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一种降糖效果好的南瓜提取物及其制备工艺
申请号	CN202410059917.2	申请日	2024-01-16	公开(公告)号	CN117903333A	公开(公告)日	2024-04-19
申请人	上海益铖生物科技有限公司;			发明人	黄慧珠;
摘要	本发明涉及医用技术领域，具体公开了一种降糖效果好的南瓜提取物及其制备工艺。本发明中通过对南瓜进行提取、纯化、改性得到降糖效果好的南瓜提取物。与现有技术相比，本发明制备的南瓜提取物具备活性高、抗氧化性好、应用范围广泛等优点。
权利要求	1.一种降糖效果好的南瓜提取物的制备工艺，其特征在于，包括如下步骤： S1将新鲜南瓜去皮、除籽、去瓤、切块后干燥、粉碎、过筛，将得到的南瓜粉加入到水中，升温提取2～6h，水提取液离心后得到上清液浓缩备用；残渣加入到80wt％乙醇水溶液升温提取16～20h，醇提取液离心后得到上清液与水提后的上清液合并浓缩，残余物加入乙醇稀释后，在0～5℃下静置1～2d，沉淀经离心后加水溶解，冷冻干燥得到粗品多糖； S2将粗品多糖加水溶解后经柱层析纯化后透析2～3d后冷冻干燥得到提纯后的提取物； S3将提纯后的提取物加入到N,N‑二甲基甲酰胺中，再加入溴丙炔，降温加入60wt％氢化钠分散液，升温搅拌4～6h，加入1mol/L稀盐酸淬灭后，浓缩除去溶剂，残余物加入到大量乙醇中，有沉淀出现，过滤，滤渣经乙醇洗涤后再加水透析2～3d后冷冻干燥用于下一步； S4将上一步的产物以及二(对硝基苯基)叠氮膦酸酯加入到N,N‑二甲基甲酰胺中，得到混合物A；再加入五水硫酸铜、抗坏血酸钠加入到50wt％乙醇水溶液中得到混合物B；将混合物A与混合物B混合，室温下搅拌16～28h，加入乙醇稀释后，过滤，残余物经乙醇洗涤后加水透析2～3d后冷冻干燥得到降糖效果好的南瓜提取物。 2.如权利要求1所述的降糖效果好的南瓜提取物的制备工艺，其特征在于，所述步骤S1中水提的料液比为1:15～20g/mL。 3.如权利要求1所述的降糖效果好的南瓜提取物的制备工艺，其特征在于，所述步骤S1中水提升温的温度范围为60～100℃。 4.如权利要求1所述的降糖效果好的南瓜提取物的制备工艺，其特征在于，所述步骤S1中醇提的料液比为1:1～2g/mL。 5.如权利要求1所述的降糖效果好的南瓜提取物的制备工艺，其特征在于，所述步骤S1中醇提升温的温度范围为50～80℃。 6.如权利要求1所述的降糖效果好的南瓜提取物的制备工艺，其特征在于，所述步骤S3中降温的温度范围为0～5℃。 7.如权利要求1所述的降糖效果好的南瓜提取物的制备工艺，其特征在于，所述步骤S3中升温的温度范围为55～65℃。 8.如权利要求1所述的降糖效果好的南瓜提取物的制备工艺，其特征在于，所述透析时截留分子量Mw＜2000。 9.如权利要求1所述的降糖效果好的南瓜提取物的制备工艺，其特征在于，所述冷冻干燥条件为﹣30～﹣40℃，8～10Pa，24～48h。 10.一种降糖效果好的南瓜提取物，其特征在于，由权利要求1～9任一项所述的工艺制备而成。
说明书全文	一种降糖效果好的南瓜提取物及其制备工艺技术领域 [0001] 本发明涉及医用技术领域，尤其涉及一种降糖效果好的南瓜提取物及其制备工艺。背景技术 [0002] 糖尿病是一种慢性代谢疾病，由遗传和环境等因素共同作用而导致，主要分为Ⅰ型糖尿病、Ⅱ型糖尿病、妊娠期糖尿病和特殊类型糖尿病等四种，可引起糖尿病肾病、糖尿病眼病、糖尿病足溃疡、糖尿病性心脏病和糖尿病周围神经病变等并发症，其治疗药物主要分为α‑葡萄糖苷酶抑制剂、胰岛素分泌促进剂、二肽基肽酶‑4抑制剂、钠葡萄糖协同转运蛋白抑制剂、改善神经营养类药物等5类，但这些药物可能会存在体重增加、急性胆汁淤积性肝炎等副作用。因此，开发新型安全的降糖产品具有广阔的市场前景。 [0003] 南瓜是葫芦科南瓜属草本植物的果实，富含各种维生素、氨基酸、蛋白质、多糖等营养物质，是一种高营养、低脂的功能性食品，作为一种防治糖尿病的食品而备受关注。南瓜多糖富含降血脂、降血糖、抗氧化、抗衰老等功能的生物活性成分，作为自由基清除剂在预防氧化损伤方面起着重要作用，其降血糖活性也已被证实。 [0004] 中国专利201010183570.0公开了一种含肌醇的纳米级南瓜提取物及其制备方法和用途。该南瓜提取物含总肌醇3‑5％，平均粒径为300‑500nm；其制备方法包括用提取剂提取，再利用植酸酶将肌醇衍生物酶解释放出肌醇单体，经过离子交换树脂分离得到含有肌醇单体及其衍生物的南瓜肌醇提取物；并将提取物以高能球磨法制备成适宜粒径的纳米级南瓜提取物；经试验，此含肌醇的纳米级南瓜提取物具有较好的辅助降血糖作用，可用于糖尿病新药物及各种保健制剂的制备。 [0005] 中国专利201410785701.0涉及一种蜂胶丹参保健食品，其由下列重量百分比的组分组成：蜂胶6％‑18％、丹参提取物6％‑18％、红景天提取物4％‑18％、南瓜多糖4％‑16％、月苋草油40％‑55％，辅料5％‑10％。可制成软胶囊。该发明中蜂胶、丹参提取物、红景天提取物能同时降血压、血脂、血糖，复配使用具有协同增效的效果，搭配月苋草油和南瓜多糖，其高含量的不饱和脂肪酸对发明效果更佳。该发明原料组成简单、合理，成分天然，配比恰当，服用方便，安全性高，没有毒副作用，无不良反应，也不会产生依赖作用，适合长期服用。具有降低血脂和血糖功效。 [0006] 近年来，南瓜的功能特性逐渐逐步得到人们的认可，但目前市场上的产品大多数只是南瓜粉、南瓜饼及果汁等为数不多的品种，而南瓜的深加工尚未得到重视，若能有层次地全面利用南瓜，并从中获得各种有效成分，用来生产药品、功能性食品等，将为促进人类健康、提高人们生活质量发挥更大的作用。发明内容 [0007] 有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是一种降糖效果好的南瓜提取物及其制备工艺。 [0008] 对南瓜进行提取、纯化后得到的南瓜多糖具有显著的降血糖功效，其机理可能是在于南瓜多糖能够修复受损的胰岛细胞，促进β细胞再生，从而有效增加胰岛素的释放。并且，多糖作为一种天然抗氧化剂和免疫调节剂，能够有效抑制自由基对机体造成氧化损伤，通过激活各种免疫细胞和免疫过程发挥免疫调节活性，而线粒体功能损伤和胰岛β细胞衰竭则和氧化应激息息相关。在本发明中，通过对南瓜进行提取得到粗品多糖，再对粗品多糖进行纯化，纯化后的提取物杂质更少，有效成分含量高，对纯化后的提取物进行进一步改性不仅能够极大地加强有效成分的活性，改变其生物活性，并且通过引入强吸电子基以及能够稳定自由基的基团改善了抗氧化性，从而进一步地增强了降糖效果。本发明所制备得到的南瓜提取物不仅增强了南瓜提取物的功能，还使其应用范围更为广泛，具有广阔的开发应用前景。 [0009] 实现上述目的，本发明提供了一种降糖效果好的南瓜提取物的制备工艺，包括如下步骤： [0010] S1将新鲜南瓜去皮、除籽、去瓤、切块后干燥、粉碎、过筛，将得到的南瓜粉加入到水中，升温提取2～6h，水提取液离心后得到上清液浓缩备用；残渣加入到80wt％乙醇水溶液升温提取16～20h，醇提取液离心后得到上清液与水提后的上清液合并浓缩，残余物加入乙醇稀释后，在0～5℃下静置1～2d，沉淀经离心后加水溶解，冷冻干燥得到粗品多糖； [0011] S2将粗品多糖加水溶解后经柱层析纯化后透析2～3d后冷冻干燥得到提纯后的提取物； [0012] S3将提纯后的提取物加入到N,N‑二甲基甲酰胺中，再加入溴丙炔，降温加入60wt％氢化钠分散液，升温搅拌4～6h，加入1mol/L稀盐酸淬灭后，浓缩除去溶剂，残余物加入到大量乙醇中，有沉淀出现，过滤，滤渣经乙醇洗涤后再加水透析2～3d后冷冻干燥用于下一步； [0013] S4将上一步的产物以及二(对硝基苯基)叠氮膦酸酯加入到N,N‑二甲基甲酰胺中，得到混合物A；再加入五水硫酸铜、抗坏血酸钠加入到50wt％乙醇水溶液中得到混合物B；将混合物A与混合物B混合，室温下搅拌16～28h，加入乙醇稀释后，过滤，残余物经乙醇洗涤后加水透析2～3d后冷冻干燥得到降糖效果好的南瓜提取物。 [0014] 进一步的，所述步骤S1中水提的料液比为1:15～20g/mL。 [0015] 进一步的，所述步骤S1中水提升温的温度范围为60～100℃。 [0016] 进一步的，所述步骤S1中醇提的料液比为1:1～2g/mL。 [0017] 进一步的，所述步骤S1中醇提升温的温度范围为50～80℃。 [0018] 进一步的，所述步骤S3中降温的温度范围为0～5℃。 [0019] 进一步的，所述步骤S3中升温的温度范围为55～65℃。 [0020] 进一步的，所述透析时截留分子量Mw＜2000。 [0021] 进一步的，所述冷冻干燥条件为﹣30～﹣40℃，8～10Pa，24～48h。 [0022] 优选的，所述降糖效果好的南瓜提取物的制备工艺，包括如下步骤： [0023] S1将新鲜南瓜500～1000重量份去皮、除籽、去瓤、切块后干燥、粉碎、过筛，将得到的南瓜粉取100～200重量份按料液比1:15～20g/mL加入到水中，升温至60～100℃下提取2～6h，水提取液离心后得到上清液浓缩备用；残渣则按料液比1:1～2加入80wt％乙醇水溶液升温至50～80℃提取16～20h，醇提取液离心后得到上清液与水提后的上清液合并浓缩，残余物加入乙醇稀释后，在0～5℃下静置1～2d，沉淀经离心后加水溶解，冷冻干燥得到粗品多糖； [0024] S2将粗品多糖10～15重量份加水100～200重量份溶解后经柱层析纯化后透析(Mw＜2000)2～3d后冷冻干燥得到提纯后的提取物； [0025] S3将提纯后的提取物4～10重量份加入到20～100重量份的N,N‑二甲基甲酰胺中，再加入溴丙炔15～20重量份，降温至0～5℃后加入60wt％氢化钠分散液1～2重量份，升温至55～65℃下搅拌4～6h，加入1mol/L稀盐酸淬灭后，浓缩除去溶剂，残余物加入到大量乙醇中，有沉淀出现，过滤，滤渣经乙醇洗涤后再加水透析(Mw＜2000)2～3d后冷冻干燥用于下一步； [0026] S4将上一步的产物以及二(对硝基苯基)叠氮膦酸酯10～30重量份加入到20～100重量份的N,N‑二甲基甲酰胺中，得到混合物A；再加入五水硫酸铜0.1～0.5重量份、抗坏血酸钠0.5～1.5重量份加入到5～10重量份的50wt％乙醇水溶液中得到混合物B；将混合物A与混合物B混合，室温下搅拌16～28h，加入乙醇稀释后，过滤，残余物经乙醇洗涤后加水透析(Mw＜2000)2～3d后冷冻干燥得到降糖效果好的南瓜提取物。 [0027] 本发明还提供了一种降糖效果好的南瓜提取物，由上述方法制备而成。 [0028] 本发明的有益效果： [0029] 1、与现有技术相比，在本发明中通过对南瓜进行提取得到粗品多糖，再对粗品多糖进行纯化，纯化后的提取物杂质更少，有效成分含量高，对纯化后的提取物进行进一步改性不仅能够极大地加强有效成分的活性，改变其生物活性，并且通过引入强吸电子基以及能够稳定自由基的基团改善了抗氧化性，从而进一步地增强了降糖效果。 [0030] 2、相比现有技术，本发明所制备得到的南瓜提取物不仅增强了南瓜提取物的功能，还使其应用范围更为广泛，具有广阔的开发应用前景。具体实施方式 [0031] 60wt％氢化钠分散液，分散于液体石蜡。 [0032] 实施例1 [0033] 一种降糖效果好的南瓜提取物的制备工艺，包括如下步骤： [0034] S1将新鲜南瓜600g去皮、除籽、去瓤、切块后干燥、粉碎、过100目筛，将得到的南瓜粉取150g按料液比1:18g/mL加入到水中，升温至80℃下提取4h，水提取液离心后得到上清液浓缩备用；残渣则按料液比1:1g/mL加入80wt％乙醇水溶液升温至60℃提取18h，醇提取液离心后得到上清液与水提后的上清液合并浓缩得到残余物，残余物加入乙醇稀释后，在0℃下静置1d，沉淀经离心后加水溶解，﹣30℃，10Pa冷冻干燥48h得到粗品多糖； [0035] S2将粗品多糖15g加水150mL溶解后经柱层析纯化后透析(Mw＜2000)3d后﹣30℃，10Pa冷冻干燥48h得到提纯后的提取物； [0036] S3将提纯后的提取物6g加入到60mL N,N‑二甲基甲酰胺中，再加入溴丙炔20g，降温至0℃后加入60wt％氢化钠分散液1.5g，升温至60℃下搅拌4h，加入1mol/L稀盐酸淬灭后，浓缩除去溶剂，残余物加入到大量乙醇中，有沉淀出现，过滤，滤渣经乙醇洗涤后再加水透析(Mw＜2000)3d后﹣30℃，10Pa冷冻干燥48h用于下一步； [0037] S4将上一步的产物以及二(对硝基苯基)叠氮膦酸酯30g加入到50mL N,N‑二甲基甲酰胺中，得到混合物A；再加入五水硫酸铜0.4g、抗坏血酸钠1.2g入到8mL 50wt％乙醇水溶液中得到混合物B；将混合物A与混合物B混合，室温下搅拌24h，加入乙醇稀释后，过滤，残余物经乙醇洗涤后加水透析(Mw＜2000)3d后﹣30℃，10Pa冷冻干燥48h得到降糖效果好的南瓜提取物。 [0038] 实施例2 [0039] 与实施例1相同，唯一区别是水提时料液比为1:15g/mL。 [0040] 实施例3 [0041] 与实施例1相同，唯一区别是水提时温度为70℃。 [0042] 实施例4 [0043] 与实施例1相同，唯一区别是水提时时间为2h。 [0044] 对照例1 [0045] 一种降糖效果好的南瓜提取物的制备工艺，包括如下步骤： [0046] 将新鲜南瓜600g去皮、除籽、去瓤、切块后干燥、粉碎、过100目筛，将得到的南瓜粉取150g按料液比1:18g/mL加入到水中，升温至80℃下提取4h，水提取液离心后得到上清液浓缩备用；残渣则按料液比1:1g/mL加入80wt％乙醇水溶液升温至60℃提取18h，醇提取液离心后得到上清液与水提后的上清液合并浓缩得到残余物，残余物加入乙醇稀释后，在0℃下静置1d，沉淀经离心后加水溶解，﹣30℃，10Pa冷冻干燥48h得到降糖效果好的南瓜提取物。 [0047] 对照例2 [0048] 一种降糖效果好的南瓜提取物的制备工艺，包括如下步骤： [0049] S1将新鲜南瓜600g去皮、除籽、去瓤、切块后干燥、粉碎、过100目筛，将得到的南瓜粉取150g按料液比1:18g/mL加入到水中，升温至80℃下提取4h，水提取液离心后得到上清液浓缩备用；残渣则按料液比1:1g/mL加入80wt％乙醇水溶液升温至60℃提取18h，醇提取液离心后得到上清液与水提后的上清液合并浓缩得到残余物，残余物加入乙醇稀释后，在0℃下静置1d，沉淀经离心后加水溶解，﹣30℃，10Pa冷冻干燥48h得到粗品多糖； [0050] S2将粗品多糖15g加水150mL溶解后经柱层析纯化后透析(Mw＜2000)3d后﹣30℃，10Pa冷冻干燥48h得到提纯后的提取物； [0051] S3将提纯后的提取物6g加入到60mL N,N‑二甲基甲酰胺中，再加入溴丙炔20g，降温至0℃后加入60wt％氢化钠分散液1.5g，升温至60℃下搅拌4h，加入1mol/L稀盐酸淬灭后，浓缩除去溶剂，残余物加入到大量乙醇中，有沉淀出现，过滤，滤渣经乙醇洗涤后再加水透析(Mw＜2000)3d后﹣30℃，10Pa冷冻干燥48h得到降糖效果好的南瓜提取物。 [0052] 对照例3 [0053] 一种降糖效果好的南瓜提取物的制备工艺，包括如下步骤： [0054] S1将新鲜南瓜600g去皮、除籽、去瓤、切块后干燥、粉碎、过100目筛，将得到的南瓜粉取150g按料液比1:18g/mL加入到水中，升温至80℃下提取4h，水提取液离心后得到上清液浓缩备用；残渣则按料液比1:1g/mL加入80wt％乙醇水溶液升温至60℃提取18h，醇提取液离心后得到上清液与水提后的上清液合并浓缩得到残余物，残余物加入乙醇稀释后，在0℃下静置1d，沉淀经离心后加水溶解，﹣30℃，10Pa冷冻干燥48h得到粗品多糖； [0055] S2将粗品多糖15g加水150mL溶解后经柱层析纯化后透析(Mw＜2000)3d后﹣30℃，10Pa冷冻干燥48h得到提纯后的提取物； [0056] S3将90mL吡啶经冰盐浴进行冷却后向其中滴加12mL三氯氧磷，滴加完毕后升至室温得到磷酸盐，将6g提纯后的提取物加入到60mL N,N‑二甲基甲酰胺中得到溶液A，将溶液A与磷酸盐混合后升温至35℃搅拌3h，降至室温后用1mol/L氢氧化钠水溶液调节pH至中性，再加入乙醇稀释，静置16h后离心，收集沉淀后加水溶解，并经水透析(Mw＜2000)3d后﹣30℃，10Pa冷冻干燥48h得到降糖效果好的南瓜提取物。 [0057] 测试例1 [0058] 小鼠(ICR小鼠，不分雌雄，雌性无孕，体重19～23g)适应性喂养3d后，进行造模，实验前禁食不禁水12h，腹腔注射四氧嘧啶生理盐水溶液200mg/kg，造模5d后，分别于造模时段向后推迟24h时小鼠尾尖消毒后取血，测量小鼠的血糖值，以小鼠血糖值采用均衡随机法随机分组，其中一组为阴性对照组，另外7组为南瓜多糖组，每组5只。试验组口服南瓜提取物溶液(150mg/kg)，阴性对照组则服用等体积的生理盐水溶液，其它操作同南瓜多糖组，空白对照组则正常饲养，不进行造模或注射。7h后测量小鼠血糖浓度，具体测试数据见表1.[0059] 表1南瓜提取物的降糖效果测试 [0060] [0061] 四氧嘧啶，是胰岛β细胞毒剂，通过产生超氧自由基破坏胰岛β细胞，使β细胞合成前胰岛素减少，导致胰岛素缺乏，四氧嘧啶腹腔注射5d后可以形成稳定的高血糖模型。从对照例1～2和实施例1的对比可以发现，通过对南瓜提取的多糖进行纯化、改性能够显著提升其降糖效果，这是由于纯化后多糖的浓度提高，因此所得到的提取物活性更高，因此降糖效果更好。而对照例3相比对照例1～2对南瓜粗提后纯化、改性得到衍生物，通过分子修饰改变了多糖的空间结构，由于多糖的降糖机制可能时来源于改善受损的胰岛细胞，使其恢复分泌胰岛素功能，从而使得血糖下降，因此在多糖结构中引入吸电子基时能够增强其抗氧化作用，从而达到更快修复损伤受损细胞的功效。而实施例1和对照例3相比，不仅引入了更多的强吸电子基还具有能够稳定自由基的基团，其结构上具有的芳杂环及苯环由于具有大偶极子、共轭双键以及孤对电子，因此是良好的电子供体能够很好地析出电子，这有助于稳定自由基，而膦酸酯基团则能够改变多糖的原始结构，从而激活多糖异构碳上的氢原子，因而达到了增强活性的目的。而实施例2～4相比，提取时的料液比、温度、时间不同，因此可能造成了得到的粗品中多糖的含量有差异，从而导致了最终提取物中多糖浓度的不同，表现出了降糖效果的差异。 [0062] 测试例2 [0063] 对对照例及实施例中的南瓜提取物进行体外抗氧化测试，包括羟基自由基以及超氧自由基清除能力测试。采用邻二氮菲‑金属铁离子‑H2O2体系，通过Fenton反应生成羟自由2+ 3+ 基，促使邻二氮菲‑Fe 被氧化为邻二氮菲‑Fe ，使其水溶液在波长510nm处最大吸收消失，来计算羟基自由基清除率。采用邻苯三酚自氧化法测定自氧化前后的吸光值，计算得到超氧自由基清除率。具体数据见表2. [0064] 表2南瓜提取物抗氧化性测试结果表 [0065] [0066] [0067] 羟自由基(·OH)是一种具有极强的氧化性的自由基，破坏能力很大，可以与生命体内的任何物质都发生反应，尤其是对脱氧核糖核酸(DNA)中的嘌呤以及嘧啶进行作用，从‑而引起细胞的死亡或者突变。超氧阴离子(O2·)是生命有机体中，存在的数量占大多数的一种自由基，它的危害没有羟自由基的严重。多数来自于生命有机体内发生的化学反应，而产生的一种中间产物，正常情况下能被机体所有的酶系统自然清除(比如超氧化物歧化酶SOD)。但是当生命体在生病的情况下，酶系统失衡，自由基堆积，就会对机体造成一定程度‑ 的危害。例如在酶的催化下，细胞内产生的O2 ·就可以发生歧化反应而生成非自由基(H2O2)，然后进一步产生羟自由基。正常情况下，细胞内部和线粒体基质中有完善抗氧化防御系统，保持活性氧在一个比较低的生理浓度。而糖尿病者体内自由基反应增强，活性氧(ROS)蓄积和清除不足所致的氧化应激是糖尿病及其并发症发生、发展的重要因素之一。因此，抗氧化性的高低也会极大地影响降糖效果。 [0068] 从体外抗氧化的测试可以看到，实施例所制备的南瓜提取物具有较好的抗氧化效果，这是由于多糖可以捕捉脂质过氧化链式反应中产生的活性氧，减少脂质过氧化反应链的长度，阻断或减缓脂质过氧化的进行。对于羟自由基而言，可快速地攫取多糖碳氢链上的氢原子结合成水，多糖的碳原子上则留下一个成单电子，成为碳自由基，进一步氧化形成过氧自由基，最后分解成对机体无害的产物；对于超氧阴离子自由基而言，多糖可与其发生氧化反应，达到清除的目的。实施例中的南瓜提取物都表现出较好的抗氧化性，相比对照例，实施例的抗氧化能力显然更好，这可能时由于对南瓜提取物进行了改性，引入了能够稳定自由基的官能团以及多个强吸电子基，通过稳定自由基能够防止自由基的连锁反应从而阻断或减缓氧化应激过程。而实施例2～4、对照例1～2相比实施例1，南瓜提取物的浓度相对较低因此抗氧化性受到影响。而对照例3中通过磷酸盐对其进行改性，虽然改变了结构，提升了活性，但是则不能起到实施例1中稳定自由基的目的因此抗氧化性不如实施例1。 [0069] 以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。