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首页 / 专利分类库 / 医学或兽医学;卫生学 / 用于自身免疫的新型mRNA疫苗

用于自身免疫的新型mRNA疫苗

申请号 CN202280050156.3 申请日 2022-06-22 公开(公告)号 CN117751191A 公开(公告)日 2024-03-22
申请人 纽约市哥伦比亚大学理事会; 发明人 雷米·J·克鲁索; 雷布玛·菲尔代萨·菲特; 豪尔赫·波斯蒂戈·费尔南德斯;
摘要 本公开描述了包含Endotope构建体、STAT1c和miR142靶位点的序列的核酸构建体。在一种实例中,公开了包括Endotope构建体和包含编码组成型活性STAT1(例如STAT1c)的核酸序列的STAT1构建体的组合物,其中Endotope和STAT1构建体各自包括miR142靶位点。在替代的实例中,公开了单一构建体,其包括Endotope构建体和STAT1构建体连同miR142靶位点。核酸构建体可以 包装 到聚阳离子分子或脂质体中以产生用于有效细胞 转染 的纳米颗粒。
权利要求

1.用于向受试者给药的两种或更多种核酸构建体,包括(a)第一核酸构建体;和(b)第二核酸构建体;所述第一核酸构建体包括编码至少一种内体靶向信号的至少一种核酸序列、编码至少一种CD4表位的至少一种核酸序列、编码至少一种切割位点的至少一种核酸序列、编码至少一种CD8表位的至少一种核酸序列、以及至少一种miR142靶位点核酸序列;所述第二核酸构建体包括编码STAT1的至少一种核酸序列和至少一种miR142靶位点核酸序列。
2.根据权利要求1所述的核酸构建体,所述核酸构建体是DNA。
3.根据权利要求1所述的核酸构建体,所述核酸构建体是mRNA。
4.根据权利要求1‑3中任一项所述的核酸构建物,其中,所述至少一种CD4表位或CD8表位包括参与自身免疫性疾病病症的抗原的至少一部分。
5.根据权利要求1‑4中任一项所述的核酸构建体,其中,所述抗原是选自以下的至少一种:胰岛素原、胰岛素、GAD65、IA‑2、IGRP、ZnT8、杂合胰岛素肽、Charmogranin A、IAPP、ICA69、IA‑2β、RegII、GPR78、HSP60、HSP70、SEQ ID NO:11‑17、髓磷脂蛋白质、蛋白脂质蛋白质、髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白、次要抗原、髓磷脂相关抗原、髓磷脂相关少突胶质细胞碱性蛋白质、2',3'‑环‑核苷酸3'‑磷酸二酯酶、S100β、转醇酶、胶原蛋白、软骨糖蛋白
39、聚集蛋白聚糖G1、类湿因子、瓜酸肽、氨甲酰化抗原、PAD4、BRAF、HSP65、基底膜层粘连蛋白、LL37、颗粒蛋白前体、桥粒黏蛋白3、Pso p27、埃兹蛋白、乳腺丝抑蛋白、过化物氧还蛋白2、HSP 27、XVII型胶原蛋白、蛋白13、hnRNP‑A1、FLJ00294、hnRNP‑C1/C2、SCG、GLCDAC05、α‑内磺肽、NOL8、GFGR3、成束蛋白、信号识别颗粒亚基14、EPF、CUZD1、GP2、HMGB1/HMGB2、ASCA自身抗体、FAM84A、VII型胶原蛋白、补体C3、泛素化因子e4A(UBE4A)、CBir1鞭毛蛋白自身抗体、α3(IV)NC1、BP180自身抗体、半乳凝素‑3自身抗体、过氧化氢酶、α‑烯醇化酶或乳蛋白自身抗体。
6.根据权利要求1‑5中任一项所述的核酸构建体,其中,所述自身免疫性疾病病症选自由以下组成的组:1型糖尿病、类风湿性关节炎、多发性硬化、屑病、克罗恩病和溃疡性结肠炎。
7.根据权利要求1‑6中任一项所述的核酸构建体,其中,所述至少一种CD4表位的氨基酸序列选自SEQ ID NO:31、33、35、37、39、41或43,或者包括与其具有至少95%同一性的序列。
8.根据权利要求1‑6中任一项所述的核酸构建体,其中,所述至少一种CD8表位的氨基酸序列选自SEQ ID NO:53、55、56或57,或者包括与其具有至少95%同一性的序列。
9.根据权利要求1‑6中任一项所述的核酸构建体,其中,所述STAT1的序列被突变以防止去磷酸化
10.根据权利要求1‑6中任一项所述的核酸构建体,其中,所述STAT1的序列选自SEQ ID NO:1或2,或者包括与其具有至少95%同一性的序列。
11.根据权利要求1‑10中任一项所述的核酸构建体,其中,所述miR142靶位点核酸序列选自SEQ ID NO:9或10,或者包括与其具有至少95%同一性的序列。
12.一种分离的核酸构建体,包括编码至少一种内体靶向信号的至少一种核酸序列、编码至少一种CD4表位的至少一种核酸序列、编码至少一种切割位点的至少一种核酸序列、编码至少一种CD8表位的至少一种核酸序列;编码STAT1的至少一种核酸序列;以及至少一种miR142靶位点核酸序列。
13.根据权利要求12所述的核酸构建体,所述核酸构建体是DNA。
14.根据权利要求12所述的核酸构建体,所述核酸构建体是mRNA。
15.根据权利要求12所述的核酸构建体,其中,所述序列从5'至3'的顺序为:编码至少一种内体靶向信号的至少一种核酸序列、编码至少一种CD4表位的至少一种核酸序列、编码至少一种切割位点的至少一种核酸序列、编码至少一种CD8表位的至少一种核酸序列;编码STAT1的至少一种核酸序列;以及至少一种miR142靶位点核酸序列。
16.根据权利要求12所述的核酸构建体,所述至少一种CD4表位或CD8表位包括参与自身免疫性疾病病症的抗原的至少一部分。
17.根据权利要求12‑15中任一项所述的核酸构建体,其中,所述抗原是选自表1的至少一种。
18.根据权利要求12‑17中任一项所述的核酸构建体,其中,所述自身免疫性疾病病症选自由以下组成的组:1型糖尿病、类风湿性关节炎、多发性硬化、银屑病、克罗恩病和溃疡性结肠炎。
19.根据权利要求12‑18中任一项所述的核酸构建体,其中,所述CD4表位的序列选自SEQ ID NO:31、33、35、37、39、41或43,或者包括与其具有至少95%同一性的序列。
20.根据权利要求12‑18中任一项所述的核酸构建体,其中,所述CD8表位的序列选自SEQ ID NO:53、55、56或57,或者包括与其具有至少95%同一性的序列。
21.根据权利要求12‑20所述的核酸构建体,其中,所述STAT1的序列选自SEQ ID NO:1或2,或者包括与其具有至少95%同一性的序列。
22.根据权利要求12‑21所述的核酸构建体,其中,所述miR142靶位点的序列选自SEQ ID NO:9或10的序列,或者包括与其具有至少95%同一性的序列。
23.一种纳米颗粒,包括根据权利要求1‑22中任一项所述的核酸构建体和任选地与所述核酸构建体复合的至少一种聚阳离子分子或脂质体。
24.根据权利要求23所述的纳米颗粒,其中,所述聚阳离子分子是带正电荷的细胞穿膜肽(CPP)。
25.根据权利要求24所述的纳米颗粒,其中,所述CPP是聚赖氨酸、聚精氨酸或Tat肽。
26.根据权利要求23所述的纳米颗粒,其中,所述聚阳离子分子是聚阳离子聚合物
27.根据权利要求26所述的纳米颗粒,其中,所述聚阳离子聚合物是聚乙烯亚胺。
28.根据权利要求23所述的纳米颗粒,其中,所述聚阳离子分子是聚阳离子脂质。
29.一种免疫原性组合物,包括权利要求23‑28中任一项所述的纳米颗粒和任选的药学上可接受的负载体。
30.一种用于在患有自身免疫性疾病病症的受试者中诱导免疫耐受的方法,包括向所述受试者给药有效量的根据权利要求1‑22中任一项所述的核酸构建体、根据权利要求23‑
28中任一项所述的纳米颗粒和/或根据权利要求29所述的组合物。
31.根据权利要求30所述的方法,其中,所述有效量通过口服或肌内、皮下/真皮内或静脉内给药。
32.根据权利要求30或31所述的方法,其中,所述自身免疫性疾病病症选自由以下组成的组:1型糖尿病、类风湿性关节炎、多发性硬化、银屑病、克罗恩病和溃疡性结肠炎。

说明书全文

用于自身免疫的新型mRNA疫苗

[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求于2021年6月22日提交的美国临时专利申请No.63/202,741,标题为“用于自身免疫的新型mRNA疫苗(NOVEL mRNA VACCINE FOR AUTOIMMUNITY)”的优先权,其全部内容并入本文。
[0003] 政府声明条款
[0004] 本发明在美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的AI110812的政府支持下完成。政府对本发明享有一定的权利。

背景技术

[0005] 自身免疫是针对特定组织中表达的自身抗原(自身Ag)的适应性免疫应答的结果。例如,1型糖尿病(T1D)是由β细胞Ag反应性糖尿病T细胞对产生胰岛素的β细胞进行自身免
1‑3
疫性破坏所致。T1D影响着数百万美国人,并且其发病率每年都在不可避免地增加 。尚无治愈的方法,并且终身用外源性胰岛素替代胰岛素并不能排除严重并发症。与非ASIT疗
4,5
法 不同,Ag特异性免疫疗法(ASIT)旨在靶向并消除致病淋巴细胞群,而不影响其他免疫
5,6
细胞且不危及我们的整体免疫保护。几种ASIT和非ASIT策略已在临床上进行了研究 ,但仍没有FDA批准的对于T1D的疗法。ASIT涉及以各种形式和途径递送自身抗原,目的是使对这些Ag反应的T细胞脱敏(耐受)。然而,所涉及的Ag呈递细胞(APC)的性质通常未知或无法得到很好的控制。
[0006] 造血细胞,特别是树突状细胞(DC),在调节免疫方面发挥双重作用。根据条件,它们可以引发T细胞免疫(“战斗信号”或免疫原性)或者T细胞耐受(“停止信号”或致耐受性)。当由免疫原性DC呈递自身抗原时,它们可能会抵消致耐受性APC的作用,或甚至加剧疾病
7
此外,据报道,DC在T1D中发生了许多改变,导致它们的致耐受性更低 。相比之下,非造血(基质)细胞涵盖各种各样的细胞类型,它们通常不充当APC,但在某些情况下仍具有这样做
8
的能 。由于这些细胞缺乏完全激活T细胞所需的共刺激分子,而是表达各种类型的抑制
8,9
分子,因此它们始终以一种或另一种形式诱导耐受 。淋巴结基质细胞(LNSC)持续与T细胞
9‑15
相互作用,已被证明可诱导对其内源表达的Ag的耐受 。尽管它们表达的MHC平低于DC,+ 9‑15
但它们仍然可以经由MHC‑I来介导CD8 T细胞的缺失 ,并且还有助于经由MHC‑II来防止
16,17
自身免疫 。据报道,在T1D期间,小鼠和人LNSC在胰腺淋巴结中表现出更高的致耐受
18
性 ,但它们缺乏DC捕获Ag的能力。
附图说明
[0007] 在附图的图中以实例而非限制的方式示出了本实施方式。
[0008] 以下图仅是说明性的,并不旨在限制。
[0009] 图1A是用于处理NOD小鼠的Endotope构建体的实例(蓝色的BDC2.5Ag,绿色的NY8.3 Ag)。
[0010] 图1B是示出腹腔内(i.p.)递送后淋巴结中通过mRNA‑纳米颗粒(NP)转染的细胞类型的柱状图。
[0011] 图1C至图1D是示出用Endotope mRNA‑NP(C)或Endotope mRNA‑DC(D)处理的NOD小鼠的疾病发生率的图。与所述组分(表位)相关的序列在美国专利No.10,238,741中提供,以其全部并入本文。
[0012] 图2是示出IFNγ和STAT1c对小鼠和人成纤维网状细胞(FRC)(一种类型的LNSC)的作用的图。在IFNα或IFNγ处理(10ng/mL)或STAT1c转导后3‑4天分析细胞。人STAT1c用于这两种细胞,这可以解释为什么它对人类FRC有更显著的影响。
[0013] 图3A‑图3B是示出暴露于和不暴露于IFNγ的不同类型的LNSC(FRC和淋巴内皮细胞,LEC)的表型的图(图3A),以及它们基于这些条件下表达的表位与Ag特异性T细胞结合的能力(图3B)。图3(A)CD45‑基质细胞中表征FRC和LEC的标志物Pdpn和CD31的表达。在基线处或者在用IFNα或IFNγ处理3天后MHC I类和II类、PD‑L1和CD86的表达。图3(B)将未转导的细胞或者用包括BDC2.5和NY8.3 T细胞的表位的Endotope构建体转导的细胞在用或未用IFNγ预处理下与BDC2.5 CD4+T细胞和/或NY8.3 CD8+T细胞共培养。3天后分析T细胞应答(此处示出CD25和Lag‑3的共同诱导作为生产性结合的证据)。
[0014] 图4A‑图4E是致耐受性mRNA疫苗策略的示意图。图4A)具有在纳米颗粒制剂中掺入miR142T的编码Endotope Ag和STAT1c的修饰的mRNA的示意图。图4B)当mRNA/NP转染造血APC(例如DC)时,该mRNA被miR142靶向并降解;Ag不表达,并且这些APC不参与自身反应性T细胞。图4C)当mRNA‑NP转染基质细胞时,mRNA表达并产生靶向MHC I类和II类的表位和STAT1c。图4D)STAT1c刺激IFNγ应答基因,上调MHC I类和II类、PD‑L1、IDO和iNOS,但不上调共刺激分子,将这些基质细胞转化为有效的致耐受性APC。图4E)自身反应性T细胞通过重编程的基质细胞而与其结合,并且其自身被重编程以关闭或经历细胞凋亡。
[0015] 图5A‑图5F用miR‑142T验证细胞选择性表达。淋巴结基质APC包括体外的人成纤维网状细胞(FRC)(图5A)、体外的小鼠FRC(图5B)和体内的小鼠血液内皮细胞(BEC)(图5C)。造血APC包括人单核细胞THP‑1细胞(图5D)、小鼠骨髓衍生的树突状细胞(BM‑DC)(图5E)和体内小鼠CD11c+CD11b+cDC2细胞(图5F)。用0.1ug mRNA/孔来转染FRC,并在48h后进行分析。用0.2ug mRNA/孔转染THP‑1细胞和BM‑DC,并在48h(THP‑1)或24h(BM‑DC)后进行分析。对于所有实验,使用体内JetRNA(Polyplus)在NP中复合mRNA。将小鼠腹腔内注射20‑22.4ug mRNA/小鼠,并在48h后处理并消化胰腺淋巴结和脾以用于分析。
[0016] 定义
[0017] 除非另有定义,否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的任何方法和材料可以用于本发明的实践或测试,但是现在描述优选的方法和材料。本文提及的所有出版物均通过援引并入。
[0018] 一般而言,与本文所述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学、蛋白质和核酸化学以及杂交相关使用的命名法和技术是本领域熟知和常用的那些。除非另有说明,否则本发明的方法和技术通常根据本领域熟知的常规方法以及如通过本说明书引用和讨论的各种一般性和更具体的参考文献中所描述的来进行。
[0019] 术语向受试者“给药(administering)”或“给药(administration)”药剂、药物或肽是指向受试者引入或递送化合物以执行其预期功能的任何途径。给药(administering)或给药(administration)可以通过任何合适的途径进行,包括口服、鼻内、肠胃外(静脉内、肌内、腹腔内、真皮内或皮下)、直肠或局部。给药(administering)或给药(administration)包括自我给药和他人给药。
[0020] 本文使用的术语“抗原”或“Ag”是结构物质(分子或化学基团),通常是蛋白质或衍生自该蛋白质的肽,其由生物的免疫系统所识别并充当免疫应答的靶标。
[0021] “自身Ag”或“自身抗原”是在正常情况下不具有免疫原性并且不产生免疫应答的Ag,但其可能成为免疫原性免疫应答的靶标,导致自身免疫性疾病。为了所公开的构建体的目的,应当注意,自身Ag可以源自自体或同种异体来源。
[0022] “自身免疫性疾病”是由针对自身Ag的异常免疫应答引起的,其中免疫系统攻击正常组织或器官。1型糖尿病是一种自身免疫性疾病,其中识别胰岛素或其他β细胞Ag的细胞被激活并破坏胰腺β细胞,从而导致糖尿病。
[0023] 本文所用的关于蛋白质的术语“组成型活性”意指蛋白质始终具有功能活性。
[0024] 如本文使用的,术语“构建体”是指编码目的蛋白质或肽的核酸,并且任选地包含用于在细胞中表达该蛋白质或肽的一个或多个启动子。
[0025] 术语“Endotope”是指被工程化用于调节免疫系统的核酸构建体,其优化APC对CD4和CD8表位的呈递,其中该构建体已借助于转染或转导引入。来自自身Ag或非自身Ag(例如肿瘤或病原体衍生的Ag)的表位可分别用于优化对这些表位的耐受诱导或免疫。Endotope构建体可以包括各自的核酸序列,该核酸序列编码细胞内体中靶向MHCII加工的一种或多种CD4表位和细胞胞质溶胶中靶向MHCI加工的一种或多种CD8表位,以在免疫系统中产生最大的Ag/表位呈递,并且还可以包括MHCII激活因子序列。替代地,构建体编码与分泌信号可操作连接的CD4和CD8表位。本公开的构建体旨在促进基质细胞(SC)更多地参与以有效地结合并重编程自身反应性T细胞以实现或恢复耐受。本文特别举例说明了将DNA或RNA疫苗形式的表位表达构建体内源递送至非专职性APC,诸如SC。在某些实施方式中,Endotope构建体可以包含两组连接的表位,其中这些组通过蛋白水解切割位点彼此分开,并且其中注定要在MHCII途径中加工以呈递至CD4+T细胞(CD4表位)的一组表位与内体靶向序列可操作地连接,以及注定要在MHCI途径中加工以呈递至CD8+T细胞的另一组表位(CD8表位)则没有与内体靶向序列可操作地连接。在蛋白水解切割位点进行切割后,Endotope构建体中的两组表位被分离,以便每一组在细胞内经历单独的加工,一组加工至MHCII,另一组加工至MHCI。两组中的每一组中的每个表位可以被蛋白水解切割位点分开,使得一旦进入适当的细胞区室进行加工,每个表位就与该组中的其他表位切割。
[0026] 本文使用的术语“表位”(也称为“抗原决定簇”)是被免疫系统特异性识别的Ag的部分。表位或是由MHC分子呈递的肽形式,并通过其T细胞受体被T细胞识别,或是对应于完整Ag的暴露区域,该区域通过其B细胞受体而被B细胞识别,并且随后被这些B细胞产生的抗体识别。除非另有说明或者如果参考文献的上下文暗示仅描述了天然表位,否则将术语表位解释为包括模拟表位。
[0027] 术语“MHCII激活因子序列”是指当在细胞中表达时诱导MHCII分子产生的序列。MHCII激活因子序列的一种非限制性实例是II类反式激活因子(CIITA)序列(参见Kim et al.,J Immunol 2008;180:7019‑7027)。
[0028] 如本文使用的,“模拟表位”是模拟表位的三维结构的分子,并且因此具有相同或高度相似的结合特异性,但可以具有或可以不具有不同的亲和力或亲和性。“模拟表位”引起的抗体应答与由被模拟的表位引起的应答类似。针对特定表位(Ag)引发的抗体识别该特定表位的模拟表位,并且特定表位的模拟表位可以引发结合该特定表位的抗体应答。因此,一种或多种模拟表位可以用作疫苗。与大多数表位一样,模拟表位可以是大分子诸如蛋白质、核酸或多糖的一部分。优选地,它是蛋白质或蛋白质的一部分,并且可以是长度通常为约9至约20个基酸的肽。一些模拟表位可能作为天然表位的突变体出现,其中“突变”实际上代表翻译后修饰引起的氨基酸变化(例如,脱酰胺,导致Asn变为Asp,以及从Gln变为Glu),这可能在某些致病条件下自然发生。根据本领域已知的方法,通过筛选噬菌体展示或肽文库,或者通过旨在改变肽的结合特性的定向诱变来获得模拟表位。
[0029] 如本文使用的“基质细胞”(SC)是指属于基质一部分的细胞。SC是器官的结缔组织细胞,并且支持该器官实质细胞的功能。SC可以包括成纤维细胞和周细胞、它们的前体间充质基质细胞以及某些类型的内皮细胞和上皮细胞。在某些实施方式中,基质细胞是淋巴结基质细胞(LNSC),其具有持续与免疫细胞直接接触的特殊性。
[0030] 如本文使用的术语“专职性抗原呈递细胞”或“专职性APC”是指树突细胞、巨噬细胞和B细胞。
[0031] “T细胞”是淋巴细胞的一种类型。当T辅助细胞(CD4+T细胞)由APC表面上的MHCII分子呈递肽Ag时,它们就会被激活。一旦被激活,辅助性T细胞就会分裂并分泌刺激主动免疫应答的细胞因子。一些辅助性T细胞细胞反过来分化成为调节细胞,具有抑制适应性免疫应答的能力。细胞毒性T细胞(CD8+T细胞)通过结合与APC表面的MHCI分子缔合的Ag而被激活,并破坏病毒感染的细胞和肿瘤细胞。这些细胞毒性T细胞还与移植排斥和自身免疫性损伤有关。自反应性(或自身反应性)T细胞是被自身Ag(或自身抗原)激活或已被自身Ag(或自身抗原)激活的CD4+或CD8+T细胞。
[0032] “分泌信号”是这样的一种肽,当该肽与一个或多个表位可操作地连接时,指导该一个或多个表位从表达它们的细胞中分泌出来。
[0033] 如本文使用的“治疗有效量”或“有效量”具有本领域已知的标准含义并且在本文中可互换使用,意指足以治疗患有疾病(例如,糖尿病)的受试者或者缓解与疾病相关的症状或并发症的量。
[0034] 术语“miR142”或“微RNA 142”是指RNA基因并且属于miRNA类。与miR142相关的疾病包括脑癌和多发性硬化。造血细胞表达miR142,但基质细胞不表达(25)。术语“miR142靶位点(miR142T)”是指与miR142互补的任何核酸序列或者可以被miR142结合的序列。在本发明的上下文中,miR142与存在于构建体上的miR142T的结合导致构建体编码的mRNA的降解和/或抑制由构建体上的核酸序列编码的任何蛋白质/肽序列的表达。包括引入基因下游miR142靶位点(miR142T)的构建体可以在肝细胞(27,26)和基质细胞(15)中表达,但不能在造血细胞中表达,因为转录的mRNA在表达之前会被miR142降解。
[0035] 术语“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”可互换使用,并且是指线性或环状构象、并且呈或是单链或是双链形式的脱核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物。出于本公开的目的,这些术语不应被解释为针对聚合物长度的限制。该术语可以涵盖天然核苷酸的已知类似物,以及在基、糖和/或磷酸部分(例如,硫代磷酸酯主链)中修饰的核苷酸。一般而言,特定核苷酸的类似物具有相同的碱基配对特异性;即,A的类似物将与T碱基配对。
[0036] 术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”可互换使用,指氨基酸残基的聚合物。该术语还适用于氨基酸聚合物,其中一种或多种氨基酸是相应天然存在氨基酸的化学类似物或修饰衍生物。
[0037] 术语“药学上可接受的负载体、赋形剂、运载体或稀释剂”是指不干扰活性成分的有效性或活性并且对其给药的宿主无毒的介质。负载体、赋形剂、运载体或稀释剂包括但不限于粘结剂、胶黏剂、润滑剂、崩解剂、膨胀剂、缓冲剂和杂项材料,诸如制备特定组合物可能需要的吸收剂。
[0038] 如本文使用的,“聚阳离子分子”是指带正电荷的分子,当其与核酸构建体复合时,诱导其缩合成更紧凑的大分子并增加细胞的捕获。转染可以在所有类型的细胞中实现,但效率各异。更频繁复制的基质细胞和某些实质细胞往往比专专职性APC更有效地转染,专职性APC往往会在DNA或mRNA有机会从内体逃逸至胞质溶胶之前降解DNA或mRNA复合物。聚阳离子分子包括含有带正电荷的氨基酸诸如聚精氨酸、聚‑L‑赖氨酸的小非免疫原性肽以及基于HIV的Tat肽(GRKKRRQRRRPQ SEQ ID NO:18)。在优选的实施方式中,CPP是聚阳离子脂质。聚阳离子脂质能够与带负电荷的遗传物质诸如DNA或RNA形成聚集复合物。这些聚集的脂质体结构在水性溶液中时具有正表面电荷。聚阳离子脂质可以通过各种给药途径在体内安全地递送核酸以靶向多种组织。这些肽通常被称为“细胞穿膜肽”(CPP)。其他聚阳离子分子包括带正电荷的聚合物,诸如聚乙烯亚胺(PEI)和聚酰胺‑胺(PAMAM)。这些聚阳离子分子在其他地方有更详细的描述(用于基于基因的疗法的非病毒载体。Yin H,Kanasty R L,Eltoukhy A A,Vegas A J,Dorkin J R,Anderson D G.Nat Rev Genet.2014August;15(8):541‑55)。当复合核酸构建体被胞吞时,其中在内体内部的pH较低,质子中和核酸序列的负电荷,并且聚阳离子分子分离并可以破坏内体的膜。
[0039] 如本文使用的,“序列”是指生物大分子或寡分子的一级结构,或者生物聚合物内共价连接的单体(例如核苷酸或肽)的排序。
[0040] 如在两个多核苷酸或多肽的上下文中本文使用的术语“序列同一性”或“同一性”是指当在指定的比较窗口上比对最大对应性时,两个分子的序列中相同的残基。如本文使用的,术语“序列同一性百分比”或“序列同一性%”是指通过在比较窗口内比较分子的两个最佳比对序列(例如,核酸序列或多肽序列)而确定的值,其中与参考序列(其不包括添加或缺失)相比,在比较窗口中的序列部分可以包括添加或缺失(即,缺口),以实现两个序列的最佳比对。通过确定两个序列中出现相同核苷酸或氨基酸残基的位置数来计算百分比以产生匹配位置数,将匹配位置数除以比较窗口中的位置总数,并将结果乘以100以得出序列同一性的百分比。与参考序列相比,每个位置都相同的序列被认为与参考序列100%同一,反之亦然。
[0041] 术语“STAT1”或“信号转导和转录激活因子1”是指在人中由STAT1基因编码的转录因子。STAT1基因的非限制性实例包括SEQ ID NO 1或2)。STAT1包括SEQ ID NOs 3‑8中的任一个,或与其具有至少百分之95同一性的氨基酸序列。它是STAT蛋白质家族的成员。所有STAT分子均被受体相关激酶磷酸化,从而引起激活,通过形成同二聚体或异二聚体进行二聚,并最终易位至细胞核作为转录因子。特别地,STAT1可以通过以下激活,多种配体诸如干扰素α(IFNα)、干扰素γ(IFNγ)、表皮生长因子(EGF)、血小板源性生长因子(PDGF)、白细胞介素6(IL‑6)或IL‑27。STAT1参与由I型、II型或III型干扰素的信号导致的基因上调。响应IFN‑γ刺激,STAT1与STAT3形成同二聚体或异二聚体,与GAS(干扰素γ激活序列)启动子元件结合;响应IFN‑α或IFN‑β刺激,STAT1与STAT2形成异二聚体,可以结合ISRE(干扰素刺激反应元件)启动子元件。无论哪种情况,启动子元件的结合都会导致ISG(干扰素刺激基因)表达增加。
[0042] 如本文使用的术语“受试者”是指个体。例如,受试者是哺乳动物,诸如灵长类,以及更特别地,人。该术语并不表示特定的年龄或性别。因此,成人和新生儿受试者,无论男性还是女性,都旨在被覆盖。如本文所使用的,患者或受试者可以互换使用并且可以指患有疾病或疾患的受试者。
[0043] 如本文使用的术语“靶位点”是指由微RNA、siRNA或shRNA识别(例如,特异性结合)和/或作用(切除或切割)的核酸序列或区域。
[0044] 如本文使用的“免疫耐受”是非自我辨别的机制,其允许免疫系统识别外来Ag,但不识别自身Ag。在正常条件下,组织特异性自身Ag由耐受诱导(致耐受性)细胞呈现,这些细胞对T细胞进行编程,使其不对这些Ag进行应答。当这些自身Ag不被耐受时,就会导致自身免疫性疾病。

具体实施方式

[0045] 研究发现,基质细胞可以通过STAT1c(STAT1的突变形式,其在不存在磷酸化下通过二聚导致STAT1的组成型活性)的过表达来重编程为更有效的APC。然后,可以使重编程的基质细胞表达Endotope构建体和Ag,以优化CD4和CD8 T细胞的结合。然而,也有研究表明,将Ag广泛递送至基质细胞和专职性APC可能会导致致耐受性潜力缺陷。研究发现,miR142在非造血细胞诸如肝细胞和基质细胞等中不表达,但在造血细胞(包括专职APC)中表达。给药包括miR142靶位点序列的Endotope构建体,并任选地与编码STAT1c的序列组合(在同一构建体或单独的构建体上),允许Endotope编码的肽在基质细胞中而不是在专职性APCS中选择性表达。这种选择性表达增强了对目的Ag或表位的致耐受性免疫应答。
[0046] 本公开描述了包含Endotope构建体、STAT1c和miR142靶位点的序列的核酸构建体。在某些实施方式中,公开了包括Endotope构建体和包括编码组成型活性STAT1(例如STAT1c)的核酸序列的STAT1构建体的组合物,其中Endotope和STAT1构建体各自包括miR142靶位点。替代地,公开了包括Endotope构建体和STAT1构建体连同miR142靶位点的单一构建体。核酸构建体可以被包装到聚阳离子分子中以产生用于有效细胞转染的纳米颗粒。Endotope构建体是可定制的,并且可以递送患者特异性或高度共享的与疾病相关的表位。本文提供的某些实施方式涉及用于通过给药DNA或RNA疫苗形式的新型核酸构建体来治疗自身免疫性疾病的方法。
[0047] 概述
[0048] 开发了用于选定表位的基于核酸递送的平台(Endotope),以结合作为疾病主要驱动因素的特异性T细胞群(以图1A为例)。Endotope的专利设计能够使在MHC‑I和MHC‑II上有19
效呈递内源性表达的表位,从而实现CD4和CD8 T细胞两者的最佳结合 。该平台用于DNA疫
20 21,22
苗 、纳米颗粒配制的mRNA疫苗(mRNA‑NP) 以及还通过mRNA电穿孔或转导将其引入至离
19,23 21
体DC或基质细胞中 。mRNA‑NP递送系统可以靶向LNSC和DC亚群两者 (图1B),但是当mRNA‑NP通过各种途径将Ag递送至NOD小鼠时,它们未能改善疾病(图1C),而注射用相同mRNA电穿孔的致耐受性DC则显著降低了疾病发生率(图1D)。
[0049] 这表明,在持续的自身免疫性疾病(伴有慢性炎症)的情况下,将Ag广泛递送至各种APC(可能包括免疫原性DC)可能会导致不同的和不需要的T细胞应答。尽管mRNA通过核苷24
酸置换进行修饰以最小化其免疫佐剂性(adjuvanticity) ,但它仍然可以增强某些DC的免疫原性,或者mRNA‑NP可以转染已经处于免疫原性状态的DC。此外,阳离子脂质制剂可能对专职性APC具有免疫原性佐剂作用(Nat Immunol.2022 Apr;23(4):532‑542)。由于只有造
25
血细胞表达miR142微RNA ,在以引入基因下游的miR142靶位点(miR142T)为特征的病毒载
25‑27 15
体可以在非造血细胞诸如肝细胞 和基质细胞 中安全地表达。病毒载体不会在造血细胞中表达,因为转录的mRNA在能够被表达之前会被miR142降解。该系统正在以我们的mRNA‑NP平台为特征的非病毒递送系统中进行验证。
[0050] 基质细胞可以被编程为更有效且具致耐受性的APC。IFNγ对基质细胞(包括间充17,28‑30
质基质细胞和LNSC)具有明确的调节作用,以增强MHC‑I和MHC‑II水平 ,以及经由PD‑
30‑32 30,33,34 29,35,36
L1 、吲哚胺2,3‑双加氧酶 和诱导型一氧化氮合酶(iNOS) 具有致耐受性潜
力,它们都对T细胞有抑制作用。响应于IFNγ处理,几种LNSC亚群,成纤维网状细胞(FRC;图
2、图3A和图3B)和淋巴内皮细胞(图3A和3B)上调MHC‑I、MHC‑II和PD‑L1,但不上调共刺激分子(CD80/CD86)。为了在不使用IFNγ(其可能对其他免疫细胞产生不良影响)的情况下在体内重编程这些细胞,测试了STAT1(STAT1c)的组成型活性形式,以重现IFNγ信号传导。与IFNγ处理类似,STAT1c的过表达将这些细胞重编程为更有效的APC(更高的MHC水平以结合CD4和CD8 T细胞两者)和更高的致耐受性(在没有共刺激分子诱导的情况下PD‑L1增加)(图
2)。
[0051] 本公开描述了新型mRNA疫苗,其适用性因FDA最近批准针对SARS‑CoV‑2的mRNA疫苗而得到提升,但在利用基质细胞重编程自身反应性T细胞以实现耐受方面是非常规的(图4)。当前的ASIT有几个限制:(1)大多数以外源性肽/蛋白质的形式提供Ag,这些Ag主要由DC
7
获得和呈递,其在T1D的情况下具有缺陷的致耐受性潜力,以及(2)它们还不包括新的新表位(neoepitope)(不存在于使用的天然肽/重组蛋白中)。这种mRNA‑NP方法能够实现肽(表位)的内源表达,该肽(表位)包括新表位或可以在细胞内进行翻译后修饰。这种新型疫苗具有多项创新:(1)Endotope设计能够将mRNA编码的表位呈递至CD4和CD8 T细胞,(2)用于有
22
效的体内mRNA递送的基于阳离子脂质的制剂最近已可商购 ,(3)miR142T的特征是限制Ag和辅助分子对基质细胞的表达(防止通过DC呈递),以及(4)使用STAT1c作为辅助分子将基质细胞重编程为更有效且更致耐受性的APC,以结合自身反应性T细胞并关闭其应答。
[0052] mRNA的优点包括非常有效的细胞转染(包括休眠基质细胞)、缺乏基因组整合和产物的瞬时表达,这两者都是安全特征。这种非常规疫苗通过避免DC参与递送的自身抗原的呈递(另一个重要的安全特征),在使ASIT险最小化中具有重要意义。基质细胞可以被制成更好的APC,而不会变得具有免疫原性,即使是用mRNA,因为经由TLR3来体内刺激LNSC会9
增加MHC‑I和PD‑L1,但不会增加共刺激分子,如用IFNγ所示。本公开描述了用于自身免疫性疾病的创新且潜在更安全的ASIT形式,满足了未满足的需求。此外,可定制的Endotope平
37‑40
台构建了理想的工具,用于在患者群体中递送患者定制的或高度共享的表位 ,作为T1D和其他几种自身免疫性疾病的精准医学方法。大量近期发病的T1D患者群体和被确定为高风险的个体将受益于这种新型ASIT,以阻止自身免疫性应答并保留内源性β细胞。
[0053] Endotope构建体
[0054] 本发明的某些实施方式涉及Endotope构建体,其携带编码可操作地连接的内体MHCII靶向序列的融合肽序列,随后是CD4+T细胞的一个或多个表位序列(MHCII上呈递)、一系列一个或多个CD8表位序列(MHCI上呈递),具有分隔两个表位序列的可裂解接头和可操作地连接至一个或多个表位序列的MHCII激活因子序列。这种类型的构建体称为Endotope,能够将由单个基于核酸(DNA或RNA)构建体或同一复合物中的多个mRNA分子表达的多个疾病驱动表位递送至单细胞中,从而通过优化的Ag呈递和加工来启动对由自身反应性CD4+和CD8+T细胞两者识别的表位的免疫耐受,并使转染的基质细胞具备在MHCII上呈递CD4表位的能力。虽然Endotope构建体携带可操作地连接至旨在于内体中加工的CD4表位的MHCII靶向序列,但不必包括针对CD8表位的MHCI靶向序列,因为构建体被递送至细胞质,在细胞质中这些表位将根据正常细胞过程经由蛋白酶体进行加工。
[0055] Endotope构建体可以针对使用该构建体的物种进行密码子优化。密码子优化可以包括在不改变氨基酸序列的情况下降低或增强载体的免疫原性的核苷酸改变。
[0056] 例如,在治疗糖尿病的实施方式中,使用在T1D患者中具有良好安全性的致耐受性DNA疫苗接种策略,Endotope构建体允许靶向CD4+和CD8+致糖尿病T细胞两者,以使多个β细胞Ag缺失或得到抑制(Roep et al.,2013)。
[0057] 由Endotope构建体编码的Ag不仅可以针对需要或是免疫耐受(诸如自身免疫性疾病)或是免疫刺激诸如传染病的各种疾病进行定制,而且可以针对个体患者进行定制,以引发最大的耐受应答或最大的免疫应答。存在多种免疫测定来确定特定患者血液中循环的某些免疫细胞是否对所测试的特定肽产生免疫应答。替代地,可以基于一类患者中最常见的反应性来选择Ag。由于它是可定制的,天然肽可以发生突变,以便更好地靶向特定类型的自身反应性T细胞(需要翻译后修饰或不常见的MHC结合位点的那些细胞)。Endotope构建体提供了确保显性疾病表位(包括修饰的新表位)的内源性表达的方法,这不能通过简单给药组合的外源性蛋白质实现。因为只有Endotope构建体中包括重要的选择的疾病表位,则单个构建体足以将来自多个蛋白质Ag的多个表位呈递至CD4+和CD8+T细胞两者或其中之一,从而实现CD4和CD8表位两者的平衡表达。在先前的方法中,构建体需要包括每个完整蛋白质的序列,这是有问题的,因为构建体和运载体递送核酸的能力是有限的。
[0058] 以下是已知针对某些疾病的Ag列表。来自这些Ag的表位可以包括在用于治疗相应疾病的核酸构建体中。有关综述,参见Di Lorenzo et al.,Clin.Exp.Immunol.148(1):1‑16,2007和James EA et al Diabetes.2020Jul;69(7):1311‑1335。有趣的是,杂合胰岛素肽最近被认为是重要的疾病驱动Ag,但任何全蛋白质Ag中都不存在这种情况(48‑50)。
[0059] 表1A
[0060]
[0061]
[0062]
[0063]
[0064]
[0065]
[0066]
[0067] 想要在受试者中诱导耐受的任何已知表位都考虑用于本发明。表位的选择是基于患者群体中最常靶向的表位确定的,或者基于诊断测试针对个体患者进行个性化的。表位的选择还取决于已知能够呈递特定表位的患者的HLA单倍型。免疫表位数据库(IEDB)代表了已知表位的最大来源,并且通常是它们已知结合的一种或多种MHC单倍型、与其验证相关的测定以及与其鉴定相关的参考。例如,搜索1型糖尿病中的人表位会产生~11,500个表位。由于它是可定制的,天然肽可以发生突变,以便更好地靶向特定类型的自身反应性T细胞(需要翻译后修饰或不常见的MHC结合登记的那些细胞)。优选地,构建体编码CD4和CD8表位两者的平衡,以便同时诱导对MHCI和MHCII Ag的耐受。用于制备致耐受性核酸构建体的优选Ag包括本文具体讨论或提供的那些中的任一种,或来自致糖尿病或自身免疫性Ag的任何表位。迄今为止,已在T1D临床试验中使用各种各样的递送方法对三种Ag(胰岛素原/胰岛素、GAD65和HSP60 p277)进行了单独评价。总体而言,这些Ag特异性疗法耐受性良好,但疗效不佳。T1D中被靶向的其他Ag,包括但不限于IA‑2、IGRP、ChgA和ZnT8。考虑到表位在T1D(如在其他主要的组织特异性自身免疫性疾病中)中的扩散程度,实现针对单个Ag或表位的耐受似乎不足以诱导持久的耐受,并且这可能在一定程度上解释了先前临床试验的相对失败。除了靶向多种Ag特异性之外,通过使用可用的模拟表位进一步增强对CD4+和CD8+T细胞的有效致耐受性呈递,从而提高效率,并利用所有耐受诱导机制。为了优化当前策略,需要对这些新参数进行临床前评估。
[0068] 正如DiLorenzo et al.在2007年报道的,现在已知来自β细胞Ag的大量表位在NOD小鼠和T1D患者两者中均由致糖尿病CD4+或CD8+T细胞靶向,此后鉴定了更多的表位(参见例如Delong  et  al.2016,and  Wang  et  al.2015)。由DiLorenzo等人(Clin.Exp.Immunol.147:doi:10.1111/j.11365‑2249.2007.03328.x(2007))和James等人(Diabetes.2020 Jul;69(7):1311‑1335.doi:10.2337/dbi19‑0022)的评述提供了有关自身免疫性糖尿病的许多有用的T细胞表位的序列、实例和讨论以及T细胞表位的许多实例。
所提供的数据基于NOD小鼠T1D模型中被靶向的表位,并且包括用于CD8表位的Ins2 B:15‑
23和IGRP206‑214,以及用于CD4表位/模拟表位的Ins2 B:9‑23、Ins2 B:9‑23(R22E)、Ins2 B:
9‑23(R22E、E21G)、ChgA1040‑79、GAD65286‑300、GAD65524‑543。这些表位中的一些表位已被选择用于原理实验证明,因为存在评估T细胞对这些特定表位应答的工具和试剂,诸如T细胞受体转基因小鼠和MHC四聚物试剂。对于人来说,关键表位包括本领域已知的来自胰岛素、GAD65和IA‑2的那些表位。已鉴定出针对其他Ag的较少量表位,包括IGRP、ChgA、ZnT8、IAPP和ICA69以及一些新发现的杂合胰岛素肽(Delong et al.2016;James et al.,2020)and DRiP peptide(Nat Med.2017Apr;23(4):501‑507)。HSP60/70蛋白的表位也可以被靶向,尽管这些表位不是β细胞特异性的。广泛认可的T1D重要表位是CD4表位胰岛素B:9‑23,其在NOD小鼠和T1D患者被靶向。在NOD小鼠中,该表位参与疾病的引发(Nakayama et al.,Nature.35(7039):220‑3,2005)。针对该表位设计了各种模拟表位,这些模拟表位在小鼠(Daniel et al.Exp Med.2011Jul 4;208(7):1501‑10),人源化小鼠(Serr et al.,Nat Commun.2016Mar 15;7:10991)和人(Nakayama et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 112(14):4429‑34,2015)中均有效。T1D和其他自身免疫性疾病的表位和模拟表位会继续定期鉴定,并因此将完善现有的表位库。随着越来越多的表位被了解,以及有助于确定特定疾病或甚至特定个体中需要待靶向哪些表位的敏感测定,可以相应地设计构建体和方法。
[0069] 疾病诸如MS、RA、IBD和屑病中的其他自身抗原(其中一些在本文中列出,以及其他在本领域中也是已知的)也考虑与本发明一起使用。由于表位扩散现象,已知自身免疫性表位的数量正在增长。还考虑了任何自身Ag和来自待移植器官或组织的Ag。因此,未来已知的任何表位也考虑用于本发明。当可用时,模拟表位可以替代任何表位。可以使用本领域已知的相关Ag/表位的模拟表位的任何一种。
[0070] 对于免疫耐受,可以修饰携带Endotope构建体的DNA/RNA运载体,以去除某些具有免疫原性的基序,例如CpG基序(其可以用GpG基序替换)或mRNA的富含U的区域(其可以通过假尿苷替换)。
[0071] 应当认识到,本文公开的任何实施方式的一个或多个特征可以在本发明的范围内组合和/或重新布置以产生也在本发明的范围内的另外的实施例
[0072] 表位和构建体序列
[0073] 图1阐述了包含与T1D相关的许多表位序列的示例性Endotope构建体。表1B提供了所述组成序列的序列。
[0074] 表1B
[0075]
[0076] 下面提供的SEQ ID NO:27是示例性Endotope序列。如图4中所示,Endotope序列可以连接至miRNA靶向序列,诸如miR142T。(SEQ ID NO:27)
[0077] ACTAGTGCCA CCATGATGGA TCAAGCTAGA TCAGCATTCT CTAACTTGTT TGGTGGAGAA CCATTGTCAT ATACCCGGTT CAGCCTGGCT CGGCAAGTAG ATGGCGATAA CAGTCATGTG GAGATGAAAC TTGCTGTAGA TGAAGAAGAA AATGCTGACA ATAACACAAA GGCCAATGTC ACAAAACCAA AAAGGTGTAG TGGAAGTATC TGCTATGGGA CTATTGCTGT GATCGTCTTT TTCTTGATTG GATTTATGAT TGGCTACTTG GGCTATTGTA AAGGGGTAGA ACCAAAAACT GAGTGTGAGA GACTGGCAGG AACCGAGTCT CCAGTGAGGG AGGAGCCAGG AGAGGACTTC CCTGCACCGC GGTGTGGTTC CCACCTGGTG GAGGCTCTCT ACCTGGTGTG TGGGGAGGAG GGCTTCTTCA AGCGAGCAGT TCGACCTCTA TGGGTACGTA TGGAAAAGCG GTCTCTCAAG AAGGGAGCTG CAGCCTTAGG GATTGGAACA GACAGTGTGA TTCTGATTGA GGGCAGAGGA AGTCTGCTAA CATGCGGTGA CGTCGAGGAG AATCCTGGAC CTGAGGCTCT CTACCTGGTG TGTGGGGAGC GTGGCTTCTT CTTGAGTGTG TACCTGAAGA CCAACGTCTT CCTCTTCCTG CCCGGGTAGG TCGAC
[0078] 表2
[0079]
[0080]
[0081] 限制性位点有下划线
[0082] 该Endotope构建体的密码子优化的DNA序列如下(SEQ ID NO:28)。(SEQ ID NO:28)
[0083] ACTAGTGCCA CCATGATGGA CCAAGCTAGA TCCGCCTTCA GCAATCTGTT CGGAGGAGAG CCCCTCTCCT ATACAAGATT CTCCCTGGCC AGGCAAGTGG ACGGCGACAA CTCCCACGTC GAGATGAAAC TCGCCGTGGA TGAAGAGGAG AACGCCGACA ATAACACCAA GGCCAACGTG ACCAAGCCTA AGAGGTGCAG CGGAAGCATC TGCTACGGCA CAATCGCCGT GATCGTCTTC TTCCTGATCG GATTCATGAT CGGATACCTG GGCTACTGCA AGGGCGTGGA GCCTAAAACC GAGTGCGAGA GACTCGCTGG AACAGAGTCC CCTGTCAGGG AGGAACCTGG AGAGGATTTC CCTGCCCCGC GGTGCGGATC CCATCTGGTC GAAGCCCTGT ACCTGGTCTG TGGCGAGGAA GGATTCTTCA AGAGGGCTGT CAGGCCTCTG TGGGTGAGGA TGGAAAAGAG ATCCCTGAAA AAAGGCGCCG CTGCCCTGGG AATTGGCACC GACTCCGTCA TTCTCATCGA GGGCAGAGGA TCCCTCCTGA CCTGTGGCGA CGTGGAGGAA AACCCCGGAC CCGAAGCTCT GTACCTGGTG TGTGGCGAAA GGGGCTTTTT CCTGTCCGTC TACCTGAAAA CCAATGTCTT TCTGTTTCTG CCCGGGTAGG TCGAC
[0084] 该构建体的蛋白质序列如下(218aa;SEQ ID NO:29)。
[0085] (SEQ ID NO:29)
[0086] MMDQARSAFSNLFGGEPLSYTRFSLARQVDGDNSHVEMKLAVDEEENADNNTKANVTKPKRCSGSICYGTIAVIVFFLIGFMIGYLGYCKGVEPKTECERLAGTESPVREEPGEDFPAPRCGSHLVEALYLVCGEEGFFKRAVRPLWVRMEKRSLKKGAAALGIGTDSVILIEGRGSLLTCGDVEENPGPEALYLVCGERGFFLSVYLKTNVFLFLPG[0087] 表3
[0088]
[0089] 示例性表位DNA和氨基酸序列以及切割序列:
[0090] Ins2B:9‑23
[0091] TGTGGTTCCCACCTGGTGGAGGCTCTCTACCTGGTGTGTGGGGAGCGTGGCTTCTTC(SEQ ID NO:30;表位带下划线)
[0092] CGSHLVEALYLVCGERGFF(SEQ ID NO:31;表位带下划线)
[0093] Ins2B:9‑23 R22E
[0094] TGTGGTTCCCACCTGGTGGAGGCTCTCTACCTGGTGTGTGGGGAGGAGGGCTTCTTC(SEQ ID NO:32;表位带下划线)
[0095] CGSHLVEALYLVCGEEGFF(SEQ ID NO:33;表位带下划线)
[0096] Ins2B:9‑23 E21G/R22E
[0097] TGTGGTTCCCACCTGGTGGAGGCTCTCTACCTGGTGTGTGGGGGAGAGGGCTTCTTC(SEQ ID NO:34)
[0098] CGSHLVEALYLVCGGEGFF(SEQ ID NO:35;表位带下划线)
[0099] ChgA WE14
[0100] AAGCGATGGAGCAGGATGGACCAGCTGGCCAAAGAGCTGACAGCAGAGAAGCGG(SEQ ID NO:36;表位带下划线)
[0101] KRWSRMDQLAKELTAEKR(SEQ ID NO:37;表位带下划线)
[0102] ChgA 1040‑79
[0103] AAGCGAGCAGTTCGACCTCTATGGGTACGTATGGAAAAGCGG(SEQ ID NO:38;表位带下划线)[0104] KRAVRPLWVRMEKR(SEQ ID NO:39;表位带下划线)
[0105] GAD65286‑300
[0106] TCTCTCAAGAAGGGAGCTGCAGCCTTAGGGATTGGAACAGACAGTGTGATTCTGATT(SEQ ID NO:40;表位带下划线)
[0107] SLKKGAAALGIGTDSVILI(SEQ ID NO:41;表位带下划线)
[0108] GAD65524‑543
[0109] AGAATGAGCCGCCTCTCAAAGGTGGCGCCAGTGATTAAAGCCAGAATGATGGAGTATGGGACCACAATGGTC(SEQ ID NO:42)
[0110] RMSRLSKVAPVIKARMMEYGTTMV(SEQ ID NO:43;表位带下划线)
[0111] P2A(来自猪捷申病毒(porcine teschovirus)‑1)
[0112] GCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCT(SEQ ID NO:44)
[0113] ATNFSLLKQAGDVEENPGP(SEQ ID NO:45)
[0114] T2A(来自明脉扁刺蛾病毒(Thosea asigna virus))
[0115] GAGGGCAGAGGAAGTCTGCTAACATGCGGTGACGTCGAGGAGAATCCTGGACCT(SEQ ID NO:46)[0116] EGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQ ID NO:47)
[0117] E2A(来自甲型鼻炎病毒(equine rhinitis A virus))
[0118] CAGTGTACTAATTATGCTCTCTTGAAATTGGCTGGAGATGTTGAGAGCAACCCTGGACCT(SEQ ID NO:48)
[0119] QCTNYALLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO:49)
[0120] F2A(来自疫病毒(Foot‑and‑mouth disease virus))
[0121] GTGAAACAGACTTTGAATTTTGACCTTCTCAAGTTGGCGGGAGACGTGGAGTCCAACCCTGGACCT(SEQ ID NO:50)
[0122] VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO:51)
[0123] Ins2B:15‑23
[0124] GAGGCTCTCTACCTGGTGTGTGGGGAGCGTGGCTTCTTC(SEQ ID NO:52;表位带下划线)[0125] EALYLVCGERGFF(SEQ ID NO:53;表位带下划线)
[0126] IGRP206‑214
[0127] TTGAGTGTGTACCTGAAGACCAACGTCTTCCTCTTCCTG(SEQ ID NO:54;表位带下划线)[0128] LSVYLKTNVFLFL(SEQ ID NO:55;表位带下划线)
[0129] GAD65206‑214
[0130] TYEIAPVFV(SEQ ID NO:56)
[0131] GAD65546‑554
[0132] SYQPLGDKV(SEQ ID NO:57)
[0133] 1.STAT1c
[0134] 根据本公开的蛋白质可以通过以下来产生:改变(即,修饰)野生型蛋白质,以产生具有有用蛋白质特征诸如改变的Vmax、Km、底物特异性、底物选择性和蛋白质稳定性的新组合的新蛋白质。修饰可以在蛋白质中的特定氨基酸位置处进行,并且可以是用不同的氨基酸置换自然界中(即,在野生型蛋白质中)该位置处发现的氨基酸。因此,本公开提供的蛋白质提供了相对于自然界中发现的野生型蛋白质具有一种或多种改变的蛋白质特征的新蛋白质。在本公开的一种实施方式中,蛋白质可以具有改变的蛋白质特征,诸如与相似的野生型蛋白质相比,针对一种或多种除草剂的活性提高或降低,或者蛋白质稳定性提高,或者这些特性的任意组合。在一种实施方式中,本公开提供了蛋白质,以及编码它的DNA分子或编码序列,与蛋白质序列诸如所示的SEQ ID NO:3和4具有至少约80%序列同一性、约81%序列同一性、约82%序列同一性、约83%序列同一性、约84%序列同一性、约85%序列同一性、约86%序列同一性、约87%序列同一性、约88%序列同一性、约89%序列同一性、约90%序列同一性、约91%序列同一性、约92%序列同一性、约93%序列同一性、约94%序列同一性、约95%序列同一性、约96%序列同一性、约97%序列同一性、约98%序列同一性、约99%序列同一性或约100%序列同一性。氨基酸突变可以作为蛋白质中的单个氨基酸置换或与一种或多种其他突变(诸如一种或多种其他氨基酸置换、缺失或添加)组合进行。可以如本文所述或通过本领域技术人员已知的任何其他方法进行突变。
[0135] STAT1序列:
[0136] STAT1蛋白质比对(来自CDS序列):
[0137] 小鼠与人之间93%同一性
[0138] Mm:小鼠序列(小家鼠(Mus musculus))
[0139] Hs:人序列(智人(Homo sapiens))
[0140] LF:长形式(剪接异构体)
[0141] SF:短形式(剪接异构体)
[0142] SC:STAT1c(组成型活性突变体)
[0143] 粗体和下划线突出显示的是使蛋白质具有组成型活性的突变位点(Refs:Sironi&Ouchi,2004,JBC,STAT1‑induced Apoptosis Is Mediated by Caspases2,3,and 7.Liddle,Alvarez,Poli and Frank,2006,Biochem.,Tyrosine Phosphorylation Is Required for Functional Activation of Disulfide‑Containing Constitutively Active STAT Mutants)。
[0144] 下表的SEQ ID NO的降序是SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:3。
[0145] 表4
[0146]
[0147]
[0148] 人STAT1c DNA序列:SEQ ID NO:1
[0149] ATGTCTCAGTGGTACGAACTTCAGCAGCTTGACTCAAAATTCCTGGAGCAGGTTCACCAGCTTTATGATGACAGTTTTCCCATGGAAATCAGACAGTACCTGGCACAGTGGTTAGAAAAGCAAGACTGGGAGCACGCTGCCAATGATGTTTCATTTGCCACCATCCGTTTTCATGACCTCCTGTCACAGCTGGATGATCAATATAGTCGCTTTTCTTTGGAGAATAACTTCTTGCTACAGCATAACATAAGGAAAAGCAAGCGTAATCTTCAGGATAATTTTCAGGAAGACCCAATCCAGATGTCTATGATCATTTACAGCTGTCTGAAGGAAGAAAGGAAAATTCTGGAAAACGCCCAGAGATTTAATCAGGCTCAGTCGGGGAATATTCAGAGCACAGTGATGTTAGACAAACAGAAAGAGCTTGACAGTAAAGTCAGAAATGTGAAGGACAAGGTTATGTGTATAGAGCATGAAATCAAGAGCCTGGAAGATTTACAAGATGAATATGACTTCAAATGCAAAACCTTGCAGAACAGAGAACACGAGACCAATGGTGTGGCAAAGAGTGATCAGAAACAAGAACAGCTGTTACTCAAGAAGATGTATTTAATGCTTGACAATAAGAGAAAGGAAGTAGTTCACAAAATAATAGAGTTGCTGAATGTCACTGAACTTACCCAGAATGCCCTGATTAATGATGAACTAGTGGAGTGGAAGCGGAGACAGCAGAGCGCCTGTATTGGGGGGCCGCCCAATGCTTGCTTGGATCAGCTGCAGAACTGGTTCACTATAGTTGCGGAGAGTCTGCAGCAAGTTCGGCAGCAGCTTAAAAAGTTGGAGGAATTGGAACAGAAATACACCTACGAACATGACCCTATCACAAAAAACAAACAAGTGTTATGGGACCGCACCTTCAGTCTTTTCCAGCAGCTCATTCAGAGCTCGTTTGTGGTGGAAAGACAGCCCTGCATGCCAACGCACCCTCAGAGGCCGCTGGTCTTGAAGACAGGGGTCCAGTTCACTGTGAAGTTGAGACTGTTGGTGAAATTGCAAGAGCTGAATTATAATTTGAAAGTCAAAGTCTTATTTGATAAAGATGTGAATGAGAGAAATACAGTAAAAGGATTTAGGAAGTTCAACATTTTGGGCACGCACACAAAAGTGATGAACATGGAGGAGTCCACCAATGGCAGTCTGGCGGCTGAATTTCGGCACCTGCAATTGAAAGAACAGAAAAATGCTGGCACCAGAACGAATGAGGGTCCTCTCATCGTTACTGAAGAGCTTCACTCCCTTAGTTTTGAAACCCAATTGTGCCAGCCTGGTTTGGTAATTGACCTCGAGACGACCTCTCTGCCCGTTGTGGTGATCTCCAACGTCAGCCAGCTCCCGAGCGGTTGGGCCTCCATCCTTTGGTACAACATGCTGGTGGCGGAACCCAGGAATCTGTCCTTCTTCCTGACTCCACCATGTGCACGATGGGCTCAGCTTTCAGAAGTGCTGAGTTGGCAGTTTTCTTCTGTCACCAAAAGAGGTCTCAATGTGGACCAGCTGAACATGTTGGGAGAGAAGCTTCTTGGTCCTAACGCCAGCCCCGATGGTCTCATTCCGTGGACGAGGTTTTGTAAGGAAAATATAAATGATAAAAATTTTCCCTTCTGGCTTTGGATTGAAAGCATCCTAGAACTCATTAAAAAACACCTGCTCCCTCTCTGGAATGATGGGTGCATCATGGGCTTCATCAGCAAGGAGCGAGAGCGTGCCCTGTTGAAGGACCAGCAGCCGGGGACCTTCCTGCTGCGGTTCAGTGAGAGCTCCCGGGAAGGGGCCATCACATTCACATGGGTGGAGCGGTCCCAGAACGGAGGCGAACCTGACTTCCATGCGGTTGAACCCTACACGAAGAAAGAACTTTCTGCTGTTACTTTCCCTGACATCATTCGCAATTACAAAGTCATGGCTTGTGAGTGTATTCCTGAGAATCCCCTGAAGTATCTGTATCCAAATATTGACAAAGACCATGCCTTTGGAAAGTATTACTCCAGGCCAAAGGAAGCACCAGAGCCAATGGAACTTGATGGCCCTAAAGGAACTGGATATATCAAGACTGAGTTGATTTCTGTGTCTGAAGTTCACCCTTCTAGACTTCAGACCACAGACAACCTGCTCCCCATGTCTCCTGAGGAGTTTGACGAGGTGTCTCGGATAGTGGGCTCTGTAGAATTCGACAGTATGATGAACACAGTATAG
[0150] 小鼠STAT1c DNA序列:SEQ ID NO:2ATGTCACAGTGGTTCGAGCTTCAGCAGCTGGACTCCAAGTTCCTGGAGCAGGTCCACCAGCTGTACGATGACAGTTTCCCCATGGAAATCAGACAGTACCTGGCCCAGTGGCTGGAAAAGCAAGACTGGGAGCACGCTGCCTATGATGTCTCGTTTGCGACCATCCGCTTCCATGACCTCCTCTCACAGCTGGACGACCAGTACAGCCGCTTTTCTCTGGAGAATAATTTCTTGTTGCAGCACAACATACGGAAAAGCAAGCGTAATCTCCAGGATAACTTCCAAGAAGATCCCGTACAGATGTCCATGATCATCTACAACTGTCTGAAGGAAGAAAGGAAGATTTTGGAAAATGCCCAAAGATTTAATCAGGCCCAGGAGGGAAATATTCAGAACACTGTGATGTTAGATAAACAGAAGGAGCTGGACAGTAAAGTCAGAAATGTGAAGGATCAAGTCATGTGCATAGAGCAGGAAATCAAGACCCTAGAAGAATTACAAGATGAATATGACTTTAAATGCAAAACCTCTCAGAACAGAGAAGGTGAAGCCAATGGTGTGGCGAAGAGCGACCAAAAACAGGAACAGCTGCTGCTCCACAAGATGTTTTTAATGCTTGACAATAAGAGAAAGGAGATAATTCACAAAATCAGAGAGTTGCTGAATTCCATCGAGCTCACTCAGAACACTCTGATTAATGACGAGCTCGTGGAGTGGAAGCGAAGGCAGCAGAGCGCCTGCATCGGGGGACCGCCCAACGCCTGCCTGGATCAGCTGCAAAGCTGGTTCACCATTGTTGCAGAGACCCTGCAGCAGATCCGTCAGCAGCTTAAAAAGCTGGAGGAGTTGGAACAGAAATTCACCTATGAGCCCGACCCTATTACAAAAAACAAGCAGGTGTTGTCAGATCGAACCTTCCTCCTCTTCCAGCAGCTCATTCAGAGCTCCTTCGTGGTAGAACGACAGCCGTGCATGCCCACTCACCCGCAGAGGCCCCTGGTCTTGAAGACTGGGGTACAGTTCACTGTCAAGCTGAGACTGTTGGTGAAATTGCAAGAGCTGAACTATAACTTGAAAGTGAAAGTCTCATTTGACAAAGATGTGAACGAGAAAAACACAGTTAAAGGATTTCGGAAGTTCAACATCTTGGGTACGCACACAAAAGTGATGAACATGGAAGAATCCACCAACGGAAGTCTGGCAGCTGAGTTCCGACACCTGCAACTGAAGGAACAGAAAAACGCTGGGAACAGAACTAATGAGGGGCCTCTCATTGTCACCGAAGAACTTCACTCTCTTAGCTTTGAAACCCAGTTGTGCCAGCCAGGCTTGGTGATTGACCTGGAGGTCTTTGTTCCCTTTCAGACCACCTCTCTTCCTGTCGTGGTGATCTCCAACGTCAGCCAGCTCCCCAGTGGCTGGGCGTCTATCCTGTGGTACAACATGCTGGTGACAGAGCCCAGGAATCTCTCCTTCTTCCTGAACCCCCCGTGCGCGTGGTGGTCCCAGCTCTCAGAGGTGTTGAGTTGGCAGTTTTCATCAGTCACCAAGAGAGGTCTGAACGCAGACCAGCTGAGCATGCTGGGAGAGAAGCTGCTGGGCCCTAATGCTGGCCCTGATGGTCTTATTCCATGGACAAGGTTTTGTAAGGAAAATATTAATGATAAAAATTTCTCCTTCTGGCCTTGGATTGACACCATCCTAGAGCTCATTAAGAAGCACCTGCTGTGCCTCTGGAATGATGGGTGCATTATGGGCTTCATCAGCAAGGAGCGAGAACGCGCTCTGCTCAAGGACCAGCAGCCAGGGACGTTCCTGCTTAGATTCAGTGAGAGCTCCCGGGAAGGGGCCATCACATTCACATGGGTGGAACGGTCCCAGAACGGAGGTGAACCTGACTTCCATGCCGTGGAGCCCTACACGAAAAAAGAACTTTCAGCTGTTACTTTCCCAGATATTATTCGCAACTACAAAGTCATGGCTTGCGAGTGCATACCAGAGAATCCCCTGAAGTATCTGTACCCCAATATTGACAAAGACCACGCCTTTGGGAAGTATTATTCCAGACCAAAGGAAGCACCAGAACCGATGGAGCTTGACGACCCTAAGCGAACTGGATACATCAAGACTGAGTTGATTTCTGTGTCTGAAGTCCACCCTTCTAGACTTCAGACCACAGACAACCTGCTTCCCATGTCTCCAGAGGAGTTTGATGAGATGTCCCGGATAGTGGGCCCCGAATTTGACAGTATGATGAGCACAGTATAA[0151] 2.miRNA靶向
[0152] 在一些情况下,修饰在靶序列处进行,或者在与靶序列具有至少百分之95(例如,至少百分之96、至少百分之97、至少百分之98或至少百分之99)同一性的靶序列处进行。在一些更特定的情况下,修饰在以下处进行:在SEQ ID NO:9或10所示的靶序列处,或者在与SEQ ID NO:9或10所示的序列具有至少百分之95(例如,至少百分之96、至少百分之97、至少百分之98或至少百分之99)同一性的靶序列处。
[0153] miR‑142‑T序列:
[0154] miR‑142T单一位点:TCCATAAAGTAGGAAACACTACA(SEQ ID NO:9)
[0155] miR‑142T 4X位点(用于通过miR‑142有效靶向):
[0156] CTAGAGTCGACTCCATAAAGTAGGAAACACTACACGATTCCATAAAGTAGGAAACACTACAACCGGTTCCATAAAGTAGGAAACACTACATCACTCCATAAAGTAGGAAACACTACAC(SEQ ID NO:10)
[0157] 参考:
[0158] Brown,B.D.,Venneri,M.A.,Zingale,A.,Sergi Sergi,L.&Naldini,L.Endogenous microRNAregulation suppresses transgene expression  in 
hematopoietic lineages and enables stable gene transfer.Nat Med 12,585‑591(2006).Cire,S.,Da Rocha,S.,Ferrand,M.,Collins,M.K.&Galy,A.In Vivo Gene Delivery to Lymph Node Stromal Cells Leads to Transgene‑specific CD8+T Cell Anergy in Mice.Mol Ther(2016)。
[0159] 序列同一性和修饰
[0160] 特定核酸或氨基酸序列与由特定序列识别号引用的序列之间的序列同一性百分比可以通过本领域已知的技术来确定。在一种实例中,序列同一性被确定如下。首先,使用BLAST2序列(B12seq)程序将核酸或氨基酸序列与特定序列识别号中所示的序列进行比较,该程序来自包含BLASTN版本2.0.14和BLASTP版本2.0.14的BLASTZ的独立版本。BLASTZ的独立版本可在线获取,网址为fr.com/blast或ncbi.nlm.nih.gov。解释如何使用B12 seq程序的说明可以在BLASTZ附带的自述文件中找到。Bl2seq使用BLASTN或BLASTP算法在两个序列之间进行比较。BLASTN用于比较核酸序列,而BLASTP用于比较氨基酸序列。比较两个核酸序列。选项设置如下:‑i被设置为包含待比较的第一核酸序列的文件(例如,C:\seq1.txt);‑j被设置为包含待比较的第二核酸序列的文件(例如,C:\seq2.txt);‑p被设置为blastn;‑o被设置为任何所需的文件名(例如,C:\output.txt);‑q被设置为‑1;‑r被设置为2;并且所有其他选项都保留在其默认设置中。例如,以下命令可以用于生成包含比较两个序列之间的输出文件:C:\B12seq c:\seq1.txt‑j c:\seq2.txt‑p blastn‑o c:\output.txt‑q‑1‑r 2。为了比较两个氨基酸序列,Bl2seq的选项设置如下:‑i被设置为包含待比较的第一氨基酸序列的文件(例如,C:\seq1.txt);‑j被设置为包含待比较的第二氨基酸序列的文件(例如,C:\seq2.txt);‑p被设置为blastn;‑o被设置为任何所需的文件名(例如,C:\output.txt);并且所有其他选项都保留在其默认设置中。例如,以下命令可以用于生成包含比较两个氨基酸序列之间的的输出文件:C:\B12seq c:\seq2.txt‑j c:\seq2.txt‑p blastp‑o c:\output.txt。如果两个比较的序列共享同源性,则指定的输出文件将把这些同源区域作为比对序列呈现。如果两个比较的序列不共享同源性,则指定的输出文件将不呈现的比对序列。
[0161] 一旦比对,通过计数两个序列中存在相同核苷酸或氨基酸残基的位置的数量来确定匹配的数量。序列同一性百分比是通过以下确定的:将匹配数除以所识别序列中所示序列的长度或铰接长度(例如,来自所识别序列中所示的序列的100个连续核苷酸或氨基酸残基),随后将所得值乘以100。例如,当与第一序列比对时具有x匹配的核酸序列与第二序列中所示的序列具有百分之x的同一性(即,x+y×100=%)。值得注意的是,序列同一性百分比值四舍五入至最接近的十分之一。例如,75.11、75.12、75.13和75.14向下舍入为75.1,而75.15、75.16、75.17、75.18和75.19向上舍入为75.2。还应注意的是,长度值将始终是整数。
[0162] 分泌信号
[0163] 核酸构建体的某些实施方式可以实现用于从转染的细胞分泌一个或多个表位的分泌信号序列。分泌信号序列的实例涉及密码子优化的白蛋白分泌信号:
[0164] (SEQ ID NO:24)
[0165] ATGAAGTGGGTAACCTTTCTCCTCCTCCTCTTCATCTCCGGTTCTGCCTTTTCTAGGGGCAAGCTTATG[0166] 本领域技术人员将理解,其他已知的分泌信号序列可以在核酸构建体中实施。分泌信号序列可以从已知分泌的其他真核多肽中获得。随着包括人在内的许多基因组的克隆和测序,存在着可以采用的各种各样的真核细胞分泌信号序列。理想情况下,分泌信号序列选自预期转染细胞的物种,或针对该物种优化的密码子。除了上述提供的密码子优化的白蛋白分泌信号之外,其他实例包括具有序列ATG AAG TGG GTA ACC TTT ATT TCC CTT CTT TTT CTC TTT AGC TCG GCT TAT TCC AGG GGT GTG TTT CGT CGA GAT(SEQ ID NO:25)的白蛋白前导物(leader)和具有序列ATG GAG ACA GAC ACA CTC CTG CTA TGG GTA CTG CTG CTC TGG GTT CCA GGT TCC ACT GGT GAC(SEQ ID NO:26)的免疫球蛋白κ(Igκ)链前导物。还参见美国专利No.9,157,085和WO/2014/177826,用于可适用于核酸构建体实施方式的其它实例。
[0167] 3.纳米颗粒制剂
[0168] 本文所述的核酸构建体也可以与增强细胞转染的聚阳离子分子(包括蛋白质、脂质及其聚合物)或脂质体复合。然而,这种复合物往往在专职性APC诸如DC中快速降解,因此生产性转染往往在基质细胞中更成功。如上所述,由基质细胞呈递CD4和CD8双表位或由基质细胞分泌这些表位增加了诱导对这些表位的致耐受性应答的可能性。聚阳离子分子的实例包括但不限于与或不与钙结合使用的带正电荷的细胞穿膜肽(CPP,诸如聚精氨酸、聚赖氨酸或HIV Tat肽),或者带正电荷的聚合物分子(诸如聚乙烯亚胺)和阳离子脂质。聚阳离子分子与核酸构建体上的负电荷结合,从而折叠和压缩构建体。这种压缩使构建体更小,这反过来又促进了构建体的迁移和更容易地被细胞所摄取。
[0169] 本文公开的核酸构建体可以与用于增强细胞的摄取的聚阳离子分子缔合。将核酸构建体与聚阳离子分子复合也有助于包装构建体,使其尺寸减小,这被认为有助于细胞摄取和体内分散,包括改善向淋巴结的递送以靶向LNSC。一旦进入内体,由于pH较低,复合物就会解离,并且聚阳离子分子可以破坏内体的膜,以促进DNA在其可能被降解之前逃逸至细胞质中。已发表的数据示出,当与阳离子脂质复合时,核酸构建体实施方式与DC相比增强了被摄取至SC中(21)。
[0170] 可用于与核酸构建体复合的聚阳离子分子的一种实例包括CPP,实例包括聚赖氨酸(如上所述)、聚精氨酸和Tat肽。CPP是一种小肽,其可以与DNA结合,一旦释放,就会穿透细胞膜,以促进DNA/mRNA从内体逃逸至细胞质。CPP的另一实例涉及27个残基的嵌合肽,称为MPG,不久前被证明以稳定的方式结合ss和ds寡核苷酸,产生非共价复合物,该复合物保护核酸不被DNA酶降解,并在体外将寡核苷酸有效地递送至细胞(Mahapatro A,et al.,J Nanobiotechnol,2011,9:55)。当检测不同的肽:DNA的比率以及10:1和5:1的比率(分别为150nm和1um)时,复合物形成大约150nm至1um的小颗粒。另一种CPP涉及修饰的四肽[包含胍羰基吡咯(GCP)基团的四赖氨酸(TL‑GCP)],据报道其与6.2kb质粒DNA高亲和力结合,产生
700‑900nm的带正电荷的聚集体,Li et al.,Agnew Chem Int Ed Enl 2015;54(10):2941‑
4)。RNA也可以被这种聚阳离子分子复合用于体内递送(参见Yin&Anderson的综述)。
[0171] 可以与本文所述核酸构建体复合的聚阳离子分子的其它实例包括以下可商购的聚阳离子聚合物:如 和体内 (具有聚乙烯亚胺)和体内(具有阳离子脂质)(Polypus‑转染,S.A.,法国,伊尔基希-格拉芬斯塔登)。
[0172] 4.疫苗的组合物、给药、途径和剂量
[0173] 本文公开的核酸构建体被考虑用于向有需要的受试者给药,并且可以通过本领域技术人员已知的任何方便的方法给药。给药可以通过任何途径,包括但不限于局部和全身方法,例如递送至气溶胶,经口服、直肠、阴道口腔、经粘膜、结内(intranodal)、经皮、皮下、静脉内、皮下、皮内、气管内、肌内、动脉内、腹腔内、颅内(例如鞘内或脑室内)或任何已知且方便的途径。优选的给药途径是静脉内、腹腔内、皮下、口服/鼻腔和直接注射至受影响的器官、组织、感染或肿瘤区域或特定淋巴结中。给药的形式可以确定活性剂是如何配制的,并且这是本领域技术人员容易确定的。核酸药物通常以纳米尺寸的药物制剂递送至血流中,并且这些众所周知的制剂和给药方法是优选的。Pujol‑Autonell et al.,“Use of autoantigen‑loaded phosphatidylserine‑liposomes to arrest autoimmunity in type 1diabetes.”PloS one 10,e0127057(2015)中描述了一种示例性纳米载体。
[0174] 因此,包括一种或核酸构建体的组合物实施方式可以包括但不限于用于口服给药的固体制剂、溶解在用于口服或非肠道给药的液体负载体中的固体制剂,溶液、悬浮液、乳液、油、乳膏、软膏、洗剂、凝胶、粉末、颗粒、悬浮液中的细胞,和包含脂质体的制剂等,或本领域已知的任何方便形式。这些组合物可以由各种各样的组分生成,该组分包括但不限于预成型液体、自乳化固体和自乳化半固体。
[0175] 用于胃肠外、皮内、皮下或其他注射的溶液或悬浮液可以包括以下组分:无菌稀释剂诸如注射用水、盐水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂;抗细菌剂诸如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯;抗氧化剂诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠;螯合剂诸如乙二胺四乙酸;缓冲剂诸如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐;以及用于调节张力的药剂诸如氯化钠或右旋糖。pH可以用酸或碱诸如盐酸或氢氧化钠来进行调节。肠胃外制剂可以封装在安瓿、一次性注射器或者玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。
[0176] 适用于注射使用的包含核酸构建体的组合物包括无菌水性溶液(其中治疗剂是水溶性的)或分散体以及用于即时制备无菌注射溶液或分散体的无菌粉末。对于静脉内给药,合适的负载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor (BASF,Parsippany,N.J.)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下,组合物都必须是无菌的,并且应该是流动的,使其能够足够容易地通过注射器和针头给药。它应在制造和储存条件下保持稳定,并应防止微生物诸如细菌和真菌的污染行为。用于溶解DNA或RNA的所有溶液也应该是不含DNA酶和RNA酶的。
[0177] 负载体可以是包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适混合物的溶剂或分散介质。例如,可以通过使用涂层诸如卵磷脂在分散的情况下通过保持所需的颗粒尺寸以及通过使用表面活性剂来保持适当的流动性。通过各种抗细菌剂和抗真菌剂,例如,苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等,可以实现对微生物作用的预防。在许多情形下,在组合物中包括等渗剂(例如,糖、多元醇(诸如甘露醇、山梨醇)和氯化钠)将是优选的。通过在可注射组合物中包括延迟吸收的试剂,例如,单硬脂酸和明胶,可实现该组合物的持久吸收。
[0178] 包括一种或多种公开的核酸构建体的无菌可注射溶液可以通过以下来制备:将所需量的活性剂与一种或上文列举的成分的组合(如需要)掺入适当的溶剂中,随后过滤灭菌。通常,通过将活性剂掺入至无菌运载体中来制备分散体,该无菌运载体包含碱性分散介质和来自上文列举的那些的所需其它成分。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下,优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥,其从其先前无菌过滤的溶液中得到活性成分的粉末加上任何额外的所需成分。本领域技术人员知道如何使用这些干燥的制剂进行注射。
[0179] 包括一种或多种公开的核酸构建体的口服组合物通常包括惰性稀释剂或可食用负载体。它们可以封装在明胶胶囊中,或可以压缩成片剂。根据所治疗的特定条件,本发明用于治疗动脉粥样硬化或代谢综合征的其他组成的药物组合物可以被配制并全身或局部给药。配制和给药的技术可在“Remington:The Science and Practice of Pharmacy”(20th edition,Gennaro(ed.)and Gennaro,Lippincott,Williams&Wilkins,2000)中得到。对于口服给药,该药剂可以以肠溶形式包含以在胃中存活,或者通过已知方法另外包衣或混合以在GI道的特定区域中释放。为了口服治疗给药的目的,活性剂可以与赋形剂结合,并以片剂、锭剂或胶囊的形式使用。还可以使用用作漱口水的流体负载体来制备口腔组合物,其中流体负载体中的化合物经口施用并漱口、咳出或吞咽。药物相容性结合剂和/或佐剂材料可以作为组合物的一部分包括在内。片剂、丸剂、胶囊、糖锭剂等可以包含以下成分或者或类似性质的化合物的任何一种:粘结剂诸如微晶纤维素、黄芪胶或明胶;赋形剂诸如淀粉或乳糖,崩解剂诸如海藻酸、 或玉米淀粉;润滑剂诸如硬脂酸镁或助流剂诸如胶体二氧化甜味剂诸如蔗糖或糖精;或者调味剂诸如薄荷、
水杨酸甲酯或橙味调味剂。
[0180] 全身给药也可以通过肠或结肠的经粘膜方式,诸如,例如,通过栓剂或灌肠剂。对于经粘膜或经皮给药,在制剂中使用适合于待渗透屏障的渗透剂。这种渗透剂在本领域中通常是已知的,并且包括例如用于经粘膜给药洗涤剂、胆汁盐和夫西地酸衍生物。经粘膜给药可以通过使用鼻喷雾剂或栓剂来完成。对于经皮给药,将所公开的核酸构建体配制成本领域公知的软膏、药膏、凝胶或乳膏。
[0181] 在几种实施方式中,所公开的核酸构建体是用负载体制备的,该负载体将保护化合物免受从体内快速消除,诸如控释或延迟制剂,包括植入物和微胶囊递送系统。可以使用可生物降解生物相容性聚合物,诸如乙烯‑乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯(polyorthoester)和聚乳酸。制备这种制剂的方法对本领域技术人员来说是显而易见的。该材料也可以从Alza Corporation和Nova Pharmaceuticals,Inc.商业获得。脂质体悬浮液(包括用例如单克隆抗体靶向特定细胞的脂质体)也可以用作药学上可接受的负载体。这些可以根据本领域技术人员已知的方法来制备。
[0182] 包括被设计为提供延长或延迟释放的一种或多种公开核酸构建体的制剂也考虑用于本发明。以下美国专利包含关于摄取、分布和/或吸收辅助制剂的制备的代表性教导:美国专利No.5,108,921、5,354,844、5,416,016、5,459,127、5,521,291、5,543,158、5,547,
932、5,583,020、5,591,721、4,426,330、4,534,899、5,013,556、5,108,921、5,213,804、5,
227,170、5,264,221、5,356,633、5,395,619、5,416,016、5,417,978、5,462,854、5,469,
854、5,512,295、5,527,528、5,534,259、5,543,152、5,556,948、5,580,575和5,595,756。这样的组合物考虑用于本发明。
[0183] 包括一种或多种公开的核酸构建体的药物制剂,其可以方便地以单位剂型呈现,可以根据制药工业中众所周知的常规技术制备。这种技术包括使活性成分与一种或多种药物负载体或者一种或多种赋形剂结合的步骤。通常,制剂是通过将活性成分与液体负载体或细分的固体负载体或两者均匀且紧密地结合来制备,并且然后,如果需要,将产品成型。本文所述的活性剂也可以与其他分子、分子结构或化合物的混合物例如脂质体、受体靶向分子、口服、直肠、局部或其他制剂来共混、包封、缀合或以其他方式缔合,以帮助摄取、分布和/或吸收。用于产生液体、固体、半固体、凝胶、粉末或可吸入制剂等的这种方法是本领域已知的。配制和给药的技术可在“Remington:The Science and Practice of Pharmacy”(20th edition,Gennaro(ed.)and Gennaro,Lippincott,Williams&Wilkins,2000)中得到。替代地,本发明的化合物可以与悬浮液中的微球融合用于静脉内注射。
[0184] 给药的剂量和方案由包括医生在内的专业人员决定。组合物,包括本发明的核酸、肽、组合物和细胞的给药可以按以下进行:单次或以一定间隔重复,诸如通过持续输注一段时间,每日四次、每日两次、每日、每隔一天、每周、每月,或由本领域技术人员基于所涉及的受试者确定的任何间隔。治疗可以涉及给药以下的时间段:仅一天、一周、一个月、几个月、几年或一生。方案和持续时间可以根据本领域已知的任何系统而变化,如本领域技术人员所知。
[0185] 在纳米载体型药物运载体中表达DNA或mRNA或者裸DNA或RNA的细胞可以静脉内注射至患者中或者注射至由待治疗疾病病症影响的组织和/或器官中。目前可用于人治疗的细胞运载体包括致耐受性或免疫原性树突状细胞和基质细胞。某些类型的基质细胞的前体(间充质基质细胞或间充质干细胞)可以来源于骨髓或脂肪组织。纳米载体运载体可以是脂质体、纳米颗粒或微粒,其可以在体内被APC摄取。
[0186] 所公开的一种或多种核酸构建体、肽和细胞的剂量可由本领域技术人员基于受试者的病症和待使用的给药途径来确定,但预期范围为约100μg至约10mg,优选约500μg至约10mg,或约1mg至约10mg,或约1mg至约5mg或约5mg至约10mg,以及最优选约1mg至约5mg。优化/药代动力学可以使较低剂量有效,因此本发明考虑使用更低剂量,例如约10μg至约100μg。
[0187] 实施例
[0188] 实施例1.体外评估T细胞对Endotope编码表位的应答
[0189] 表位的呈递可以使用来自T细胞受体转基因小鼠诸如BDC2.5、BDC12‑4.1、NY8.3、G9C8和G286的T细胞克隆在体外进行测试。将来自这些小鼠的脾和汇集的淋巴结制备成单细胞悬浮液,并纯化Ag特异性CD4+CD25‑或CD8+T细胞,并在体外与通过慢病毒转导、质粒DNA转染或mRNA‑NP转染修饰的基质细胞共培养,以表达核酸构建体。3天后测量T细胞应答以测量刺激、无反应性标志物和例如表达Foxp3或IL‑10的调节性T细胞的诱导。在添加T细胞之前,可以对基质细胞进行修饰以表达表位STAT1c和/或用IFNγ调节3‑4天。
[0190] 小鼠:所有小鼠品系均从杰克逊实验室(Jackson Laboratory)购买,并在我们的屏障设施中繁殖:NOD(#001976)、NOD.SCID(#001303)、NOD.Thy1.1(#004483)、NOD.CD45.2(#14149)和T细胞受体转基因(TCR‑Tg)小鼠:BDC2.5(#004460)、BDC12–4.1(#006303/006304)和NY8.3(#005868)。来自这些小鼠的TCR‑Tg T细胞分别识别p79/2.5模拟表位(2.5mi)(23)、InsB9–23表位和模拟表位(24),以及IGRP206–214表位,所有这些表位都由我们的NOD小鼠定制的Endotope构建体编码。
[0191] 转导和mRNA转染:如果使用病毒载体来转导基质细胞,则优选使用约5‑10MOI的多重度感染(MOI;悬浮液中病毒颗粒的估计数量)(这些细胞高效转导)。用mRNA‑NP转染也可以获得非常高的效率水平(>90%)(21)。
[0192] 实施例2:评估靶向非病毒基因向基质细胞的递送_
[0193] 体外转录(IVT)GFP mRNA±miR‑142T由TriLink定制合成。使用市售的体内JetRNA22
(Polyplus) 将mRNA复合为mRNA‑NP。用不同的mRNA产生的纳米颗粒通过NanoSight或Zetasizer来评估尺寸和颗粒电荷的一致性。NOD小鼠(6‑10周龄)腹腔内注射mRNA‑NP(每只小鼠20μg mRNA)。8h、24h和48h后收集脾、各种淋巴结和肝脏(也包含示出介导耐受的不同
8、26、41、42
类型的基质细胞 ),消化以释放基质细胞,并通过磁分离去除淋巴细胞,以富集LNSC和DC群体(<5%的淋巴组织中的细胞数)。通过流式细胞术分析各种APC,以评估GFP与LNSC和DC标志物(CD45、CD31、Pdpn、CD11c、CD11b、B220、CD317、CD8a)的表达。使用静脉和皮下递送途径重复分析。如果48h后仍可见高表达,则在分析中包括稍后的时间点以确定表达的持续时间。当使用miR‑142T时,预计表达将仅限于基质细胞。
[0194] 实施例3:表征T细胞对由基质细胞表达的Ag的应答
[0195] 所产生的IVT mRNA表达(1)多个β细胞表位(Endotope)19和(2)小鼠STAT1c,两者都具有miR‑142T位点(TriLink)。使用体内JetRNA将Endotope mRNA(5μg/小鼠)与GFP或STAT1c mRNA(20μg/鼠)联合配制为mRNA‑NP,并注射至NOD小鼠中。在过继转移模型中,将细+ ‑ +胞增殖染料标记的CD4 CD25 T细胞和CD8T细胞(分别来自CD45.2先天性BDC2.5和NY8.3小鼠)注射至NOD小鼠中,其与两个mRNA编码的表位(图1A)反应,并通过流式细胞术在两个时间点(3天和2周后)根据以下来评估Ag特异性T细胞应答:克隆频率(总T细胞中的CD45.2+
%)、增殖(示踪染料稀释)和表型标志物(例如CD25、CD44、PD‑1、Lag‑3、CD49b、CD73、FR4、Tim‑3和Tigit)。另外,对Foxp3、IFNγ和IL‑10进行细胞内染色。在第二个模型中,使用相同的时间点和分析图,使用MHC四聚体(来自NIH Tetramer Core Facility)评估多克隆Ag特
20、21、43
异性T细胞对两个表位的应答 。在这两个模型中,作为内部对照的宿主T细胞(CD45.1+
)或四聚体阴性T细胞的分析提供了这些标志物在一般T细胞群上的基线表达。测试了三种mRNA‑NPP注射途径(i.p.、i.v.、s.c.),并且每个构建体(Ag/GFP与Ag/STAT1c)、每个时间点和每个途径至少5只小鼠。STAT1c共递送增强了基质细胞对T细胞的结合及其耐受相关标志物的表达。
[0196] 实施例4.细胞选择性表达miR‑142T的验证。
[0197] 用0.1ug mRNA/孔来转染FRC,并在48h后进行分析。用0.2ug mRNA/孔转染THP‑1细胞和BM‑DC,并在48h(THP‑1)或24h(BM‑DC)后进行分析。将小鼠腹腔内注射20‑22.4ug mRNA/小鼠,并在48h后处理并消化胰腺淋巴结和脾以用于分析。
[0198] 淋巴结基质APC包括体外的人成纤维网状细胞(FRC)(图5A)、体外的小鼠FRC(图5B)和体内的小鼠血液内皮细胞(BEC)(图5C)。造血APC包括人单核细胞THP‑1细胞(图5D)、小鼠骨髓衍生的树突状细胞(DM‑DC)(图5E)和体内小鼠CD11c+CD11b+cDC2细胞(图5F)。图
5A‑5B示出GFP‑miR‑142T构建体在体外被引入至基质APC中并在基质APC中表达。图5C示出GFP‑miR‑142构建体在体内被基质APC优先表达。图5D和5E示出GFP‑miR‑142构建体在体外的造血APC中不表达。图5F示出GFP‑miR‑142构建体在体内的造血APC中不表达。总体而言,图5中的数据证实,虽然GFP mRNA可以在造血APC和基质APC中表达,但GFP‑miR‑142T mRNA在基质APC中选择性表达。
[0199] 实施例5:确定mRNA疫苗预防T1D的疗效
[0200] 在所使用的群体中,雌性NOD小鼠在约12周龄发展为糖尿病,到25周龄时发病率为~90%。使用四组小鼠:盐水(A)、具有GFP mRNA的mRNA‑NP(B)、Ag/GFP mRNA(C)和Ag/STAT1c mRNA(D),所有这些都具有包含miR142T的mRNA。通过先前测试的注射途径的至少一种每隔一周对小鼠进行处理(从8周龄开始注射4次),并监测它们的血糖直到30周龄,以确20、43
定疾病的发生率,如先前报道的 。12只小鼠的组在80%统计功效和0.05的显著性下足以具有20%的效应值。具有Ag/STAT1c mRNA的mRNA‑NP提供了对糖尿病发展的最佳保护。作为Endotope的替代,考虑将胰岛素原mRNA作为Ag(通常用于NOD小鼠中的ASIT)。如果可能的话,除了从8周龄的预防性处理外,当小鼠在高血糖症(>250mg/dL)发作之前当小鼠达到血糖代谢障碍(150‑250mg/dL)时则在之后进行处理。
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[0248] 本发明不限于所描述的特定过程、组合物或方法,因为这些可以变化。描述中使用的术语仅用于描述特定的版本或实施方式,而不是旨在限制本发明的范围,本发明的范围将仅由所附权利要求书限制。尽管与本文描述的方法和材料相似或等效的任何方法和材料都可以用于本发明的实践或实施方式的测试,但现在描述的是优选的方法、装置和材料。本文提及的所有公开,其全部内容通过援引并入;本文的任何内容都不应被理解为承认本发明因在先发明而无权在此类公开之前。