[0001] 本发明属于抗体和细胞治疗领域，具体涉及靶向GCC的纳米抗体及其应用。

[0002] 重链(VHH)抗体(或纳米抗体)是仅重链抗体的抗原结合片段。据报道，单个VHH定向BCMA CAR T细胞可导致复发/难治性多发性骨髓瘤的缓解。因此，VHH抗体可用于引导CAR T细胞来靶向实体瘤。

[0003] 实施方案涉及结合GCC的抗体，其中该抗体包含VHH结构域，包含SEQ ID NO:1、5或9所示的氨基酸序列。

[0004] 本发明内容不旨在标识所要求保护的主题的关键特征或必要特征，也不旨在用于限制所要求保护的主题的范围。附图说明

[0005] 具体实施方式参照附图进行描述。在不同的图中使用相同的附图标记表示相似或相同的项目。

[0006] 图1说明CAR结构的示例的示意图。

[0007] 图2显示了结合分子的示例性结构。

[0008] 图3示出了CAR的示例性结构。

[0009] 图4显示抗体结合测定的流式细胞术结果。

[0010] 图5显示抗体结合测定的流式细胞术结果。

[0011] 图6显示抗体结合测定的流式细胞术结果。

[0012] 图7显示GCC CAR T细胞在第7天的CAR表达和激活情况。

[0013] 图8显示GCC CAR T细胞在第8天的CAR表达和激活情况。

[0014] 图9显示了GCC CAR T细胞与不同底物细胞共培养后细胞激活情况。

[0015] 图10显示了GCC CAR T细胞与不同底物细胞共培养后细胞杀伤情况。

[0016] 图11显示了GCC CAR T细胞与不同底物细胞共培养后细胞因子释放情况。

[0017] 除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管可以在本公开的实践或测试中使用与本文描述的那些类似或等同的任何方法和材料，但是描述了优选的方法和材料。出于本公开的目的，以下术语定义如下。

[0018] 本文使用冠词“一(a)”和“一个(an)”指的是一个或多于一个(即，指的是至少一个)该冠词的语法对象。举例来说，“元件”表示一个元件或多于一个元件。

[0019] “大约”是指数量，水平，值，数量，频率，百分比，尺寸，大小，数量，重量或长度相差多达20、15、10、9、8、7、6、5的数量，参考数量，水平，数值，数量，频率，百分比，尺寸，大小，数量，重量或长度的4％，3％，2％或1％。

[0020] 如本文所用，术语“活化”是指已经充分刺激以诱导可检测的细胞增殖的细胞的状态。激活还可以与诱导的细胞因子产生和可检测的效应子功能相关联。术语“活化的T细胞”特别指正在进行细胞分裂的T细胞。

[0021] 术语“抗体”以最广义使用，指单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的生物活性或功能。本公开中的抗体可以多种形式存在，包括例如多克隆抗体、单克隆抗体、Fv、Fab和F(ab)2，以及单链抗体和人源化抗体(Harlow et al.,1999,In Using Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY；Harlow et al.,1989,In Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,New York；Houston et al.,
1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：5879‑5883；Bird等人，1988，Science 242：423‑426)。

[0022] 术语“抗体片段”是指全长抗体的一部分，例如抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的其他例子包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双体；线性抗体；单链抗体分子；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。

[0023] 术语“Fv”是指包含完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。该片段由一个重链和一个轻链可变区结构域的二聚体组成，形成紧密的非共价结合。这两个结构域的折叠产生了六个高变环(H链和L链各3个环)，它们有助于抗原结合的氨基酸残基，并赋予抗体抗原结合特异性。然而，即使是单个可变域(或Fv的一半，仅包括对抗原特异的三个互补决定区(CDR))也可以识别和结合抗原，尽管亲和力低于整个结合位点(二聚体)。

[0024] 如本文所用，“抗体重链”是指在所有抗体分子中以其天然存在的构象存在的较大的两种类型的多肽链。如本文所用，“抗体轻链”是指在所有抗体分子中以其天然存在的构象存在的较小的两种多肽链。κ和λ轻链是指两种主要的抗体轻链同种型。

[0025] 术语“合成抗体”是指使用重组DNA技术产生的抗体，例如由噬菌体表达的抗体。该术语还包括通过合成编码该抗体的DNA分子和表达该DNA分子以获得该抗体或获得编码该抗体的氨基酸而产生的抗体。合成DNA是使用本领域可用且众所周知的技术获得的。

[0026] 在实施方案中，抗体是近25年前发现的重链(VHH)抗体上的单个可变结构域，也称为 仅重链抗体(HcAb)由骆驼和鲨鱼自然产生。HcAb的抗原结合部分由VHH片段组成。

[0027] 术语“抗原”是指引起免疫反应的分子，这可能涉及抗体的产生、特定免疫活性细胞的激活，或两者兼而有之。抗原包括任何大分子，包括源自重组或基因组DNA的所有蛋白质或肽或分子。例如，DNA包括编码蛋白质或肽的核苷酸序列或部分核苷酸序列，所述蛋白质或肽引发免疫反应，因此编码“抗原”，如本文所用术语。抗原不需要仅由基因的全长核苷酸序列编码。抗原可以从生物样品产生、合成或衍生，包括组织样品、肿瘤样品、细胞或生物流体。

[0028] 如本文所用，术语“抗肿瘤作用”是指与肿瘤体积减少、肿瘤细胞数量减少、转移灶数量减少、肿瘤减少相关的生物学效应、细胞增殖、肿瘤细胞存活率降低、具有肿瘤细胞的受试者的预期寿命增加、或与癌症状况相关的各种生理症状的改善。“抗肿瘤作用”也可以通过肽、多核苷酸、细胞和抗体首先预防肿瘤发生的能力来体现。

[0029] 术语“自身抗原”是指被免疫系统错误识别为外来的抗原。自身抗原包括细胞蛋白、磷蛋白、细胞表面蛋白、细胞脂质、核酸和糖蛋白，包括细胞表面受体。术语“自体”用于描述来自同一受试者的材料，稍后将其重新引入受试者。

[0030] 术语“同种异体的”用于描述源自相同物种的不同受试者的移植物。例如，供体受试者可以是相关或不相关的受体受试者，但供体受试者具有与受体受试者相似的免疫系统标记。术语“异种”用于描述源自不同物种的受试者的移植物。例如，供体受试者来自与受体受试者不同的物种，供体受试者和受体受试者可以在遗传上和免疫学上不相容。

[0031] 术语“癌症”是指以异常细胞的快速和不受控制的生长为特征的疾病。癌细胞可以局部扩散或通过血流和淋巴系统扩散到身体的其他部位。各种癌症的实例包括乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等。

[0032] 可以治疗的癌症包括未血管化或尚未充分血管化的肿瘤，以及血管化肿瘤。癌症可包括非实体瘤(例如血液肿瘤，例如白血病和淋巴瘤)或可包括实体瘤。用本公开的CAR治疗的癌症类型包括但不限于癌、母细胞瘤和肉瘤，以及某些白血病或淋巴恶性肿瘤、良性和恶性肿瘤，以及恶性肿瘤，例如肉瘤、癌和黑素瘤.成人肿瘤/癌症和儿童肿瘤/癌症也包括在内。

[0033] 血液癌症是血液或骨髓的癌症。血液(或血源性)癌症的实例包括白血病，包括急性白血病(例如急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性髓细胞白血病和成髓细胞、早幼粒细胞、骨髓单核细胞、单核细胞和红白血病)、慢性白血病(例如慢性粒细胞(粒细胞)白血病、慢性粒细胞性白血病和慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤(惰性和高级形式)、多发性骨髓瘤、华氏巨球蛋白血症、重链病、骨髓增生异常综合征、毛细胞白血病，和骨髓增生异常。实体瘤是异常的组织块，通常不含囊肿或液体区域。实体瘤可以是良性或恶性的。不同类型的实体瘤以形成它们的细胞类型命名(例如肉瘤、癌和淋巴瘤)。实体瘤的实例，例如肉瘤和癌，包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌、乳腺癌、肺癌,前列腺癌,肝细胞癌,鳞状细胞癌,基底细胞癌,腺癌,汗腺癌,甲状腺髓样癌,甲状腺乳头状癌,嗜铬细胞瘤皮脂腺癌,乳头状癌,乳头状腺癌,髓样癌,支气管癌,肾细胞癌,肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、维尔姆斯瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、精原细胞瘤、膀胱癌、黑色素瘤和中枢神经系统肿瘤(如胶质瘤(如脑干胶质瘤和混合胶质瘤)、胶质母细胞瘤(也称为多形性胶质母细胞瘤))、星形细胞瘤、中枢神经系统淋巴瘤、生殖细胞瘤、髓母细胞瘤、颅神经鞘瘤瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤和脑转移瘤)。

[0034] 实体瘤抗原是在实体瘤上表达的抗原。在实施方案中，实体瘤抗原也在健康组织上以低水平表达。表1中提供了实体瘤抗原及其相关疾病肿瘤的实例。表1

[0035] 在整个本说明书中，除非上下文另有要求，否则词语“包括”、“包括”和“包括”将被理解为暗示包含陈述的步骤或元素(成分或组分)或步骤组或元素(成分或组件)，但不排除任何其他步骤或元素或一组步骤或元素。短语“由...组成”意味着包括并且限于在短语“由...组成”之后的任何事物。因此，短语“由...组成”表示列出的元素是必需的或强制性的，并且不存在其它元素可以存在。

[0036] 短语“基本上由……组成”是指包括在短语之后列出的任何要素，并且可以包括不干扰或不影响本公开中针对所列要素所指定的活动或动作的其他要素。因此，短语“基本上由……组成”表示所列出的要素是必需的或强制性的，但是那些其他要素是可选的并且可以存在或可以不存在，这取决于它们是否影响所列出的要素的活动或动作。

[0037] 术语“互补”和“互补性”是指通过碱基配对规则相关的多核苷酸(即，核苷酸序列)。例如，序列“A‑G‑T”与序列“T‑C‑A”互补。互补性可以是“部分的”，即根据碱基配对规则，只有部分核酸的碱基匹配，也可以是核酸之间的“完全”或“全部”互补。核酸链之间的互补程度对核酸链之间杂交的效率和强度有显着影响。

[0038] 术语“对应于”或“对应于”是指(a)具有与参考多核苷酸序列的全部或一部分基本上相同或互补或编码与氨基酸序列相同的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸在肽或蛋白质中；或(b)具有与参考肽或蛋白质中的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列的肽或多肽。

[0039] 术语“共刺激配体”是指抗原呈递细胞(例如，APC、树突细胞、B细胞等)上的分子，其特异性结合T细胞上的同源共刺激分子，从而提供除了由例如TCR/CD3复合物与负载有肽的MHC分子结合所提供的主要信号之外，该信号还介导T细胞反应，包括增殖、活化、分化和其他细胞反应中的至少一种。回应。共刺激配体可包括B7‑1(CD80)、B7‑2(CD86)、PD‑L1、PD‑L2、4‑1BBL、OX40L、诱导型共刺激配体(ICOS‑L)、细胞间粘附分子(ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA‑G、MICA、MICB、HVEM、淋巴毒素β受体、3/TR6、ILT3、ILT4、HVEM、CD7的配体、结合Toll配体受体的激动剂或抗体和与B7‑H3特异性结合的配体。共刺激配体还尤其包括与存在于T细胞上的共刺激分子例如CD27、CD28、4‑1BB、OX40、CD30、CD40、PD‑1特异性结合的激动剂或抗体、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原‑1(LFA‑1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7‑H3，以及特异性结合CD83的配体。

[0040] 术语“共刺激分子”是指T细胞上的同源结合配偶体，其与共刺激配体特异性结合，由此介导T细胞的共刺激反应，例如增殖。共刺激分子包括MHC I类分子，BTLA和Toll样受体。

[0041] 术语“共刺激信号”是指与诸如TCR/CD3连接的初级信号组合的信号，其导致T细胞增殖和/或关键分子的上调或下调。

[0042] 术语“共刺激信号传导区域”、“共刺激结构域”和“共刺激结构域”可互换使用以指代除了诸如CD3的刺激或信号传导结构域之外的一个或多个额外的刺激结构域。泽塔。当指代例如CD3 zeta时，术语“刺激”或“信号”域(或区域)也可互换使用。在实施方案中，共刺激信号传导结构域和刺激信号传导结构域可以在同一分子上或同一细胞中的不同分子上。

[0043] 术语“疾病”和“病症”可以互换使用或可以不同，因为特定的疾病或病症可能没有已知的致病因子(因此病因尚未解决)，因此尚未被认为是疾病，而只是一种不良状况或综合征，其中临床医生已经确定了或多或少特定的一组症状。术语“疾病”是受试者的健康状态，其中受试者不能维持体内平衡，并且其中如果疾病没有得到改善，则受试者的健康继续恶化。相反，受试者中的“疾病”是动物能够维持体内平衡但其中动物的健康状态不如没有疾病时的健康状态。如果不加以治疗，疾病不一定会导致动物健康状况的进一步下降。术语“有效”是指足以实现期望的，预期的或预期的结果。例如，治疗中的“有效量”可以是足以产生治疗或预防益处的化合物的量。

[0044] 术语“编码”是指多核苷酸中特定核苷酸序列的固有特性，例如基因，cDNA或mRNA，以用作在具有确定的核苷酸序列(即rRNA，tRNA和mRNA)或确定的氨基酸序列以及由此产生的生物学特性。因此，如果对应于该基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生该蛋白质，则该基因编码蛋白质。核苷酸序列与mRNA序列相同的编码链(除了用“U”代替“T”以外)通常都在序列表中提供，非编码链均用作模板用于基因或cDNA转录的“蛋白质”可以被称为编码该基因或cDNA的蛋白质或其他产物。

[0045] 术语“外源”是指不是天然存在于野生型细胞或生物中但通常通过分子生物学技术引入细胞中的分子。外源多核苷酸的实例包括编码所需蛋白质的载体，质粒和/或人造核酸构建体。关于多核苷酸和蛋白质，术语“内源”或“天然”是指可以在给定的野生型细胞或生物体中发现的天然存在的多核苷酸或氨基酸序列。而且，通过分子生物学技术从第一生物分离并转移到第二生物的特定多核苷酸序列通常被认为是相对于第二生物的“外源”多核苷酸或氨基酸序列。在特定的实施方案中，可以通过分子生物学技术将多核苷酸序列“引入”到已经含有这样的多核苷酸序列的微生物中，例如，以产生原本天然存在的多核苷酸序列的一个或多个另外的拷贝，从而促进其的过表达。编码的多肽。

[0046] 术语“表达”是指由其启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。

[0047] 术语“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包括与待表达的核苷酸序列可操作地连接的表达控制序列。表达载体包括足够的用于表达的顺式作用元件；用于表达的其他元件可由宿主细胞或在体外表达系统中提供。表达载体包括本领域已知的所有载体，例如掺入重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如，裸露的或包含在脂质体中的)和病毒(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。

[0048] 术语“同源的”是指当两个比较的序列的两个中的一个位置被相同的碱基或氨基酸单体亚基占据时，例如，如果两个的每个中的一个位置，则两个多肽之间或两个多核苷酸之间的序列相似性或序列同一性。DNA分子被腺嘌呤占据，然后该分子在该位置是同源的。两个序列之间的同源性百分比是两个序列共有的匹配或同源位置数除以与100相比的位置数的函数。例如，如果两个序列中10个位置中的6个是匹配或同源的，则两个序列是60％同源的。举例来说，DNA序列ATTGCC和TATGGC具有50％的同源性。当两个序列比对以给出最大同源性时进行比较。

[0049] 术语“免疫球蛋白”或“Ig”是指起抗体作用的一类蛋白质。此类蛋白质中包括的五个成员是IgA、IgG、IgM、IgD和IgE。IgA是存在于身体分泌物中的一抗，例如唾液、眼泪、母乳、胃肠道分泌物以及呼吸道和泌尿生殖道的粘液分泌物。IgG是最常见的循环抗体。IgM是大多数受试者的初级免疫反应中产生的主要免疫球蛋白。它是凝集、补体固定和其他抗体反应中最有效的免疫球蛋白，对防御细菌和病毒很重要。IgD是一种免疫球蛋白，它没有已知的抗体功能，但可以作为抗原受体。IgE是一种免疫球蛋白，它通过在暴露于过敏原时导致肥大细胞和嗜碱性粒细胞释放介质来介导速发型超敏反应。

[0050] 术语“分离的”是指基本上或基本上不含在其天然状态下通常伴随它的组分的材料。该材料可以是细胞或大分子，例如蛋白质或核酸。例如，如本文所用，“分离的多核苷酸”是指已从天然存在状态的侧翼序列中纯化的多核苷酸，例如已从通常相邻的序列中去除的DNA片段到片段。或者，如本文所用，“分离的肽”或“分离的多肽”等是指肽或多肽分子从其天然细胞环境和与细胞的其他成分结合的体外分离和/或纯化。术语“基本上纯化的”是指基本上不含通常与其天然状态相关的组分的物质。例如，基本上纯化的细胞是指已经与其通常以其天然存在或天然状态相关联的其他细胞类型分离的细胞。在一些情况下，基本上纯化的细胞群是指同源的细胞群。在其他情况下，该术语仅指已经与天然状态下天然相关的细胞分离的细胞。在实施方案中，细胞在体外培养。在实施方案中，细胞不在体外培养。

[0051] 在本公开的上下文中，使用下列普遍存在的核酸碱基的缩写。“A”指的是腺苷，“C”指的是胞嘧啶，“G”指的是鸟苷，“T”指的是胸苷，以及“U”指的是尿苷。

[0052] 除非另有说明，“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此为简并形式且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质或RNA的短语核苷酸序列也可以包括内含子，以至于编码蛋白质的核苷酸序列在一些版本中可以包含内含子。术语“慢病毒”是指逆转录病毒科的一个属。慢病毒在逆转录病毒中是独一无二的，它能够感染非分裂细胞；它们可以将大量遗传信息传递到宿主细胞的DNA中，因此它们是最有效的基因传递载体方法之一。此外，慢病毒的使用能够将遗传信息整合到宿主染色体中，从而稳定转导遗传信息。HIV、SIV和FIV都是慢病毒的例子。源自慢病毒的载体提供了在体内实现显着水平的基因转移的手段。

[0053] 术语“调节”是指与没有治疗或化合物的情况下受试者的应答水平相比和/或与应答水平相比，在受试者中应答水平可检测地增加或减少。在其他相同但未经治疗的受试者中该术语包括干扰和/或影响天然信号或反应，从而在受试者，优选人中介导有益的治疗反应。

[0054] 当核酸与另一核酸序列形成功能关系时，核酸是“可操作连接的”。例如，如果多肽作为参与多肽分泌的前蛋白表达，则序列或分泌前导序列的DNA与多肽的DNA有效连接；如果启动子或增强子影响序列的转录，则启动子或增强子可操作地连接到编码序列，或如果定位为便于翻译，则核糖体结合位点可操作地连接到编码序列。术语“在转录控制下”是指与多核苷酸有效连接并处于正确位置和方向的启动子，以控制RNA聚合酶的转录起始和多核苷酸的表达。

[0055] 术语“过度表达”的肿瘤抗原或肿瘤抗原的“过表达”旨在表示肿瘤抗原在来自疾病区域的细胞中的异常表达水平，所述疾病区域例如患者相关的特定组织或器官内的实体肿瘤到来自该组织或器官的正常细胞中的表达水平。可以通过本领域已知的标准测定来确定具有肿瘤抗原过表达的以实体瘤或血液恶性肿瘤为特征的患者。

[0056] 组合物的术语“肠胃外施用”包括例如皮下(sc)，静脉内(iv)，肌内(im)，胸骨内注射或输注技术。

[0057] 术语“患者”、“受试者”、“个体”等在本文中可互换使用，并且是指适用于本文所述方法的任何人、动物或活的有机体。在某些非限制性实施方案中，患者、受试者或个体是人或动物。在实施方案中，术语“受试者”旨在包括其中可以引发免疫反应的活生物体(例如，哺乳动物)。受试者的实例包括人和动物，例如狗、猫、小鼠、大鼠及其转基因物种。

[0058] 需要治疗或需要治疗的受试者包括患有需要治疗的疾病、病症或病症的受试者。有需要的受试者还包括需要治疗以预防疾病、病症或病症的受试者。在实施方案中，疾病是癌症。

[0059] 术语“多核苷酸”或“核酸”是指mRNA、RNA、cRNA、rRNA、cDNA或DNA。该术语通常指至少十个碱基长度的核苷酸的聚合形式，核糖核苷酸或脱氧核苷酸或任一类型核苷酸的修饰形式。该术语包括所有形式的核酸，包括单链和双链形式的核酸。

[0060] 术语“多核苷酸变体”和“变体”等是指与参考多核苷酸序列显示基本序列同一性的多核苷酸或在下文定义的严格条件下与参考序列杂交的多核苷酸。这些术语还包括通过添加、缺失或取代至少一个核苷酸而与参考多核苷酸区分开来的多核苷酸。因此，术语“多核苷酸变体”和“变体”包括其中一个或多个核苷酸已被添加或删除，或被不同核苷酸替代的多核苷酸。在这方面，本领域熟知的是，可以对参考多核苷酸进行某些改变，包括突变、添加、缺失和取代，由此改变的多核苷酸保留参考多核苷酸的生物学功能或活性或增加与参考多核苷酸相关的活性(即优化的)。多核苷酸变体包括，例如，与参考多核苷酸序列具有至少50％(和至少51％至至少99％和其间的所有整数百分比，例如90％、95％或98％)序列同一性的多核苷酸此处描述。术语“多核苷酸变体”和“变体”还包括天然存在的等位基因变体和直系同源物。

[0061] 术语“多肽”，“多肽片段”，“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物以及其变体和合成类似物。因此，这些术语适用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是合成的非天然存在的氨基酸，例如相应天然存在的氨基酸的化学类似物，以及天然存在的氨基酸聚合物。在某些方面，多肽可以包括通常催化(即增加各种化学反应的速率)的酶促多肽或“酶”。

[0062] 术语“多肽变体”是指通过添加，缺失或取代至少一个氨基酸残基而与参考多肽序列区分开的多肽。在实施方案中，多肽变体通过一个或多个取代而与参考多肽区别开，所述取代可以是保守的或非保守的。在实施方案中，多肽变体包含保守取代，并且就这一点而言，在本领域中众所周知，可以将一些氨基酸改变为具有广泛相似性质的其他氨基酸而不改变多肽活性的性质。多肽变体还涵盖其中一个或多个氨基酸已添加或缺失，或被不同氨基酸残基取代的多肽。

[0063] 术语“启动子”是指由细胞的合成机器识别的DNA序列或启动多核苷酸序列的特异性转录所需的引入的合成机器。术语“表达控制序列”是指在特定宿主生物中表达可操作连接的编码序列所必需的DNA序列。例如，适用于原核生物的控制序列包括启动子、任选的操纵子序列和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、多聚腺苷酸化信号和增强子。

[0064] 术语“结合”、“结合”或“与”相互作用是指分子识别并粘附到样品或生物体中的第二分子，但基本上不识别或粘附到样品中的其他结构上不相关的分子。如本文所用，关于抗体的术语“特异性结合”是指识别特定抗原但基本上不识别或结合样品中的其他分子的抗体。例如，特异性结合来自一种物种的抗原的抗体也可以结合来自一种或多种物种的抗原。但是，这种跨物种反应性本身并不会改变抗体的特异性分类。在另一个例子中，特异性结合抗原的抗体也可以结合抗原的不同等位基因形式。然而，这种交叉反应本身并不会改变抗体的特异性分类。在某些情况下，术语“特异性结合”或“特异性结合”可用于指抗体、蛋白质或肽与第二种化学物质的相互作用，以表示该相互作用取决于化学物种上的特定结构(例如，抗原决定簇或表位)；例如，抗体识别并结合特定的蛋白质结构，而不是与任何蛋白质结合。如果抗体对表位“A”具有特异性，则在含有标记“A”的反应中存在含有表位A(或游离、未标记的A)的分子，并且抗体将减少与抗体结合的标记A的量.

[0065] “结合蛋白”是能够与另一个分子非共价结合的蛋白。结合蛋白可以与例如DNA分子(DNA结合蛋白)、RNA分子(RNA结合蛋白)和/或蛋白分子(蛋白结合蛋白)结合。在蛋白质结合蛋白的情况下，它可以结合自身(形成同二聚体、同三聚体等)，和/或它可以结合不同蛋白质的一个或多个分子。结合蛋白可以具有多于一种类型的结合活性。例如，锌指蛋白具有DNA结合、RNA结合和蛋白质结合活性。

[0066] “锌指DNA结合蛋白”(或结合结构域)是蛋白质或更大蛋白质内的结构域，其以序列特异性方式通过一个或多个锌指结合DNA，所述锌指是在其结构通过配位锌离子稳定结构域。术语锌指DNA结合蛋白通常缩写为锌指蛋白或ZFP。

[0067] 锌指结合域可以被“工程化”以结合预定的核苷酸序列，例如，通过工程化(改变一个或多个氨基酸)天然存在的锌指蛋白的识别螺旋区。此外，锌指结合结构域可以与DNA切割结构域融合以形成靶向特定所需DNA序列的锌指核酸酶(ZFN)。例如，一对ZFN(例如，ZFN‑左臂和ZFN‑右臂)可以被工程化以靶向并引起特定所需DNA序列(例如，TRAC基因)的修饰。

[0068] “切割”是指DNA分子共价骨架的断裂。切割可以通过多种方法引发，包括但不限于磷酸二酯键的酶水解或化学水解。单链切割和双链切割都是可能的，并且双链切割可以作为两个不同的单链切割事件的结果而发生。DNA切割可导致产生平末端或交错末端。在实施方案中，融合多肽用于靶向双链DNA切割。

[0069] “靶位点”或“靶序列”是限定核酸的一部分的核酸序列，如果存在足够的结合条件，结合分子将与其结合。例如，序列5'GAATTC 3'是Eco RI限制性内切酶的靶位点。

[0070] “融合”分子是其中两个或更多个亚基分子优选共价连接的分子。亚基分子可以是相同化学类型的分子，也可以是不同化学类型的分子。第一类融合分子的实例包括但不限于融合蛋白(例如，ZFP DNA结合结构域和一个或多个激活结构域之间的融合)和融合核酸(例如，编码上文所述的融合蛋白)。第二类融合分子的实例包括但不限于三链形成核酸与多肽之间的融合以及小沟结合物与核酸之间的融合。

[0071] 融合蛋白在细胞中的表达可以通过将融合蛋白递送至细胞或通过将编码融合蛋白的多核苷酸递送至细胞而产生，其中转录多核苷酸并且翻译转录物以产生融合蛋白。反式剪接、多肽切割和多肽连接也可以参与蛋白质在细胞中的表达。用于向细胞递送多核苷酸和多肽的方法在本公开的别处呈现。

[0072] 基因表达的“调节”是指基因活性的改变。表达的调节可以包括但不限于基因激活和基因抑制。基因组编辑(例如，切割、改变、失活、随机突变)可用于调节表达。基因失活是指与不包括本文所述ZFP的细胞相比基因表达的任何降低。因此，基因失活可以是部分的或完全的。

[0073] “感兴趣的区域”是细胞染色质的任何区域，例如基因内或与其相邻的基因或非编码序列，其中希望结合外源分子。结合可以用于靶向DNA切割和/或靶向重组。例如，感兴趣的区域可以存在于染色体、附加体、细胞器基因组(例如，线粒体、叶绿体)或感染病毒基因组中。感兴趣的区域可以在基因的编码区内，在转录的非编码区内，例如前导序列、尾随序列或内含子，或在编码区上游或下游的非转录区内.感兴趣的区域可以小至单个核苷酸对或长达2,000个核苷酸对或核苷酸对的任何整数值。

[0074] “统计显著”是指结果不太可能是偶然发生的。统计显著性可以通过本领域已知的任何方法确定。常用的显着性度量包括p值，它是在原假设为真的情况下观察到的事件发生的频率或概率。如果获得的p值小于显着性水平，则拒绝原假设。在简单的情况下，显着性水平定义为0.05或更小的p值。“减少的”或“减少的”或“较小的”量通常是“统计学上显着”或生理上显着的量并且可以包括约1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9的减少、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40或50次或更多次(例如，100、500、1000次)(包括1(例如，1.5、1.6、1.7、1.8等)和本文所述的量或水平之间的所有整数和小数点。

[0075] 术语“刺激”是指由刺激分子(例如，TCR/CD3复合物)与其同源配体结合诱导的初级反应，从而介导信号转导事件，例如通过TCR/CD3复合物的信号转导。刺激可以介导某些分子的表达改变，例如TGF‑β的下调和/或细胞骨架结构的重组。CD3 zeta并不是CAR构建体就主要反应而言唯一合适的主要信号域。例如，早在1993年，CD3 zeta和FcRγ都被证明是CAR分子的功能性初级信号结构域。如Z Eshhar等人的“Specific activation and targeting of cytotoxic lymphocytes through chimeric single chains consisting of antibody‑binding domains and the gamma or zeta subunits of the immunoglobulin and T‑cell receptors”(DOI:10.1073/pnas.90.2.720)，其中一个scFv与“FcRγ链或CD3复合物链”融合的两个CAR构建体触发了T细胞活化和靶细胞。值得注意的是，正如Eshhar等人所证明的那样，仅包含主要信号结构域CD3 zeta或FcRγ的CAR结构在没有共刺激结构域的共同存在的情况下具有功能。多年来，已经开发了其他基于非CD3 zeta的CAR结构。例如，王等人的“A Chimeric Antigen Receptor(CARs)Based Upon a Killer Immunoglobulin‑Like Receptor(KIR)Triggers Robust Cytotoxic Activity in Solid Tumors”(Molecular Therapy，第22卷，第1期，2014年5月，第S57页)测试了CAR其中一个scFv融合到“杀伤性免疫球蛋白样受体(KIR)的跨膜和细胞质结构域”的分子。Wang等人报道说，“基于KIR的CAR靶向间皮素(SS 1‑KIR)触发抗原‑可与基于CD3～的CAR相媲美的特定细胞毒活性和细胞因子产生。”来自同一组的第二份出版物，Wang等人(“Generation of Potent T‑cell Immunotherapy for Cancer Using DAP12‑Based,Multichain,Chimeric Immunoreceptors”Cancer Immunol Res.2015Jul；3(7):815‑26)，表明一种CAR分子，其中“用于抗原识别的单链可变片段融合到KIR2DS2的跨膜和细胞质结构域，一种刺激性杀伤免疫球蛋白‑样受体(KIR)”在体外和体内均发挥作用“当用DAP12引入人类T细胞时，DAP12是一种基于免疫酪氨酸的含有激活基序的接头。”

[0076] 术语“刺激分子”是指T细胞上的分子，其特异性结合存在于抗原呈递细胞上的同源刺激配体。例如，衍生自刺激分子的功能信号传导结构域是与T细胞受体复合物相关的zeta链。刺激分子包括负责信号转导的结构域。

[0077] 术语“刺激性配体”是指当存在于抗原呈递细胞(例如，APC、树突细胞、B细胞等)上时，可以与同源结合配偶体(称为在本文中作为“刺激分子”)在细胞例如T细胞上，从而介导T细胞的初级反应，包括激活、免疫反应的启动、增殖和类似过程。刺激性配体是本领域众所周知的并且尤其包括装载有肽的MHC I类分子、抗CD3抗体、超激动剂抗CD28抗体和超激动剂抗CD2抗体。

[0078] 术语“治疗”是指治疗和/或预防。通过抑制、缓解或根除疾病状态或减轻疾病状态的症状来获得治疗效果。

[0079] 术语“治疗有效量”是指将引起研究人员、兽医、医生或其他临床医生正在寻找的组织、系统或受试者的生物学或医学反应的主题化合物的量。术语“治疗有效量”包括化合物的量，当施用时，足以预防或在一定程度上减轻所治疗的病症或疾病的一种或多种体征或症状的发展。治疗有效量将根据待治疗对象的化合物、疾病、其严重程度以及年龄、体重等而变化。

[0080] 术语“治疗疾病”是指降低受试者经历的疾病或病症的至少一种体征或症状的频率或严重程度。

[0081] 术语“转染的”、“转化的”或“转导的”是指将外源核酸转移或引入宿主细胞的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已经用外源核酸转染、转化或转导的细胞。该细胞包括初级主题细胞及其后代。

[0082] 术语“载体”是指包含分离的核酸并且可用于在体外和体内(在受试者中)将分离的核酸递送至细胞内部的多核苷酸。许多载体是本领域已知的，包括线性多核苷酸、与离子或两亲化合物相关的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语还包括促进核酸转移到细胞中的非质粒和非病毒化合物，例如聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒载体的例子包括腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体等。例如，慢病毒是复杂的逆转录病毒，除了常见的逆转录病毒基因gag、pol和env之外，还包含其他具有调节或结构功能的基因。慢病毒载体是本领域众所周知的。慢病毒的一些例子包括人类免疫缺陷病毒：HIV‑1、HIV‑2和猿猴免疫缺陷病毒：SIV。慢病毒载体是通过多重减毒HIV毒力基因产生的；例如，基因env、vif、vpr、vpu和nef被删除，使载体在生物学上是安全的。

[0083] 范围：在整个本公开中，本公开的各个方面可以以范围格式呈现。应当理解，范围格式的描述仅仅是为了方便和简洁，不应理解为对本发明范围的硬性限制。因此，范围的描述应该被认为已经具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的各个数值。例如，对诸如从1到6的范围的描述应该被认为具有具体公开的子范围，例如从1到3、从1到4、从1到5、从2到4、从2到6、从3到6等，以及该范围内的单个数字，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。无论范围的广度如何，这都适用。

[0084] T细胞或T淋巴细胞是免疫系统的一种白细胞。有多种类型的T细胞，包括T辅助(TH)细胞、细胞毒性T(TC)细胞(T杀伤细胞、杀伤T细胞)、自然杀伤T(NKT)细胞、记忆T(Tm)细胞、调节性T(Treg))细胞和gamma delta T(γδT)细胞。

[0085] T辅助(TH)细胞协助其他淋巴细胞，例如，激活细胞毒性T细胞和巨噬细胞以及B细胞成熟为浆细胞和记忆B细胞。这些T辅助细胞在其表面表达CD4糖蛋白，也称为CD4+T细胞。一旦被激活，这些T细胞就会迅速分裂并分泌细胞因子。

[0086] 细胞毒性T(TC)细胞会破坏病毒感染的细胞和肿瘤细胞，并且还参与移植排斥。它们在其表面表达CD8蛋白。细胞毒性T细胞释放细胞因子。

[0087] 自然杀伤T(NKT)细胞不同于自然杀伤细胞。NKT细胞识别由CD1d呈递的糖脂抗原。一旦被激活，NKT细胞就会产生细胞因子并释放细胞杀伤分子。

[0088] 记忆T(Tm)细胞寿命长，并且在再次暴露于其同源抗原后可以扩展为大量效应T细胞。Tm细胞为免疫系统提供针对先前遇到的病原体的记忆。Tm细胞有多种亚型，包括中央记忆T(TCM)细胞、效应记忆T(TEM)细胞、组织驻留记忆T(TRM)细胞和虚拟记忆T细胞。Tm细胞要么是CD4+要么是CD8+，通常是CD45RO。

[0089] 调节性T(Treg)细胞在免疫反应结束时关闭T细胞介导的免疫，并抑制逃避胸腺负选择过程的自身反应性T细胞。Treg细胞亚群包括胸腺Treg和外周衍生的Treg。Treg的两个子集都需要转录因子FOXP3的表达。

[0090] Gamma delta T(γδT)细胞是T细胞的一个子集，在细胞表面具有γδT细胞受体(TCR)，因为大多数T细胞表达αβTCR链。γδT细胞在人和小鼠中不太常见，主要存在于肠道黏膜、皮肤、肺和子宫中。它们参与免疫反应的启动和传播。

[0091] 本公开的实施方案涉及使用嵌合抗原受体(CAR)细胞治疗癌症。

[0092] 实施方案涉及编码一种抗体，所述抗体能够特异性结合GCC，所述抗体包含VHH结构域，所述VHH结构域包含CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:2‑4所示的氨基酸序列，或所述CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:6‑8所示的氨基酸序列，或所述CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO：10‑12所示的氨基酸序列。在实施方案中，所述抗体包含SEQ ID NO：1、5或9所示的氨基酸序列。在实施方案中，所述抗体为纳米抗体。在实施方案中，所述抗体为包含多个VHH结构域的抗体。在实施方案中，所述抗体是包含VHH结构域、接头和结合CD3抗体的双特异性抗体。

[0093] 实施方案涉及编码一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括胞外结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，所述胞外结构域包括上述能够特异性结合GCC的抗体，所述胞内结构域包含共刺激信号传导区域，所述共刺激信号传导区域包含共刺激分子的胞内结构域，所述共刺激分子包含CD27、CD28、4‑1BB、OX40、CD30、CD40、PD‑1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原‑1(LFA‑1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C和B7‑H3中的至少一种。在实施方案中，所述嵌合抗原受体包含SEQ ID NO：14‑21所示的氨基酸序列的一种。在实施方案中，所述嵌合抗原受体胞外结构域还包括第二抗原结合结构域，所述第二抗原结合结构域包括结合WBC抗原的结合域或结合实体瘤抗原的结合域。在实施方案中，所述WBC抗原包括CD19或BCMA。

[0094] 实施方案涉及修饰细胞，所述修饰细胞包括上述编码能够特异性结合GCC的抗体或上述编码一种嵌合抗原受体的任一种多核苷酸。在实施方案中，所述修饰细胞是T细胞或NK细胞。实施方案涉及一种组合物，包含上述的修饰细胞群。实施方案涉及上述组合物有在制备细胞治疗药物中的应用。

[0095] 在实施方案中，上述的能够特异性结合GCC的抗体在制备细胞治疗药物中的应用。在实施方案中，所述药物包括抗体偶联药物。在实施方案中，所述抗体偶联药物为上述能够特异性结合GCC的抗体与细胞毒剂偶联。在实施方案中，所述细胞毒剂是放射性同位素或毒素。

[0096] 实施方案涉及一种抗体偶联药物，所述抗体偶联药物中抗体包括上述任一所述的一种抗体。

[0097] 实施方案涉及编码CAR的分离的核酸，其中CAR包含胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域，其中CAR的胞外结构域结合实体瘤的抗原。例如，转录数据显示，SLC6A3、KISS1R、QRFPR等抗原在正常组织中的表达量很低，但这些抗原在与肾癌相关的细胞中的表达量却很高。下面的表2中提供了一些抗原的信息。表2

[0098] 在实施方案中，CAR的胞外结构域结合SIGLEC15。SIGLEC15是一种在细胞膜上表达的受体蛋白，可识别唾液酸化聚糖。转录数据预测它在尿路上皮癌细胞中过度表达，并且在正常组织中以低水平表达。主要见于脾脏和淋巴结，其他免疫器官有一定量的低表达。实施方案涉及在患有实体瘤的受试者中引发和/或增强T细胞反应或治疗受试者的实体瘤的方法，该方法包括向受试者施用有效量的包含CAR的T细胞。在实施方案中，肿瘤与尿路上皮癌有关。

[0099] 受试者中的T细胞反应是指与辅助、杀伤、调节和其他类型的T细胞相关的细胞介导的免疫。例如，T细胞反应可能包括在免疫过程中为其他白细胞提供帮助以及识别和破坏病毒感染细胞和肿瘤细胞等活动。受试者中的T细胞反应可以通过各种指标来测量，例如病毒感染的细胞和/或T细胞杀死的肿瘤细胞的数量、T细胞在与病毒感染的细胞共培养时释放的细胞因子的数量和/或肿瘤细胞、受试者中T细胞的增殖水平、T细胞的表型变化(例如，记忆T细胞的变化)以及受试者中T细胞的寿命或寿命水平。

[0100] 在实施方案中，可以通过将CAR T细胞与抗原阳性细胞共培养来测量CAR T细胞的杀伤效力来进行体外杀伤测定。CAR T细胞与CAR T细胞共培养的相应抗原阳性细胞数量减少，IFNγ、TNFα等释放增加，可认为对相应抗原阳性细胞具有杀伤作用.与不表达相应抗原的对照细胞相比。此外，可以测试CAR T细胞的体内抗肿瘤活性。例如，可以使用本文所述的抗原在免疫缺陷小鼠中建立异种移植模型。在过去的二十年里，将人类癌细胞或肿瘤活检异种移植到免疫缺陷啮齿动物(异种移植模型)中，构成了开发新型癌症疗法的主要临床前筛选(Song等人，Cancer Res.PMC 2014年8月21日，和Morton et al.,Nature Protocols,2,‑247‑250(2007))。为了评估CAR T细胞在体内的抗肿瘤活性，评估了携带肿瘤异种移植物的免疫缺陷小鼠的CAR T细胞抗肿瘤活性(例如，小鼠肿瘤和小鼠血液中IFNγ、TNFα等的减少)。

[0101] 术语“嵌合抗原受体”或备选地“CAR”是指重组多肽构建体，其至少包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号结构域(例如，细胞质结构域)。在实施方案中，CAR多肽构建体中的结构域在相同的多肽链上(例如，包含嵌合融合蛋白)。在实施方案中，CAR多肽的结构域不在同一分子上，例如彼此不连续或在不同的多肽链上。

[0102] 在实施方案中，细胞内信号结构域包括源自如本文所述的刺激分子和/或共刺激分子的功能性信号结构域。在实施方案中，细胞内信号传导结构域包括源自初级信号传导结构域(例如CD3‑zeta的初级信号传导结构域)的功能性信号传导结构域。在实施方案中，细胞内信号传导结构域还包括一种或多种源自至少一种共刺激分子的功能性信号传导结构域。共刺激信号区是指CAR的一部分，包括共刺激分子的细胞内结构域。共刺激分子可以包括用于诱导淋巴细胞的有效反应(对抗原的反应)的细胞表面分子。

[0103] 在CAR的胞外结构域和跨膜结构域之间，可以掺入间隔结构域。如本文所用，术语“间隔结构域”通常是指起到将跨膜结构域连接到多肽链中的细胞外结构域和/或细胞质结构域的功能的任何寡核苷酸或多肽。间隔结构域可包括多达300个氨基酸、10至100个氨基酸或25至50个氨基酸。

[0104] 在实施方案中，CAR的胞外结构域包括靶向特定肿瘤标志物(例如，一种肿瘤抗原)。肿瘤抗原是由肿瘤细胞产生的蛋白质，可引发免疫反应，特别是T细胞介导的免疫反应。肿瘤抗原在本领域是众所周知的并且包括例如神经胶质瘤相关抗原、癌胚抗原(CEA)、β‑人绒毛膜促性腺激素、甲胎蛋白(AFP)、凝集素反应性AFP、甲状腺球蛋白、RAGE‑1、MN‑CA IX、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2(AS)、肠羧基酯酶、mut hsp70‑2、M‑CSF、前列腺酶、前列腺特异性抗原(PSA)、PAP、NY‑ESO‑1、LAGE‑1a、p53、prostein、PSMA、Her2/neu、存活素和端粒酶、前列腺癌肿瘤抗原1(PCTA‑1)、MAGE、ELF2M、中性粒细胞弹性蛋白酶、ephrinB2、CD22、胰岛素生长因子(IGF)‑I、IGF‑II、IGF‑I受体和间皮素。例如，当CAR结合的抗原为CD19时，将其CAR称为CD19CAR。

[0105] 在实施方案中，细胞外配体结合结构域包含scFv，该scFv包含通过柔性接头连接的靶抗原特异性单克隆抗体的轻链可变区(VL)区和重链可变区(VH)区。通过使用短连接肽连接轻链和/或重链可变区来制备单链可变区片段(Bird等，Science 242:423‑426,1988)。连接肽的一个例子是具有氨基酸序列(GGGGS)3(SEQ ID NO:13)的GS接头，其在一个可变区的羧基末端和另一可变区的氨基末端之间桥接大约3.5nm。已经设计和使用了其他序列的接头(Bird等，1988，同上)。一般而言，接头可以是包含约20个或更少氨基酸残基的短而灵活的多肽。反过来，接头可以被修饰以获得额外的功能，例如药物的附着或与固体支持物的附着。单链变体可以重组或合成产生。对于scFv的合成生产，可以使用自动合成仪。对于scFv的重组生产，可以将含有编码scFv的多核苷酸的合适质粒引入合适的宿主细胞，真核细胞，例如酵母、植物、昆虫或哺乳动物细胞，或原核细胞，例如大肠杆菌。编码感兴趣的scFv的多核苷酸可以通过常规操作例如多核苷酸的连接来制备。可以使用本领域已知的标准蛋白质纯化技术分离得到的scFv。

[0106] 在实施方案中，肿瘤抗原包括HER2、CD19、CD20、CD22、κ或轻链、CD30、CD33、CD123、CD38、ROR1、ErbB3/4、EGFR、EGFRvIII、EphA2、FAP、癌胚抗原、EGP2、EGP40、间皮素,TAG72,PSMA,NKG2D配体,B7‑H6,IL‑13受体α2,IL‑11受体α,MUC1,MUC16,CA9,GD2,GD3,HMW‑MAA,CD171,Lewis Y,G250/CAIX,HLA‑AI MAGE A1、HLA‑A2 NY‑ESO‑1、PSC1、叶酸受体‑α、CD44v7/8、8H9、NCAM、VEGF受体、5T4、胎儿AchR、NKG2D配体、CD44v6、TEM1、TEM8或病毒相关抗原由肿瘤表达。在实施方案中，CAR的结合元件可以包括任何抗原结合部分，当结合至其关联抗原时，影响肿瘤细胞使得肿瘤细胞不能生长或被促进死亡或减少。

[0107] 在实施方案中，CAR的胞外结构域结合KISS1R(KISS1受体)。KISS1R是一种甘丙肽样G蛋白偶联受体，可结合Kisspeptin(metastin)，一种由转移抑制基因KISS1编码的肽。KISS1R参与内分泌功能的调节。实施方案涉及在患有实体瘤的受试者中引发和/或增强T细胞反应或在受试者中治疗实体瘤的方法，其中该方法包括施用有效量的包含CAR的T细胞。
在实施方案中，实体瘤与肾癌相关。

[0108] 在实施方案中，CAR的胞外结构域结合CLDN6(Claudin‑6)。CLDN6是紧密连接链的一个组成部分，它是密链蛋白家族的成员，是一种完整的膜蛋白。转录数据预测在子宫内膜癌和尿路上皮癌中的高表达，而在正常组织中的表达是紧密连接链的一个组成部分，它们是密蛋白家族的成员低体积。实施方案涉及在患有实体瘤的受试者中引发和/或增强T细胞反应或在受试者中治疗实体瘤的方法，其中该方法包括施用有效量的包含CAR的T细胞。在实施方案中，实体瘤与子宫内膜癌和/或尿路上皮癌相关。

[0109] 在实施方案中，CAR的胞外结构域结合MUC16(粘蛋白16)。MUC21(粘蛋白21)和MUC16是属于粘蛋白家族的大型膜结合糖蛋白。粘蛋白是O‑糖基化蛋白质，在上皮表面形成保护性粘液屏障中起重要作用。MUC21对食管癌的食管表达受限。MUC16在正常组织中低表达，在子宫内膜中低表达。在卵巢癌中，MUC16高度表达。实施方案涉及在患有实体瘤的受试者中引发和/或增强T细胞反应或在受试者中治疗实体瘤的方法，其中该方法包括施用有效量的包含CAR的T细胞。在实施方案中，实体瘤与卵巢癌相关。

[0110] 在实施方案中，CAR的胞外结构域结合SLC6A3(溶质载体家族6成员3)。SLC6A3是一种多巴胺转运蛋白，是钠和氯依赖性神经递质转运蛋白家族的成员。实施方案包括在患有实体瘤的受试者中引发和/或增强T细胞反应或在受试者中治疗实体瘤的方法，其中该方法包括施用有效量的包含CAR的T细胞。在实施方案中，肿瘤包括肾癌。

[0111] 在实施方案中，CAR的胞外结构域结合QRFPR。QRFPR是一种焦谷氨酰化RFamide肽受体，可能与其配体QRFP一起参与脂肪生成。实施方案涉及在患有实体瘤的受试者中引发和/或增强T细胞反应或在受试者中治疗实体瘤的方法，其中该方法包括施用有效量的包含CAR的T细胞。在实施方案中，实体瘤与肾癌相关。

[0112] 在实施方案中，CAR的胞外结构域结合GPR119(G蛋白偶联受体119)。GPR119是G蛋白偶联受体视紫红质亚家族的成员，在胰腺和胃肠道中低表达，可能参与葡萄糖稳态。转录数据预测胰腺癌中的高表达。实施方案涉及在患有实体瘤的受试者中引发和/或增强T细胞反应或治疗受试者的实体瘤的方法，其中该方法包括施用有效量的包含CAR的T细胞。在实施方案中，肿瘤与胰腺癌相关。

[0113] 在实施方案中，CAR的胞外结构域结合UPK2(Uroplakin 2)。UPK2是不对称单位膜的高度保守的尿路上皮特异性整合膜蛋白之一，主要在正常组织的膀胱和包括膀胱癌在内的尿路上皮癌中表达。实施方案涉及在患有实体瘤的受试者中引发和/或增强T细胞反应或在受试者中治疗实体瘤的方法，其中该方法包括施用有效量的包含CAR的T细胞。在实施方案中，实体瘤与尿路上皮癌和/或膀胱癌相关。

[0114] 在实施方案中，CAR的胞外结构域结合ADAM12(金属蛋白酶12)。ADAM12是结构上与蛇毒解聚素相关的蛋白质家族的成员，参与细胞‑细胞和细胞‑基质相互作用，并且在胎盘和乳腺癌/胰腺癌等肿瘤中高度表达。实施方案涉及在患有实体瘤的受试者中引发和/或增强T细胞反应或在受试者中治疗实体瘤的方法，其中该方法包括施用有效量的包含CAR的T细胞。在实施方案中，实体瘤与乳腺癌和/或胰腺癌相关。

[0115] 在实施方案中，CAR的胞外结构域结合SLC45A3(溶质载体家族45成员3)。SLC45A3是一种质膜蛋白；正常组织主要在前列腺中表达，为前列腺癌。实施方案涉及在患有实体瘤的受试者中引发和/或增强T细胞反应或在受试者中治疗实体瘤的方法，其中该方法包括施用有效量的包含CAR的T细胞。在实施方案中，实体瘤与前列腺癌相关。

[0116] 在实施方案中，CAR的胞外结构域结合ACPP(酸性磷酸酶，前列腺)。ACPP是一种催化正磷酸单酯转化为醇和正磷酸盐的酶，含有跨膜结构域，位于质膜‑内体‑溶酶体途径中。对于前列腺癌，正常组织在前列腺中特异性表达。实施方案涉及在患有实体瘤的受试者中引发和/或增强T细胞反应或在受试者中治疗实体瘤的方法，其中该方法包括施用有效量的包含CAR的T细胞。在实施方案中，实体瘤与前列腺癌相关。

[0117] 在实施方案中，CAR的胞外结构域结合MUC21(粘蛋白21)。MUC21和MUC16是属于粘蛋白家族的大型膜结合糖蛋白。粘蛋白是O‑糖基化蛋白质，在上皮表面形成保护性粘液屏障中起重要作用。当受试者患有食道癌时，MUC21对食道的表达受到限制。实施方案涉及在患有实体瘤的受试者中引发和/或增强T细胞反应或在受试者中治疗实体瘤的方法，其中该方法包括施用有效量的包含CAR的T细胞。在实施方案中，实体瘤与食道癌相关。

[0118] 在实施方案中，CAR的胞外结构域结合MS4A12(跨膜4‑结构域亚家族A12)。MS4A12是一种存在于结肠细胞顶膜的细胞表面蛋白，在结肠上表达受限，可用于治疗结直肠癌。实施方案涉及在患有实体瘤的受试者中引发和/或增强T细胞反应或在受试者中治疗实体瘤的方法，其中该方法包括施用有效量的包含CAR的T细胞。在实施方案中，实体瘤与结肠直肠癌相关。

[0119] 在实施方案中，CAR的胞外结构域结合ALPP。ALPP是碱性磷酸酶(胎盘型)，一种催化磷酸单酯水解的金属酶。ALPP的表达仅限于胎盘；在卵巢腺癌、浆液性囊腺癌和其他卵巢癌细胞中检测到ALPP的强异位表达。实施方案涉及在患有实体瘤的受试者中引发和/或增强T细胞反应或在受试者中治疗实体瘤的方法，其中该方法包括施用有效量的包含CAR的T细胞。在实施方案中，实体瘤与子宫内膜癌相关。

[0120] 在实施方案中，CAR的胞外结构域结合SLC2A14(溶质载体家族2成员14)。实施方案涉及在患有实体瘤的受试者中引发和/或增强T细胞反应或在受试者中治疗实体瘤的方法，其中该方法包括施用有效量的包含CAR的T细胞。在实施方案中，肿瘤与睾丸癌有关。

[0121] 在实施方案中，CAR的胞外结构域结合GS1‑259H13.2(TMEM225B，跨膜蛋白225B)。实施方案涉及在患有实体瘤的受试者中引发和/或增强T细胞反应或治疗受试者的实体瘤的方法，其中该方法包括施用有效量的包含CAR的T细胞。在实施方案中，肿瘤与甲状腺癌或神经胶质瘤或睾丸癌有关。

[0122] 在实施方案中，CAR的胞外结构域结合ERVFRD‑1(内源性逆转录病毒组FRD成员)。实施方案涉及在患有实体瘤的受试者中引发和/或增强T细胞反应或在受试者中治疗实体瘤的方法，其中该方法包括施用有效量的包含CAR的T细胞。在实施方案中，肿瘤与肾癌或尿道癌相关。

[0123] 在实施方案中，CAR的胞外结构域结合ADGRG2(粘附G蛋白偶联受体G2)。实施方案涉及在患有实体瘤或治疗实体瘤的受试者中引发和/或增强T细胞反应的方法所述受试者，其中所述方法包括施用有效量的包含所述CAR的T细胞。在实施方案中，肿瘤与卵巢癌相关。

[0124] 在实施方案中，CAR的胞外结构域结合ECEL1(内皮素转化酶样1)。，其中该方法包括施用有效量的包含CAR的T细胞。在实施方案中，肿瘤与子宫内膜癌相关。

[0125] 在实施方案中，CAR的胞外结构域结合CHRNA2(胆碱能受体烟碱α2亚基)。实施方案涉及在患有实体瘤的受试者中引发和/或增强T细胞反应或在受试者中治疗实体瘤的方法，其中该方法包括施用有效量的包含CAR的T细胞。在实施方案中，肿瘤与前列腺癌有关。

[0126] 在实施方案中，CAR的胞外结构域结合GP2(糖蛋白2)。实施方案涉及在患有实体瘤的受试者中引发和/或增强T细胞反应或在受试者中治疗实体瘤的方法，其中该方法包括施用有效量的包含CAR的T细胞。在实施方案中，肿瘤与胰腺癌相关。

[0127] 在实施方案中，CAR的胞外结构域结合PSG9(妊娠特异性β‑1‑糖蛋白9)。实施方案涉及在患有实体瘤的受试者中引发和/或增强T细胞反应或在受试者中治疗实体瘤的方法，其中该方法包括施用有效量的包含CAR的T细胞。在实施方案中，肿瘤与肾癌或肝癌有关。

[0128] 本公开还涉及双特异性嵌合抗原受体(参见图3)、编码双特异性嵌合抗原受体的多核苷酸和/或包含所述多核苷酸的修饰细胞，其中所述双特异性嵌合抗原受体包含第一抗原结合结构域，第二抗原结合结构域、细胞质结构域和跨膜结构域，其中第一抗原结合结构域识别第一抗原，第二抗原结合结构域识别第二抗原。在实施方案中，第一抗原是与白细胞相关的抗原，第二抗原是实体瘤抗原。在实施方案中，第一和第二抗原相同或不同。在实施方案中，第一和第二抗原都是实体瘤抗原。

[0129] 在实施方案中，CAR的胞内结构域包含共刺激信号传导区域，该共刺激信号传导区域包含选自CD27、CD28、4‑1BB、OX40、CD30、CD40、PD‑1的共刺激分子的胞内结构域,ICOS,淋巴细胞功能相关抗原‑1(LFA‑1),CD2,CD7,LIGHT,NKG2C,B7‑H3,及其任意组合。

[0130] 在实施方案中，胞内结构域包含CD3 zeta信号结构域。实施方案涉及包含本文所述的分离的核酸序列的载体。实施方案涉及包含本文所述的分离的核酸序列的分离的细胞。

[0131] 实施方案涉及包含细胞群的组合物，所述细胞群包括包含本文所述CAR的T细胞。实施方案涉及由本文所述的分离的核酸序列编码的CAR。

[0132] 本文所述的细胞，包括CAR细胞和修饰细胞，可以来源于干细胞。干细胞可以是成体干细胞、胚胎干细胞、非人类干细胞、脐带血干细胞、祖细胞、骨髓干细胞、诱导多能干细胞、全能干细胞或造血干细胞。细胞也可以是树突细胞、NK细胞、B细胞或选自炎性T淋巴细胞、细胞毒性T淋巴细胞、调节性T淋巴细胞和辅助性T淋巴细胞的T细胞。在实施方案中，细胞可以来源于由CD4+T‑淋巴细胞和CD8+T‑淋巴细胞组成的组。在本文所述的细胞的扩增和遗传修饰之前，可以通过多种非限制性方法从受试者获得细胞来源。T细胞可以从许多非限制性来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤.在实施方案中，可以使用本领域技术人员可用和已知的任何数量的T细胞系。在实施方案中，细胞可以来自健康供体、来自被诊断患有癌症的患者或来自被诊断患有感染的患者。在实施方案中，细胞是呈现不同表型特征的混合细胞群的一部分。

[0133] 术语“干细胞”是指具有自我更新能力和分化成其他种类细胞能力的任何类型的细胞。例如，干细胞产生两个子干细胞(如体外培养的胚胎干细胞发生)或产生一个干细胞和一个经历分化的细胞(如发生在造血干细胞中，这产生上升到血细胞)。不同类别的干细胞可以根据它们的来源和/或它们分化成其他类型细胞的能力程度来区分。干细胞可以包括胚胎干(ES)细胞(即多能干细胞)、体干细胞、诱导多能干细胞和任何其他类型的干细胞。

[0134] 多能胚胎干细胞存在于囊胚的内细胞团中，并具有很高的先天分化能力。例如，多能胚胎干细胞有可能在体内形成任何类型的细胞。当在体外长时间生长时，ES细胞保持多能性，而子代细胞保留了多向分化的潜力。

[0135] 体干细胞可以包括胎儿干细胞(来自胎儿)和成体干细胞(存在于各种组织中，例如骨髓)。这些细胞被认为具有低于多能胚胎干细胞的分化能力——胎儿干细胞的能力高于成体干细胞；它们显然只分化成数量有限的不同类型的细胞，并被描述为多能细胞。“组织特异性”干细胞通常只产生一种类型的细胞。例如，胚胎干细胞可以分化成血液干细胞(例如，造血干细胞(HSCs))，其可以进一步分化成各种血细胞(例如，红细胞、血小板、白细胞等)。

[0136] 诱导多能干细胞(iPS细胞或iPSC)可包括通过诱导特定基因表达从非多能细胞(例如成体细胞)人工衍生的一类多能干细胞。诱导多能干细胞在许多方面类似于天然多能干细胞，例如胚胎干细胞(ES)，例如某些干细胞基因和蛋白质的表达、染色质甲基化模式、倍增时间、胚状体形成、畸胎瘤形成、可行的嵌合体形成以及效力和可区分性。诱导的多能细胞可以从成人的胃、肝、皮肤细胞和血细胞中分离出来。

[0137] 在实施方案中，CAR细胞、修饰细胞或细胞是T细胞、NK细胞、巨噬细胞或树突细胞。例如，CAR细胞、修饰细胞或细胞是T细胞。

[0138] 在实施方案中，抗原结合分子是T细胞受体(TCR)。在实施例中，TCR是修饰的TCR。在实施方案中，TCR来源于患者中自发产生的肿瘤特异性T细胞。在实施方案中，TCR结合肿瘤抗原。在实施方案中，肿瘤抗原包括CEA、gp100、MART‑1、p53、MAGE‑A3或NY‑ESO‑1。在实施方案中，TCR包含TCRγ和TCRδ链或TCRα和TCRβ链。在实施方案中，可以分离表达对靶抗原具有高亲和力的TCR的T细胞克隆。在实施方案中，肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)或外周血单核细胞(PBMC)可在抗原呈递细胞(APC)的存在下培养，该抗原呈递细胞(APC)用代表已知当呈递时引起显性T细胞反应的表位的肽脉冲。定义的HLA等位基因的上下文。然后可以根据MHC‑肽四聚体染色和/或识别和裂解用低滴定浓度的同源肽抗原脉冲的靶细胞的能力来选择高亲和力克隆。选择克隆后，通过分子克隆鉴定和分离TCRα和TCRβ链或TCRγ和TCRδ链。例如，对于TCRα和TCRβ链，然后使用TCRα和TCRβ基因序列生成一个表达构建体，该构建体理想地促进两条TCR链在人类T细胞中的稳定、高水平表达。然后可以产生转导载体(例如，伽马逆转录病毒或慢病毒)并测试其功能(抗原特异性和功能亲和力)并用于产生载体的临床批次。
然后使用最终产品的等分试样来转导目标T细胞群(通常从患者PBMC中纯化)，在输注到受试者之前将其扩增。

[0139] 在实施方案中，CAR的结合元件可以包括任何抗原结合部分，当结合其同源抗原时，影响肿瘤细胞；例如，它杀死肿瘤细胞，抑制肿瘤细胞的生长，或促进肿瘤细胞的死亡。

[0140] 编码所需分子的核酸序列可以使用本领域已知的重组方法获得，例如通过从表达该基因的细胞中筛选文库，从已知包含该基因的载体中衍生该基因，或直接从使用标准技术，包含相同的细胞和组织。或者，可以合成而不是克隆目的基因。

[0141] 本公开的实施方案还涉及其中插入了本公开的DNA的载体。源自逆转录病毒(如慢病毒)的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因的长期、稳定整合及其在子细胞中的繁殖。慢病毒载体与衍生自肿瘤逆转录病毒(如鼠白血病病毒)的载体相比具有额外的优势，因为它们可以转导非增殖细胞，如肝细胞。它们还具有低免疫原性的额外优势。

[0142] 病毒可用于在体外和体内(在受试者中)将核酸递送到细胞中。可用于将核酸递送到细胞中的病毒的例子包括逆转录病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒、牛痘病毒和腺相关病毒。

[0143] 还存在用于将核酸递送到细胞中的非病毒方法，例如电穿孔、基因枪、声穿孔、磁感受以及寡核苷酸、脂质复合物、树枝状聚合物和无机纳米粒子的使用。

[0144] 编码CAR的天然或合成核酸的表达通常通过将编码CAR多肽或其部分的核酸可操作地连接至一个或多个启动子并将构建体整合到表达载体中来实现。载体可以适合复制和整合到真核生物中。典型的克隆载体含有转录和翻译终止子、起始序列和可用于调节所需核酸序列表达的启动子。

[0145] 与编码CARs的合成核酸的表达和基因转移到哺乳动物细胞中有关的其他信息在美国专利5,500,000中提供。US8,906,682，通过引用整体并入。

[0146] 本公开的药物组合物可以以适合待治疗(或预防)的疾病的方式施用。给药的量和频率将由诸如患者的状况、患者疾病的类型和严重程度等因素决定，尽管适当的剂量可以通过临床试验来确定。

[0147] 当标明“免疫有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤抑制有效量”或“治疗量”时，可以确定待施用的本公开组合物的精确量由医生考虑年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移程度以及患者(受试者)的状况等个体差异。可以说，包含本文所述的T细胞的药物组合物可以104至109个细胞/kg体重，优选105至106个细胞/kg体重的剂量施用，包括那些范围内的所有整数值。T细胞组合物也可以这些剂量多次给药。可以通过使用免疫疗法中通常已知的输注技术来施用细胞(参见例如Rosenberg等人，New Eng.J.of Med.319:1676,1988)。医学领域的技术人员可以通过监测患者的疾病迹象并相应地调整治疗来容易地确定特定患者的最佳剂量和治疗方案。在实施方案中，可能需要将活化的T细胞施用于受试者，然后再抽血(或进行单采术)，收集活化和扩增的T细胞，并将这些活化和扩增的T细胞重新注入患者。这个过程可以每隔几周进行多次。在实施方案中，T细胞可以从10cc至400cc的抽血中被激活。在实施方案中，T细胞从20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc或100cc的抽血中被激活。不受理论的束缚，使用这种多次抽血/多次回输方案，可以选择某些T细胞群。

[0148] 本文所述的药物组合物的施用可以任何方便的方式进行，包括通过气溶胶吸入、注射、摄取、输血、植入或移植。本文所述的组合物可以皮下、皮内、瘤内、结内、髓内、肌肉内、通过静脉内(iv)注射或腹膜内施用给患者。在实施方案中，本公开的T细胞组合物通过皮内或皮下注射施用于患者。在实施方案中，本发明的T细胞组合物优选通过静脉内注射给药。T细胞的组合物可以直接注射到肿瘤、淋巴结或感染部位。在本公开的实施方案中，使用本文所述的方法或本领域已知的其中将T细胞扩增至治疗水平的其他方法激活和扩增的细胞与(例如，之前、同时或之后)一起施用于患者)任何数量的相关治疗方式，包括但不限于使用抗病毒治疗、西多福韦和白细胞介素‑2、阿糖胞苷(也称为ARA‑C)或那他珠单抗治疗MS患者或使用依法珠单抗治疗银屑病患者或PML患者的其他治疗方法。在进一步的实施方案中，本公开的T细胞可以与化学疗法、放射疗法、免疫抑制剂例如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯和FK506、抗体或其他免疫消融剂例如CAM PATH、抗‑CD3抗体或其他抗体疗法、细胞毒素、氟达利滨、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、FR901228、细胞因子和辐射。这些药物抑制钙依赖性磷酸酶钙调神经磷酸酶(环孢素和FK506)或抑制对生长因子诱导的信号传导很重要的p70S6激酶(雷帕霉素)。(Liu等人，Cell 66：807‑815，1991；Henderson等人，Immun 73：316‑321，1991；Bierer等人，Curr.Opin.Immun 5：763‑773，
1993；Isoniemi(同上)))。在实施方案中，本公开的细胞组合物与骨髓移植、使用诸如氟达拉滨的化疗剂的T细胞消融疗法、外束放射疗法(例如，之前、同时或之后)一起施用于患者。
XRT)、环磷酰胺或抗体如OKT3或CAMPATH。在实施方案中，本公开的细胞组合物在B细胞消融疗法例如与CD20反应的试剂例如Rituxan之后施用。例如，受试者可以接受高剂量化疗的标准治疗，然后进行外周血干细胞移植。在实施方案中，在移植之后，受试者接受本公开的扩增的免疫细胞的输注。在实施方案中，扩增的细胞在手术之前或之后施用。

[0149] 待给予患者的上述治疗剂量将随着被治疗病症和治疗接受者的确切性质而变化。根据各种因素，医师可根据本领域公认的实践进行人用药剂量的缩放。

[0150] 在美国专利No.5,315,418中提供了关于使用工程化或修饰的T细胞的癌症治疗方法的其他信息。美国专利US8,906,682，通过引用整体并入。

[0151] 在实施方案中，本文所述的细胞群用于自体CAR T细胞疗法。在实施方案中，CAR T细胞疗法是同种异体CAR T细胞疗法、TCR T细胞疗法和NK细胞疗法。

[0152] 实施方案涉及制备修饰细胞的体外方法。该方法可以包括从受试者获得细胞样品。例如，样品可以包括T细胞或T细胞祖细胞。该方法可以进一步包括用编码至少CAR的DNA转染细胞，在选择性增强表达CAR的T细胞增殖的培养基中离体培养CAR细胞群。

[0153] 在实施例中，样品是冷冻保存的样品。在实施方案中，细胞样品来自脐带血或来自受试者的外周血样品。在实施方案中，细胞样品通过血液分离术或静脉穿刺获得。在实施方案中，细胞样品是T细胞亚群。

[0154] 本公开的实施方案涉及使用嵌合抗原受体(CAR)细胞使用与基因融合相关的分子治疗癌症。实施方案涉及编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸序列，其中CAR包含细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，其中细胞外结构域结合基因融合的基因融合抗原。

[0155] 如本文所用，术语“基因融合”是指基因的至少一部分与另外基因的至少一部分融合。基因融合不需要包括整个基因或基因的外显子。在某些情况下，基因融合与癌症的变化有关。基因融合产物是指由基因融合产生的嵌合基因组DNA、嵌合信使RNA、截短蛋白或嵌合蛋白。可以通过美国专利9938582中描述的各种方法检测基因融合产物，该专利作为参考并入本文。“基因融合抗原”是指由基因融合产生的截短蛋白或嵌合蛋白。在实施方案中，基因融合抗原的表位可以包括基因融合抗原的一部分或由基因融合引起的另一抗原的免疫原性部分。在实施方案中，基因融合抗原与细胞膜相互作用或者是细胞膜的一部分。

[0156] 在实施方案中，可以使用诸如qPCR和FACS的实验方法来检测人细胞中靶分子(列于表2中)的mRNA和蛋白质表达水平。此外，可以鉴定在相应肿瘤细胞中特异性表达的靶分子，在正常组织细胞中具有非常低的表达或无法检测到的表达。

[0157] 在实施方案中，可以进行体外杀伤试验以及与抗原阳性细胞共培养的CAR T细胞的杀伤实验。CAR T细胞可能对相应的抗原阳性细胞有杀伤作用，与CAR T细胞共培养的相应抗原阳性细胞数量减少，IFNγ、TNFα等的释放增加。控制不表达相应抗原的细胞。

[0158] 在实施方案中，可以进行体内杀伤测定。例如，可以给小鼠移植相应的抗原肿瘤细胞，输注CAR T细胞致瘤，可以检测到小鼠肿瘤和小鼠血液中IFNγ、TNFα等信号的减少。

[0159] 实施方案涉及在患有实体瘤的受试者中引发和/或增强T细胞反应或在受试者中治疗实体瘤的方法，该方法包括施用有效量的包含本文所述的CAR的T细胞。在实施方案中，CAR的胞内结构域包含共刺激信号传导区域，该共刺激信号传导区域包含选自CD27、CD28、4‑1BB、OX40、CD30、CD40、PD‑1的共刺激分子的胞内结构域,ICOS,淋巴细胞功能相关抗原‑1(LFA‑1),CD2,CD7,LIGHT,NKG2C,B7‑H3,及其任意组合。在实施方案中，胞内结构域包含CD3 zeta信号结构域。

[0160] 实施方案涉及包含本文所述的分离的核酸的载体。

[0161] 实施方案涉及包含本文所述的分离的核酸序列的分离的细胞。实施方案涉及包含T细胞群的组合物，所述T细胞群包含本文所述的CAR。实施方案涉及由本文所述的分离的核酸序列编码的CAR。实施方案涉及在受试者中引发和/或增强T细胞反应或治疗受试者的肿瘤的方法，该方法包括：施用有效量的包含本文所述的CAR的T细胞。

[0162] 实施方案涉及本文所述的多核苷酸的方法或用途。所述方法或用途包括提供包含载体基因组的病毒颗粒(例如，AAV、慢病毒或它们的变体)，所述载体基因组包含所述多核苷酸，其中所述多核苷酸可操作地连接至赋予所述多核苷酸转录的表达控制元件，和向受试者施用一定量的病毒颗粒，使得多核苷酸在受试者中表达。在实施方案中，AAV制剂可以包括AAV载体颗粒、空衣壳和宿主细胞杂质，从而提供基本上不含AAV空衣壳的AAV产品。有关病毒颗粒的给药和制备的更多信息可以在美国专利号：9840719和Milani等人“Phagocytosis‑shielded lentiviral vectors improve liver gene therapy in nonhuman primates”(Sci Transl Med.2019 May 22；11(493):eaav7325.DOI:10.1126/scitranslmed.aav7325)，通过引用将其并入本文。

[0163] 在实施方案中，本文所述的CAR分子包含一个或多个用于结合感兴趣抗原的互补决定区(CDR)。CDR是免疫球蛋白和T细胞受体中用于结合特定抗原的可变结构域的一部分。每个可变域有三个CDR。由于存在可变重结构域和可变轻结构域，因此有六个用于结合抗原的CDR。此外，由于抗体具有两条重链和两条轻链，因此抗体总共具有十二个用于结合抗原的CDR。在实施方案中，CAR分子包含SIGLEC15、SLC6A3、KISS1R、QRFPR、GPR119、CLDN6、UPK2、ADAM12、SLC45A3、ACPP、MUC21、MUC16、MS4A12或ALPP的一种或多种CDR。

[0164] 本公开描述了包括一种或多种不同抗原结合结构域的修饰细胞。修饰的细胞可以包括至少两种不同的抗原结合结构域：用于扩增和/或维持遗传修饰细胞的第一抗原结合结构域和用于杀死靶细胞例如肿瘤细胞的第二抗原结合结构域。例如，第一抗原结合结构域结合表面标志物，例如白细胞(WBC)的细胞表面分子(例如CD19)，第二抗原结合结构域结合肿瘤细胞上的靶抗原。在实施方案中，细胞表面分子是WBC的表面抗原。在实施方案中，肿瘤细胞上的靶抗原包括SIGLEC15、SLC6A3、KISS1R、QRFPR、GPR119、CLDN6、UPK2、ADAM12、SLC45A3、ACPP、MUC21、MUC16、MS4A12或ALPP中的一种或多种。至少两个抗原结合结构域可以位于相同或不同的修饰细胞上。例如，修饰细胞可包括包含结合CAR的CD19的修饰细胞、包含结合ACPP的CAR的修饰细胞、包含结合CD19和ACPP的CAR的修饰细胞和/或包含分别结合的两个CAR的修饰细胞CD19和ACPP。在实施方案中，修饰的细胞可用于治疗患有癌症的受试者。

[0165] 在实施方案中，本文所述的修饰细胞包括包含至少两个不同抗原结合结构域的CAR分子。CAR分子可以是双特异性CAR分子。例如，两个抗原结合结构域可以位于相同的CAR分子上、不同的CAR分子上或CAR分子和T细胞受体(TCR)上。单个CAR可以包括至少两个不同的抗原结合结构域，或者两个不同的抗原结合结构域各自位于单独的CAR分子上。至少两个不同的抗原结合结构域可以在相同的CAR分子上或不同的CAR分子上但在相同的修饰细胞中。此外，至少两个不同的抗原结合结构域可以位于同一修饰细胞中的CAR分子和T细胞受体上。在实施方案中，双特异性CAR分子可以包括结合WBC抗原(例如CD19)的结合域和结合实体瘤抗原的结合域。在实施方案中，双特异性CAR分子可以包括结合两种不同实体瘤抗原的两个结合域。

[0166] 在实施方案中，至少两个不同的抗原结合结构域在不同的CAR分子上，其由不同的修饰细胞表达。此外，一种或多种不同的抗原结合结构域位于由不同修饰细胞表达的CAR分子和T细胞受体上。

[0167] 在本申请和Innovative Cellular Therapeutics的PCT专利申请号：PCT/CN2016/075061、PCT/CN2018/08891、PCT/US21/28429和PCT/US19/13068中提供了相关序列，通过引用将其全部并入。

[0168] 在实施方案中，本文所述的组合物和/或方法可以与PCT公开号：WO2020106843和WO2020146743中所述的与 相关的技术组合，其全部并入。

[0169] 本公开描述了结合GCC(GUCY2C，鸟苷酸环化酶2C)的抗体，其中该抗体包含包含SEQ ID NO:1、5或9的VHH结构域。

[0170] 在实施方案中，抗体是纳米抗体(单域抗体，sdAb)，包含或基本上由VHH(重链上的单可变域)域组成。在实施方案中，抗体与细胞毒剂缀合，并且细胞毒剂是放射性同位素或毒素。在实施方案中，抗体是包含VHH结构域、靶向CD3的抗体或抗体片段(例如，scFv)和接头的双特异性抗体(如图2)。

[0171] 在实施方案中，抗体包含或基本上由VHH结构域和一个或多个恒定结构域如CH2和CH3组成。在实施方案中，抗体在结构上类似于包含或基本上由VHH结构域、CH2结构域和CH3结构域组成的羊驼抗体。在实施方案中，本文所述的包含VHH结构域的抗体不包括VL(可变)和CL(恒定)结构域。

[0172] 本公开描述了包含抗原结合域的CAR(如图1)，所述抗原结合域包含结合GCC的抗体，如上所述。实施方案描述了编码抗体或CAR的多核苷酸。实施方案描述了包含多核苷酸的修饰细胞。在实施方案中，修饰细胞是T细胞或NK细胞。

[0173] 本公开描述了包含CAR的修饰免疫细胞群。在实施方案中，所述组合物包含包含结合第一抗原的第一CAR的第一细胞群和包含结合第二抗原的第二CAR的第二细胞群，其中所述第二抗原是肿瘤抗原并且不同于所述第一抗原，第一细胞群和/或第二细胞群包含本文所述的一个或多个多核苷酸。

[0174] 本公开描述了包含第一细胞群和第二细胞群的组合物的用途或使用该组合物在有需要的受试者中增强细胞扩增或治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括：向受试者施用有效量的组合物，该受试者患有表达肿瘤抗原的癌症。在实施方案中，受试者中第二细胞群的扩增大于施用第二细胞群但未施用第一细胞群的受试者中第二细胞群的扩增。在实施方案中，扩增基于第二细胞群的数量或编码第二CAR的DNA的拷贝数来测量。在实施方案中，细胞是T细胞、NK细胞、巨噬细胞或树突细胞。在实施方案中，第一抗原包括白细胞(WBC)的细胞表面分子、肿瘤抗原或实体瘤抗原。在实施方案中，WBC是粒细胞、单核细胞或淋巴细胞。在实施方案中，WBC是B细胞。在实施方案中，WBC的细胞表面分子是CD19、CD22、CD20、BCMA、CD5、CD7、CD2、CD16、CD56、CD30、CD14、CD68、CD11b、CD18、CD169、CD1c、CD33、CD38、CD138，或CD13。在实施方案中，WBC的细胞表面分子是CD19、CD20、CD22或BCMA。在实施方案中，WBC的细胞表面分子是CD19或BCMA。在实施方案中，肿瘤抗原是实体瘤抗原。

[0175] 在实施方案中，修饰的细胞包含编码结合分子和显性失活形式的抑制性免疫检查点分子或其受体的核酸序列。在实施方案中，抑制性免疫检查点分子选自程序性死亡1(PD‑1)、细胞毒性T淋巴细胞抗原‑4(CTLA‑4)、B‑和T‑淋巴细胞减毒剂(BTLA)、T细胞免疫球蛋白mucin‑3(TIM‑3)、淋巴细胞活化蛋白3(LAG‑3)、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)、白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)、自然杀伤细胞受体2B4(2B4)和CD160。在实施方案中，抑制性免疫检查点分子是修饰的PD‑1。在实施方案中，修饰的PD‑1缺乏用于PD‑1信号转导的功能性PD‑1胞内结构域，干扰人细胞的人T细胞的PD‑1与特定细胞的PD‑L1之间的通路，包括或者是PD‑1胞外结构域或PD‑1跨膜结构域，或它们的组合，或与野生型PD‑1胞内结构域相比包含取代或缺失的修饰的PD‑1胞内结构域，或包含或是一种可溶性受体，包含与特定细胞的PD‑L1结合的PD‑1胞外结构域。

[0176] 在实施方案中，修饰细胞具有降低的内源TRAC基因表达。在实施方案中，修饰的细胞包括编码hTERT的核酸序列或编码SV40LT的核酸，或它们的组合。在实施方案中，修饰的细胞包括编码hTERT的核酸序列和编码SV40LT的核酸。在实施方案中，hTERT的表达由诱导型表达系统调节。在实施方案中，SV40LT基因的表达由诱导型表达系统调节。在实施方案中，诱导型表达系统是rTTA‑TRE，其增加或激活SV40LT基因或hTERT基因或其组合的表达。在实施方案中，修饰的细胞包括编码自杀基因的核酸序列。在实施方案中，自杀基因包括HSV‑TK自杀基因系统，和/或可诱导修饰细胞经历细胞凋亡。

[0177] 在实施方案中，修饰的细胞包括编码细胞因子的核酸序列。在实施方案中，修饰的细胞包括编码IL‑6、IFNγ、IL‑12和/或IL‑2的核酸序列。

[0178] 本公开描述了结合GCC的抗体，其中该抗体包含VHH结构域，该VHH结构域包含互补决定区1(CDR1)、CDR2和CDR3，并且其中：CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO：2‑4，或CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:6‑8，或CDR1、CDR2和CDR3分别包含SEQ ID NO:10‑12。实施方案描述了编码抗体的多核苷酸。实施方案描述了包含多核苷酸的修饰细胞。实施方案描述了包含包含上述抗体的细胞外结构域的CAR。在实施方案中，修饰细胞是T细胞或NK细胞。在实施方案中，抗体包含SEQ ID NO：1、5或9。在实施方案中，抗体是纳米抗体。在实施方案中，抗体与细胞毒剂缀合，并且细胞毒剂是放射性同位素或毒素。在实施方案中，抗体是包含VHH结构域、接头和靶向CD3的抗体的双特异性抗体。靶向CD3的抗体可以是scFv抗体。

[0179] 本公开描述了一种组合物，该组合物包含修饰细胞群，该修饰细胞群包含含有上述抗体的CAR。在实施方案中，修饰细胞包含编码显性失活形式的抑制性免疫检查点分子或其受体的多核苷酸。在实施方案中，抑制性免疫检查点分子选自程序性死亡1(PD‑1)、细胞毒性T淋巴细胞抗原‑4(CTLA‑4)、B‑和T‑淋巴细胞减毒剂(BTLA)、T细胞免疫球蛋白mucin‑3(TIM‑3)、淋巴细胞活化蛋白3(LAG‑3)、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)、白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)、自然杀伤细胞受体2B4(2B4)和CD160。在实施方案中，修饰的细胞具有降低的内源性TRAC基因的表达。在实施方案中，修饰的细胞包含编码hTERT的多核苷酸或编码SV40LT的核酸，或它们的组合。在实施方案中，修饰的细胞包含编码细胞因子的多核苷酸。在实施方案中，修饰的细胞包括编码IL‑6、IFNγ、IL‑12和IL‑2中的至少一种的多核苷酸。

[0180] 通过参考以下示例性实施例和示例进一步描述本公开。提供这些示例性实施例和示例仅用于说明的目的，并且不旨在限制，除非另有说明。因此，本公开绝不应被解释为限于以下示例性实施例和示例，而是应被解释为涵盖由于本文提供的教导而变得明显的任何和所有变化。例子

[0181] 通过参考以下实施例进一步描述本发明。提供这些示例仅用于说明目的，并且不旨在限制，除非另有说明。因此，本公开绝不应被解释为限于以下实施例，而是应被解释为涵盖由于本文提供的教导而变得明显的任何和所有变体。

[0182] 已经产生了针对GCC的各种纳米抗体。制备纳米抗体的方法可以参考Candace S Bever等人“VHH antibodies:emerging reagents for the analysis of environmental chemicals”(Anal Bioanal Chem.2016Sep；408(22):5985‑6002.doi:10.1007/s00216‑016‑9585‑x.)；Bao,C.等人“The Application of Nanobody in CAR‑T Therapy”(Biomolecules 2021,11(2),238；https://doi.org/10.3390/biom11020238)；和Han,L等人“Single VHH‑directed BCMA CAR‑T cells cause remission of relapsed/
refractory multiple myeloma”(Leukemia volume 35,pages3002–3006(2021)，所有这些都全文纳入本文。VHH域及其CDR在表3中标识和提供。

[0183] 图4和5显示了抗体结合测定的流式细胞术结果，其中293T细胞是GCC阴性细胞系(即不表达GCC)，T84细胞是表达GCC的阳性细胞，CT26‑GCC是构建的过表达GCC的CT26细胞系。使用以GCC为抗原的ELISA筛选VHH抗体。基于通过ELISA对抗体亲和力的测量鉴定了几种VHH抗体。使用GCC阳性细胞和GCC阴性细胞分析这些VHH抗体，并将59E GCC抗体(图5‑5F9)用作阳性对照。如图所示。参见图4和5，VHH抗体#32(SEQ ID NO：9，具有CDR：SEQ ID NO：10‑12)、#44(SEQ ID NO：5，具有CDR：SEQ ID NO：6‑8)和#62(SEQ NO:ID:1和CDR:SEQ ID NO:2‑4)特异性结合GCC阳性细胞但不结合GCC阴性细胞。

[0184] 图6显示二价抗体结合测定的流式细胞术结果。其中3T3细胞是GCC阴性细胞系(即不表达GCC)，T84细胞是表达GCC的阳性细胞，CT26‑GCC是构建的过表达GCC的CT26细胞系，产生了VHH抗体#32、#44和#62的二价抗体，这些二价抗体就是将它们两个相同的一价抗体通过GS linker连接到一起，然后就组成了它们对应的二价抗体，并且这些二价抗体特异性结合GCC阳性细胞而不是GCC阴性细胞。

[0185] 选择VHH抗体#32、#44和#62用于构建CAR T细胞。生成编码单个CAR分子的慢病毒载体并将其转导到T细胞中，获得细胞1273(GCC CAR 32‑1，以VHH抗体#32为抗原结合结构域，CAR序列如SEQ ID NO：14所示，CAR中scFv序列如SEQ ID NO：15所示)、细胞1274(GCC CAR 32‑2，以二价VHH抗体#32为抗原结合结构域，CAR序列如SEQ ID NO：16所示，CAR中scFv序列如SEQ ID NO：17所示)、细胞1326(GCC CAR 44‑1，以VHH抗体#44为抗原结合结构域，CAR序列如SEQ ID NO：18所示，CAR中scFv序列如SEQ ID NO：19所示)、细胞1327(GCC CAR 62‑1，以VHH抗体#62为抗原结合结构域，CAR序列如SEQ ID NO：20所示，CAR中scFv序列如SEQ ID NO：21所示)，并通过流式细胞术测定确认CAR的表达。此外，将这些CAR T细胞和表达GCC的细胞共培养，并观察由表达GCC的细胞诱导的CAR T细胞的反应(例如，细胞因子释放)。与细胞培养和构建细胞毒性T淋巴细胞测定相关的技术可在“Control of large,established tumor xenografts with genetically retargeted human T cells 
containing CD28 and CD137 domains”(PNAS,March 3,2009,106(9)3360‑3365/https://doi.org/10.1073/pnas.0813101106)和Chimeric receptors containing CD137 signal transduction domains mediate enhanced survival of T cells and increased 
antileukemic efficacy in vivo”(Mol Ther.,2009 Aug；17(8):1453‑64.doi:10.1038/mt.2009.83)，通过引用将其全部并入本文。

[0186] VHH抗体#32构建的CAR T细胞(1273)的CAR表达和激活情况、与不同底物细胞共培养后细胞激活情况、细胞杀伤情况和与细胞因子释放情况如图7‑11所示，其中6701为表达5F9CAR T细胞(其CAR的序列如SEQ ID NO：22所示，CAR中scFv序列如SEQ ID NO：23所示)。
图7显示GCC CAR T细胞在第7天的CAR表达和激活情况，其中6701的GCC CAR表达为
23.97％；1273的GCC CAR表达为41.51％；同时用GCC蛋白检测发现两者表达率分别为
16.64％和40.50％；说明CAR正确地表达在细胞表面；并且1273有更高的激活。图8显示GCC CAR T细胞在第8天的CAR表达和激活情况，其中6701的GCC CAR表达为29.99％；1273的GCC CAR表达为37.99％；同时用GCC蛋白检测发现两者表达率分别为15.09％和38.13％；并且
1273有更高的激活。由此可见，1273与6701相比，具有较好的CAR及蛋白表达且激活较高。

[0187] 图9显示了GCC CAR T细胞与不同底物细胞共培养后细胞激活情况，共培养24h之6
后，取(1×10)个细胞，使用流式细胞术检测CAR T的表型，与对照组相比，带GCC靶点的靶细胞能够上调6701、1273GCC CAR T细胞CD137的表达，证明这几个GCC CART细胞能够识别GCC靶点，并且被激活且1273被激活的程度更高；说明1273具有较好的肿瘤培养后的T细胞的激活反应，CAR‑T具有功能。

[0188] 图10显示了GCC CAR T细胞与不同底物细胞共培养后细胞杀伤情况，使用NT、6701和1273的细胞分别与GCC阳性的肿瘤细胞T84共培养(T84 E:T＝3:1)，检测它们的杀伤能力，可以发现1273有着略优于6701的杀伤肿瘤细胞的能力，对肿瘤细胞的杀伤接近80％；表明1273有很好的CAR‑T功能，能有效杀伤GCC阳性的肿瘤细胞。

[0189] 图11显示了GCC CAR T细胞与不同底物细胞共培养后细胞因子释放情况，对共培养后的上清液进行了细胞因子释放的检测并进行分析，6701与1273在和GCC阳性肿瘤共培养后，细胞因子释放均有明显上调，包括IL2、TNF‑α、IFN‑g和GZMB，有很好的anti‑tumor的能力；而对于阴性肿瘤基本没有释放；表明1273与6701均有很好的CAR‑T功能，能在预到GCC阳性肿瘤时释放较高水品的细胞因子，且1273释放的IFN‑g和GZMB因子较6701多。

[0190] 本说明书中引用的所有出版物，专利和专利申请均通过引用整体并入本文，如同每个单独的出版物，专利或专利申请被具体和单独地指示为通过引用并入。虽然已经根据各种实施例描述了前述内容，但是本领域技术人员将认识到，在不脱离其精神的情况下可以进行各种修改，替换，省略和改变。表3