8、10至13、15以及17至23处的2'‑OMe修饰，以及位置2、6、9、14和16处的2'‑F修饰(从5'端开始计数)；以及
[0607] (iii)核苷酸位置1与2之间、核苷酸位置2与3之间、核苷酸位置21与22之间以及核苷酸位置22与23之间的硫代磷酸酯核苷酸间键(从5'端开始计数)；
[0608] 其中RNAi药剂在反义链的3'端处具有两个核苷酸突出端，并且在反义链的5'端处具有钝端。
[0609] 在另一个特定实施例中，本发明的RNAi药剂包括：
[0610] (a)有义链，所述有义链具有：
[0611] (i)21个核苷酸的长度；
[0612] (ii)与3'端连接的ASGPR配体，其中所述ASGPR配体包括通过三价支链接头连接的三种GalNAc衍生物；
[0613] (iii)位置1至6、8和12至21处的2'‑OMe修饰，以及位置7和9至11处的2'‑F修饰；以及
[0614] (iv)核苷酸位置1与2之间以及核苷酸位置2与3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键(从5'端开始计数)；
[0615] 以及
[0616] (b)反义链，所述反义链具有：
[0617] (i)23个核苷酸的长度；
[0618] (ii)位置1、3至5、7、10至13、15以及17至23处的2'‑OMe修饰，以及位置2、6、8、9、14和16处的2'‑F修饰(从5'端开始计数)；以及
[0619] (iii)核苷酸位置1与2之间、核苷酸位置2与3之间、核苷酸位置21与22之间以及核苷酸位置22与23之间的硫代磷酸酯核苷酸间键(从5'端开始计数)；
[0620] 其中RNAi药剂在反义链的3'端处具有两个核苷酸突出端，并且在反义链的5'端处具有钝端。
[0621] 在另一个特定实施例中，本发明的RNAi药剂包括：
[0622] (a)有义链，所述有义链具有：
[0623] (i)19个核苷酸的长度；
[0624] (ii)与3'端连接的ASGPR配体，其中所述ASGPR配体包括通过三价支链接头连接的三种GalNAc衍生物；
[0625] (iii)位置1至4、6和10至19处的2'‑OMe修饰，以及位置5和7至9处的2'‑F修饰；以及
[0626] (iv)核苷酸位置1与2之间以及核苷酸位置2与3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键(从5'端开始计数)；
[0627] 以及
[0628] (b)反义链，所述反义链具有：
[0629] (i)21个核苷酸的长度；
[0630] (ii)位置1、3至5、7、10至13、15以及17至21处的2'‑OMe修饰，以及位置2、6、8、9、14和16处的2'‑F修饰(从5'端开始计数)；以及
[0631] (iii)核苷酸位置1和2之间、核苷酸位置2和3之间、核苷酸位置19和20之间以及核苷酸位置20和21之间的硫代磷酸酯核苷酸间键(从5'端开始计数)；
[0632] 其中RNAi药剂在反义链的3'端处具有两个核苷酸突出端，并且在反义链的5'端处具有钝端。
[0633] 在某些实施例中，用于本发明的方法的iRNA是选自表2、3、5、6和8‑13中的任一者中列出的药剂的药剂。这些药剂可以进一步包括配体。
[0634] IV.与配体缀合的iRNA
[0635] 本发明的iRNA的RNA的另一种修饰涉及将一种或多种配体、部分或缀合物与iRNA化学连接，所述一种或多种配体、部分或缀合物增强iRNA的活性、细胞分布或细胞摄取(例
如，进入细胞)。此类部分包含但不限于脂质部分，如胆固醇部分(Letsinger等人《, 美国国
家科学院院刊(Proc.Natl.Acid.Sci.USA)》,1989,86:6553‑6556)。在其它实施例中，配体
是胆酸(Manoharan等人《, 生物有机与药物化学快报(Biorg.Med.Chem.Let.)》,1994,4:
1053‑1060)、硫醚，例如绿柱石‑S‑三苯甲基硫醇(Manoharan等人《, 纽约科学院年鉴
(Ann.N.Y.Acad.Sci.)》,1992,660:306‑309；Manoharan等人《, 生物有机与药物化学快报
(Biorg.Med.Chem.Let.)》,1993,3:2765‑2770)、硫代胆固醇(Oberhauser等人《, 核酸研究
(Nucl.Acids Res.)》,1992,20:533‑538)、脂肪族链，例如十二烷二醇或十一烷基残基
(Saison‑Behmoaras等人《, 欧洲分子生物学组织杂志(EMBO J)》,1991,10:1111‑1118；
Kabanov等人《, FEBS快报(FEBS Lett.)》,1990,259:327‑330；Svinarchuk等人《, 生物化学(Biochimie)》,1993,75:49‑54)、磷脂，例如二‑十六烷基‑rac‑甘油或三乙基‑铵1,2‑二‑O‑十六烷基‑rac‑甘油‑3‑膦酸酯(Manoharan等人《, 四面体快报(Tetrahedron Lett.)》,
1995,36:3651‑3654；Shea等人《, 核酸研究(Nucl.Acids Res.)》,1990,18:3777‑3783)、多胺或聚乙二醇链(Manoharan等人《, 核苷与核苷酸(Nucleosides&Nucleotides)》,1995,14:
969‑973)、或金刚烷乙酸(Manoharan等人《, 四面体快报(Tetrahedron Lett.)》,1995,36:
3651‑3654)、棕榈基部分(Mishra等人 ,《生物化学与生物物理学报
(Biochim.Biophys.Acta)》,1995,1264:229‑237)、或十八胺或己基氨基‑羰基氧基胆固醇
部分(Crooke等人《, 药理和实验治疗学杂志(J.Pharmacol.Exp.Ther.)》,1996,277:923‑
937)。
[0636] 在某些实施例中，配体改变其掺入的iRNA药剂的分布、靶向或寿命。在一些实施例中，例如与不存在此类配体的物种相比，配体为所选靶标(例如，分子、细胞或细胞类型)、区
室(例如，细胞或器官区室、组织、器官或身体部位)提供增强的亲和力。在一些实施例中，配
体不参与双链体核酸中的双链体配对。
[0637] 配体可以包含天然存在的物质，如蛋白质(例如，人血清白蛋白(HSA)、低密度脂蛋白(LDL)或球蛋白)；碳水化合物(例如，葡聚糖、支链淀粉、几丁质、壳聚糖、菊粉、环糊精、N‑乙酰氨基葡萄糖、N‑乙酰基半乳糖胺或透明质酸)；或脂质。配体也可以是重组分子或合成
分子，如合成聚合物，例如合成聚氨基酸。聚氨基酸的实例包含聚氨基酸，即聚赖氨酸
(PLL)、聚L‑天冬氨酸、聚L‑谷氨酸、苯乙烯‑马来酸酐共聚物、聚(L‑丙交酯‑共‑乙交酯)共聚物、二乙烯基醚‑马来酸酐共聚物、N‑(2‑羟丙基)甲基丙烯酰胺共聚物(HMPA)、聚乙二醇
(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚氨酯、聚(2‑乙基丙烯酸)、N‑异丙基丙烯酰胺聚合物或聚膦嗪。多胺的实例包含：聚乙烯亚胺、聚赖氨酸(PLL)、精胺、亚精胺、多胺、假肽‑多胺、拟肽多胺、树枝状多胺、精氨酸、脒、鱼精蛋白、阳离子脂质、阳离子卟啉、多胺的季盐或α螺旋肽。
[0638] 配体还可以包含靶向基团，例如细胞或组织靶向剂，例如凝集素、糖蛋白、脂质或蛋白质，例如与特定细胞类型(如肾细胞)结合的抗体。靶向基团可以是促甲状腺素、促黑
素、凝集素、糖蛋白、表面活性剂蛋白A、粘蛋白碳水化合物、多价乳糖、多价半乳糖、N‑乙酰基‑半乳糖胺、N‑乙酰基‑葡糖胺多价甘露糖、多价岩藻糖、糖基化多氨基酸、多价半乳糖、转铁蛋白、双膦酸酯、聚谷氨酸酯、聚天冬氨酸酯、脂质、胆固醇、类固醇、胆汁酸、叶酸、维生素B12、维生素A、生物素或RGD肽或RGD肽模拟物。在某些实施例中，配体是多价半乳糖，例如，
N‑乙酰基‑半乳糖胺。
[0639] 配体的其它实例包含染料、嵌入剂(例如，吖啶)、交联剂(例如，补骨脂烯、丝裂霉素C(mitomycin C))、卟啉(TPPC4、德克萨斯卟啉(texaphyrin)、扩环卟啉(Sapphyrin))、多
环芳香族烃(例如，吩嗪、二氢吩嗪)、人工核酸内切酶(例如，EDTA)、亲脂性分子(例如，胆固醇、胆酸、金刚烷乙酸、1‑芘丁酸、二氢睾酮、1,3‑双‑O(十六烷基)甘油、香叶基氧基己基、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1,3‑丙二醇、十七烷基、棕榈酸、肉豆蔻酸、O3‑(油酰基)石胆酸、O3‑(油酰基)胆烯酸、二甲氧基三苯甲基或吩噁嗪)、肽缀合物(例如，触角足突变肽、Tat
肽)、烷化剂、磷酸盐、氨基、巯基、PEG(例如，PEG‑40K)、MPEG、[MPEG]2、聚氨基、烷基、经取代的烷基、放射性标记的标志物、酶、半抗原(例如，生物素)、转运/吸收促进剂(例如，阿司匹
林(aspirin)、维生素E、叶酸)、合成核糖核酸酶(例如，咪唑、双咪唑、组胺、咪唑簇、吖啶‑咪唑缀合物、四氮杂大环化合物的Eu3+络合物)、二硝基苯基、HRP或AP。
[0640] 配体可以是蛋白质(例如，糖蛋白)或肽(例如，对共配体具有特异性亲和力的分子)或抗体(例如，与特定细胞类型，如肝细胞结合的抗体)。配体还可以包含激素和激素受
体。配体还可以包含非肽物质，如脂质、凝集素、碳水化合物、维生素、辅因子、多价乳糖、多价半乳糖、N‑乙酰基‑半乳糖胺、N‑乙酰基‑葡糖胺多价甘露糖或多价岩藻糖。配体可以是例如脂多糖、p38 MAP激酶的激活剂或NF‑κB的激活剂。
[0641] 配体可以是物质，例如药物，其可以例如通过破坏细胞的细胞骨架，例如通过破坏细胞的微管、微丝或中间丝来增加iRNA药剂摄取到细胞中。药物可以是例如紫杉醇
(taxol)、长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、细胞松弛素(cytochalasin)、诺
考达唑(nocodazole)、杰斯内酯(japlakinolide)、拉春库林A(latrunculin A)、毒伞素
(phalloidin)、斯文赫利A(swinholide A)、印丹诺辛(indanocine)或麦司文(myoservin)。
[0642] 在一些实施例中，与如本文所描述的iRNA连接的配体充当药代动力学调节剂(PK调节剂)。PK调节剂包含亲脂性物质、胆汁酸、类固醇、磷脂类似物、肽、蛋白质结合剂、PEG、维生素等。示例性PK调节剂包含但不限于胆固醇、脂肪酸、胆酸、石胆酸、二烷基甘油酯、二
酰基甘油酯、磷脂、鞘脂、萘普生(naproxen)、布洛芬(ibuprofen)、维生素E、生物素。还已知包括许多硫代磷酸酯键的与血清蛋白结合的寡核苷酸，因此在主链中包括多个硫代磷酸酯
键的短寡核苷酸(例如，具有约5个碱基、10个碱基、15个碱基或20个碱基的寡核苷酸)也适
于本发明作为配体(例如，作为PK调节配体)。另外，与血清组分(例如，血清蛋白)结合的适
体也适于用作本文所述的实施例中的PK调节配体。
[0643] 本发明的配体缀合的iRNA可以通过使用具有侧反应功能的寡核苷酸来合成，如源自连接分子连接到寡核苷酸上的寡核苷酸(如下文所描述的)。这种反应性寡核苷酸可以直
接与可商购获得的配体、合成的带有多种保护基团中的任一种的配体、或具有与其连接的
连接部分的配体反应。
[0644] 本发明的缀合物中使用的寡核苷酸可以通过众所周知的固相合成技术方便且常规地制备。用于此类合成的设备由若干个供应商销售，例如，包含Applied
(加利福尼亚州福斯特市(Foster City,Calif.))。可以另外或可替代地采用本领域已知的
用于此类合成的任何其它方法。使用类似技术来制备其它寡核苷酸(如硫代磷酸酯和烷基
化的衍生物)也是已知的。
[0645] 在本发明的配体缀合的iRNA和带有序列特异性连接的核苷的配体分子中，寡核苷酸和寡核苷可以利用标准核苷酸或核苷前体或已经带有连接部分的核苷酸或核苷缀合物
前体、已经带有配体分子的配体‑核苷酸或核苷缀合物前体或带有构建块的非核苷配体组
装在合适的DNA合成器上。
[0646] 当使用已经带有连接部分的核苷酸缀合物前体时，通常完成序列特异性连接核苷的合成，并且然后配体分子与连接部分反应以形成配体缀合的寡核苷酸。在一些实施例中，
本发明的寡核苷酸或连接的核苷通过自动合成器合成，使用源自配体‑核苷缀合物的磷脒
以及可商购获得的和常规用于寡核苷酸合成的标准磷脒和非标准磷酰胺。
[0647] A.脂质缀合物
[0648] 在某些实施例中，配体或缀合物是脂质或基于脂质的分子。此类脂质或基于脂质的分子可以与血清蛋白，例如人血清白蛋白(HSA)结合。HSA结合配体允许缀合物分布到靶
组织，例如身体的非肾靶组织。例如，靶组织可以是肝，包含肝的实质细胞。可以与HSA结合
的其它分子也可以用作配体。例如，可以使用萘普生或阿司匹林。脂质或基于脂质的配体可
以(a)增加对缀合物降解的抗性，(b)增加靶向或转运到靶细胞或细胞膜中，或(c)可以用于
调节与血清蛋白，例如HSA的结合HSA。
[0649] 基于脂质的配体可以用于抑制(例如，控制)缀合物与靶组织的结合。例如，更强地与HSA结合的脂质或基于脂质的配体将较不可能被靶向到肾脏，并且因此较不可能从身体
清除。较不强烈地与HSA结合的脂质或基于脂质的配体可以用于将缀合物靶向到肾脏。
[0650] 在某些实施例中，基于脂质的配体与HSA结合。在一些实施例中，其以足够的亲和力与HSA结合，使得缀合物将分布到非肾组织。然而，优选的是亲和力不要强到HSA配体结合
不能被逆转。
[0651] 在其它实施例中，基于脂质的配体微弱地或根本不与HSA结合，使得缀合物将分布到肾脏。靶向到肾细胞的其它部分也可以代替基于脂质的配体或除其之外使用。
[0652] 另一方面，配体是被靶细胞(例如，增殖细胞)摄取的部分，例如维生素。这些对于治疗以不期望的细胞增殖为特征的疾病特别有用，例如恶性或非恶性类型的疾病，例如癌
细胞。示例性维生素包含维生素A、E和K。包含的其它示例性维生素是B族维生素，例如叶酸、
B12、核黄素、生物素、吡哆醛或被靶细胞(如肝细胞)摄取的其它维生素或营养素。还包含
HSA和低密度脂蛋白(LDL)。
[0653] B.细胞渗透剂
[0654] 另一方面，配体是细胞渗透剂，如螺旋细胞渗透剂。在一些实施例中，药剂为两亲性的。示例性药剂为肽，如tat或触角足突变肽。如果药剂为肽，那么其可以被修饰，包含肽
基模拟物、反演体、非肽或假肽键和使用D‑氨基酸。在一些实施例中，螺旋试为α螺旋剂，其具有亲脂性和疏脂性相。
[0655] 配体可以是肽或肽模拟物。肽模拟物(在本文中也称为寡肽模拟物)是能够折叠成类似于天然肽的所定义三维结构的分子。肽和肽模拟物与iRNA药剂的连接可能影响iRNA的
药代动力学分布，如通过增强细胞识别和吸收。肽或肽模拟物部分的长度可以为约5个至50
个氨基酸，例如约5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个或50个氨基酸长。
[0656] 肽或肽模拟物可以是例如细胞渗透肽、阳离子肽、两亲性肽或疏水肽(例如，主要由Tyr、Trp或Phe组成)。肽部分可以是树状体肽、约束肽或交联肽。在另一个替代方案中，肽
部分可以包含疏水性膜易位序列(MTS)。示例性疏水性含MTS肽是具有氨基酸序列
AAVALLPAVLLALLAP(SEQ ID NO:14)的RFGF。含疏水性MTS的RFGF类似物(例如，氨基酸序列
AALLPVLLAAP(SEQ ID NO:15))也可以是靶向部分。肽部分可以是“递送”肽，所述肽可以携
带包含肽、寡核苷酸和蛋白质在内的大极性分子穿过细胞膜。例如，已发现来自HIV Tat蛋
白(GRKKRRQRRRPPQ(SEQ ID NO:16)和果蝇触角足突变蛋白(RQIKIWFQNRRMKWKK(SEQ ID 
NO:17))的序列能够充当递送肽。肽或肽模拟物可以由DNA的随机序列编码，如从噬菌体展
示文库或一珠一化合物(OBOC)组合文库中标识的肽(Lam等人《, 自然(Nature)》,354:82‑
84,1991)。为了细胞靶向目的，经由掺入的单体单元与dsRNA药剂系链的肽或肽模拟物的实
例是精氨酸‑甘氨酸‑天冬氨酸(RGD)‑肽或RGD模拟物。肽部分的长度可以在约5个氨基酸至
约40个氨基酸的范围内。肽部分可以具有结构修饰，如增加稳定性或直接构象特性。可以使
用下面描述的任何结构修饰。
[0657] 用于本发明的组合物和方法的RGD肽可以是线性或环状的，并且可以被修饰，例如糖基化或甲基化，以促进靶向特定组织。含有RGD的肽和肽二聚体可以包含D‑氨基酸以及合
成的RGD模拟物。除了RGD，还可以使用靶向整合素配体的其它部分，例如PECAM‑1或VEGF。
[0658] “细胞渗透肽”能够渗透细胞，例如微生物细胞(如细菌或真菌细胞)或哺乳动物细胞(如人细胞)。微生物细胞渗透肽可以是例如α‑螺旋线性肽(例如，LL‑37或Ceropin P1)、
含二硫键的肽(例如，α‑防御素、β‑防御素或细菌素)或仅含有一个或两个主要氨基酸的肽
(例如，PR‑39或吲哚西丁(indolicidin))。细胞渗透肽还可以包含核定位信号(NLS)。例如，
细胞渗透肽可以是二分两亲性肽，如MPG，其源自HIV‑1gp41的融合肽结构域和SV40大T抗原
的NLS(Simeoni等人《, 核酸研究(Nucl.Acids Res.)》31:2717‑2724,2003)。
[0659] C.碳水化合物缀合物
[0660] 在本发明的组合物和方法的一些实施例中，iRNA进一步包括碳水化合物。碳水化合物缀合的iRNA对于核酸的体内递送以及适于如本文所描述的体内治疗用途的组合物而
言是有利的。如本文所使用的，“碳水化合物”是指化合物，所述化合物是碳水化合物，所述
碳水化合物本身由一个或多个单糖单元构成，所述单糖单元具有至少6个碳原子(可以是直
链、支链或环状)，其中氧、氮或硫原子与每个碳原子结合；或是具有碳水化合物部分作为其
部分的化合物，所述碳水化合物部分由一个或多个单糖单元构成，每个单糖单元具有至少
六个碳原子(可以是直链、支链或环状)，其中氧、氮或硫原子与每个碳原子结合。代表性碳
水化合物包含糖(单糖、二糖、三糖和含有约4个、5个、6个、7个、8个或9个单糖单元的寡糖)
和多糖如淀粉、糖原、纤维素和多糖胶。特定单糖包含C5及以上(例如，C5、C6、C7或C8)糖；二糖和三糖包含具有两个或三个单糖单元(例如，C5、C6、C7或C8)的糖。
[0661] 在某些实施例中，用于本发明的组合物和方法的碳水化合物缀合物是单糖。
[0662] 在某些实施例中，单糖是N‑乙酰基半乳糖胺(GalNAc)。包括一种或多种N‑乙酰基半乳糖胺(GalNAc)衍生物的GalNAc缀合物在例如US 8,106,022中进行了描述，所述文献的
完整内容特此通过引用的方式并入本文。在一些实施例中，GalNAc缀合物用作将iRNA靶向
特定细胞的配体。在一些实施例中，GalNAc缀合物将iRNA靶向肝细胞，例如，通过充当肝细
胞(例如，肝细胞(hepatocyte))的去唾液酸糖蛋白受体的配体。
[0663] 在一些实施例中，碳水化合物缀合物包括一种或多种GalNAc衍生物。GalNAc衍生物可以通过接头连接，例如二价或三价支链接头。在一些实施例中，GalNAc缀合物与有义链
的3'端缀合。在一些实施例中，GalNAc缀合物通过接头，例如本文所描述的接头与iRNA药剂
缀合(例如，与有义链的3'端)。在一些实施例中，GalNAc缀合物与有义链的5'端缀合。在一
些实施例中，GalNAc缀合物通过接头，例如本文所描述的接头与iRNA药剂缀合(例如，与有
义链的5'端)。
[0664] 在本发明的某些实施例中，GalNAc或GalNAc衍生物通过单价接头与本发明的iRNA药剂连接。在一些实施例中，GalNAc或GalNAc衍生物通过二价接头与本发明的iRNA药剂连
接。在本发明的又其它实施例中，GalNAc或GalNAc衍生物通过三价接头与本发明的iRNA药
剂连接。在本发明的其它实施例中，GalNAc或GalNAc衍生物通过四价接头与本发明的iRNA
药剂连接。
[0665] 在某些实施例中，本发明的双链RNAi药剂包括与iRNA药剂连接的一种GalNAc或GalNAc衍生物。在某些实施例中，本发明的双链RNAi药剂包括多个(例如，2个、3个、4个、5个或6个)GalNAc或GalNAc衍生物，每个所述衍生物通过多个单价接头独立地与双链RNAi药剂
的多个核苷酸连接。
[0666] 在一些实施例中，例如，当本发明的iRNA药剂的两条链是一个较大分子的一部分时，所述较大分子由一条链的3'端和相应的另一条链的5'端之间的不间断核苷酸链连接，
形成包括多个未配对核苷酸的发夹环，发夹环内的每个未配对核苷酸可以独立地包括通过
单价接头连接的GalNAc或GalNAc衍生物。发夹环也可以由双链体的一条链中的延伸突出端
形成。
[0667] 在一些实施例中，例如，当本发明的iRNA药剂的两条链是一个较大分子的一部分时，所述较大分子由一条链的3'端和相应的另一条链的5'端之间的不间断核苷酸链连接，
形成包括多个未配对核苷酸的发夹环，发夹环内的每个未配对核苷酸可以独立地包括通过
单价接头连接的GalNAc或GalNAc衍生物。发夹环也可以由双链体的一条链中的延伸突出端
形成。
[0668] 在一个实施例中，用于本发明的组合物和方法的碳水化合物缀合物选自由以下组成的组：
[0669]
[0670]
[0671]
[0672]
[0673]
[0674] 其中Y是O或S，并且n是3至6(式XXIV)；
[0675] 其中Y是O或S，并且n是3至6(式XXV)；
[0676]
[0677] 其中X是O或S(式XXVII)；
[0678]
[0679]
[0680] 以及
[0681]
[0682]
[0683] 式XXXIV。
[0684] 在另一个实施例中，用于本发明的组合物和方法的碳水化合物缀合物是单糖。在一个实施例中，单糖是N‑乙酰基半乳糖胺，如
[0685]
[0686] 在一些实施例中，RNAi药剂通过接头与碳水化合物缀合物连接，如以下示意图所示，其中X是O或S
[0687]
[0688] 在一些实施例中，RNAi药剂与如表1中定义的L96缀合，并且如下所示：
[0689]
[0690] 用于本文所描述的实施例中的另一代表性碳水化合物缀合物包含但不限于：
[0691]
[0692] (式XXXVI)，当X或Y中的一个是寡核苷酸时，另一个是氢。
[0693] 在一些实施例中，合适的配体是WO 2019/055633中公开的配体，所述文献的全部内容通过引用并入本文。在一个实施例中，配体包括以下结构：
[0694]
[0695] 在本发明的某些实施例中，GalNAc或GalNAc衍生物通过单价接头与本发明的iRNA药剂连接。在一些实施例中，GalNAc或GalNAc衍生物通过二价接头与本发明的iRNA药剂连
接。在本发明的又其它实施例中，GalNAc或GalNAc衍生物通过三价接头与本发明的iRNA药
剂连接。
[0696] 在一个实施例中，本发明的双链RNAi药剂包括与iRNA药剂连接的一种或多种GalNAc或GalNAc衍生物。GalNAc可以通过有义链或反义链上的接头与任何核苷酸连接。
GalNac可以与有义链的5'端、有义链的3'端、反义链的5'端或反义链的3'端连接。在一个实
施例中，GalNAc例如通过三价接头与有义链的3'端连接。
[0697] 在其它实施例中，本发明的双链RNAi药剂包括多个(例如，2个、3个、4个、5个或6个)GalNAc或GalNAc衍生物，每个所述衍生物通过多个接头(例如，单价接头)独立地与双链
RNAi药剂的多个核苷酸连接。
[0698] 在一些实施例中，例如，当本发明的iRNA药剂的两条链是一个较大分子的一部分时，所述较大分子由一条链的3'端和相应的另一条链的5'端之间的不间断核苷酸链连接，
形成包括多个未配对核苷酸的发夹环，发夹环内的每个未配对核苷酸可以独立地包括通过
单价接头连接的GalNAc或GalNAc衍生物。
[0699] 在一些实施例中，碳水化合物缀合物进一步包括一个或多个如上文所描述的另外的配体，如但不限于PK调节剂或细胞渗透肽。
[0700] 适用于本发明的另外的碳水化合物缀合物和接头包含PCT公开第WO 2014/179620号和第WO 2014/179627号中所描述的那些，所述文献中的每一个的全部内容通过引用并入
本文。
[0701] D.接头
[0702] 在一些实施例中，本文所述的缀合物或配体可以通过各种接头与iRNA寡核苷酸连接，所述接头可以是可切割的或不可切割的。
[0703] 术语“接头”或“连接基团”意指连接化合物两部分的有机部分，例如，共价连接化合物的两部分。接头通常包括直接键或原子，如氧或硫；单元，如NR8、C(O)、C(O)NH、SO、SO2、SO2NH或原子链，如但不限于经取代的或未经取代的烷基、经取代的或未经取代的烯基、经
取代的或未经取代的炔基、芳烷基、芳烯基、芳炔基、杂芳基烷基、杂芳基烯基、杂芳基炔基、杂环烷基、杂环烯基、杂环炔基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、环烯基、烷基芳烷基、烷基芳烯基、烷基芳炔基、烯基芳烷基、烯基芳烯基、烯基芳炔基、炔基芳烷基、炔基芳烯基、炔基芳炔基、烷基杂芳基烷基、烷基杂芳基烯基、烷基杂芳基炔基、烯基杂芳基烷基、烯基杂芳基烯
基、烯基杂芳基炔基、炔基杂芳基烷基、炔基杂芳基烯基、炔基杂芳基炔基、烷基杂环烷基、
烷基杂环烯基、烷基杂环炔基、烯基杂环烷基、烯基杂环烯基、烯基杂环炔基、炔基杂环烷
基、炔基杂环烯基、炔基杂环炔基、烷基芳基、烯基芳基、炔基芳基、烷基杂芳基、烯基杂芳
基、炔基杂芳基，所述一个或多个亚甲基可以被以下中断或封端：O、S、S(O)、SO2、N(R8)、C(O)、经取代的或未经取代的芳基、经取代的或未经取代的杂芳基或经取代的或未经取代的
杂环基；其中R8是氢、酰基、脂肪族或经取代的脂肪族。在一个实施例中，接头为约1个至24
个原子、2个至24个、3个至24个、4个至24个、5个至24个、6个至24个、6个至18个、7个至18个、
8个至18个、7个至17个、8个至17个、6个至16个、7个至17个或8个至16个原子。
[0704] 可切割连接基团是在细胞外部充分稳定的连接基团，但其在进入靶细胞之后切割以释放接头保持在一起的两个部分。在一个实施例中，可切割连接基团在靶细胞中或在第
一参考条件下(其可以例如被选择以模拟或代表细胞内条件)的切割是在受试者的血液中
或在第二参考条件下(其可以例如被选择以模拟或代表在血液或血清中发现的条件)的切
割速度的至少约10倍、20,倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或更多，或至少100倍。
[0705] 可切割连接基团易受切割剂(例如，pH、氧化还原电位或降解分子的存在)影响。一般来说，切割剂在细胞内部比在血清或血液中更普遍，或以更高的水平或活性找到。此类降
解剂的实例包含：针对特定底物选择的或不具有底物特异性的氧化还原剂，包含例如存在
于细胞中的氧化或还原酶或还原剂，如硫醇，所述氧化或还原酶或还原剂可以通过还原降
解氧化还原可切割连接基团；酯酶；可以产生酸性环境的核内体或药剂，例如，产生pH为五
或更低的那些核内体或药剂；可以通过充当广义酸、肽酶(其可以是底物特异性的)和磷酸
酶来水解或降解酸可切割连接基团的酶。
[0706] 可切割键基团，如二硫键可能对pH敏感。人血清的pH为7.4，而细胞内pH的平均值略低，范围为约7.1‑7.3。核内体具有更酸性的pH，范围为5.5‑6.0，并且溶酶体具有甚至更
酸性的pH，为约5.0。一些接头将具有可切割连接基团，所述连接基团在所选pH下切割，由此
从细胞内的配体释放阳离子脂质，或释放到细胞的期望的区室中。
[0707] 接头可以包含可由特定酶切割的可切割连接基团。并入到接头中的可切割连接基团的类型可以取决于所靶向的细胞。例如，肝脏靶向配体可以通过包含酯基的接头与阳离
子脂质连接。肝细胞富含酯酶，并且因此接头在肝细胞中将比在非富含酯酶的细胞类型中
更高效地切割。其它富含酯酶的细胞类型包含肺、肾皮质和睾丸中的细胞。
[0708] 当靶向富含肽酶的细胞类型，如肝细胞和滑膜细胞时，可以使用含有肽键的接头。
[0709] 一般来说，可以通过测试降解剂(或条件)切割候选连接基团的能力来评价候选可切割连接基团的适合性。还将期望测试候选可切割连接基团抵抗在血液中或当与其它非靶
组织接触时切割的能力。因此，可以确定第一条件与第二条件之间对切割的相对易感性，其
中选择第一条件以指示靶细胞中的切割，并且选择第二条件以指示其它组织或生物流体，
例如血液或血清中的切割。评价可以在无细胞系统、在细胞、在细胞培养物、在器官或组织
培养物或在整只动物中进行。在无细胞或培养条件下进行初始评价并且通过在整只动物中
进一步评价来确认可以是有用的。在某些实施例中，有用的候选化合物在细胞中(或在被选
择以模拟细胞内条件的体外条件下)的切割是在血液或血清中(或在被选择以模拟细胞外
条件的体外条件下)的切割速度的至少约2、4、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100倍。
[0710] i.氧化还原可切割连接基团
[0711] 在某些实施例中，可切割连接基团是在还原或氧化时切割的氧化还原可切割连接基团。还原性可切割连接基团的实例是二硫化物连接基团(‑S‑S‑)。为了确定候选可切割连
接基团是否是合适的“还原性可切割连接基团”，或例如是否适合与特定iRNA部分和特定靶
向剂一起使用，可以参考本文所描述的方法。例如，可以通过使用本领域已知的试剂与二硫
苏糖醇(DTT)或其它还原剂一起温育来评估候选物，这模拟将在细胞(例如，靶细胞)中观察
到的切割速率。候选物还可以在被选择以模拟血液或血清条件的条件下评价。在一个中，候
选化合物在血液中被切割至多约10％。在其它实施例中，有用的候选化合物在细胞中(或在
被选择以模拟细胞内条件的体外条件下)的降解是在血液中(或在被选择以模拟细胞外条
件的体外条件下)的切割速度的至少约2倍、4倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、
80倍、90倍或约100倍。候选化合物的切割速率可以使用标准酶动力学测定在被选择以模拟
细胞内介质的条件下确定并且与被选择以模拟细胞外介质的条件进行比较。
[0712] ii.基于磷酸酯的可切割连接基团
[0713] 在其它实施例中，可切割接头包括基于磷酸酯的可切割连接基团。基于磷酸酯的可切割连接基团被降解或水解磷酸酯基团的药剂切割。细胞中使磷酸酯基团切割的药剂的
实例为细胞中的酶，如磷酸酶。基于磷酸酯的连接基团的实例为‑O‑P(O)(ORk)‑O‑、‑O‑P(S)(ORk)‑O‑、‑O‑P(S)(SRk)‑O‑、‑S‑P(O)(ORk)‑O‑、‑O‑P(O)(ORk)‑S‑、‑S‑P(O)(ORk)‑S‑、‑O‑P(S)(ORk)‑S‑、‑S‑P(S)(ORk)‑O‑、‑O‑P(O)(Rk)‑O‑、‑O‑P(S)(Rk)‑O‑、‑S‑P(O)(Rk)‑O‑、‑S‑P(S)(Rk)‑O‑、‑S‑P(O)(Rk)‑S‑、‑O‑P(S)(Rk)‑S‑，其中Rk在每次出现时可以独立地为C1‑C20烷基、C1‑C20卤代烷基、C6‑C10芳基或C7‑C12芳烷基。示例性实施例包含‑O‑P(O)(OH)‑O‑、‑O‑P(S)(OH)‑O‑、‑O‑P(S)(SH)‑O‑、‑S‑P(O)(OH)‑O‑、‑O‑P(O)(OH)‑S‑、‑S‑P(O)(OH)‑S‑、‑O‑P(S)(OH)‑S‑、‑S‑P(S)(OH)‑O‑、‑O‑P(O)(H)‑O‑、‑O‑P(S)(H)‑O‑、‑S‑P(O)(H)‑O、‑S‑P(S)(H)‑O‑、‑S‑P(O)(H)‑S‑和‑O‑P(S)(H)‑S‑。在某些实施例中，基于磷酸酯的连接基团为‑O‑P(O)(OH)‑O‑。可以使用与上文所描述的方法类似的方法来评价这些候选物。
[0714] iii.酸可切割连接基团
[0715] 在其它实施例中，可切割接头包括基于酸可切割连接基团。酸可切割连接基团是在酸性条件下被切割的连接基团。在某些实施例中，酸可切割连接基团在pH为约6.5或更低
(例如，约6.0、5.5、5.0或更低)的酸性环境中或通过可以充当广义酸的药剂，如酶被切割。
在细胞中，特定低pH细胞器，如核内体和溶酶体可以提供酸可切割连接基团的切割环境。酸
可切割连接基团的实例包含但不限于腙、酯和氨基酸的酯。酸可切割基团可以具有通式‑C
＝NN‑、C(O)O或‑OC(O)。示例性实施例是与酯的氧连接的碳(烷氧基)为芳基、经取代的烷基
或叔烷基，如二甲基戊基或叔丁基。可以使用与上文所描述的方法类似的方法来评价这些
候选物。
[0716] iv.基于酯的连接基团
[0717] 在其它实施例中，可切割接头包括基于酯的可切割连接基团。基于酯的可切割连接基团通过细胞中的酶，如酯酶和酰胺酶切割。基于酯的可切割连接基团的实例包含但不
限于亚烷基、亚烯基和亚炔基的酯。酯可切割连接基团具有通式‑C(O)O‑或‑OC(O)‑。可以使用与上文所描述的方法类似的方法来评价这些候选物。
[0718] v.基于肽的切割基团
[0719] 在又其它实施例中，可切割接头包括基于肽的可切割连接基团。基于肽的可切割连接基团通过细胞中的酶，如肽酶和蛋白酶切割。基于肽的可切割连接基团是在氨基酸之
间形成以产生寡肽(例如，二肽、三肽等)和多肽的肽键。基于肽的可切割基团不包含酰胺基
(‑C(O)NH‑)。酰胺基可以在任何亚烷基、亚烯基或亚炔基之间形成。肽键是在氨基酸之间形
成以产生肽和蛋白质的特殊类型的酰胺键。基于肽的切割基团通常限于在产生肽和蛋白质
的氨基酸之间形成的肽键(即酰胺键)并且不包含整个酰胺官能团。基于肽的可切割连接基
团具有通式–NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)‑，其中RA和RB为两个相邻氨基酸的R基团。可以使用与
上文所描述的方法类似的方法来评价这些候选物。
[0720] 在一些实施例中，本发明的iRNA通过接头与碳水化合物缀合。iRNA碳水化合物缀合物与本发明的组合物和方法的接头的非限制性实例包含但不限于：
[0721]
[0722]
[0723] (式XLIV)，当X或Y中的一个是寡核苷酸时，另一个是氢。
[0724] 在本发明的组合物和方法的某些实施例中，配体为通过二价或三价支链接头连接的一个或多个“GalNAc”(N‑乙酰基半乳糖胺)衍生物。
[0725] 在一个实施例中，本发明的dsRNA与二价或三价支链接头缀合，所述二价或三价支链接头选自由式(XLV)至(XLVI)中任一项所示的结构组成的组：
[0726] 式XXXXV 式XLVI
[0727]
[0728]
[0729] 其中：
[0730] q2A、q2B、q3A、q3B、q4A、q4B、q5A、q5B和q5C在每次出现时独立地表示0‑20，并且其中重复单元可以相同或不同；
[0731] P2A、P2B、P3A、P3B、P4A、P4B、P5A、P5B、P5C、T2A、T2B、T3A、T3B、T4A、T4B、T4A、T5B、T5C在每次出现时各自独立地为不存在、CO、NH、O、S、OC(O)、NHC(O)、CH2、CH2NH或CH2O；
[0732] Q2A、Q2B、Q3A、Q3B、Q4A、Q4B、Q5A、Q5B、Q5C在每次出现时独立地为不存在、亚烷基、经取代的亚烷基，其中一个或多个亚甲基可以被以下中的一个或多个中断或封端：O、S、S(O)、SO2、NN(R)、C(R')＝C(R”)、C≡C或C(O)；
[0733] R2A、R2B、R3A、R3B、R4A、R4B、R5A、R5B、R5C每次出现时各自独立地为不存在、NH、O、S、CH2、a aC(O)O、C(O)NH、NHCH(R )C(O)、‑C(O)‑CH(R )‑NH‑、CO、CH＝N‑O、
或杂环基；
[0734] L2A、L2B、L3A、L3B、L4A、L4B、L5A、L5B和L5C表示配体；即每次出现时各自独立地为单糖a(如GalNAc)、二糖、三糖、四糖、寡糖或多糖；并且R 是H或氨基酸侧链。三价缀合的GalNAc衍生物特别适用于与RNAi药剂一起使用以抑制靶基因的表达，如式(XLIX)的表达：
[0735] 式XLIX
[0736]
[0737] 其中L5A、L5B和L5C表示单糖，如GalNAc衍生物。
[0738] 适合的缀合GalNAc衍生物的二价和三价支链接头基团的实例包含但不限于上文所提及的式II、式VII、式XI、式X和式XIII的结构。
[0739] 教导RNA缀合物的制备的代表性美国专利包含但不限于美国专利第4,828,979号；第4,948,882号；第5,218,105号；第5,525,465号；第5,541,313号；第5,545,730号；第5,
552,538号；第5,578,717号、第5,580,731号；第5,591,584号；第5,109,124号；第5,118,802
号；第5,138,045号；第5,414,077号；第5,486,603号；第5,512,439号；第5,578,718号；第5,
608,046号；第4,587,044号；第4,605,735号；第4,667,025号；第4,762,779号；第4,789,737
号；第4,824,941号；第4,835,263号；第4,876,335号；第4,904,582号；第4,958,013号；第5,
082,830号；第5,112,963号；第5,214,136号；第5,082,830号；第5,112,963号；第5,214,136
号；第5,245,022号；第5,254,469号；第5,258,506号；第5,262,536号；第5,272,250号；第5,
292,873号；第5,317,098号；第5,371,241号、第5,391,723号；第5,416,203号、第5,451,463
号；第5,510,475号；第5,512,667号；第5,514,785号；第5,565,552号；第5,567,810号；第5,
574,142号；第5,585,481号；第5,587,371号；第5,595,726号；第5,597,696号；第5,599,923
号；第5,599,928号；第5,688,941号；第6,294,664号；第6,320,017号；第6,576,752号；第6,
783,931号；第6,900,297号；第7,037,646号；以及第8,106,022号，所述美国专利中的每一
个的全部内容特此通过引用并入本文。
[0740] 不需要均匀地修饰给定化合物中的所有位置，并且事实上，可以将上述修饰中的多于一个修饰并入单一化合物中或甚至iRNA内的单个核苷处。本发明还包含作为嵌合化合
物的iRNA化合物。
[0741] 在本发明的上下文中，“嵌合”iRNA化合物或“嵌合体”是iRNA化合物，如dsRNAi药剂，其含有两个或更多个化学上不同的区域，每个区域由至少一个单体单元构成，即在
dsRNA化合物的情况下的核苷酸。这些iRNA通常含有至少一个区，其中RNA被修饰以赋予
iRNA增加的对核酸酶降解的抗性、增加的细胞摄取或增加的对靶核酸的结合亲和力。iRNA
的另外的区可以作为能够切割RNA:DNA或RNA:RNA杂交体的酶的底物。举例来说，RNase H是
细胞核酸内切酶，所述细胞核酸内切酶切割RNA:DNA双链体的RNA链。因此，RNase H的激活
使RNA靶标切割，由此大大增强iRNA抑制基因表达的效率。因此，与杂交到同一靶标区的硫
代磷酸酯脱氧dsRNA相比，当使用嵌合dsRNA时，使用更短的iRNA通常可以获得相当的结果。
可以通过凝胶电泳和必要时本领域已知的相关核酸杂交技术常规检测RNA靶标的切割。
[0742] 在某些情况下，iRNA的RNA可以被非配体基团修饰。许多非配体分子已与iRNA缀合以增强iRNA的活性、细胞分布或细胞摄取，并且进行此类缀合的程序可在科学文献中获得。
此类非配体部分已经包含脂质部分，如胆固醇(Kubo,T.等人《, 生物化学和生物物理研究通
讯(Biochem.Biophys.Res.Comm.)》,2007,365(1):54‑61；Letsinger等人《, 美国国家科学
院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》,1989,86:6553)、胆酸(Manoharan等人《, 生物有机与
药物化学快报(Bioorg.Med.Chem.Lett.)》,1994,4:1053)、硫醚，例如己基‑S‑三苯甲基硫
醇(Manoharan等人《,纽约科学院年鉴(Ann.N.Y.Acad.Sci.)》,1992,660:306；Manoharan等
人《, 生物有机与药物化学快报(Bioorg.Med.Chem.Let.)》,1993,3:2765)、硫代胆固醇
(Oberhauser等人《, 核酸研究(Nucl.Acids Res.)》,1992,20:533)、脂肪族链，例如十二烷
二醇或十一烷基残基(Saison‑Behmoaras等人《, 欧洲分子生物学组织杂志(EMBO J.)》,
1991,10:111；Kabanov等人《, FEBS快报(FEBS Lett.)》,1990,259:327；Svinarchuk等人,
《生物化学(Biochimie)》,1993,75:49)、磷脂，例如二‑十六烷基‑rac‑甘油或三乙基铵1,2‑二‑O‑十六烷基‑rac‑甘油‑3‑H‑膦酸酯(Manoharan等人《, 四面体快报(Tetrahedron 
Lett.)》,1995,36:3651；Shea等人《, 核酸研究(Nucl.Acids Res.)》,1990,18:3777)、多胺
或聚乙二醇链(Manoharan等人《, 核苷与核苷酸(Nucleosides&Nucleotides)》,1995,14:
969)、或金刚烷乙酸(Manoharan等人,《四面体快报(Tetrahedron Lett.)》,1995,36:
3651)、棕榈基部分(Mishra等人《,生物化学与生物物理学报(Biochim.Biophys.Acta)》,
1995,1264:229)、或十八胺或己基氨基‑羰基‑羰基氧基胆固醇部分(Crooke等人《, 药理和
实验治疗学杂志(J.Pharmacol.Exp.Ther.)》,1996,277:923)。上面列出了教导制备此类
RNA缀合物的代表性美国专利。典型的缀合方案涉及合成在序列的一个或多个位置处具有
氨基接头的RNA。随后使用适当偶联试剂或激活试剂使氨基与所缀合的分子反应。缀合反应
可以在RNA仍与固相载体结合的情况下或在RNA切割之后在溶液相中进行。通过HPLC纯化
RNA缀合物通常产生纯缀合物。
[0743] V.本发明的iRNA的递送
[0744] 将本发明的iRNA递送到细胞，例如受试者(如人受试者(例如，有需要的受试者，如易患或被诊断为患有KHK相关病症的受试者，如本文所述))体内的细胞可以以多种不同方
式实现。例如，可以通过在体外或体内使细胞与本发明的iRNA接触来进行递送。还可以通过
向受试者施用包括iRNA的组合物(例如，dsRNA)直接进行体内递送。可替代地，体内递送可
以通过施用一种或多种编码和引导iRNA的表达的载体间接进行。下文将进一步讨论这些替
代方案。
[0745] 通常，任何递送核酸分子的方法(体外或体内)都可以适于与本发明的iRNA一起使用(参见例如，Akhtar S.和Julian RL.(1992)《细胞生物学趋势(Trends Cell.Biol.)》2
(5):139‑144和WO94/02595，所述文献通过全文引用的方式并入本文)。对于体内递送，为递
送iRNA分子需要考虑的因素包含例如，递送的分子的生物稳定性、非特异性效应的预防以
及递送的分子在靶组织中的积累。RNA干扰也显示出通过直接注射局部递送到CNS的成功
(Dorn,G.等人(2004)《核酸(Nucleic Acids)》32:e49；Tan,PH.等人(2005)《基因疗法(Gene 
Ther.)》12:59‑66；Makimura,H.等人(2002)《BMC神经科学(BMC Neurosci.)》3:18；
Shishkina,GT.等人(2004)《神经科学(Neuroscience)》129:521‑528；Thakker,ER.等人
(2004)《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)》101:17270‑17275；Akaneya,
Y.等人(2005)《神经生理学杂志(J.Neurophysiol.)》93:594‑602)。RNA或药物载体的修饰
也可以允许iRNA靶向靶组织，并且避免不期望的脱靶效应。iRNA分子可以通过与亲脂性基
团(如胆固醇)的化学缀合进行修饰，以增强细胞摄取并防止降解。例如，将针对与亲脂性胆
固醇部分缀合的ApoB的iRNA全身注射到小鼠体内，并且引起肝脏和空肠两者中apoB mRNA
的敲低(Soutschek,J.等人(2004)《自然》432:173‑178)。
[0746] 在替代性实施例中，可以使用药物递送系统(如纳米颗粒、树状物、聚合物、脂质体或阳离子递送系统)递送iRNA。带正电荷的阳离子递送系统促进(带负电荷的)iRNA分子的
结合并且还在带负电荷的细胞膜增强相互作用以允许细胞高效地摄取iRNA。阳离子脂质、
树状物或聚合物可以与iRNA结合或被诱导以形成包裹iRNA的囊泡或胶束(参见例如，Kim 
SH等人(2008)《控释杂志(Journal of Controlled Release)》129(2):107‑116)。当全身施
用时，囊泡或胶束的形成进一步防止iRNA的降解。用于制备和施用阳离子iRNA复合物的方
法完全在本领域技术人员的能力范围内(参见例如，Sorensen,DR等人(2003)《分子生物学
杂志(J.Mol.Biol)》327:761‑766；Verma,UN等人(2003)《临床癌症研究(Clin.Cancer 
Res.)》9:1291‑1300；Arnold,AS等人(2007)《神经生理学杂志(J.Hypertens.)》25:197‑
205，所述文献通过全文引用的方式并入本文)。可用于iRNA的全身递送的药物递送系统的
一些非限制性实例包含DOTAP(Sorensen,DR.等人(2003),同上；Verma,UN等人(2003),同
上)，“固体核酸脂质颗粒(solid nucleic acid lipid particles)”(Zimmermann,TS等人
(2006)《自然》441:111‑114)，心磷脂(Chien,PY等人(2005)《癌症基因疗法(Cancer Gene 
Ther.)》12:321‑328；Pal,A等人(2005)《国际肿瘤学杂志(Int J.Oncol.)》26:1087‑1091)，聚乙烯亚胺(Bonnet ME等人(2008)《药学研究(Pharm.Res.)》8月16日印刷前的电子出版
物；Aigner,A.(2006)《生物医学与生物技术杂志(J.Biomed.Biotechnol.)》71659)，Arg‑
Gly‑Asp(RGD)肽(Liu,S.(2006)《分子药物学(Mol.Pharm.)》3:472‑487)以及聚酰胺型胺
(Tomalia,DA等人(2007)《生化学会会刊(Biochem.Soc.Trans.)》35:61‑67；Yoo,H.等人
(1999)《药学研究》16:1799–1804)。在一些实施例中，iRNA与环糊精形成用于全身施用的复
合物。施用方法以及iRNA和环糊精的药物组合物可以在美国专利第7,427,605号中找到，所
述美国专利通过全文引用的方式并入本文。
[0747] A.本发明的载体编码的iRNA
[0748] 靶向KHK基因的iRNA可以从插入DNA或RNA载体的转录单元表达(参见例如Couture,A等人《,TIG.》(1996),12:5‑10；Skillern,A等人,国际PCT公开第WO 00/22113号，
Conrad,国际PCT公开第WO 00/22114号以及Conrad,美国专利第6,054,299号)。表达可以是
瞬时的(数小时至数周的数量级)或持续的(数周至数月或更长)，这取决于所使用的特定构
建体和靶组织或细胞类型。这些转基因可以作为线性构建体、环状质粒或病毒载体引入，其
可以是整合或非整合载体。还可以构建转基因以允许其作为染色体外质粒遗传(Gassmann
等人《, 美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》(1995)92:1292)。
[0749] 可以与本文所描述的方法和组合物一起使用的病毒载体系统包含但不限于(a)腺病毒载体；(b)逆转录病毒载体，包含但不限于慢病毒载体、莫罗尼鼠白血病病毒(moloney 
murine leukemia virus)等；(c)腺相关病毒载体；(d)单纯性疱疹病毒载体；(e)SV 40载
体；(f)多瘤病毒载体；(g)乳头瘤病毒载体；(h)小核糖核酸病毒载体；(i)痘病毒载体，如正
痘(例如，牛痘病毒载体)或禽痘(例如，金丝雀痘或禽痘)；以及(j)辅助依赖性或无肠腺病
毒。复制缺陷病毒也可能是有利的。不同的载体将或不会被并入到细胞的基因组中。如果期
望，构建体可以包含用于转染的病毒序列。可替代地，构建体可以被并入能够附加型复制的
载体中，例如EPV和EBV载体。用于重组表达iRNA的构建体将通常需要调节元件，例如启动
子、增强子等，以确保iRNA在靶细胞中的表达。对于载体和构建体要考虑的其它方面是本领
域已知的。
[0750] VI.本发明的药物组合物
[0751] 本发明还包含药物组合物和调配物，所述药物组合物和调配物包含本发明的iRNA。在一个实施例中，本文提供了药物组合物，所述药物组合物包含如本文所描述的iRNA
以及药学上可接受的载体。含有iRNA的药物组合物可用于治疗与KHK基因的表达或活性相
关的疾病或病症。此类药物组合物基于递送模式调配。一个实例是调配经由肠胃外递送，例
如通过皮下(SC)或静脉内(IV)递送用于全身施用的组合物。本发明的药物组合物可以以足
以抑制KHK基因的表达的剂量施用。
[0752] 在一些实施例中，本发明的药物组合物是无菌的。在另一个实施例中，本发明的药物组合物是不含热原的。
[0753] 本发明的药物组合物可以以足以抑制KHK基因的表达的剂量施用。通常，本发明的iRNA的合适剂量的范围将为约0.001至约200.0毫克/受体的千克体重/天，通常范围为约1
至50毫克/千克体重/天。通常，本发明的iRNA的合适剂量将在约0.1mg/kg至约5.0mg/kg、约
0.3mg/kg和约3.0mg/kg的范围内。重复剂量方案可以包含定期施用治疗量的iRNA，如每月、
每3个月至6个月一次或每年一次。在某些实施例中，iRNA是约每月一次至约每六个月一次
施用。
[0754] 在初始治疗方案之后，可以在不太频繁的基础上施用治疗。治疗的持续时间可以基于疾病的严重程度来确定。
[0755] 在其它实施例中，单剂量的药物组合物可以是持久的，使得剂量以不超过1个月、2个月、3个月或4个月的间隔施用。在本发明的一些实施例中，单剂量的本发明药物组合物约
每月施用一次。在本发明的其它实施例中，每季度(即约每三个月)施用单剂量的本发明药
物组合物。在本发明的其它实施例中，每年施用两次(即约每六个月一次)单剂量的本发明
的药物组合物。
[0756] 本领域技术人员将理解，某些因素可能影响有效治疗受试者所需的剂量和时间安排，所述因素包含但不限于受试者中存在的突变、之前的治疗、所述受试者的总体健康或年
龄以及存在的其它疾病。此外，用预防或治疗有效量的组合物(视情况而定)治疗受试者可
以包含单次治疗或系列治疗。
[0757] iRNA可以以靶向特定组织(例如，肝细胞)的方式递送。
[0758] 本发明的药物组合物包含但不限于溶液、乳液和含有脂质体的调配物。这些组合物可以由多种组分产生，所述组分包含但不限于预成型液体、自乳化固体和自乳化半固体。
调配物包含靶向肝脏的调配物。
[0759] 本发明的药物调配物可以方便地以单位剂型存在，可以根据制药工业中众所周知的常规技术制备。此类技术包含使活性成分与药物载体或赋形剂缔合的步骤。通常，通过将
活性成分与液体载体均匀且紧密地缔合来制备调配物。
[0760] A.另外的调配物
[0761] i.乳液
[0762] 本发明的组合物可以制备并调配成乳液。乳液通常是一种液体以液滴的形式分散在另一种液体中的非均相系统，通常直径超过0.1μm(参见例如《安塞尔的药物剂型和药物
递送系统(Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems)》,
Allen,LV.,Popovich NG.和Ansel HC.,2004,纽约州纽约的利平科特·威廉斯·威尔金斯
出版公司(Lippincott Williams&Wilkins,New York,NY)(第8版)；Idson,《药物剂型
(Pharmaceutical Dosage Forms)》,Lieberman,Rieger和Banker(编辑),1988,纽约州纽约
的马塞尔德克尔公司(Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.),第1卷,第199页；Rosoff《,药
物剂型》,Lieberman,Rieger和Banker(编辑),1988,纽约州纽约的马塞尔德克尔公司,第1
卷,第245页；Block《, 药物剂型》,Lieberman,Rieger和Banker(编辑),1988,纽约州纽约的
马塞尔德克尔公司,第2卷,第335页；Higuchi等人,《雷明顿药物科学(Remington's 
Pharmaceutical Sciences)》,宾夕法尼亚州伊斯顿的马克出版公司(Mack Publishing 
Co.,Easton,Pa.),1985,第301页)。乳液通常是两相系统，包括两个相互紧密混合和分散的
不混溶液相。通常，乳液可以是油包水(w/w)或水包油(w/w)类型。当水相被精细地分成微小
的液滴并分散到本体油相中时，所得到的组合物被称为油包水(w/o)乳液。可替代地，当油
相被精细地分成微小的液滴并分散到本体水相中时，所得到的组合物被称为水包油(o/w)
乳液。除了分散相和活性药物之外，乳液还可以含有另外的组分，所述活性药物可以以溶液
的形式存在于水相、油相中或其本身作为单独的相。药物赋形剂，如乳化剂、稳定剂、染料和
抗氧化剂也可以根据需要存在于乳液中。药物乳液也可以是包含多于两相的多种乳液，例
如在油包水包油(o/w/o)和水包油包水(w/o/w)乳液的情况下。此类复杂的调配物通常提供
简单的二元乳液所没有的某些优点。其中o/w乳液的单个油滴包围小水滴的多重乳液构成
w/o/w乳液。类似地，包围在油状连续相中稳定的水滴中的油滴系统提供o/w/o乳液。
[0763] 乳液的特征在于几乎没有或没有热力学稳定性。通常，乳液的分散或不连续相很好地分散到外部或连续相中，并且通过乳化剂或调配物的粘度维持这种形式。稳定乳液的
其它方法需要使用可以并入乳液任一相中的乳化剂。乳化剂可以大致分为四类：合成表面
活性剂、天然存在的乳化剂、吸收碱和精细分散的固体(参见例如，《安塞尔的药物剂型和药
物递送系统》,Allen,LV.,Popovich NG.和Ansel HC.,2004,纽约州纽约的利平科特·威廉
斯·威尔金斯出版公司(第8版)；Idson《,药物剂型》,Lieberman,Rieger和Banker(编辑),
1988,纽约州纽约的马塞尔德克尔公司,第1卷,第199页)。
[0764] 已发现合成表面活性剂(也称为表面活性药剂)在乳液调配物中具有广泛的适用性，并且已在文献中进行了综述(参见例如，《安塞尔的药物剂型和药物递送系统》,Allen,
LV.,Popovich NG.和Ansel HC.,2004,纽约州纽约的利平科特·威廉斯·威尔金斯出版公
司(第8版)；Rieger《, 药物剂型》,Lieberman,Rieger和Banker(编辑),1988,纽约州纽约的
马塞尔德克尔公司,第1卷,第285页；Idson《, 药物剂型》,Lieberman,Rieger和Banker(编
辑),1988,纽约州纽约的马塞尔德克尔公司,第1卷,第199页)。表面活性剂通常是两亲性
的，并且包括亲水性和疏水性部分。表面活性剂的亲水性与疏水性的比率被称为亲水/亲脂
平衡(HLB)，并且是在调配物的制备中对表面活性剂进行分类和选择的有价值的工具。表面
活性剂可以基于亲水基团的性质分为不同的类别：非离子、阴离子、阳离子和两性(参见例
如，Allen,LV.,Popovich NG.和Ansel HC.,2004,利平科特·威廉斯·威尔金斯出版公司
(第8版),纽约州纽约；Rieger《, 药物剂型》,Lieberman,Rieger和Banker(编辑),1988,纽约
州纽约的马塞尔德克尔公司,第1卷,第285页)。
[0765] 乳液调配物中还包含多种非乳化材料，并且有助于乳液的特性。这些包含脂肪、油、蜡、脂肪酸、脂肪醇、脂肪酸酯、保湿剂、亲水胶体、防腐剂和抗氧化剂(Block《, 药物剂型》,Lieberman,Rieger和Banker(编辑),1988,纽约州纽约的马塞尔德克尔公司,第1卷,第
335页；Idson《,药物剂型》,Lieberman,Rieger和Banker(编辑),1988,纽约州纽约的马塞尔
德克尔公司,第1卷,第199页)。
[0766] 乳液调配物通过皮肤、口服和肠胃外通路的应用以及其制造方法已经在文献中进行了综述(参见例如，《安塞尔的药物剂型和药物递送系统》,Allen,LV.,Popovich NG.和
Ansel HC.,2004,利平科特·威廉斯·威尔金斯出版公司(第8版),纽约州纽约；Idson《,药
物剂型》,Lieberman,Rieger和Banker(编辑),1988,纽约州纽约的马塞尔德克尔公司,第1
卷,第199页)。
[0767] ii.微乳液
[0768] 在本发明的一个实施例中，iRNA和核酸的组合物被调配为微乳液。微乳液可以定义为水、油和两亲物的系统，其是单一的光学各向同性和热力学稳定的液体溶液(参见例
如，Allen,LV.,Popovich NG.和Ansel HC.,2004,利平科特·威廉斯·威尔金斯出版公司
(第8版),纽约州纽约；Rosoff《, 药物剂型》,Lieberman,Rieger和Banker(编辑),1988,纽约
州纽约的马塞尔德克尔公司,第1卷,第245页)。通常，微乳液是通过首先将油分散在表面活
性剂水溶液中，并且然后添加足量的第四组分(通常是中链长醇)以形成透明系统而制备的
系统。因此，微乳液也被描述为两种不混溶液体的热力学稳定、各向同性透明的分散体，所
述两种不混溶液体通过表面活性分子的界面膜来稳定(Leung和Shah《, 药物的控制释放：聚
合物和聚集系统(Controlled Release of Drugs:Polymers and Aggregate Systems)》,
Rosoff,M.编辑,1989,纽约的VCH出版社(VCH Publishers,New York),第185‑215页)。
[0769] iii.微颗粒
[0770] 本发明的iRNA可以掺入到颗粒中，例如微颗粒中。微颗粒可以通过喷雾干燥生产，但也可以通过其它方法生产，包含冻干、蒸发、流化床干燥、真空干燥或这些技术的组合。
[0771] iv.增渗剂
[0772] 在一个实施例中，本发明使用各种增渗剂来实现核酸，特别是iRNA到动物皮肤的有效递送。大多数药物以电离和非电离两种形式存在于溶液中。然而，通常只有脂溶性或亲
脂性药物容易穿过细胞膜。已经发现，如果用增渗剂处理待穿过的膜，即使是非亲脂性药物
也可以穿过细胞膜。除了有助于非亲脂性药物穿过细胞膜的扩散外，增渗剂还可以增强亲
脂性药物的渗透性。
[0773] 增渗剂可以分为五大类之一，即表面活性剂、脂肪酸、胆汁盐、螯合剂和非螯合非表面活性剂(参见例如Malmsten,M《. 药物递送中的表面活性剂和聚合物(Surfactants and 
polymers in drug delivery)》,纽约州纽约的英富曼医疗健康公司(Informa Health 
Care,New York,NY),2002；Lee等人《, 治疗药物载体系统的关键综述(Critical Reviews 
in Therapeutic Drug Carrier Systems)》,1991,第92页)。上述每一类增渗剂及其在制造
药物组合物和递送药剂中的用途在本领域是众所周知的。
[0774] v.赋形剂
[0775] 与载体化合物相比，“药物载体”或“赋形剂”是药学上可接受的溶剂、悬浮剂或任何其它用于将一种或多种核酸递送到动物的药理学惰性媒剂。赋形剂可以是液体的或固体
的并且在考虑计划的施用方式的情况下被选择，以便在与核酸和给定药物组合物的其它组
分组合时提供期望的体积、一致性等。此类药剂在本领域中是众所周知的。
[0776] vi.其它组分
[0777] 本发明的组合物可以另外含有在药物组合物中常规存在的其它附属组分，处于其现有技术确定的使用水平。因此，例如，组合物可以含有另外的相容性药物活性材料，例如，
止痒药、收敛剂、局部麻醉剂或抗炎剂，或者可以含有可用于物理调配本发明的组合物的各
种剂型的另外的材料，如染料、调味剂、防腐剂、抗氧化剂、不透明剂、增稠剂和稳定剂。然
而，此类材料，在添加时，不应该不适当地干扰本发明的组合物的成分的生物活性。调配物
可以进行灭菌，并且如果期望的话，可以与不与所述调配物的核酸有害地相互作用的助剂，
例如润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、用于影响渗透压的盐、缓冲液、着色剂、调味剂或芳香物质等混合。
[0778] 含水悬浮液可以含有增加悬浮液粘度的物质，包含例如羧甲基纤维素钠、山梨醇或右旋糖酐。悬浮液也可以含有稳定剂。
[0779] 在一些实施例中，本发明中特征的药物组合物包含(a)一种或多种iRNA和(b)一种或多种药剂，所述药剂通过非iRNA机制起作用并且用于治疗KHK相关病症，例如肝病(例如，
脂肪肝、脂肪性肝炎、非酒精性脂肪性肝炎(NASH))、血脂异常(例如，高脂血症、高LDL胆固
醇、低HDL胆固醇、高甘油三酯血症、餐后高甘油三酯血症)、血糖控制病症(例如，胰岛素抵
抗、2型糖尿病)、心血管疾病(例如，高血压、内皮细胞功能障碍)、肾病(例如，急性肾病症、小管功能障碍、近端小管的促炎性变化、慢性肾病)、代谢综合征、脂肪细胞功能障碍、内脏
脂肪沉积、肥胖、高尿酸血症、痛风、进食障碍和糖渴求过度。
[0780] 此类化合物的毒性和预防功效可以通过细胞培养物或实验动物中的标准制药程序测定，例如，用于确定LD50(对50％群体致死的剂量)和ED50(对50％群体预防有效的剂
量)。毒性作用与治疗效果之间的剂量比为治疗指数并且所述治疗指数可以被表示为比率
LD50/ED50。表现出高治疗指数的化合物是优选的。
[0781] 从细胞培养测定和动物研究获得的数据可以用于调配用于在人中使用的剂量范围。本发明中本文特征的组合物的剂量通常在包含ED50(如ED80或ED90)的循环浓度范围
内，几乎没有或没有毒性。根据所采用的剂型和所利用的施用通路，剂量可以在此范围内变
化。对于本发明特征的方法中使用的任何化合物，预防有效剂量可以最初根据细胞培养测
定估计。可以在动物模型中调配剂量，以达到化合物的循环血浆浓度范围，或者在适当的情
况下，达到靶序列的多肽产物的循环血浆浓度范围(例如，实现多肽浓度的降低)，所述范围
包含细胞培养中确定的IC50或更高水平的抑制(即达到症状的一半最大抑制的测试化合物
的浓度)。可以使用此类信息来更精确地确定人体中的有用剂量。可以测量血浆中的水平，
例如通过高效液相色谱。
[0782] 除了其施用之外，如上所讨论，本发明中特征的iRNA可以与用于预防或治疗KHK相关病症的其它已知药剂组合施用，所述病症例如肝病(例如，脂肪肝、脂肪性肝炎、非酒精性
脂肪性肝炎(NASH))、血脂异常(例如，高脂血症、高LDL胆固醇、低HDL胆固醇、高甘油三酯血
症、餐后高甘油三酯血症)、血糖控制病症(例如，胰岛素抵抗、2型糖尿病)、心血管疾病(例
如，高血压、内皮细胞功能障碍)、肾病(例如，急性肾病症、小管功能障碍、近端小管的促炎
性变化、慢性肾病)、代谢综合征、脂肪细胞功能障碍、内脏脂肪沉积、肥胖、高尿酸血症、痛风、进食障碍和糖渴求过度。在任何情况下，施用医师可以基于使用本领域已知或本文所描
述的功效的标准测量观察到的结果来调节iRNA施用的量和时间。
[0783] VII.用于抑制KHK表达的方法
[0784] 本发明还提供了抑制细胞中的KHK基因的表达的方法。所述方法包含将细胞与RNAi药剂，例如双链RNAi药剂接触，所述药剂的量有效地抑制细胞中的KHK的表达，由此抑
制细胞中的KHK的表达。
[0785] 细胞与iRNA，例如双链RNA药剂的接触可以在体外或体内进行。使细胞与iRNA体内接触包含使受试者(例如，人受试者)体内的细胞或细胞组与iRNA接触。体外和体内接触细
胞方法的组合也是可能的。如上文所讨论的，接触细胞可以是直接的或间接的。此外，接触
细胞可以通过靶向配体实现，包含本文所描述的或本领域已知的任何配体。在一些实施例
中，靶向配体是碳水化合物部分，例如GalNAc3配体，或将RNAi药剂引导到所关注的位点的
任何其它配体。
[0786] 如本文所使用的，术语“抑制(inhibiting)”可以与“减少”、“沉默”、“下调”、“抑制(suppressing)”和其它类似术语互换使用，并且包含任何水平的抑制。
[0787] 短语“抑制KHK的表达”旨在指对任何KHK基因(如例如小鼠KHK 3基因、大鼠KHK基因、猴KHK基因或人KHK基因)以及KHK基因的变体或突变体的表达的抑制。因此，在基因操纵
的细胞、细胞组或生物体的上下文下，KHK基因可以是野生型KHK基因、突变体KHK基因或转
基因KHK基因。
[0788] “抑制KHK基因的表达”包含对KHK基因的任何水平的抑制，例如至少部分抑制KHK基因的表达。KHK基因的表达可以基于与KHK基因表达相关的任何变量的水平或水平变化来
评估，例如KHK mRNA水平或KHK蛋白水平。此水平可以在单个细胞或一组细胞中进行评估，
包含例如源自受试者的样品。
[0789] 可以通过与对照水平相比的与KHK表达相关的一个或多个变量的绝对或相对水平的降低来评估抑制。对照水平可以是本领域中使用的任何类型的对照水平，例如，给药前基
线水平，或从未经治疗或用对照(例如，仅缓冲液对照或无活性药剂对照)治疗的类似受试
者、细胞或样品中确定的水平。
[0790] 应理解，KHK相关疾病的体征升高的程度和持续时间将取决于所述体征而有所不同。例如，脂质体征，例如空腹脂质水平、NAFLD、NASH、肥胖；肝和肾功能体征以及葡萄糖或胰岛素反应，是不会在一天内或甚至在一周内以临床上显著方式变化的持久体征。其它标
志物，例如血清尿酸和葡萄糖水平以及尿果糖水平，将在数日内变化且可能在数日之间变
化。血压可能响应于果糖而瞬时且持久地升高。由于果糖可能至少部分地通过降低饱腹感
来产生增重，所以果糖消耗与热量限制相结合可能不会产生增重。
[0791] 此外，取决于受试者的疾病状态，多达三分之一的成人和三分之二的儿童存在果糖吸收不良(Johnson等人(2013)《糖尿病(Diabetes.)》62:3307‑3315)，例如由于肠道中
GLUT5转运蛋白的表达变化。然而，重复暴露于果糖可以增加果糖吸收。已证明，果糖代谢可
取决于果糖来源而有所不同，例如在高果糖玉米糖浆中以及在天然水果中，并且在高浓度
下，如由软饮料提供的高浓度，葡萄糖可以通过多元醇途径转化为果糖。然而，果糖将比葡
萄糖具有更多的代谢效应。还已证明，身体组成，例如瘦体质可影响果糖代谢。因此，必须仔
细选择测试时间和对照。
[0792] 在本发明的方法的一些实施例中，KHK基因的表达被抑制至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％，或被抑制到低于测定的检测水平。在一些实施例中，KHK基因的表达被抑制至少70％。在一些实施例中，使用实例2中提供的测定方法在合适
的物种匹配的细胞系中以10nM siRNA浓度确定表达水平。
[0793] 在某些实施例中，体内表达的抑制是通过在表达人基因的啮齿类动物，例如表达人靶基因(即KHK)的AAV感染的小鼠中敲低人基因来确定的，例如当以单剂量施用时，例如
在RNA表达的最低点以3mg/kg施用。模型动物系统中内源性基因表达的敲低也可以确定，例
如，在RNA表达的最低点以例如3mg/kg施用单剂量后。当人基因和模型动物基因的核酸序列
足够接近使得人iRNA提供模型动物基因有效敲低时，此类系统是有用的。使用实例2中提供
的PCR方法确定肝脏中的RNA表达。
[0794] KHK基因表达的抑制可以通过第一细胞或细胞组(例如，此类细胞可以存在于源自受试者的样品中)表达的mRNA的量的减少来表现，在所述细胞或细胞组中，KHK基因被转录
并且已经被处理(例如，通过使所述一个或多个细胞与本发明的iRNA接触，或通过向存在或
曾经存在所述细胞的受试者施用本发明的iRNA)，从而与基本与第一细胞或细胞组相同但
尚未如此处理的第二细胞或细胞组(未用iRNA处理或未用靶向所关注的基因的iRNA处理的
对照细胞)相比，KHK基因的表达受到抑制。在一些实施例中，通过实例2中提供的方法评估
抑制，在物种匹配的细胞系中使用10nM siRNA浓度，并且使用下式将处理的细胞中的mRNA
水平表达为对照细胞中mRNA水平的百分比：
[0795]
[0796] 在其它实施例中，可以根据与KHK基因表达功能性相关的参数(例如，来自受试者的血液或血清中的KHK蛋白水平)的降低来评估KHK基因的表达的抑制。KHK基因沉默可以在
表达KHK的任何细胞中确定，无论是内源性的还是来自表达构建体的异源性的，并且通过本
领域已知的任何测定。
[0797] KHK蛋白的表达的抑制可以通过细胞或细胞组或受试者样品中(例如，源自受试者的血样中的蛋白质水平)表达的KHK蛋白水平的降低来表现。如上文所解释的，为了评估
mRNA抑制，处理的细胞或细胞组中蛋白质表达水平的抑制可以类似地表达为对照细胞或细
胞组中蛋白质水平的百分比，或表达为受试者样品(例如，源自其的血液或血清)中蛋白质
水平变化。
[0798] 可以用于评估KHK基因的表达的抑制的对照细胞、细胞组或受试者样品包含尚未与本发明的RNAi药剂接触的细胞、细胞组或受试物样品。例如，在用RNAi药剂或适当匹配的
群体对照治疗受试者之前，对照细胞、细胞组或受试者样品可以源自个体受试者(例如，人
或动物受试者)。
[0799] 细胞或细胞组表达的KHK mRNA的水平可以使用本领域已知的用于评估mRNA表达的任何方法来确定。在一个实施例中，通过检测转录的多核苷酸或其部分，例如KHK基因的
mRNA来确定样品中KHK的表达水平。可以使用RNA提取技术从细胞中提取RNA，包含例如使用
TM
酸酚/异硫氰酸胍提取(RNAzol B；生物起源公司(Biogenesis))、RNeasy  RNA制备试剂盒
TM TM
或PAXgene (瑞士的PreAnalytix )。利用核糖核酸杂交的典型分析形式包含
核运行测定、RT‑PCR、RNase保护测定、northern印迹、原位杂交和微阵列分析。
[0800] 在一些实施例中，使用核酸探针确定KHK的表达水平。如本文所使用，术语“探针”是指能够与特定KHK选择性地结合的任何分子。探针可以由本领域技术人员合成，或源自适
当的生物制剂。探针可以专门设计成被标记。可以用作探针的分子的实例包含但不限于
RNA、DNA、蛋白质、抗体和有机分子。
[0801] 分离的mRNA可以用于杂交或扩增测定，包含但不限于Southern分析或northern分析、聚合酶链式反应(PCR)分析和探针阵列。一种用于确定mRNA水平的方法涉及将分离的
mRNA与可以与KHK mRNA杂交的核酸分子(探针)接触。在一个实施例中，mRNA被固定在固体
表面上并与探针接触，例如通过在琼脂糖凝胶上运行分离的mRNA并将mRNA从凝胶转移到
膜，如硝酸纤维素。在替代性实施例中，探针固定在固体表面上，并且mRNA与探针接触，例
如，在 基因芯片阵列中。本领域技术人员可以容易地将已知的mRNA检测方法
用于确定KHK mRNA的水平。
[0802] 用于确定样品中的KHK的表达水平的替代方法涉及样品中例如mRNA的核酸扩增或逆转录酶(以制备cDNA)的过程，例如通过RT‑PCR(Mullis,1987,美国专利第4,683,202号中
所述的实验实施例)、连接酶链反应(Barany(1991)《美国国家科学院院刊
(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》88:189‑193)、自持序列复制(Guatelli等人(1990)《美国国家
科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》87:1874‑1878)、转录扩增系统(Kwoh等人(1989)
《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》86:1173‑1177)、Q‑β复制酶(Lizardi等人(1988)《生物/技术(Bio/Technology)》6:1197)、滚环复制(Lizardi等人,美国专利第5,
854,033号)或任何其它核酸扩增方法，然后使用本领域技术人员熟知的技术检测扩增的分
子。如果此类核酸分子以非常低的数量存在，则这些检测方案对于检测核酸分子特别有用。
TM
在本发明的特定方面，KHK的表达水平通过定量荧光RT‑PCR(即TaqMan 系统)确定。在一些
实施例中，通过实例2中提供的方法，使用例如10nM siRNA浓度，在物种匹配的细胞系中确
定表达水平。
[0803] KHK mRNA的表达水平可以使用膜印迹(如用于杂交分析，如northern、Southern、斑点等)或微孔、样品管、凝胶、珠或纤维(或包括结合核酸的任何固相载体)来监测。参见美
国专利第5,770,722号、第5,874,219号、第5,744,305号、第5,677,195号和第5,445,934号，
所述美国专利通过引用并入本文。KHK表达水平的确定也可以包括在溶液中使用核酸探针。
[0804] 在一些实施例中，使用支链DNA(bDNA)测定或实时PCR(qPCR)来评估mRNA表达的水平。这些方法的使用在本文给出的实例中进行了描述和例示。在一些实施例中，通过实例2
中提供的方法，使用10nM siRNA浓度，在物种匹配的细胞系中确定表达水平。
[0805] KHK蛋白表达的水平可以使用本领域已知的用于测量蛋白质水平的任何方法来确定。此类方法包含，例如，电泳、毛细管电泳、高效液相色谱法(HPLC)、薄层色谱法(TLC)、超扩散色谱法、流体或凝胶沉淀反应、吸收光谱法、比色测定、分光光度测定、流式细胞术、免
疫扩散(单或双)、免疫电泳、蛋白质印迹、放射免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、
免疫荧光测定、电化学发光测定等。
[0806] 在一些实施例中，通过KHK mRNA或蛋白质水平的降低(例如，在肝活检中)来评估本发明的方法的功效。
[0807] 在本发明的方法的一些实施例中，向受试者施用iRNA，从而将iRNA递送到受试者体内的特定位点。KHK表达的抑制可以使用源自受试者体内特定部位(例如，肝脏或血液)的
流体或组织的样品中KHK mRNA或KHK蛋白的水平或水平变化的测量来评估。
[0808] 如本文所使用的，术语检测或确定分析物的水平被理解为执行步骤以确定是否存在材料(例如，蛋白质、RNA)。如本文所使用的，检测或确定的方法包含检测或确定低于所使
用的方法的检测水平的分析物水平。
[0809] VIII.本发明的预防和治疗方法
[0810] 本发明还提供了使用本发明的iRNA或含有本发明的iRNA的组合物来抑制KHK的表达，从而预防或治疗KHK相关病症的方法，所述病症例如肝病(例如，脂肪肝、脂肪性肝炎、非
酒精性脂肪性肝炎(NASH))、血脂异常(例如，高脂血症、高LDL胆固醇、低HDL胆固醇、高甘油
三酯血症、餐后高甘油三酯血症)、血糖控制病症(例如，胰岛素抵抗、2型糖尿病)、心血管疾
病(例如，高血压、内皮细胞功能障碍)、肾病(例如，急性肾病症、小管功能障碍、近端小管的促炎性变化、慢性肾病)、代谢综合征、脂肪细胞功能障碍、内脏脂肪沉积、肥胖、高尿酸血
症、痛风、进食障碍和糖渴求过度。在本发明的方法中，细胞可以在体外或体内与siRNA接
触，即细胞可以在受试者体内。
[0811] 适合用于使用本公开的方法进行处理的细胞可以是表达KHK基因的任何细胞，例如肝细胞。适用于本发明的方法的细胞可以是哺乳动物细胞，例如灵长类动物细胞(如人细
胞，包含嵌合非人动物中的人细胞，或非人灵长类动物细胞，例如猴细胞或黑猩猩细胞)或
非灵长类动物细胞。在某些实施例中，细胞是人细胞，例如人肝细胞。在本发明的方法中，
KHK在细胞中的表达被抑制至少50、55、60、65、70、75、80、85、90或95，或被抑制到低于测定的检测水平的水平。
[0812] 本发明的体内方法可以包含向受试者施用含有iRNA的组合物，其中所述iRNA包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与待施用RNAi药剂的哺乳动物的KHK基因的RNA转录物的至少
一部分互补。组合物可以通过本领域已知的任何方式施用，包含但不限于口服、腹膜内或肠
胃外通路，包含颅内(例如，脑室内、脑实质内和鞘内)、静脉内、肌内、皮下、透皮、气道(气溶胶)、鼻内、直肠和局部(包含经颊和舌下)施用。在某些实施例中，组合物通过静脉输注或注
射施用。在某些实施例中，组合物通过皮下注射施用。在某些实施例中，组合物通过肌内注
射施用。
[0813] 一方面，本发明还提供了用于抑制哺乳动物中的KHK基因的表达的方法。所述方法包含向哺乳动物施用包括靶向哺乳动物的细胞中的KHK基因的dsRNA的组合物，并且维持哺
乳动物足够的时间以获得KHK基因的mRNA转录物的降解，从而抑制细胞中的KHK基因的表
达。基因表达的减少可以通过本领域已知的任何方法和通过本文所描述的(例如，实例2中)
方法(例如，qRT‑PCR)来评估。蛋白质产生的减少可以通过本领域已知的任何方法来评估，
例如ELISA。在某些实施例中，穿刺肝活检样品用作组织材料，用于监测KHK基因或蛋白质表
达的减少。在其它实施例中，血样用作受试者样品，用于监测KHK蛋白表达的减少。KHK表达
的减少也可以通过通过检测果糖代谢的一个或多个指标来测量果糖代谢的降低来间接评
估，例如尿中存在果糖指示缺乏果糖代谢。
[0814] 本发明进一步提供了在有需要的受试者，例如被诊断患有KHK相关病症的受试者中的治疗方法，所述病症如肝病(例如，脂肪肝、脂肪性肝炎、非酒精性脂肪性肝炎(NASH))、
血脂异常(例如，高脂血症、高LDL胆固醇、低HDL胆固醇、高甘油三酯血症、餐后高甘油三酯
血症)、血糖控制病症(例如，胰岛素抵抗、2型糖尿病)、心血管疾病(例如，高血压、内皮细胞功能障碍)、肾病(例如，急性肾病症、小管功能障碍、近端小管的促炎性变化、慢性肾病)、代谢综合征、脂肪细胞功能障碍、内脏脂肪沉积、肥胖、高尿酸血症、痛风、进食障碍和糖渴求
过度。
[0815] 本发明进一步提供了在有需要的受试者中进行预防的方法。本发明的治疗方法包含将本发明的iRNA以预防有效量的靶向KHK基因的iRNA或包括靶向KHK基因的iRNA的药物
组合物向受试者施用，例如将受益于KHK表达减少的受试者。
[0816] 一方面，本发明提供了治疗患有将受益于KHK表达减少的病症的受试者的方法，所述病症例如KHK相关疾病，如肝病(例如，脂肪肝、脂肪性肝炎、非酒精性脂肪性肝炎
(NASH))、血脂异常(例如，高脂血症、高LDL胆固醇、低HDL胆固醇、高甘油三酯血症、餐后高
甘油三酯血症)、血糖控制病症(例如，胰岛素抵抗、2型糖尿病)、心血管疾病(例如，高血压、内皮细胞功能障碍)、肾病(例如，急性肾病症、小管功能障碍、近端小管的促炎性变化、慢性
肾病)、代谢综合征、脂肪细胞功能障碍、内脏脂肪沉积、肥胖、高尿酸血症、痛风、进食障碍和糖渴求过度。
[0817] 在某些实施例中，所述KHK相关病症是肝病，例如脂肪性肝病，如NAFLD或NASH。在某些实施例中，所述KHK相关病症是血脂异常，例如高血清甘油三酯、高血清LDL、高血清胆
固醇、低血清HDL、餐后高甘油三酯血症。在另一个实施例中，所述KHK相关病症是血糖控制
病症，例如并非由针对胰岛素的免疫反应引起的胰岛素抵抗、葡萄糖抵抗、2型糖尿病。在某
些实施例中，所述KHK相关病症是心血管疾病，例如高血压、内皮细胞功能障碍。在某些实施
例中，所述KHK相关病症是肾病，例如急性肾病症、小管功能障碍、近端小管的促炎性变化、
慢性肾病。在某些实施例中，所述疾病是代谢综合征。在某些实施例中，所述KHK相关病症是
脂质沉积或功能障碍疾病，例如内脏脂肪沉积、脂肪肝、肥胖。在某些实施例中，所述KHK相
关病症是高尿酸疾病，例如痛风、高尿酸血症。在某些实施例中，所述KHK相关病症是进食障
碍，如糖渴求过度。
[0818] 本发明的iRNA可以作为“游离iRNA”施用。在不存在药物组合物的情况下施用游离iRNA。裸露的iRNA可以在合适的缓冲溶液中。缓冲溶液可以包括乙酸盐、柠檬酸盐、醇溶蛋
白、碳酸盐或磷酸盐，或其任何组合。在一个实施例中，缓冲溶液是磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
可以调节含有iRNA的缓冲溶液的pH和渗透压，使得其适合向受试者施用。
[0819] 可替代地，本发明的iRNA可以作为药物组合物，如dsRNA脂质体调配物施用。
[0820] 将受益于KHK基因表达抑制的受试者是易患或被诊断患有KHK相关病症的受试者，所述病症如肝病(例如，脂肪肝、脂肪性肝炎、非酒精性脂肪性肝炎(NASH))、血脂异常(例
如，高脂血症、高LDL胆固醇、低HDL胆固醇、高甘油三酯血症、餐后高甘油三酯血症)、血糖控制病症(例如，胰岛素抵抗、2型糖尿病)、心血管疾病(例如，高血压、内皮细胞功能障碍)、肾病(例如，急性肾病症、小管功能障碍、近端小管的促炎性变化、慢性肾病)、代谢综合征、脂
肪细胞功能障碍、内脏脂肪沉积、肥胖、高尿酸血症、痛风、进食障碍和糖渴求过度。
[0821] 在一个实施例中，所述方法包含施用本文特征的组合物，使得靶KHK基因的表达降低，如每剂量约1、2、3、4、5、6、1‑6、1‑3或3‑6个月。在某些实施例中，组合物每3个月至6个月施用一次。
[0822] 在一些实施例中，可用于本文特征的方法和组合物的iRNA特异性靶向靶KHK基因的RNA(初级或加工的)。使用iRNA抑制这些基因的表达的组合物和方法可以如本文所描述
的制备和进行。
[0823] 根据本发明的方法的iRNA的施用可以实现KHK相关病症的预防或治疗，所述病症例如肝病(例如，脂肪肝、脂肪性肝炎、非酒精性脂肪性肝炎(NASH))、血脂异常(例如，高脂
血症、高LDL胆固醇、低HDL胆固醇、高甘油三酯血症、餐后高甘油三酯血症)、血糖控制病症
(例如，胰岛素抵抗、2型糖尿病)、心血管疾病(例如，高血压、内皮细胞功能障碍)、肾病(例
如，急性肾病症、小管功能障碍、近端小管的促炎性变化、慢性肾病)、代谢综合征、脂肪细胞功能障碍、内脏脂肪沉积、肥胖、高尿酸血症、痛风、进食障碍和糖渴求过度。
[0824] 可以向受试者施用治疗量的iRNA，如约0.01mg/kg至约200mg/kg。
[0825] 在一些实施例中，皮下施用iRNA，即通过皮下注射。一次或多次注射可用于向受试者递送期望剂量的iRNA。注射可以在一个时间段内重复进行。
[0826] 可以定期重复施用。在某些实施例中，在初始治疗方案之后，可以在不太频繁的基础上施用治疗。重复剂量方案可以包含定期施用治疗量的iRNA，如每月一次至每年一次。在
某些实施例中，iRNA约每月施用一次至约每三个月施用一次，或约每三个月施用一次至约
每六个月施用一次。
[0827] 本发明进一步提供了iRNA药剂或其药物组合物用于治疗将受益于KHK基因表达的减少和/或抑制的受试者(例如，患有KHK相关疾病的受试者)的方法和用途，其与其它药物
和/或其它治疗方法组合，例如与已知药物和/或已知治疗方法组合，如例如目前用于治疗
这些病症的那些药物或治疗方法。
[0828] 因此，在本发明的一些方面，包含本发明的单个iRNA药剂的方法进一步包含向受试者施用一种或多种另外的治疗剂。
[0829] iRNA药剂和另外的治疗剂和/或治疗可以同时或以相同的组合施用，例如肠胃外，或另外的治疗剂可以作为单独的组合物的一部分和/或在单独的时间施用，和/或通过本领
域已知或本文所描述的另一种方法施用。
[0830] IX.KHK相关疾病的诊断标准和治疗
[0831] 下文提供了用于治疗各种KHK相关疾病的诊断标准、治疗剂和考虑因素。
[0832] A.高尿酸血症
[0833] 血清尿酸水平不作为临床实验室值常规获得。然而，高尿酸血症(高尿酸)与多种疾病和病状相关，包含痛风、NAFLD、NASH、代谢病症、胰岛素抵抗(并非由针对胰岛素的免疫
反应引起)、心血管疾病、高血压和2型糖尿病。预期KHK表达降低可以用于预防或治疗与高
血清尿酸水平相关的一种或多种病状。此外，预期即使在不存在与高尿酸相关的一种或多
种病状的明显体征或症状的情况下，受试者将从血清尿酸水平正常化至正常血清尿酸水平
(例如，不超过6.8mg/dl，如不超过6mg/dl)或朝此方向正常化获得临床益处。
[0834] 高尿酸血症的动物模型包含例如大鼠和小鼠中的例如高果糖饮食，其可以诱导以下中的一种或多种：脂肪累积，包含脂肪肝、胰岛素抵抗、2型糖尿病、肥胖，包含内脏肥胖、代谢综合征、脂联素分泌减少、肾功能降低和炎症(参见例如Johnson等人(2013)《糖尿病
(Diabetes.)》62:3307‑3315)。氧嗪酸(一种尿酸酶抑制剂)的施用也可以用于诱导高尿酸
血症(参见例如Mazalli等人(2001)《高血压(Hypertens.)》38:1101‑1106)。高尿酸血症的
遗传模型包含购自杰克逊实验室(Jackson Laboratory)(/jaxmice.jax.org/strain/
tm1Bay
002223.html)的B6；129S7‑Uox /J小鼠，其发展高尿酸血症，具有10倍高水平的血清尿
酸水平。
[0835] 用于高尿酸血症的各种治疗是本领域已知的。然而，一些药剂只能用于有限的群体中。例如，别嘌呤醇是一种黄嘌呤氧化酶抑制剂，其用于降低血清尿酸水平，以用于治疗
多种病状，例如痛风、心血管疾病，包含缺血再灌注损伤、高血压、动脉粥样硬化和中风、和
炎性疾病(Pacher等人,(2006)《药理学评论(Pharma.Rev.)》58:87‑114)。然而，别嘌呤醇在
以下受试者中禁用：患有肾功能受损的受试者，例如患有慢性肾病、甲状腺机能减退症、高
胰岛素血症或胰岛素抵抗的受试者；或易患肾病或肾功能受损的受试者，例如患有高血压、
代谢病症、糖尿病的受试者，和老年人。此外，服用口服凝血剂或丙磺舒的受试者，以及服用
利尿剂，特别是噻嗪类利尿剂或可以降低肾功能或具有潜在肾毒性的其它药物的受试者，
均不应服用别嘌呤醇。
[0836] 在某些实施例中，本发明的组合物和方法与其它组合物和方法组合使用以治疗高尿酸血症，例如别嘌呤醇、羟嘌呤醇、非布司他。在某些实施例中，本发明的组合物和方法用
于治疗患有肾功能降低或例如由于年龄、合并症或药物相互作用而易患肾功能降低的受试
者。
[0837] B.痛风
[0838] 40名成人中约有1人罹患痛风，最常见的是30‑60岁的男性。痛风对女性的影响较少。痛风是多种类型的关节炎中的一种，其中可以通过治疗避免对关节的未来损伤。痛风的
特征在于由于由尿酸的肾清除率不足或尿酸产生过度引起的高尿酸血症，关节中的尿酸晶
体的炎性反应引起急性炎性关节炎的复发性发作。果糖相关的痛风有时与在肾、肠和肝中
表达的转运蛋白的变体相关。痛风的特征在于在关节和皮下中形成和沉积痛风石，即单钠
尿酸盐(MSU)晶体。与痛风相关的疼痛与痛风石的大小无关，而是针对MSU晶体的免疫反应
的结果。血清尿酸和痛风石大小的减小速率之间存在线性反比关系。例如，在一项对18名患
有痛风石性痛风的患者的研究中，在开始尿酸盐降低疗法的3个月内，血清尿酸在所有受试
者中下降至2.7–5.4mg/dL(0.16‑0.32mM)(Pascual和Sivera(2007)《风湿病年鉴
(Ann.Rheum.Dis.)》66:1056‑1058)。然而，在患有痛风少于10年的患者中，在归一化血清尿
酸的情况下，使MSU晶体从无症状的膝盖或第一MTP关节消失用了12个月，而在患有痛风超
过10年的患者中，则用了18个月。因此，对痛风的有效治疗不需要完全清除痛风石或缓解所
有症状，例如关节疼痛和肿胀、炎症，而是简单地减少痛风的至少一种体征或症状，例如降
低痛风发作的严重程度或频率，同时降低血清尿酸盐水平。
[0839] 痛风的动物模型包含氧嗪酸诱导的高尿酸血症(参见例如Jang等人(2014)《真菌生物学(Mycobiology.)》42:296‑300)。
[0840] 目前可用于痛风的治疗在许多受试者中是禁用的或无效的。如上文所论述，在很多群体中，特别是在肾功能受损的群体中，禁止使用别嘌呤醇，所述别嘌呤醇是降低患有痛
风的受试者的尿酸水平的常用一线治疗。此外，许多受试者用别嘌呤醇治疗失败，例如尽管
进行了治疗但仍存在痛风发作的受试者，或患有与别嘌呤醇相关的皮疹或超敏反应的受试
者。
[0841] 在某些实施例中，本发明的组合物和方法与其它药剂组合使用以减少血清尿酸。在某些实施例中，本发明的组合物和方法与用于治疗痛风症状的药剂组合使用，例如止痛
剂或抗炎剂，例如NSAIDS。在某些实施例中，本发明的组合物和方法用于治疗患有肾功能降
低或例如由于年龄、合并症或药物相互作用而易患肾功能降低的受试者。
[0842] C.肝病
[0843] NAFLD与高尿酸血症相关(Xu等人(2015)《肝脏病学杂志(J.Hepatol.)》62:1412‑1419)，这又与高果糖代谢相关。非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的定义要求(a)通过成像或通
过组织学证明存在肝脂肪变性的证据，以及(b)不存在继发性肝脂肪累积的原因，例如显著
的酒精消耗、脂肪生成药物的使用或遗传性病症。在大多数患者中，NAFLD与代谢风险因素
相关，如肥胖、糖尿病和血脂异常。NAFLD在组织学上进一步分类为非酒精性脂肪肝(NAFL)
和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。NAFL定义为存在肝脂肪变性，并且没有证据表明肝细胞气
球样形式的肝细胞损伤。NASH定义为存在肝脂肪变性和炎症，并且伴随有肝细胞损伤(气球
样)伴或不伴纤维化(Chalasani等人(2012)《肝脏病学(Hepatol.)》55:2005‑2023)。一般认
为，患有单纯脂肪变性的患者具有非常缓慢的组织学进展(如果有的话)，而患有NASH的患
者可以表现出到肝硬化期疾病的组织学进展。已有几项研究报道了患有NAFLD和NASH的患
者的长期结果。他们的研究结果可以总结如下:(a)与匹配的对照群体相比，患有NAFLD的患
者的总体死亡率增加，(b)在患有NAFLD、NAFL和NASH的患者中，最常见的死因是心血管疾
病，以及(c)患有NASH的患者(但不患有NAFL)的肝相关性死亡率增加。
[0844] NAFLD的动物模型包含各种高脂肪或高果糖喂养的动物模型。NAFLD的遗传模型包tm1Her
含购自杰克逊实验室(The Jackson Laboratory)的B6.129S7‑Ldlr /J和B6.129S4‑
tm1Hwu
Pten /J小鼠。
[0845] NAFLD的治疗通常是为了管控导致NAFLD发展的病状。例如，在需要时，患有血脂异常的患者会用药物治疗来正常化胆固醇或甘油三酯，以治疗或预防NAFLD的进一步进展。患
有2型糖尿病的患者用药剂治疗以正常化葡萄糖或胰岛素敏感性。生活方式改变，例如饮食
改变和运动，也用于治疗NAFLD。在NAFLD的小鼠模型中，用别嘌呤醇进行治疗可预防肝脂肪
变性的发展，并且还可显著改善小鼠中已建立的肝脂肪变性(Xu等人,《肝脏病学杂志
(J.Hepatol.)》62:1412‑1419,2015)。
[0846] 在某些实施例中，本发明的组合物和方法与其它药剂组合使用以减少血清尿酸。在某些实施例中，本发明的组合物和方法与用于治疗NAFLD症状的药剂组合使用。在某些实
施例中，本发明的组合物和方法用于治疗患有肾功能降低或例如由于年龄、合并症或药物
相互作用而易患肾功能降低的受试者。
[0847] D.血脂异常、血糖控制病症、代谢综合征和肥胖
[0848] 血脂异常(例如，高脂血症、高LDL胆固醇、低HDL胆固醇、高甘油三酯血症、餐后高甘油三酯血症)、血糖控制病症(例如，胰岛素抵抗、2型糖尿病)、代谢综合征、脂肪细胞功能
障碍、内脏脂肪沉积、肥胖和糖渴求过度与高果糖代谢相关。下文提供了病状的特性或诊断
标准。代谢病症和组分特征的动物模型包含各种高脂肪或高果糖喂养的动物模型。遗传模
ob
型包含瘦蛋白缺乏的B6.Cg‑Lep /J(通常称为ob或ob/ob)小鼠，其购自杰克逊实验室(The 
Jackson Laboratory)。
[0849] 下表提供了脂质的正常和异常空腹水平。
[0850]
[0851] 餐后高甘油三酯血症主要由富含甘油三酯的脂蛋白(TRL)的过度产生或分解代谢减少引起，并且是易感性遗传变异和如肥胖和胰岛素抵抗等医疗状况的后果。
[0852] 胰岛素抗性的特征在于存在以下中的至少一种：
[0853] 1.在两个不同时间测量的空腹血糖水平为100‑125mg/dL；或
[0854] 2.口服葡萄糖耐量测试结果为，在葡萄糖消耗后2小时的葡萄糖水平为140‑199mg/dL。
[0855] 如本文所使用，胰岛素抵抗不包含由于对施用的胰岛素的免疫反应而缺乏对胰岛素的反应，如在胰岛素依赖性糖尿病，特别是1型糖尿病的晚期阶段所经常发生。
[0856] 2型糖尿病的特征在于以下中的至少一种：
[0857] 1.在两个不同时间测量的空腹血糖水平≥126mg/dL；
[0858] 2.血红蛋白A1c(A1C)测试结果≥6.5％或更高；或
[0859] 3.口服葡萄糖耐量测试结果为，在葡萄糖消耗后2小时的葡萄糖水平≥200mg/dL。
[0860] 用于2型糖尿病和胰岛素抵抗的药理学治疗包含用药剂治疗来正常化血糖，所述药剂如二甲双胍(例如，glucophage、glumetza)、磺脲类(例如，格列苯脲、格列吡嗪、格列美脲)、美格列脲类(例如，瑞格列奈、那格列奈)、噻唑烷二酮类(罗格列酮、吡格列酮)、DPP‑4抑制剂(西格列汀、沙格列汀、林格列汀)、GLP‑1受体拮抗剂(艾塞那肽、利拉鲁肽)和SGLT2
抑制剂(例如，坎格列净、达格列净)。
[0861] 肥胖的特征在于过量体脂疾病。通过以千克(kg)为单位的体重除以以米(m)为单位的高度的平方来计算的体质指数(BMI)，为大多数但并非所有人提供了对体脂的合理估
计。通常，低于18.5的BMI被表征为体重过轻，18‑.5至24.9为正常，25.0‑29.9为超重，30.0‑
34.9为肥胖(I类)，35‑39.9为肥胖(II类)，并且40.0及更高为极度肥胖(III类)。
[0862] 用于评估皮下脂肪与内脏脂肪的方法提供在例如Wajchenberg(2000)皮下和内脏脂肪组织：其与代谢综合征的关系(Subcutaneous and visceral adipose tissue:their 
relation to the metabolic syndrome)《, 内分泌评论(Endocr Rev.)》21:697‑738中，所
述文献通过引用并入本文。
[0863] 代谢综合征的特征在于定义为以下五个代谢风险因素中的至少三个的条件簇：
[0864] 1.腰围较大(女性≥35英寸，或男性≥40英寸)；
[0865] 2.高甘油三酯水平(≥150mg/dl)；
[0866] 3.低HDL胆固醇(≤50mg/dl，或男性≤40mg/dl)；
[0867] 4.高血压(≥130/85)或正在服用治疗高血压的药物；和
[0868] 5.高空腹血糖(≥100mg/dl)或正在服用治疗高血糖的药物。
[0869] 与NAFLD一样，用于治疗代谢综合征的药剂取决于存在的特定风险因素，例如当脂质异常时使脂质正常化，当葡萄糖或胰岛素敏感性异常时使它们正常化。
[0870] 代谢综合征、胰岛素抵抗和2型糖尿病通常与肾功能降低或肾功能降低的可能性相关。
[0871] 在某些实施例中，本发明的组合物和方法用于治疗患有血脂异常、血糖控制病症、代谢综合征和肥胖的受试者。例如，在某些实施例中，本发明的组合物和方法用于患有代谢
综合征、胰岛素抵抗或2型糖尿病和慢性肾病的受试者。在某些实施例中，组合物和方法用
于患有代谢综合征、胰岛素抵抗或2型糖尿病的受试者，所述受试者患有心血管疾病、甲状
腺机能减退症或炎性疾病中的一种或多种；或是老年受试者(例如，超过65岁)。在某些实施
例中，组合物和方法用于患有代谢综合征、胰岛素抵抗或2型糖尿病的受试者，所述受试者
还正在服用药物，所述药物可以降低肾功能，如药物标签所证明。例如，在某些实施例中，本
发明的组合物和方法用于患有代谢综合征、胰岛素抵抗或2型糖尿病的受试者，所述受试者
正在用口服凝血剂或丙磺舒进行治疗。例如，在某些实施例中，本发明的组合物和方法用于
患有代谢综合征、胰岛素抵抗或2型糖尿病的受试者，所述受试者正在用利尿剂，特别是噻
嗪类利尿剂进行治疗。
[0872] 在某些实施例中，本发明的组合物和方法与其它药剂组合使用以减少血清尿酸。在某些实施例中，本发明的组合物和方法与用于治疗代谢综合征、胰岛素抵抗或2型糖尿病
的症状的药剂组合使用。在某些实施例中，受试者用例如降低血压的药剂，例如利尿剂、β‑
受体阻滞剂、ACE抑制剂、血管紧张素II受体阻滞剂、钙通道阻滞剂、α‑受体阻滞剂、α‑2受体拮抗剂、组合的α‑和β‑受体阻滞剂、中央激动剂、外周肾上腺素能抑制剂和血管扩张剂；降低胆固醇的药剂，例如他汀类、选择性胆固醇吸收抑制剂、树脂或降脂疗法；或正常化血糖
的药剂，例如二甲双胍、磺脲类、美格列脲、噻唑烷二酮类、DPP‑4抑制剂、GLP‑1受体拮抗剂和SGLT2抑制剂进行治疗。
[0873] 在某些实施例中，本发明的组合物和方法用于治疗患有肾功能降低或例如由于年龄、合并症或药物相互作用而易患肾功能降低的受试者。
[0874] iRNA药剂和另外的治疗剂可以同时或以相同的组合施用，例如肠胃外，或另外的治疗剂可以作为单独的组合物的一部分或在单独的时间施用，或通过本领域已知或本文所
描述的另一种方法施用。
[0875] E.心血管疾病
[0876] 在某些实施例中，本发明的组合物和方法用于治疗患有心血管疾病的受试者。例如，在某些实施例中，本发明的组合物和方法用于患有心血管疾病和慢性肾病的受试者。在
某些实施例中，所述组合物和方法用于患有心血管疾病的受试者，所述受试者患有代谢病
症、胰岛素抵抗、高胰岛素血症、糖尿病、甲状腺机能减退症或炎性疾病中的一种或多种。在
某些实施例中，所述组合物和方法用于患有心血管疾病的受试者，所述受试者还正在服用
药物，所述药物可以降低肾功能，如药物标签所证明。例如，在某些实施例中，本发明的组合
物和方法用于患有心血管疾病的受试者，所述受试者正在用口服凝血剂或丙磺舒进行治
疗。例如，在某些实施例中，本发明的组合物和方法用于患有心血管疾病的受试者，所述受
试者正在用利尿剂，特别是噻嗪类利尿剂进行治疗。例如，在某些实施例中，本发明的组合
物和方法用于患有心血管疾病的受试者，所述受试者用别嘌呤醇治疗失败。
[0877] 在某些实施例中，本发明的组合物和方法与其它药剂组合使用以减少血清尿酸。在某些实施例中，本发明的组合物和方法与用于治疗心血管疾病的症状的药剂组合使用，
所述药剂例如降低血压的药剂，例如利尿剂、β‑受体阻滞剂、ACE抑制剂、血管紧张素II受体阻滞剂、钙通道阻滞剂、α‑受体阻滞剂、α‑2受体拮抗剂、组合的α‑和β‑受体阻滞剂、中央激动剂、外周肾上腺素能抑制剂和血管扩张剂；降低胆固醇的药剂，例如他汀类、选择性胆固
醇吸收抑制剂、树脂或降脂疗法。
[0878] F.肾病
[0879] 肾病包含例如急性肾病症、小管功能障碍、近端小管的促炎性变化和慢性肾病。
[0880] 当肾突然变得无法从血液过滤废物产物，从而导致危险水平的废物在血清中累积和全身化学不平衡时，便会发生急性肾(肾)衰竭。急性肾衰竭可能在数小时或数天内迅速
发展，并且在已经住院的个体中最为常见，尤其是在需要重症监护的危重个体中。急性肾衰
竭可能是致命的，并且需要密集治疗。然而，急性肾衰竭可以是可逆的。如果你身体健康状
况良好，你可能恢复正常或几乎正常的肾功能。
[0881] 慢性肾病，也称为慢性肾衰竭，描述了肾功能的逐渐丧失。当慢性肾病达到晚期时，危险水平的流体、电解质和废物可能会在体内累积。肾病的体征和症状可以包含恶心、
呕吐、食欲不振、疲劳和无力、睡眠问题、排尿量的变化、头脑敏锐度降低、肌肉颤搐和痉挛、打嗝、脚和踝部肿胀、持续性瘙痒、胸痛(如果流体在心脏内膜周围积累)、呼吸短促(如果流
体在肺部中积累)、难以控制的高血压(高血压)。慢性肾病的体征和症状通常是非特异性
的，并且可能缓慢发展，并且可能直到发生不可逆的损伤时才会出现。
[0882] 肾病通过去除正在引起肾损伤的破坏剂或病状来治疗，例如正常化血压以改善肾功能，结束可能诱导肾损伤的药剂的治疗，减少正在引起肾损伤的炎症，或通过提供肾支持
(例如，肾透析)以辅助肾功能。
[0883] 通常使用一种或多种常规实验室测试，即BUN(血尿素氮)、肌酐(血液)、肌酐(尿液)或肌酐清除率来确定肾功能(参见例如www.nlm.nih.gov/medlineplus/ency/article/
003435.htm)。所述测试还可以是其它器官中的病状的诊断。
[0884] 通常，6至20mg/dL的BUN水平被认为是正常的，但正常值在不同实验室之间可能会有所不同。高BUN水平可以指示肾病，包含肾小球肾炎、肾盂肾炎和急性小管坏死或肾衰竭。
[0885] 男性的血液肌酐的正常结果为0.7至1.3mg/dL，而女性为0.6至1.1mg/dL。高血液肌酐可以指示由于肾损伤或衰竭、感染或血流量减少而引起的肾功能受损。
[0886] 尿液肌酐(24小时样品)值可以在500至2000mg/天的范围内。结果取决于年龄和瘦体质的量。男性的正常结果为每天14至26mg/kg体质，而女性为每天11至20mg/kg体量。异常
结果可以指示肾损伤，如小管细胞的损伤、肾衰竭、流向肾的血流量减少或肾感染(肾盂肾
炎)。
[0887] 肌酐清除率测试通过将尿液中的肌酐水平与血液中的肌酐水平进行比较，帮助提供关于肾功能的信息。清除率通常以毫升/分钟(ml/分钟)为单位测量。男性的正常值为97
至137ml/分钟，而女性为88至128ml/分钟。低于正常的肌酐清除率可以指示肾损伤，如小管
细胞的损伤、肾衰竭、流向肾的血流量减少或肾中的肾小球过滤减少。
[0888] 在某些实施例中，本发明的组合物和方法可以用于治疗肾病。预期此类药剂不会对肾造成损伤。
[0889] X.试剂盒
[0890] 在某些方面，本公开提供了试剂盒，所述试剂盒包含含有siRNA化合物(例如，双链siRNA化合物或siRNA化合物(例如，前体，例如可以加工成siRNA化合物的较大siRNA化合
物，或编码siRNA化合物的DNA，例如双链siRNA化合物或ssiRNA化合物，或其前体))的药物
调配物的合适容器。
[0891] 此类试剂盒包含一种或多种dsRNA药剂和使用说明书，例如，施用预防或治疗有效量的dsRNA药剂的说明书。dsRNA药剂可以在小瓶或预先填充的注射器中。所述试剂盒可以
任选地进一步包括用于施用dsRNA药剂的装置(例如，注射装置，如预填充注射器)，或用于
测量KHK的抑制的装置(例如，用于测量KHK mRNA、KHK蛋白和/或KHK活性的抑制的装置)。用
于测量KHK的抑制的此类装置可以包括用于从受试者获得样品(例如，血浆样品)的装置。本
发明的试剂盒可以任选地进一步包括用于确定治疗有效量或预防有效量的装置。
[0892] 在某些实施例中，药物调配物的各个组分可以提供在一个容器中，例如小瓶或预填充的注射器。可替代地，可能期望在两个或更多个容器中单独提供药物调配物的组分，例
如，一个容器用于siRNA化合物制剂，并且至少另一个用于载体化合物。试剂盒可以包装在
许多不同的配置中，如单个盒子中的一个或多个容器。可以将不同的组分组合，例如，根据
随试剂盒提供的说明书。这些组分可以根据本文所描述的方法进行组合，例如，以制备和施
用药物组合物。试剂盒还可以包含递送装置。
[0893] 本发明通过以下实例进一步说明，所述实例不应被解释为限制性的。在本申请中引用的所有参考文献、专利和公开的专利申请的全部内容以及非正式序列表由此通过引用
并入本文。
[0894] 实例
[0895] 实例1.iRNA合成
[0896] 试剂来源
[0897] 在本文没有具体给出药剂来源的情况下，此类试剂可以从任何分子生物学试剂供应商处获得，其质量/纯度标准适用于分子生物学。
[0898] siRNA设计
[0899] 靶向人KHK的siRNA(人NCBI refseqID:XM_017004061.1；NCBI GeneID:3795)是使用定制R和Python脚本设计的。人KHK REFSEQ mRNA的长度为2283个碱基。
[0900] 未经修饰的KHK有义和反义链核苷酸序列的详细列表在表2、5和8中示出。经修饰的KHK有义和反义链核苷酸序列的详细列表在表3、6和9中示出。
[0901] 应理解，在整个应用程序中，没有小数的双链体名称等效于具有仅引用双链体的批号的具有小数的双链体名称。例如，AD‑959917等效于AD‑959917.1。
[0902] siRNA合成
[0903] 使用本领域已知的方法设计、合成并制备了siRNA。
[0904] 简而言之，siRNA序列是使用Mermade  192合成器(生物自动化公司(BioAutomation))在1μmol的规模上合成的，所述合成器在固相载体上具有亚磷酰胺化学。
固相载体是受控孔玻璃 装载有定制的GalNAc配体(3'‑GalNAc缀合物)、通
用固相载体(AM Chemicals(AM化学公司))或所关注的第一核苷酸。辅助合成试剂和标准2‑
氰基乙基亚磷酰胺单体(2'‑脱氧‑2'‑氟、2'‑O‑甲基、RNA、DNA)从赛默飞世尔公司(Thermo Fisher)(威斯康星州密尔沃基(Milwaukee,WI))、兆维科技发展有限公司(Hongene)(中国
(China))或Chemgenes公司(Chemgenes)(美国马萨诸塞州威尔明顿(Wilmington,MA,USA))
获得。另外的亚磷酰胺单体从商业供应商处采购，在内部制备，或使用来自各种CMO的定制
合成采购。在乙腈或9:1乙腈:DMF中以100mM的浓度制备亚磷酰胺，并且使用5‑乙基硫代‑
1H‑四唑(ETT，0.25M于乙腈中)以400秒的反应时间偶联。使用3‑((二甲基氨基‑亚甲基)氨
基)‑3H‑1,2,4‑二噻唑‑3‑硫酮(DDTT，从Chemgenes公司(美国马萨诸塞州威尔明顿)获得)
于无水乙腈/吡啶(9:1v/v)中的100mM溶液产生硫代磷酸酯键。氧化时间为5分钟。所有序列
都是在最后去除DMT基团的情况下合成的(“DMT‑Off”)。
[0905] 固相合成完成后，用300μL的甲胺(40％水溶液)在室温下在96孔板中处理固相支持的寡核糖核苷酸约2小时，以从固相载体中切割，并且随后去除所有另外的碱不稳定保护
基。对于含有用叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)基团保护的任何天然核糖核苷酸键(2'‑OH)
的序列，使用TEA.3HF(三乙基胺三氢氟酸盐)进行第二次脱保护步骤。向甲胺水溶液中的每
个寡核苷酸溶液中添加200μL的二甲基亚砜(DMSO)和300μL TEA.3HF，并且将溶液在60℃下
温育约30分钟。温育后，使板达到室温，并且通过添加1mL的9:1乙腈:乙醇或1:1乙醇:异丙
醇沉淀粗寡核苷酸。然后将板在4℃下离心45分钟，并且在多通道移液管的帮助下小心倾析
上清液。将寡核苷酸颗粒重悬于20mM NaOAc中，并且随后在配备有自动进样器、UV检测器、
电导率计和级分收集器的Agilent LC系统上使用HiTrap尺寸排除柱(5mL，通用电气医疗集
团(GE Healthcare))脱盐。在96孔板中收集脱盐样品，并且然后通过LC‑MS和UV光谱法进行
分析，以分别证实材料的同一性和定量。
[0906] 在Tecan液体处理机器人上进行单链的双面折叠。在96孔板中，将有义和反义单链以等摩尔比组合到1x PBS中的最终浓度10μM，将板密封，在100℃下温育10分钟，并且随后
允许其在2小时至3小时内缓慢恢复到室温。证实每个双链体的浓度和同一性，并且然后用
于体外筛选测定。
[0907] 实例2.体外筛选方法
[0908] HepG2细胞培养和96孔转染
[0909] HepG2细胞在37℃下5％ CO2的气氛中，在补充有10％ FBS(ATCC)的Eagle最低必需培养基(吉博科公司(Gibco))中生长至接近汇合，然后通过胰蛋白酶消化从板中释放。转
染是通过将18.5μl的Opti‑MEM加0.25μl的Lipofectamine RNAiMax每孔(加利福尼亚州卡
尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen,Carlsbad CA.)，目录号13778‑150)添加到5μl的每种
siRNA双链体到96孔板中的单个孔中来进行的。然后将混合物在室温下温育15分钟。然后将
4
八十μl不含抗生素的含有～2x10个HepG2细胞的完全生长培养基添加到siRNA混合物中。
在RNA纯化之前将细胞温育24小时。在10nM、1nM和0.1nM的最终双链体浓度下进行剂量实
验。
[0910] 使用DYNABEADS mRNA分离试剂盒(InvitrogenTM，部件#：610‑12)的总RNA分离
[0911] 将细胞裂解在每孔含有3μL珠的75μl裂解/结合缓冲液中，并且在静电振荡器上混合10分钟。洗涤步骤在Biotek EL406上使用磁性板支撑件进行自动化。在缓冲液A中将珠洗
涤一次(在90μL中)，在缓冲液B中洗涤一次，并在缓冲液E中洗涤两次，其间有抽吸步骤。在
最终抽吸之后，将完整的10μL RT混合物添加到每个孔中，如下文所描述的。
[0912] 使用ABI高容量cDNA逆转录试剂盒(加利福尼亚州福斯特市的应用生物系统公司(Applied Biosystems,Foster City,CA)，目录号4368813)进行cDNA合成
[0913] 每个反应每个孔添加1μl 10X缓冲液、0.4μl 25X dNTP、1μl随机引物、0.5μl逆转录酶、0.5μl RNase抑制剂和6.6μl H2O的主混合物。将板密封，在静电振荡器上搅拌10分
钟，然后在37℃下温育2小时。在此之后，将板在80℃下搅拌8分钟。
[0914] 实时PCR
[0915] 将两微升(μl)的cDNA添加到384孔板(罗氏公司(Roche)，目录号04887301001)中每孔含有0.5μl人GAPDH TaqMan探针(4326317E)、0.5μl人KHK、2μl无核酸酶水和5μl 
Lightcycler 480探针主混合物(罗氏公司，目录号04887301001)的主混合物中。实时PCR是
在LightCycler480实时PCR系统(罗氏公司)中进行的。
[0916] 为了计算相对倍数变化，使用Δ ΔCt方法分析数据，并且将其相对于用10nM AD‑1955转染的细胞或模拟转染的细胞进行的测定归一化。使用XLFit的4参数拟合模型计算
IC50，并且将其相对于用AD‑1955转染或模拟转染的细胞归一化。AD‑1955的有义和反义序
列为：有义：cuuAcGcuGAGuAcuucGAdTsdT(SEQ  ID  NO:18)和反义
UCGAAGuACUcAGCGuAAGdTsdT(SEQ ID NO:19)。
[0917] 表2和3中列出的dsRNA药剂在HepG2细胞中的转染测定的结果在表4中示出。
[0918] 表1.用于核酸序列表示的核苷酸单体的缩略语。将理解，当存在于寡核苷酸中时，这些单体通过5'‑3'‑磷酸二酯键相互连接；并且应理解，当核苷酸含有2'‑氟修饰时，则氟
替换亲本核苷酸中所述位置处的羟基(即其为2'‑脱氧‑2'‑氟核苷酸)。
[0919]
[0920]
[0921]
[0922]
[0923]
[0924]
[0925]
[0926]
[0927]
[0928]
[0929]
[0930]
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[0932]
[0933]
[0934]
[0935]
[0936]
[0937]
[0938]
[0939]
[0940]
[0941]
[0942]
[0943]
[0944]
[0945]
[0946]
[0947]
[0948]
[0949]
[0950]
[0951]
[0952]
[0953]
[0954] 表4.HepG2细胞中的KHK剂量筛选
[0955]
[0956]
[0957]
[0958]
[0959]
[0960] 实例3.另外的dsRNA双链体的设计、合成和体外筛选
[0961] 使用本领域已知的和上文实例1中描述的方法设计、合成和制备另外的siRNA。
[0962] 另外的未经修饰的KHK有义和反义链核苷酸序列的详细列表在表5中示出。经修饰的KHK有义和反义链核苷酸序列的详细列表在表6中示出。
[0963] 对于转染，Hep3b细胞(弗吉尼亚州马纳萨斯的美国菌种保藏中心(ATCC,Manassas,VA))在37℃下5％ CO2的气氛中，在补充有10％ FBS(ATCC)的Eagle最低必需培
养基(吉博科公司(Gibco))中生长至接近汇合，然后通过胰蛋白酶消化从板中释放。转染是
通过将7.5μl的Opti‑MEM加0.1μl的Lipofectamine RNAiMax每孔(加利福尼亚州卡尔斯巴
德的英杰公司(Invitrogen,Carlsbad CA.)，目录号13778‑150)添加到2.5μl的每种siRNA
双链体到384孔板中的单个孔中来进行的。然后将混合物在室温下温育15分钟。然后将四十
4
μl不含抗生素的含有～1.5x10 个Hep3b细胞的完全生长培养基添加到siRNA混合物中。在
RNA纯化之前将细胞温育24小时。在10nM的最终双链体浓度下进行单剂量实验。
[0964] 使用DYNABEADS进行总RNA分离。简而言之，将细胞裂解在每孔含有3μL珠的10μl裂解/结合缓冲液中，并在静电振荡器上混合10分钟。洗涤步骤在Biotek EL406上使用磁性板
支撑件进行自动化。在缓冲液A中将珠洗涤一次(在3μL中)，在缓冲液B中洗涤一次，并在缓
冲液E中洗涤两次，其间有抽吸步骤。在最终抽吸之后，将完整的12μL RT混合物添加到每个
孔中，如下文所描述的。
[0965] 对于cDNA合成，每个反应每个孔添加1.5μl 10X缓冲液、0.6μl 10XdNTP、1.5μl随机引物、0.75μl逆转录酶、0.75μl RNase抑制剂和9.9μl H2O的主混合物。将板密封，在静电振荡器上搅拌10分钟，然后在37℃下温育2小时。在此之后，将板在80℃下搅拌8分钟。
[0966] 如上所述进行RT‑qPCR，并且如上所述计算相对倍数变化。
[0967] 表5和6中列出的dsRNA药剂在Hep3b细胞中的转染测定的结果在表7中示出。
[0968] 表8提供了所选dsRNA药剂的未经修饰KHK有义和反义链核苷酸序列的列表。表9提供了所选dsRNA药剂的经修饰的KHK有义和反义链核苷酸序列的列表。
[0969]
[0970]
[0971]
[0972]
[0973]
[0974] 表7.Hep3b细胞中的KHK单剂量筛选
[0975]双链体名称 消息剩余％(qPCR)
AD‑1423317 9.38
AD‑1423327 7.75
AD‑1423336 7.70
AD‑1423311 6.06
AD‑1423320 21.59
AD‑1423324 10.44
AD‑1423329 12.28
AD‑1423333 9.09
AD‑1423330 8.78
AD‑1423310 6.66
AD‑1423314 8.66
AD‑1423316 10.59
AD‑1423322 18.97
AD‑1423325 16.15
AD‑1423334 10.71
AD‑1423312 12.77
AD‑1423313 9.33
AD‑1423315 7.66
AD‑1423318 13.43
AD‑1423319 8.34
AD‑1423321 11.82
AD‑1423323 9.65
AD‑1423326 5.15
AD‑1423328 22.84
AD‑1423331 13.21
AD‑1423332 10.54
AD‑1423335 8.60
[0976]
[0977]
[0978]
[0979]
[0980]
[0981] 实例4.另外的dsRNA双链体的设计、合成和体外筛选
[0982] 使用上文实例1中描述的方法设计、合成和制备另外的siRNA。
[0983] 另外的未经修饰的KHK有义和反义链核苷酸序列的详细列表在表10中示出。经修饰的KHK有义和反义链核苷酸序列的详细列表在表11中示出。
[0984]
[0985]
[0986]
[0987]
[0988]
[0989]
[0990]
[0991]
[0992]
[0993]
[0994]
[0995]
[0996]
[0997]
[0998]
[0999]
[1000]
[1001]
[1002]
[1003]
[1004]
[1005]
[1006] 实例5.另外的dsRNA双链体的设计、合成和体外筛选
[1007] 基于体外分析，进行结构‑活性关系(SAR)分析。特别地，设计、合成并测定另外的双链体。
[1008] 使用上述方法设计、合成并制备siRNA。如上所述，在含这些siRNA的Hep3B和PCH细胞中进行体外筛选测定。
[1009] 未经修饰的KHK有义和反义链核苷酸序列的详细列表在表12中示出。经修饰的KHK有义和反义链核苷酸序列的详细列表在表13中示出。
[1010] 对于转染，细胞(弗吉尼亚州马纳萨斯的美国菌种保藏中心(ATCC,Manassas,VA))在37℃下5％ CO2的气氛中，在补充有10％ FBS(ATCC)的Eagle最低必需培养基(吉博科公
司(Gibco))中生长至接近汇合，然后通过胰蛋白酶消化从板中释放。转染是通过将7.5μl的
Opti‑MEM加0.1μl的Lipofectamine RNAiMax每孔(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司
(Invitrogen,Carlsbad CA.)，目录号13778‑150)添加到2.5μl的每种siRNA双链体到384孔
板中的单个孔中来进行的。然后将混合物在室温下温育15分钟。然后将四十μl不含抗生素
4
的含有～1.5x10个细胞的完全生长培养基添加到siRNA混合物中。在RNA纯化之前将细胞
温育24小时。在10、1和0.1nM的最终双链体浓度下进行单剂量实验。
[1011] 使用DYNABEADS进行总RNA分离。简而言之，将细胞裂解在每孔含有3μL珠的10μl裂解/结合缓冲液中，并在静电振荡器上混合10分钟。洗涤步骤在Biotek EL406上使用磁性板
支撑件进行自动化。在缓冲液A中将珠洗涤一次(在3μL中)，在缓冲液B中洗涤一次，并在缓
冲液E中洗涤两次，其间有抽吸步骤。在最终抽吸之后，将完整的12μL RT混合物添加到每个
孔中，如下文所描述的。
[1012] 对于cDNA合成，每个反应每个孔添加1.5μl 10X缓冲液、0.6μl 10XdNTP、1.5μl随机引物、0.75μl逆转录酶、0.75μl RNase抑制剂和9.9μl H2O的主混合物。将板密封，在静电振荡器上搅拌10分钟，然后在37℃下温育2小时。在此之后，将板在80℃下搅拌8分钟。
[1013] 如上所述进行RT‑qPCR，并且如上所述计算相对倍数变化。表12和13中列出的dsRNA药剂在Hep3B细胞中的转染测定的结果在表14中示出。表12和13中列出的dsRNA药剂
在原代食蟹猴肝细胞(PCH)中的转染测定的结果在表15中示出。
[1014] 对于 荧光素酶测定，细胞(弗吉尼亚州马纳萨斯的美国菌种保藏中心(ATCC,Manassas,VA))在37℃下5％ CO2的气氛中，在补充有10％ FBS(ATCC)的Eagle最低
必需培养基(吉博科公司(Gibco))中生长至接近汇合，然后通过胰蛋白酶消化从板中释放。
在含有人KHK基因组序列的psiCHECK2质粒中生成 荧光素酶构建体。使用
Lipofectamine 2000(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen,Carlsbad CA.)，
4
目录号11668‑019)将每个双荧光素酶质粒与siRNA共转染(表12和13)到大约2x10个细胞
中。对于96孔板的每个孔，将0.5μl Lipofectamine添加到100ng质粒载体和14.8μl Opti‑
MEM中的单一siRNA(表12和13)中，并在室温下复合15分钟。然后将混合物添加到细胞中，将
所述细胞重悬浮于80μl新鲜完全培养基中。在测量荧光素酶之前将细胞温育24小时。在10、
1和0.1nM的最终双链体浓度下进行单剂量实验。
[1015] 在转染siRNA后四十八小时，测量Firefly(转染对照)和Rinella(与KHK靶序列融合)荧光素酶。首先，从细胞中去除培养基。然后，通过将等于培养基体积的75μl
荧光素酶试剂添加到每个孔中并混合，测量Firefly荧光素酶活性。将混合物
在室温下温育30分钟，然后在Spectramax(分子装置(Molecular Devices))上测量发光
(500nm)以检测Firefly荧光素酶信号。通过将75μl室温 Stop& 试剂添加
到每个孔中，并将板温育10‑15分钟，然后再次测量发光以确定Renilla荧光素酶信号，测量
Renilla荧光素酶活性。 Stop& 试剂淬灭了firefly荧光素酶信号，并维
持了Renilla荧光素酶反应的发光。通过将每个孔内的Renilla(KHK)信号相对于Firefly
(对照)信号归一化来确定siRNA活性。然后相对于用相同载体转染但未用siRNA处理或用非
靶向siRNA处理的细胞评估siRNA活性的量值。所有转染以四联进行。
[1016] 表16示出了用表12和13中指示的药剂转染的细胞中的单剂量筛选的荧光素酶测定结果。
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[1052]
[1053]
[1054]
[1055] 表14.Hep3b细胞中的KHK单剂量筛选
[1056]
[1057]
[1058]
[1059]
[1060]
[1061]
[1062] 表15.PCH细胞中的KHK单剂量筛选
[1063]
[1064]
[1065]
[1066]
[1067]
[1068]
[1069] 表16.KHK单剂量筛选(双荧光素酶测定)
[1070]
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[1072]
[1073]
[1074]
[1075]
[1076] 实例6：siRNA‑GalNAC缀合物在非人灵长类动物中的作用针对在非人灵长类动物中的有效性，对从上述体外研究标识出的候选物，即双链体AD‑1613062、AD‑1613073、AD‑
1613242、AD‑1613243、AD‑1613246、AD‑1613247、AD‑1613400、AD‑1634397、AD‑1634424和AD‑1634425的作用进一步进行研究。具体地，将单剂量3mg/kg的AD‑1613062、AD‑1613073、AD‑1613242、AD‑1613243、AD‑1613246、AD‑1613247、AD‑1613400、AD‑1634397、AD‑1634424或AD‑1634425皮下施用于食蟹猴。在给药后第29、50和78天收集血清和组织样品。
[1077] 使用马歇雷‑纳格尔公司(Macherey‑Nagel)的NucleoMag RNA试剂盒，通过基于磁珠的提取方法从肝组织中提取mRNA。使用应用生物系统公司(Applied Biosystems)
SuperScript IV VILO主混合物生成cDNA。使用基于Taqman探针的qPCR来定量KHK mRNA，其
相对于两个管家基因ARL6IP4和PPIB的几何平均值归一化。
[1078] 使用平行反应监测(PRM)，在正离子模式中，经由液相色谱法与质谱仪联用(LC‑MS)进行食蟹猴肝中的KHK蛋白的靶向定量。被选择用于定量的特征肽序列是HLGFQSAGEALR
(UniProtKB‑A0A2K5V1R8‑1，氨基酸位置198‑209)。
[1079] 图2示出了单次3mg/kg剂量的所选双链体的施用对给药后第29天的KHK mRNA和蛋白质水平的影响。
[1080] 图3示出了单次3mg/kg剂量的所选双链体的施用对给药后第50天的KHK mRNA水平的影响。
[1081] 图4示出了单次3mg/kg剂量的所选双链体的施用对给药后第78天的KHK mRNA水平的影响。
[1082] 数据证明，指示的药剂，例如AD‑1613400和AD‑1613243，在持久且强效地抑制KHK mRNA和蛋白质表达方面是有效的。
[1083] 等效形式
[1084] 本领域技术人员会认识到或能够使用不超过例行实验确定本文描述的具体实施例和方法的许多等效形式。此类等效形式旨在被涵盖在以下权利要求书的范围内。

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