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一种结合肺炎支原体的单链DNA适配子及其应用
申请号	CN202410106510.0	申请日	2024-01-25	公开(公告)号	CN117904118A	公开(公告)日	2024-04-19
申请人	皖南医学院第二附属医院;			发明人	唐晓磊; 张林媛; 张华敏; 黄子煜;
摘要	本发明公开了一种结合肺炎支原体的单链DNA适配子及其应用，所述结合肺炎支原体的单链DNA适配子的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；本发明的结合肺炎支原体的单链DNA适配子能够与肺炎支原体进行特异性结合，进而能够阻断肺炎支原体与宿主细胞的结合，降低肺炎支原体粘附定植以及减缓对宿主细胞的损伤，因此，能够将结合肺炎支原体的单链DNA适配子用于制备治疗肺炎支原体感染的药物，为新型抗肺炎支原体药物的研发提供新方向；此外，本发明结合肺炎支原体的单链DNA适配子成本低廉、无毒副作用，免疫原性低，渗透性好，不会产生抗生素耐药压力，解决了现有技术中抗生素存在副作用的问题。
权利要求	1.一种结合肺炎支原体的单链DNA适配子，其特征在于，所述结合肺炎支原体的单链DNA适配子的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。 2.权利要求1所述的结合肺炎支原体的单链DNA适配子在制备治疗肺炎支原体感染药物中的应用。 3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药物剂型为雾化剂或喷剂。 4.一种用于治疗肺炎支原体感染的生物制剂，其特征在于，所述生物制剂包含治疗有效量的权利要求1所述的结合肺炎支原体的单链DNA适配子。 5.根据权利要求4所述的用于治疗肺炎支原体感染的生物制剂，其特征在于，所述生物制剂的剂型为雾化剂或喷剂。 6.根据权利要求4所述的用于治疗肺炎支原体感染的生物制剂，其特征在于，所述生物制剂还包含药学上可以接受的辅料。 7.根据权利要求4所述的用于治疗肺炎支原体感染的生物制剂，其特征在于，所述药学上可接受的辅料包括生理盐水。
说明书全文	一种结合肺炎支原体的单链DNA适配子及其应用技术领域 [0001] 本发明涉及生物制剂技术领域，具体涉及一种结合肺炎支原体的单链DNA适配子及其应用。背景技术 [0002] 肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,MP)是人类支原体肺炎的病原体。支原体肺炎的病理改变以间质性肺炎为主，有时并发支气管肺炎，称为原发性非典型性肺炎。主要经飞沫传染，潜伏期2～3周，发病率以青少年最高。临床症状较轻，甚至根本无症状，若有也只是头痛、咽痛、发热、咳嗽等一般的呼吸道症状，但也有个别死亡报道。一年四季均可发生，但多在秋冬时节。 [0003] 肺炎支原体是引发青少年急性呼吸道症状的常见病原体之一，并且其感染易于诱发多系统的损伤，目前尚无有效疫苗预防。分析MP感染侵袭过程可知，其能够通过其表面上的黏附素结构与宿主细胞发生特异性结合。这种黏附作用对于肺炎支原体感染过程中的初步侵袭至关重要。通过黏附素与宿主细胞受体之间的相互作用，肺炎支原体得以稳定定植并进一步侵入宿主细胞内部。同时，在感染过程中，肺炎支原体黏附素还可能参与调节免疫反应和引起组织损伤。黏附素可能激活机体免疫系统产生针对肺炎支原体的抗菌免疫反应过度激活时，该黏附素也可能导致机体自身组织遭受炎症损伤。 [0004] 目前临床治疗MP感染仍以抗生素类为主要手段，如大环内酯类，等。但是近年来其耐药率逐年增高，儿童感染者服用抗生素依从性较差，且毒副作用不容忽视。 [0005] 有鉴于此，特提出本发明。发明内容 [0006] 本发明的第一目的在于提供一种结合肺炎支原体的单链DNA适配子，该结合肺炎支原体的单链DNA适配子能够与肺炎支原体进行特异性结合，降低肺炎支原体粘附定植以及减缓对宿主细胞的损伤；此外，单链DNA适配子成本低廉、无毒副作用，免疫原性低，渗透性好，不会产生抗生素耐药压力。 [0007] 本发明的第二目的在于提供一种结合肺炎支原体的单链DNA适配子的应用，通过该单链DNA适配子与肺炎支原体进行特异性结合，进而能够阻断肺炎支原体与宿主细胞的结合，因此，能够将结合肺炎支原体的单链DNA适配子用于制备治疗肺炎支原体感染的药物，为新型抗肺炎支原体药物的研发提供新方向。 [0008] 为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案： [0009] 本发明第一方面提供了一种结合肺炎支原体的单链DNA适配子，所述结合肺炎支原体的单链DNA适配子的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。 [0010] 本发明通过SELEX技术筛选获得相应的核酸适配子，利用适配子的结构特异、效价稳定、低免疫原性等优势，该单链DNA适配子能够结合肺炎支原体，阻断肺炎支原体对宿主细胞的结合，降低肺炎支原体粘附定植以及减缓对宿主细胞的损伤，进而开发一种能够通过超声雾化吸入的核酸治疗型生物制剂，实现了广谱抗MP的功效。 [0011] 本发明第二方面提供了一种上述结合肺炎支原体的单链DNA适配子在制备治疗肺炎支原体感染药物中的应用。 [0012] 优选地，所述药物剂型为雾化剂或喷剂。 [0013] 本发明第三方面提供了一种用于治疗肺炎支原体感染的生物制剂，所述生物制剂包含治疗有效量的上述结合肺炎支原体的单链DNA适配子。 [0014] 优选地，所述生物制剂的剂型为雾化剂或喷剂。 [0015] 优选地，所述生物制剂还包含药学上可以接受的辅料。 [0016] 优选地，所述药学上可接受的辅料包括生理盐水。 [0017] 与现有技术相比，本发明的有益效果至少包括： [0018] 本发明的结合肺炎支原体的单链DNA适配子能够与肺炎支原体进行特异性结合，进而能够阻断肺炎支原体与宿主细胞的结合，降低肺炎支原体粘附定植以及减缓对宿主细胞的损伤，因此，能够将结合肺炎支原体的单链DNA适配子用于制备治疗肺炎支原体感染的药物，为新型抗肺炎支原体药物的研发提供新方向。 [0019] 本发明结合肺炎支原体的单链DNA适配子成本低廉、无毒副作用，免疫原性低，渗透性好，不会产生抗生素耐药压力，解决了现有技术中抗生素存在副作用的问题。附图说明 [0020] 为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。在所有附图中，类似的元件或部分一般由类似的附图标记标识。附图中，各元件或部分并不一定按照实际的比例绘制。 [0021] 图1为本发明实施例1中12轮筛选的结合力情况； [0022] 图2为本发明实施例1中30个单克隆适配子与肺炎支原体的相对结合力情况； [0023] 图3为本发明实施例1中不同适配子结构是否一致的验证结果； [0024] 图4为本发明实施例1中MP 1和MP2的模拟二级结构； [0025] 图5为本发明实施例1中MP 3和MP4的模拟二级结构； [0026] 图6为本发明实施例1中MP 5和MP6的模拟二级结构； [0027] 图7为本发明实施例1中ELONA法测定4种单克隆适配子结合力的测定结果； [0028] 图8为本发明实施例1中荧光显微镜观察结果； [0029] 图9为本发明实施例1中流式细胞术检测结果； [0030] 图10为本发明实施例2中第3组中采用的单克隆适配子为MP2的实验结果。具体实施方式 [0031] 下面将结合实施例对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。 [0032] 需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。 [0033] 目前临床治疗MP感染仍以抗生素类为主要手段，如大环内酯类，等。但是近年来其耐药率逐年增高，儿童感染者服用抗生素依从性较差，且毒副作用不容忽视。 [0034] 有鉴于此，本发明实施例提供了一种结合肺炎支原体的单链DNA适配子，所述结合肺炎支原体的单链DNA适配子的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；具体序列为AAGCTTGCTTATTCAATTACGAGGTTGGATTCGTACCCATGACCGTATTGC GCTACTACCTTCCTACCGTGAAGATAGTAAGTGGGATCC。 [0035] 本发明通过SELEX技术筛选获得相应的核酸适配子，利用适配子的结构特异、效价稳定、低免疫原性等优势，该单链DNA适配子能够结合肺炎支原体，阻断肺炎支原体对宿主细胞的结合，降低肺炎支原体粘附定植以及减缓对宿主细胞的损伤，进而开发一种能够通过超声雾化吸入的核酸治疗型生物制剂，实现了广谱抗MP的功效。 [0036] 单链DNA能够在缓冲液中折叠形成三维结构，以形成特定三维结构，其三维结构能够与靶标物质的三维结构吻合，并形成相对较强的结合力，从而模拟单克隆抗体，作为检测或治疗元件； [0037] 本发明实施例还提供了一种上述结合肺炎支原体的单链DNA适配子在制备治疗肺炎支原体感染药物中的应用。 [0038] 本发明的结合肺炎支原体的单链DNA适配子能够与肺炎支原体进行特异性结合，进而能够阻断肺炎支原体与宿主细胞的结合，降低肺炎支原体粘附定植以及减缓对宿主细胞的损伤，因此，能够将结合肺炎支原体的单链DNA适配子用于制备治疗肺炎支原体感染的药物，为新型抗肺炎支原体药物的研发提供新方向。 [0039] 在本发明中对药物剂型不作具体限定，本领域技术人员可以根据实际需要选择本领域的常规药物剂型；优选第，在一实施方式中，所述药物剂型可以为雾化剂，通过选择雾化剂，能够直接快速的通过呼吸使得药物进入肺部组织，能够避免胃肠道环境对有效物质的降解，进而提高药物的疗效且见效快；在另一实施方式中，所述药物剂型可以为喷剂。 [0040] 本发明在一实施例提供了一种用于治疗肺炎支原体感染的生物制剂，所述生物制剂包含治疗有效量的上述结合肺炎支原体的单链DNA适配子。 [0041] 在一实施方式中，所述生物制剂的剂型可以为雾化剂或喷剂。 [0042] 在一实施方式中，所述生物制剂还包含药学上可以接受的辅料。 [0043] 在本发明中，对药学上可接受的辅料不作具体限定，本领域技术人员可以根据药物剂型选择本领域的常规辅料，优选地，在一实施方式中，所述药学上可接受的辅料可以包括生理盐水。 [0044] 本发明结合肺炎支原体的单链DNA适配子成本低廉、无毒副作用，免疫原性低，渗透性好，不会产生抗生素耐药压力，解决了现有技术中抗生素存在副作用的问题。 [0045] 以下通过具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细说明。 [0046] 实施例1 [0047] 本实施例为结合肺炎支原体的单链DNA适配子的筛选； [0048] 1、文库的构建： [0049] 设计合成ssDNA适配子文库:5’‑AAGCTTGCTTATTCAATT‑N52(52个随机碱基)‑AGATAGTAAGTGGGATCC‑3’(88个碱基)；同时设计一对引物：P1:5’‑CCCAAGCTTGCTTATTCAATT‑3’(划线部分为Hind III酶切位点)；P2:5’‑CGCGGATCCCACTTACTATCT‑3’(划线部分为BamH I酶切位点)；以便后续能够通过酶切位点酶切后构建连接到酶切后的质粒pUC19中，有利于后续的检测和适配子的性能验证。 [0050] 2、采用cell‑SELEX技术，通过12轮筛选，十二轮文库筛选过程中采用的溶剂为(20mM HEPES(pH＝7.4),120mM NaCl，5mM KCl，1mM CaCl2，1mM MgCl2·6H2O)，第六轮后加入了呼吸道上皮细胞进行反筛，第一轮至第十二轮相对结合力如图1所示，由图1可知，从第1轮到第6轮，其相对结合力呈现逐渐升高的趋势；第7轮的结合力显著下降，后呈现快速升高趋势，第1轮至第12轮相对结合力与起始文库相比，差异均具有统计学意义； [0051] 3、图1中显示第11轮与第12轮文库相对结合力的比较显示，两者结合力的差异无统计学意义；因此，将第11轮文库扩增为双链并与pUC19质粒双酶切后重组导入DH5ɑ并经抗生素筛选，然后挑取30个单克隆菌落，进行PCR扩增；随后分析比较单克隆适配子与肺炎支原体的相对结合力，如图2所示，设定OD450nm值为1.4为阈值，高于该阈值的单克隆适配子分别编号为MP1～MP6。 [0052] 其中，MP1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，具体为：AAGCTTGCTTATTCAATTTTGACTAGGGCTCGTACCTTAGACCGTATTGCA TACCTACCTTAGACCGTGAAGATAGTAAGTGGGATCC； [0053] MP2的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，具体为：AAGCTTGCTTATTCAATTACGAGGTTGGATTCGTACCCATGACCGTATTGC GCTACTACCTTCCTACCGTGAAGATAGTAAGTGGGATCC； [0054] MP3的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，具体为：AAGCTTGCTTATTCAATTCGAATGTTGCGCATCGAACGGATCTTCGTATCG ATAGGACTACCTAGCTACCTTTAAGATAGTAAGTGGGATCC； [0055] MP4的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，具体为：AAGCTTGCTTATTCAATTCGAATGTATTCTATCGTAGGCACGAATTTATCG ACGGGTCTACCTAGCTACCTTTAAGATAGTAAGTGGGATCC； [0056] MP5的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，具体为：AAGCTTGCTTATTCAATTGCGTAACGTAGGCTATCTTAGACACGAGGTTAT ATCCGTTTCTGCCTAGCTACCTAAGATAGTAAGTGGGATCC； [0057] MP6的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示，具体为：AAGCTTGCTTATTCAATTCCCTATATGCTATCGTAGGCACGAGATGATCGA CTTCCTCTACCTAGCTACCTCTAAGATAGTAAGTGGGATCC。 [0058] 4、单克隆适配子性能鉴定 [0059] 将上述筛选得到的适配子两两配伍构建竞争型ELONA检测法，以验证其结合位点是否一致。结果显示MP1与MP3结合相似的位点，MP4与MP6结合相似的位点，如图3所示；通过软件模拟MP1、MP2、MP4、MP5的二级结构，模拟结果如图4～6所示，由图4～6可知，上述适配子均存在类似的茎环结构。 [0060] 5、单克隆适配子的结合力和特异性鉴定 [0061] 通过ELONA法测定上述4种单克隆适配子(MP1、MP2、MP4、MP5)的结合力，经拟合获得其解离常数Kd值，具体如图7所示； [0062] 通过荧光显微镜观察FAM标记的单克隆适配子(MP1、MP2、MP4和MP5的混合物，分别为10nM)与MP及其大肠杆菌(E.coli)和金黄色葡萄球菌(S.au)的结合，结果如图8所示； [0063] 由图8可知，单克隆适配子能且仅能识别并结合MP菌体，具有优异的特异性。 [0064] 采用流式细胞术鉴定单克隆适配子能够有效的结合，检测结果如图9所示，由图9可知，单克隆适配子能够有效的结合并阻碍MP粘附在A549细胞，且有一定的剂量依赖性。 [0065] 实施例2 [0066] 本实施例为小鼠动物实验： [0067] 选择结合力好MP2进行以下实验，小鼠感染模型构建：固体培养基培养MP ATCC 8 15531刮取菌落使用生理盐水调节麦氏浊度至0.1(约10 CFU/mL)，每只小鼠行上述MP菌液滴鼻100mL/次/天，连续4次结束后观察1周，精神状态欠佳，有耸毛现象，皮毛无光泽，食量减少，蜷缩、行动迟缓，呼吸加快，消瘦，进行肺支气管病理评分，鉴定MP造模成功与否进行下一步实验。 [0068] 实验分组如下：I)模型未处理组：模型组正常饲养；II)抗生素处理组：模型组正常饲养+阿奇霉素灌胃(按照25mg/kg剂量给药)；III)适配子治疗组：模型组正常饲养+筛选所得适配子滴鼻(按照100nM/100mL/只剂量给药)；IV)适配子溶剂处理组：模型组正常饲养+结合缓冲液(按照III)等体积剂量滴鼻)；V)抗生素溶剂处理组：模型组正常饲养+磷酸盐缓冲液灌胃。 [0069] 以上5组均每天正常饮食之外，II)～V)组给予不同处理1次/天，持续5天后空腹2天。随后脱颈处死，并分离肺，随后将肺部匀浆后取上清均匀涂布固体培养基，置于5％浓度CO2培养箱中培养1w，无菌棉签刮取菌落重悬于生理盐水中，比较麦氏浊度，比较结果如图10所示。 [0070] 图10为第III组中采用的单克隆适配子为MP2的实验结果。 [0071] 由图10可知： [0072] 本申请单克隆适配子均能够与肺炎支原体进行特异性结合，进而能够阻断肺炎支原体与宿主细胞的结合，降低肺炎支原体粘附定植以及减缓对宿主细胞的损伤，能够减少肺组织中肺炎支原体的含量，对肺炎支原体感染具有显著疗效，为新型抗肺炎支原体药物的研发提供新方向。 [0073] 最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。