[0001] 本发明属于生物制药技术领域，具体是涉及一种抗菌肽及其在药学中的应用。

[0002] 皮肤微生物菌群在人类健康和疾病中发挥着重要作用。当各种内源性和外源性因素影响到皮肤共生微生物的种类和数量时，微生物菌群的失调会导致多种皮肤感染性和自身免疫性疾病，比如痤疮、慢性伤口感染、化脓性皮炎、特应性皮炎、银屑病、系统性红斑狼疮等(Y.Zhu,X.Yu,G.Cheng,Human skin bacterial microbiota homeostasis:A delicate balance between health and disease,mLife 2(2)(2023)107‑120)。外用广谱抗生素的滥用，会改变微生物菌群组成及代谢，影响皮肤屏障保护作用和免疫功能，从而导致疾病的发生。考虑到保持皮肤细菌微生态平衡的必要性，在临床上往往认为窄谱抗生素比广谱抗生素更好，甚至能用窄谱抗生素就尽量不用广谱抗生素(C.Walsh,Where will new antibiotics come from？,Nat Rev Microbiol 1(1)(2003)65‑70.)。窄谱杀伤能力因此被逐渐认为是抗菌剂的理想特性，因为它可最大限度地减少致病菌的迅速传播，降低致病菌对抗生素产生耐药性的风险，同时不会伤害生活在人类正常组织的微生物菌群以减少继发感染的风险。

[0003] 近年来，窄谱抗菌剂的研究主要集中在小分子抗生素化合物上，这些小分子化合物以目标细菌的特异蛋白和通路为靶点，从而对特定细菌发挥抑制或杀灭效果。不同于这种传统抗生素的杀菌机制，抗菌肽主要通过与细菌细胞膜相互作用并引起膜扰动，从而产生直接破膜杀菌作用(Y.Shi,X.Q.Feng,L.M.Lin,J.Wang,J.Y.Chi,B.Y.Wu,G.L.Zhou,F.Y.Yu,Q.Xu,D.J.Liu,G.L.Quan,C.Lu,X.Pan,J.F.Cai,C.B.Wu,Virus‑inspired surface‑nanoengineered antimicrobial liposome:A  potential system to simultaneously achieve high activity and selectivity,Bioact Mater 6(10)(2021)3207‑3217)。因为抗菌肽能够绕开细菌对现有抗生素所产生的耐药机制，具有杀菌效率高且不容易产生耐药性的特点，被认为是抗生素最有潜力的替代品之一。然而，目前为止能够实现窄谱抗菌的抗菌肽(或聚合物)抗菌肽的成功开发与临床应用的例子仍然很少(Y.M.Wu,K.Chen,J.ZWang,M.Z.Chen,Y.Chen,Y.R.She,Z.Yan,R.H.Liu,Host defense peptide mimicking antimicrobial amino acid polymers and beyond:Design,synthesis and biomedical applications,Prog Polym Sci 141(2023))。

[0004] 天然抗菌肽的结构通常由12‑50个氨基酸组成，包含阳离子的亲水区域和疏水区域。这些肽的氨基酸组成中包括大于2个的碱性氨基酸(如赖氨酸和精氨酸)，以及大约占50％的疏水性氨基酸(如色氨酸、亮氨酸和丙氨酸)。关于抗菌肽在膜表面作用的模型，目前已经提出了多种模型，包括桶‑板模型、地毯模型和环状孔模型。这些模型强调了抗菌肽杀灭细菌的方式普遍依赖于自身所带正电荷残基与带负电荷的细菌细胞膜静电相互作用。抗菌肽静电结合细菌细胞膜后，能够在膜表面聚集，进一步诱导细菌细胞膜的扰动或裂解，最终杀灭细菌。值得注意的是，细菌细胞膜和哺乳动物细胞膜的组成成分具有显著差异。细菌细胞膜的最外层小叶含有高比例的带负电荷头基的磷脂，而且细菌细胞壁上还含有大量带负电荷的磷壁酸及脂多糖，而哺乳动物细胞膜主要由电中性的脂质组成。因此，抗菌肽能够选择性地结合带负电荷的细菌病原体，而对哺乳动物细胞影响和作用较小(L.M.Lin,J.Y.Chi,Y.L.Yan,R.Luo,X.Q.Feng,Y.W.Zheng,D.Y.Xian,X.Li,G.L.Quan,D.J.Liu,C.B.Wu,C.Lu,X.Pan,Membrane‑disruptive peptides/peptidomimetics‑based therapeutics:Promising systems to combat bacteria and cancer in the drug‑resistant era,Acta Pharm Sin B11(9)(2021)2609‑2644.)。

[0005] 尽管天然抗菌肽在破膜杀菌效果上表现出色，但其在应用上却受到诸如高毒性、低蛋白水解稳定性和高制造成本的限制。因此，为了模拟天然抗菌肽的结构和功能特性，包括两亲性结构、正电荷、二级结构和氨基酸序列等，人们精心设计和合成了许多新型的人工抗菌肽或抗菌聚合物。与天然抗菌肽相比，它们通常具有更稳定的物理化学性质、更强的抗菌活性和更高的选择性。

[0006] 抗菌肽的正电荷和疏水性对其抗菌活性具有关键性的影响。研究表明，增加结构中的疏水部分比例可以增强抗菌肽对细菌细胞膜的穿透作用，但同时也提高了与表面呈电中性的哺乳动物细胞膜结合的可能性，导致溶血副作用增加，选择性降低。近年来，有研究通过分子结构设计，成功构建了一种纯亲水型的星形聚赖氨酸抗菌肽。这种独特的设计将抗菌肽的疏水部分比例控制在一定范围内，同时增加了正电荷数目及密度，打破了传统线性抗菌肽电荷密度较低的限制，最终实现了穿膜效率、抗菌活性和选择性的提高，同时降低了溶血副作用(C.Lu,G.L.Quan,M.Su,A.Nimmagadda,W.D.Chen,M.Pan,P.Teng,F.Y.Yu,X.Liu,L.Jiang,W.Y.Du,W.Hu,F.Yao,X.Pan,C.B.Wu,D.J.Liu,J.F.Cai,Molecular Architecture and Charging Effects Enhance the In Vitro and In Vivo Performance of Multi‑Arm Antimicrobial Agents Based on Star‑Shaped Poly(L‑lysine),Adv Ther 2(12)(2019).)。这类具有多臂结构的抗菌肽在结合带负电荷的细菌细胞膜上展现出巨大的应用潜力，其安全性也较高。但这种设计和活性只能体现在使抗菌肽杀细菌而不杀动物细胞(选择性)。对于特定菌株的特异性杀灭作用(窄谱抗菌活性)不明显。

[0007] 双分子层的最外层小叶含有高比例的带负电荷头基的磷脂是细菌细胞质膜的共同特征，但是不同细菌细胞膜的磷脂尾部成分其实存在很大的差异，这暗示着通过利用这些差异来设计抗菌肽有望获得对特定菌株有效的新型窄谱抗菌剂。据报道，铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)等革兰氏阴性菌的细胞膜中富含不饱和的磷脂酰乙醇胺，而葡萄球菌等革兰氏阳性菌的细胞膜则主要由磷脂酰甘油和心磷脂组成。P.aeruginosa细胞膜中的不饱和磷脂含量往往高于饱和磷脂，而其它人体组织共生菌群(如葡萄球菌属)细胞膜中的饱和磷脂则占比较高。

[0008] 近年来，一些研究指出抗菌肽具有潜力作为抗生素的增效佐剂，能与抗生素协同作用，增强抗菌效果。抗菌肽与抗生素的联合应用有助于提升抗生素的功效，同时降低使用剂量，从而减少可能产生的毒副作用。通常，抗菌肽通过破坏细菌细胞膜发挥作用。它们能增加细菌细胞膜通透性，有助于抗生素更好地靶向细菌内部，并最终发挥协同抗菌效果。Wong等人(Z.Shao,E.Wulandari,R.C.Lin,J.Xu,K.Liang,E.H.Wong,Two plus one:
combination therapy tri‑systems involving two membrane‑disrupting antimicrobial macromolecules and antibiotics,ACS Infectious Diseases 8(8)(2022)1480‑1490)描述了一种针对多重耐药细菌的新型“三系统”联合治疗体系，包括合成的阳离子抗菌聚合物、粘菌素甲磺酸盐以及多西环素。研究结果显示，与单一抗生素治疗相比，该体系表现出更强的杀菌活性，在低剂量下仅需3小时即可将铜绿假单胞菌的数量降至
99.999％以下。在Yang课题组的研究中，他们发现一种聚合度为20的胍基官能化聚碳酸酯pEt_20与利福平结合使用，展现出出色的协同抗菌效果(X.Ding,C.Yang,W.Moreira,P.Yuan,B.Periaswamy,P.F.de Sessions,H.Zhao,J.Tan,A.Lee,K.X.Ong,A macromolecule reversing antibiotic resistance phenotype and repurposing drugs as potent antibiotics,Advanced Science 7(17)(2020)2001374.)。在小鼠的MDR鲍曼不动杆菌菌血症模型中，pEt_20与抗生素联合治疗表现出更显著的细菌清除效果和更高的小鼠存活率。

[0009] 鉴于生物技术与药效发挥的复杂性，科研人员正在努力筛选适用于临床应用、能够有效抑制细菌、并与抗生素联合使用的合适抗菌肽。

[0010] 基于此，本发明的目的是提供一系列含有咪唑基的多臂抗菌肽，该多臂抗菌肽具有窄谱抗菌活性，其作为抗生素增效剂能够有效抑制细菌的生长，尤其铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)的生长，所述抗菌肽与抗生素共载的药物具有显著的抑菌效果，且更不容易产生耐药性，具有临床应用价值。

[0011] 实现上述目的的包括如下技术方案：

[0012] 本发明的第一方面，在于提供一种四臂抗菌肽，所述四臂抗菌肽由四段组成相同的、氨基酸残基数目为8‑12的多肽侧链与三个相互连接的赖氨酸残基的氨基分别连接所构成，以氨基封端；每段多肽侧链由组氨酸残基组成，或由组氨酸残基以及选自赖氨酸残基或精氨酸残基中一种所组成。

[0013] 或所述种四臂抗菌肽具有如下结构式，

[0014]

[0015] R1代表组氨酸残基的侧链时，n＝8‑12；

[0016] 或R1代表赖氨酸残基侧链和组氨酸残基侧链的组合，或为精氨酸残基侧链和组氨酸残基侧链的组合时，n＝4‑6。

[0017] 在其中一些实施例中，所述多肽侧链组成是：赖氨酸残基和组氨酸残基组合重复组成、或精氨酸残基和组氨酸残基组合重复组成。

[0018] 其中一些实施例中，所述多肽侧链组成是：8‑12个组氨酸残基，更优选是，9‑11个组氨酸残基，例如是9,10个，11个组氨酸残基。

[0019] 在其中一些实施例中，所述多肽侧链为(KHKHKHKHKH)4K2K‑NH2、(RHRHRHRHRH)4K2K‑NH2或(HHHHHHHHHH)4K2K‑NH2中的至少一种。

[0020] 在其中一些实施例中，所述四臂抗菌肽是(HHHHHHHHHH)4K2K‑NH2。

[0021] 本发明的第二方面，在于提供上述四臂抗菌肽作为在制备抗革兰氏阴性菌的药物中的应用。

[0022] 本发明的第三方面，在于提供上述四臂抗菌肽作为抗生素的增效佐剂联合抗生素在制备抗细菌的药物中的应用。

[0023] 本发明的第四方面，在于提供一种包括上述四臂抗菌肽和药学上可以接受的辅料的抗菌药物。

[0024] 本发明的第五方面，在于提供一种抗菌联合用药物，其活性成分包括上述四臂抗菌肽和抗细菌类抗生素，所述四臂抗菌肽和抗生素分别成为独立的给药单元，或所述四臂抗菌肽和抗生素共同形成组合的给药单元。

[0025] 在其中一些实施例中，所述细菌为革兰氏阴性菌，进一步地，所述革兰氏阴性菌为鲍曼不动杆菌或铜绿假单胞菌。

[0026] 在其中一些优选的实施例中，所述抗生素为四环素类抗生素，优选为强力霉素。

[0027] 所述四臂抗菌肽与强力霉素的质量比为(6‑10):1，进一步优选为(7‑9):1，更优选剂型为温敏水凝胶(TSG)。

[0028] 在其中一些实施例中，所述药物的剂型选自软膏剂、乳膏剂、糊剂、凝胶剂、溶液洗剂、涂膜剂、注射剂、气雾剂或透皮贴片中的至少一种。

[0029] 在其中一些实施例中，所述药物的剂型为软膏、水凝胶或注射液中的至少一种。

[0030] 本发明设计并筛选出了一系列富含咪唑基的四臂抗菌肽。这些抗菌肽由赖氨酸/组氨酸、精氨酸/组氨酸或组氨酸组成，其结构被设计成四臂结构，有利于提高抗菌肽结构中的咪唑基团的密度，并且增强其选择性及窄谱抗菌活性。特别是当所述四臂抗菌肽是4H10时，所述四臂抗菌肽可以作为抗生素增效剂，在不损害人体正常皮肤微生物菌群的情况下，更有效地为治疗由铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)引起的皮肤感染发挥协同抗菌作用，同时降低了溶血副作用，且更不容易产生抗生素耐药性。
附图说明

[0031] 图1为4H10在D2O中的1H NMR图。

[0032] 图2为各种抗菌肽对不同细菌(a)及不同临床铜绿假单胞菌菌株(b)的MIC值。

[0033] 图3为各种抗菌肽的溶血作用。

[0034] 图4为各种抗菌肽对多种临床铜绿假单胞菌菌株的选择性指数。

[0035] 图5为4H10和强力霉素针对铜绿假单胞菌的棋盘稀释实验；图中模块颜色越深表示对细菌生长抑制作用越小；黑色和黄色球分别代表4H10和强力霉素的MIC值；白色球指示两者具有协同效应的浓度。

[0036] 图6为经4H10联合强力霉素处理的铜绿假单胞菌TEM图像。

[0037] 图7为铜绿假单胞菌在50次传代后对4H10(0.5×MIC)和强力霉素(0.5×MIC)的耐药性发展。

[0038] 图8为PBS、4H10/Doxycyline TSG治疗铜绿假单胞菌引起的感染后，皮肤脓肿情况(a)及组织中的活菌含量(b)。

[0039] 图9为富含咪唑基的四臂抗菌肽的制备过程的示意图，其中灰色球代表固相合成所用的固相树脂。

[0040] 为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。

[0041] 下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Green和Sambrook主编的第四版《分子克隆实验指南》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)已于2013年出版，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

[0042] 除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

[0043] 定义：为了便于理解本技术，下面定义了一些术语和短语。

[0044] MIC：以MHB与菌液的混合物为阳性对照，纯MHB培养基作为阴性对照，把抑制细菌生长的最小浓度定义为最小抑菌浓度。

[0045] 咪唑基团是一个五元杂环基团，包含两个氮原子和三个碳原子。在咪唑环中，两个氮原子分别位于环的1和3位置，它们相邻且与碳原子交替排列。咪唑基团的分子式为C3H3N2。

[0046] K：Lysine(赖氨酸)

[0047] H：Histidine(组氨酸)

[0048] R：Arginine(精氨酸)。

[0049] 强力霉素:又名盐酸多西环素英文名称:Doxycycline Hyclate。

[0050] 以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。

[0051] 实施例1

[0052] 本实施例中，基于组氨酸的四臂抗菌肽，经实验证实该结构有利于提高抗菌肽结构中的咪唑基团的密度，从而增强其选择性及实现窄谱抗菌。

[0053] ①富含咪唑基的四臂抗菌肽的合成与表征

[0054] 设计了一系列富含咪唑基的抗菌肽，包括(KHKHKHKHKH)4K2K‑NH2(4K5H5)、(RHRHRHRHRH)4K2K‑NH2(4R5H5)和(HHHHHHHHHH)4K2K‑NH2(4H10)。

[0055] 采用标准的芴甲氧羰基Fmoc固相肽合成策略，在Fmoc‑Rink Amide MBHA树脂上合成一系列富含咪唑基的四臂抗菌肽，它们分别基于赖氨酸/组氨酸、精氨酸/组氨酸和组氨酸构成。

[0056] 具体合成步骤如下(图9为一系列富含咪唑基的四臂抗菌肽的制备过程示意图，灰色球代表固相合成所用的固相树脂)：

[0057] S1.用20％的哌啶DMF溶液(×2)中去除树脂上的Fmoc保护基，然后用DCM和DMF清洗树脂三次。使用四倍当量的Fmoc‑Lys(Fmoc)‑OH，与羟基苯并三唑(HOBt)和N,N′‑二异丙基碳二亚胺(DIC)进行偶联，在固相合成管中反应4小时。

[0058] S2.用DCM和DMF冲洗树脂三次，用20％的哌啶DMF溶液进行Fmoc脱保护(×2)，按照上述方案在树脂上偶联第二个Fmoc‑Lys(Fmoc)‑OH，得到第二代赖氨酸树枝状化合物。

[0059] S3.该树脂反复经过Fmoc脱保护与后续氨基酸的偶联，与12倍当量的Fmoc‑His(Trt)‑OH、Fmoc‑Lys(Fmoc)‑OH或Fmoc‑Arg(Pbf)‑OH反应，直到获得不同的目标多肽。

[0060] S4.多肽经过脱保护后，然后用92.5％(v/v)三氟乙酸(TFA)与2.5％三乙基硅烷(TIS)、2.5％乙二硫醇(EDT)和2.5％H2O的混合溶液，在室温下振荡反应2.5h，使多肽从树脂上裂解出来。

[0061] S5.所有粗产物均在冷乙醚中沉淀、纯化，最后使用Shimadzu LC‑20A HPLC系统、1
MALDI‑TOF和H NMR进行表征。

[0062] 结果如表1及图1所示，目标产物经高效液相色谱法(HPLC)、基质辅助激光解吸电1
离飞行时间(MALDI‑TOF)质谱法和 H NMR证实了它们的纯度和结构，表明目标产物合成成功且所设计的合成方法可行。

[0063] 表1抗菌肽的HPLC和ESI‑MS表征

[0064]

[0065] ②体内外抗菌活性与选择性研究

[0066] a)最小抑菌浓度研究

[0067] 为了深入研究4K5H5、4R5H5和4H10的抗菌效果，针对多种在临床医学上具有重要意义的病原微生物，进行了最小抑菌浓度(MIC)的测定，这些病原微生物包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、大肠杆菌(E.coli)、鲍曼不动杆菌(A.baumannii)以及铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)。

[0068] 取革兰氏阳性菌(耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA，ATCC 33591))、革兰氏阴性菌(大肠杆菌(E.coli，ATCC 25922)、鲍曼不动杆菌(A.baumannii，ATCC 19606)、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa，ATCC 27853))接种于MHB中，并培养至对数生长期，然后稀释至2×‑1105CFU·mL 。抗菌肽样品用磷酸盐缓冲液(PBS)溶解，并稀释至200、100、50、25、12.5、6.2、‑1
3.1、1.55、0.78μg·mL 。样品孔中加入50μL不同浓度的抗菌肽溶液，接着加入50μL稀释好的菌液。混合好的样品置于37℃培养箱中培养16h。用酶标仪测量600nm处的吸光度，并记录实验结果。

[0069] 通过检测上述方法①中合成的3种富含咪唑基的四臂抗菌肽对不同细菌(图2中a)的MIC值，可知它们展示出对铜绿假单胞菌标准菌株的窄谱抗菌活性。它们对铜绿假单胞菌标准菌株的MIC值，要低出其它病原体的MIC达4倍以上。

[0070] 我们进一步评估所述富含咪唑基的四臂抗菌肽(4K5H5、4R5H5和4H10)对于各种临床分离的铜绿假单胞菌菌株的抗菌效果。结果如图2中b所示，不同的临床铜绿假单胞菌株(图2中b)对4K5H5、4R5H5和4H10的敏感性表现出一定程度的差异。其中，4H10对所有测试的铜绿假单胞菌菌株的MIC值均为最低，其几何平均数(Gm)为4μM。结果表明，通过将抗菌肽设计为多臂结构，可以有效地提高咪唑基团的密度，从而获得具有对铜绿假单胞菌有针对性杀菌效果的窄谱抗菌肽。此外，我们的研究中还发现，当在4H10抗菌肽结构中的咪唑基团被换成氨基或胍基后(即4K5H5和4R5H5)，抗菌肽对各类临床分离的铜绿假单胞菌株的活性会出现降低，这进一步突显了咪唑基团在实现对铜绿假单胞菌的特异性杀菌作用中的关键地位，有利于提高药物的特异性。

[0071] 实施例2：溶血活性研究

[0072] 由于高溶血率是限制许多抗菌肽应用的主要原因之一。我们采用大鼠红细胞进行溶血实验来评估这些抗菌肽的溶血活性。

[0073] 釆集经EDTA‑K2处理的新鲜大鼠红细胞(rRBC)，离心收集底部红细胞。用PBS洗涤红细胞3次，配成5％(v/v)的红细胞悬液。用PBS配制浓度为2000、1000、500、250、125、62.5‑1和31.3μg·mL 的抗菌肽溶液，随后加入等体积的红细胞悬液，于37℃培养箱内恒温孵育
1h。

[0074] 本实验采用PBS和2％Triton X‑100处理的RBC悬浮液分别作为阴性和阳性对照。培养结束后，在1000×g下离心10min。在另一个96孔板中用100μL PBS稀释30μL上清液，然后用酶标仪在540nm处测定吸光度值。每个样品的溶血率根据以下公式计算：

[0075] 溶血率(％)＝(Asample‑APBS)/(ATritonX‑100‑APBS)×100％

[0076] Asample表示抗菌肽与红细胞混合物的吸光度；

[0077] ATritonX‑100表示阳性对照的吸光度；

[0078] APBS表示阴性对照的吸光度。

[0079] 结果如图3所示，4K5H5，4R5H5和4H10均表现出可忽略不计的溶血活性，而且其HC5‑1(即引起5％红细胞溶血所需的药物浓度)均大于1000μg·mL 。该结果说明我们设计合成的一系列富含咪唑基的四臂抗菌肽(4K5H5，4R5H5和4H10)具有较好的生物安全性和应用潜力。

[0080] 随后，我们计算不同抗菌肽的HC5与Gm的比值得到选择性指数，以评估这一系列富含咪唑基的四臂抗菌肽对多种临床铜绿假单胞菌菌株的选择性。

[0081] 如图4所示，4H10的选择性指数最高，为40.0，而4R5H5和4K5H5的选择性指数分别为17.2和12.6。据文献报道，抗菌药物的选择性指数需要高于10才具有较好的临床应用和研究价值。在这一系列抗菌肽中，结构中含有最高密度咪唑基团的4H10表现出对铜绿假单胞菌最强的抗菌活性以及最高的选择性。因此，该结果再次证明了咪唑基团在实现特异性杀灭铜绿假单胞菌方面具有独特的作用。

[0082] 实施例3抗菌肽联合抗生素的体外抗菌活性和机制研究

[0083] a)体外联合抗菌活性研究

[0084] 据报道，抗菌肽与抗生素的联用有利于增强抗生素药效并降低使用剂量，从而减少大量使用抗生素可能会带来的毒副作用。因此，为了在实际应用中更好地应对铜绿假单胞菌感染，我们进一步研究了4H10与多种广谱或针对革兰氏阴性菌的传统抗生素的联合抗菌能力。采用棋盘法评估4H10与多种商用抗生素的联合抑菌作用，并计算了部分抑菌浓度指数(FICI)。

[0085] 采用棋盘法研究抗菌肽与不同抗生素组合之间的相互作用。将铜绿假单胞菌培养5 ‑1
至对数生长期，并在MHB中稀释至2×10CFU·mL 。制备4H10和抗生素的梯度稀释液(2倍)，浓度范围为0至4×MIC。在96孔板的列中加入25μL的4H10溶液，在行中加入等体积的抗生素溶液。然后，在每个样品孔中加入50μL稀释好的菌液。混合好的样品置于37℃培养箱中培养
16h。用酶标仪测量600nm处的吸光度，记录4H10和抗生素单独或联合给药时的MIC，部分抑菌浓度指数(FICI)根据以下公式计算：

[0086]

[0087] 其中，MICA,alone和MICB,alone是4H10和抗生素单独作用时的MIC，MICA,combination和MICB,combination是抗生素和4H10在联合应用时的MIC。FICI≤0.5表示协同作用(S)，>0.5但<1表示部分协同作用(PS)，>1但＜4表示相加作用(A)。

[0088] 实验结果如图5所示，4H10与强力霉素具有明显协同抗菌作用(FICI≤0.5)，FICI值计算为0.375，质量比为8:1(4H10：强力霉素)是两者联用的最优比例。该结果初步表明这种富含咪唑基的四臂抗菌肽具有开发成为抗生素增效佐剂的良好应用潜力。

[0089] 如图5所示4H10和强力霉素针对铜绿假单胞菌的棋盘稀释实验结果；图5中模块颜色越深表示对细菌生长抑制作用越小；黑色和黄色球分别代表4H10和强力霉素的MIC值；白色球指示两者具有协同效应的浓度。

[0090] b)抗菌机制研究

[0091] 为了阐明4H10对抗生素的增效机制，我们采用透射电子显微镜(TEM)成像来评估经4H10联合强力霉素处理后铜绿假单胞菌细胞形貌的变化。

[0092] 使用TEM观察铜绿假单胞菌经不同药物处理前后的形态变化。细菌被培养至对数生长期，收集并用PBS洗涤3次。然后，将800μL细菌悬浮液加入至等体积的含有4H10和强力‑1 ‑1霉素的混合溶液(100μg·mL  4H10和25μg·mL 强力霉素)。经PBS处理的细菌作为对照组。于37℃培养箱中培养4h，菌体沉淀在5000×g下离心15min，并用PBS洗涤，收集。往细菌沉淀加进1mL 2.5％戊二醛溶液并吹打均匀，于4℃下固定过夜。菌体沉淀用PBS洗涤，然后进一步用1％的锇酸固定1h。PBS洗涤后，样品接着用不同浓度的乙醇(30,50,70,80,90和
95％)脱水，然后将脱水后的样品转移到丙酮中处理20min，并与包埋介质和丙酮(V/V＝1/
1)混合，处理1h，再用包埋介质和丙酮(V/V＝3/1)的混合物处理3h，最后在Spurr树脂中培养过夜。对样品切片进行染色，通过TEM观察细菌形态。

[0093] 如图6所示，我们观察到经过4H10联合强力霉素处理的细菌细胞外膜和内膜均发生了明显的破损，为强力霉素在胞内浓度的增加提供了条件。结果表明，这种富含咪唑基的四臂抗菌肽可能通过增加铜绿假单胞菌细胞膜的通透性，促进强力霉素向该细菌的胞内靶点富集，最终发挥了协同抗菌功效。

[0094] ④体外诱导耐药研究

[0095] 为了研究4H10是否容易导致细菌耐药性，我们采用体外药物浓度递增法诱导铜绿假单胞菌产生耐药，并通过微量肉汤稀释法来测定MIC值的变化情况。

[0096] 取铜绿假单胞菌接种于MHB中，并培养至对数生长期。取50μL菌液加入到含有抗生素(1/2×MIC)的MHB中，于37℃培养箱中培养10h。每10h为1代，对该菌株连续转种培养直到菌株能在1/2MIC抗生素的MHB肉汤上稳定生长。诱导后MIC值高于原始MIC值则表示菌液对抗生素或抗菌拟肤产生抗性，然后用新的含有抗生素(1/2×MIC)的MHB继续诱导。每个抗生素浓度诱导结束后，再于MHB中继续培养三代，以保证耐药诱导的稳定性。接着测定抗菌肽和强力霉素的MIC值，若MIC值高于初始测定值即表明细菌已经开始产生对药物的耐药性。

[0097] 铜绿假单胞菌在50次传代后对4H10(0.5×MIC)和强力霉素(0.5×MIC)的耐药性发展情况如图7所示，在经过50代诱导后，铜绿假单胞菌对强力霉素已经产生了耐药性，其‑1MIC值提高了64倍(达到400μg·mL )。然而，与此相反，4H10对铜绿假单胞菌的MIC值并未发生变化。该结果进一步提示，这种富含咪唑基的四臂抗菌肽可能具备杀灭耐药菌的独特优势。

[0098] ⑤小鼠皮肤感染的治疗研究

[0099] 为了提高4H10和强力霉素在体内的局部滞留，并且为注射给药提供便利，我们进一步构建了一种温敏水凝胶(TSG)，用于后续的体内药效评价实验。

[0100] a)皮肤感染模型的构建与治疗

[0101] 采用体重18～22g的健康ICR小鼠。把对数生长期的铜绿假单胞菌用无菌PBS洗涤8 ‑1
后重悬至1×10CFU·mL ，然后注射50μL至小鼠皮下。待菌液基本被吸收后(30min)，在相同造模部位注射100μL一定浓度的4H10/Doxycyline TSG(质量比为8:1)前体溶液或纯PBS溶液(作为阳性对照)。在48h后，颈椎脱臼处死小鼠，解剖取背部皮下脓肿处的皮肤。

[0102] b)皮下活菌含量分析

[0103] 加入1mL无菌PBS，将皮肤样品制成匀浆液。将匀浆液按10倍比例梯度稀释，制成不同浓度的稀释液。取10μL稀释液接种到MH琼脂平板上，在37℃下孵育过夜，计算平板上的细菌菌落数。

[0104] 每毫升匀浆液内的活菌数＝菌落数×100×稀释倍数。

[0105] 统计分析采用单因素方差分析(ANOVA)，然后使用LSD‑t法进行组间两两比较。P<0.05为具有显著性差异，显著性差异水平表示如下：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

[0106] 在这一部分的实验中，我们建立了铜绿假单胞菌引起的小鼠深层皮肤感染模型，‑1并选择市售抗生素软膏作为对照。如图8所示，在给小鼠皮下注射1×108CFU·mL 的铜绿假单胞菌48h后，Control组小鼠的背部明显肿起，其皮下能够观察到明显的大块脓肿，说明造模成功。用4H10和强力霉素共载的温敏水凝胶(4H10/Doxycyline TSG)治疗后，其皮下脓肿明显减小，可见联合治疗具有一定的抗菌作用。

[0107] 为了进一步确定皮下组织中的活菌数目，我们取皮肤脓肿区域的组织样本，将其加入无菌PBS中制成匀浆液。经过10倍比例稀释后，在MH琼脂平板上进行培养并进行定量分析。

[0108] PBS、4H10/Doxycyline TSG治疗铜绿假单胞菌引起的感染后皮肤脓肿情况及组织中活菌含量如图8所示，可见其中使用4H10/Doxycyline TSG能够在两天内有效清除小鼠皮肤中高达97.1％的铜绿假单胞菌，相较于市售软膏组，其清除率高出12倍以上(p<0.001)，表明其在体内具有显著优势的抑菌效果。这些研究结果初步展示了4H10联合强力霉素在体内抗菌方面的优势，暗示这种富含咪唑基的四臂抗菌肽具有很大的临床应用潜力。

[0109] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。