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一种酪蛋白源XP-型DPP-Ⅳ抑制肽及其制备方法与应用
申请号	CN202410087705.5	申请日	2024-01-22	公开(公告)号	CN117904241A	公开(公告)日	2024-04-19
申请人	华南理工大学; 广东华肽生物科技有限公司;			发明人	赵谋明; 王晨阳; 郑淋; 赵翊君;
摘要	本发明提供了一种酪蛋白源XP型DPP‑Ⅳ抑制肽及其制备方法与应用。本发明通过蛋白酶分类方法评价蛋白酶对含Pro肽的酶切特异性对蛋白酶进行分类。应用本发明中蛋白酶分类方法，构建一种酪蛋白XP‑型DPP‑Ⅳ抑制肽的蛋白酶组合制备工艺。该蛋白酶组合是由XP‑型肽释放能力的蛋白酶组合而成。通过所述方法制备的酪蛋白肽XP‑型肽含量22～40％，DPP‑Ⅳ抑制活性IC50值0.4～0.6mg/mL。相比于传统的依据蛋白酶切位点组合，酶解液活性导向组合，随机内切酶和外切酶组合，本发明所述制备工艺获得酪蛋白肽具有更高的XP‑肽含量，DPP‑Ⅳ抑制活性。
权利要求	1.一种酪蛋白源XP‑型DPP‑Ⅳ抑制肽的制备方法，其特征在于包括如下步骤： (1)将酪蛋白加入水中混匀，调节pH，加入组合酶进行酶解； (2)酶解完成后，灭酶，离心，干燥得到酪蛋白源XP‑型DPP‑Ⅳ抑制肽。 2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述的组合酶为两种具有XP‑型肽释放能力的蛋白酶；所述的具有XP‑型肽释放能力的蛋白酶包括木瓜蛋白酶，菠萝蛋白酶，风味蛋白酶和氨肽酶A中的至少一种。 3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述的酶解的反应温度为40～70℃；步骤(1)所述的酶解的反应时间为2～24h。 4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述的酶解的反应温度为50℃；步骤(1)所述的酶解的反应时间为12h。 5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述的组合酶的添加量为溶液总质量的0.2～4％；步骤(1)所述的组合酶中两种蛋白酶的质量比为1～4：1～4。 6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述的酪蛋白与水的质量比为1：5～20；步骤(1)所述的调节pH为调节pH值至6～8；步骤(2)所述的灭酶的条件为100℃沸水浴5～20min；步骤(2)所述的离心的条件为7000～9000rpm离心5～20min；步骤(2)所述的干燥为冷冻干燥。 7.一种酪蛋白源XP‑型DPP‑Ⅳ抑制肽，通过权利要求1～6任一所述的制备方法制备得到。 8.权利要求7所述的酪蛋白源XP‑型DPP‑Ⅳ抑制肽在制备糖尿病治疗药物中的应用。 9.权利要求7所述的酪蛋白源XP‑型DPP‑Ⅳ抑制肽在制备肝脏/肾脏疾病的预防/治疗药物中的应用。 10.一种酪蛋白源XP‑型DPP‑Ⅳ抑制肽酶解过程中蛋白酶组合的选择方法，其特征在于包括如下步骤： (1)根据蛋白酶酶解酪蛋白产生的肽第二位是否含Pro，区分出XP‑型肽和非XP‑型肽； (2)使用步骤(1)筛选出的XP‑型肽，鉴定酶解产物中XP‑型肽峰面积，区分出具有XP‑型肽释放能力的酶和不具备XP‑型肽释放能力酶； (3)将两种具有XP‑型肽释放能力的酶组合对酪蛋白进行酶解，验证其酶解效果。
说明书全文	一种酪蛋白源XP‑型DPP‑Ⅳ抑制肽及其制备方法与应用技术领域 [0001] 本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种酪蛋白源XP‑型DPP‑Ⅳ抑制肽及其制备方法与应用。背景技术 [0002] 糖尿病的发病率逐年升高，已经成为第三位严重威胁人类健康的慢性病。临床药物常伴有体重增加、低血糖及胃肠道不良反应等副作用，且其长期服用安全性还有待进一步证实。因此，开发一种安全、有效、无副作用的降血糖产品，具有重要应用价值。 [0003] 食源性DPP‑Ⅳ抑制肽，具有安全，无副作用功能被广泛开发用于降血糖产品。现有文献报道高活性DPP‑Ⅳ抑制肽的结构序列主要为XP‑型2‑6肽。因此，Pro含量高的蛋白原料是DPP‑Ⅳ制备的主要原料，其中酪蛋白是制备食源性DPP‑Ⅳ抑制肽的最主要原料之一。 [0004] 现有技术中虽然公布了高含量支链氨基酸的酪蛋白源降糖肽的制备工艺。但是芳香族氨基酸、含巯基氨基酸和支链氨基酸不是DPP‑Ⅳ抑制肽的关键结构特征。很多含有芳香族氨基酸，含巯基氨基酸和支链氨基酸的肽并不具备DPP‑Ⅳ抑制效果。相反，XP‑型肽是DPP‑Ⅳ抑制肽的结构特征。但是，现阶段缺少酪蛋白源XP‑型DPP‑Ⅳ抑制肽的制备工艺。同时，当肽链中存在Pro时，将会导致蛋白酶酶解效率和特异性发生变化。例如，即使蛋白酶可以特异性切割芳香族氨基酸，但是当肽链中存在Pro时，肽链中的芳香族氨基酸也不一定会被识别和切割。为了弥补上述方法的不足，需要提供一种特定的蛋白酶分类方法，按照蛋白酶对含有Pro肽的酶切位点的特异性进行评价和分类。基于新的蛋白酶分类方法，构建更高效酪蛋白源XP‑型DPP‑Ⅳ抑制肽的制备工艺。发明内容 [0005] 本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种酪蛋白源XP‑型DPP‑Ⅳ抑制肽的制备方法。 [0006] 本发明的另一目的在于，提供上述制备方法制备得到的酪蛋白源XP‑型DPP‑Ⅳ抑制肽。 [0007] 本发明的再一目的在于，提供上述酪蛋白源XP‑型DPP‑Ⅳ抑制肽的应用。 [0008] 本发明的目的通过下述技术方案实现： [0009] 一种酪蛋白源XP‑型DPP‑Ⅳ抑制肽的制备方法，包括如下步骤： [0010] (1)将酪蛋白加入水中混匀，调节pH，加入组合酶进行酶解； [0011] (2)酶解完成后，灭酶，离心，干燥得到酪蛋白源XP‑型DPP‑Ⅳ抑制肽。 [0012] 步骤(1)所述的酪蛋白与水的质量比为1：5～20；优选为1：10。 [0013] 步骤(1)所述的调节pH为调节pH值至6～8；优选为调节pH值至7。 [0014] 步骤(1)所述的组合酶为两种具有XP‑型肽释放能力的蛋白酶。 [0015] 上述的具有XP‑型肽释放能力的蛋白酶包括但不限制于木瓜蛋白酶，菠萝蛋白酶，风味蛋白酶和氨肽酶A。 [0016] 步骤(1)所述的酶解的反应温度为40～70℃；优选为50℃。 [0017] 步骤(1)所述的酶解的反应时间为2～24h；优选为12h。 [0018] 步骤(1)所述的组合酶的添加量为溶液总质量的0.2～4％；优选为1％。 [0019] 步骤(1)所述的组合酶中两种蛋白酶的质量比为1～4：1～4。 [0020] 步骤(2)所述的灭酶的条件为100℃沸水浴5～20min。 [0021] 步骤(2)所述的离心的条件为7000～9000rpm离心5～20min；优选为8000rpm离心10min。 [0022] 步骤(2)所述的干燥为冷冻干燥。 [0023] 一种酪蛋白源XP‑型DPP‑Ⅳ抑制肽，通过上述方法制备得到。 [0024] 上述酪蛋白源XP‑型DPP‑Ⅳ抑制肽在制备糖尿病治疗药物中的应用。 [0025] 上述酪蛋白源XP‑型DPP‑Ⅳ抑制肽在制备肝脏/肾脏疾病的预防/治疗药物中的应用。 [0026] 一种酪蛋白源XP‑型DPP‑Ⅳ抑制肽酶解过程中蛋白酶组合的选择方法，包括如下步骤： [0027] (1)根据蛋白酶酶解酪蛋白产生的肽第二位是否含Pro，区分出XP‑型肽和非XP‑型肽； [0028] (2)使用步骤(1)筛选出的XP‑型肽，鉴定酶解产物中XP‑型肽峰面积，区分出具有XP‑型肽释放能力的酶和不具备XP‑型肽释放能力酶； [0029] (3)将两种具有XP‑型肽释放能力的酶组合对酪蛋白进行酶解，验证其酶解效果。 [0030] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果： [0031] (1)本发明提供的一种蛋白酶的分类方法可以提供蛋白酶对含Pro肽的酶切特异性； [0032] (2)本发明提供的一种酪蛋白DPP‑Ⅳ抑制肽的制备工艺的应用，可以准确，快速的构建酪蛋白XP‑型DPP‑Ⅳ抑制肽的制备工艺； [0033] (3)相比于传统的制备工艺：通过酶切位点和活性导向筛选复配的蛋白组合，根据本发明提供的蛋白酶组合制备的酪蛋白源XP‑型肽含量更高，DPP‑Ⅳ抑制活性更高。附图说明 [0034] 图1是7种常见蛋白酶DPP‑Ⅳ抑制活性对比图； [0035] 图2是7种常见蛋白酶酶切位点对比图； [0036] 图3是7种常见蛋白酶XP‑型肽释放能力对比图； [0037] 图4是实施例和对比例XP‑型肽含量和DPP‑Ⅳ抑制活性对比图； [0038] 图5是实施例1的体内降糖和肝脏肾脏保护效果。具体实施方式 [0039] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。 [0040] 下面实施方案中若未注明具体试验条件，则通常按照常规试验条件或按照试剂公司所建议的试验条件。所使用的材料、试剂等，若无特殊说明，均为从商业途径得到的试剂和材料。 [0041] 根据蛋白酶的不同性质进行分类筛选 [0042] 1、按照酶解DPP‑Ⅳ抑制活性分类 [0043] 将3g酪蛋白粉末分散在30ml去离子水中。将混合物的pH和温度调整到每种酶的最佳条件。采用7种常用商业蛋白酶水解，分别是复合蛋白酶(诺维信，商品名为Protamex 1.6)、木瓜蛋白酶(庞博)、中性蛋白酶(诺维信)、Alcalase2.4L(诺维信)、菠萝蛋白酶(诺维信)、风味蛋白酶(诺维信，商品名为Flavourzyme 500MG)、氨肽酶A(ProtexA，华肽生物科技有限公司)。酶底物比为0.5％(w/w)，水解时间为12h。水解结束后，将混合物煮沸15min，然后用冰水浴冷却，在4℃下8000rpm离心10min。收集上清液，冷冻干燥。评价7种蛋白酶制备酶解液的DPP‑Ⅳ抑制能力。如图1所示，不同蛋白酶制备的酶解液DPP‑Ⅳ抑制能力不同。其中氨肽酶A制备的酪蛋白酶解液DPP‑Ⅳ抑制活性最高。 [0044] 2、按照酶切位点特异性分类 [0045] 统计酪蛋白序列中XP‑型肽N端切割时P1和P1’位点出现氨基酸频率。鉴定上述制备的7种蛋白酶解液的多肽组成。多肽鉴定在超高效液相色谱质谱联用系统上进行，该系统由ACQUITY UPLC系统和Impact II四极杆飞行时间质谱仪组成。多肽鉴定和定量的质谱参数为：雾化器压力，1.5bar；干燥气流量:8l/min；干燥气体温度，200℃。色谱柱为Waters ACQUITY UPLC HSS T3柱(2.1mm×100mm,1.8μm, )。以0.1％甲酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B。肽分离使用以下梯度洗脱：0～10min，5～40％ B；10～12min,40～90％ B；12～14min,90％ B；14～15min,90～5％ B；15～18min,5％ B，流速0.2mL/min。使用Mascot 软件或Compass Data Analysis 4.4软件对数据进行分析。长度大于6的肽段用Mascot软件收集，长度在2到6之间的肽段用Compass Data Analysis4.4软件收集。分析7种蛋白酶酶切位点，并统计这些蛋白酶在P1和P1’位氨基酸出现频率。如图2所示，在P1'位点，氨肽酶A可切割氨基酸与XP‑型肽释放所需断裂的氨基酸匹配性最高。在P1位点，复合蛋白酶可切割氨基酸与XP‑型肽释放所需断裂的氨基酸匹配性最高。 [0046] 3、按照含Pro肽酶切特异性分类 [0047] 鉴定上述制备的7种蛋白酶解液的多肽组成。多肽的峰面积采用Compass Data Analysis 4.4软件收集。并分析7种蛋白酶解液中不同含XP‑肽的峰面积。如图3所述，木瓜蛋白酶，菠萝蛋白酶，氨肽酶A和风味蛋白酶具有XP‑肽释放能力。 [0048] 实施例1 [0049] 一种依据蛋白酶XP‑型肽释放能力构建的酪蛋白肽的制备方法，包括如下步骤： [0050] (1)将酪蛋白加入水中，酪蛋白与水的质量比为1：10，混合均匀，得到酪蛋白溶液； [0051] (2)调节步骤(1)所述酪蛋白溶液的pH值为7.0； [0052] (3)在步骤(2)的酪蛋白溶液中加入总含量酶底比1％蛋白酶组合，然后进行酶解反应，酶解温度：50℃，酶解时间：12h； [0053] (4)步骤(3)所述蛋白酶组合的选择具有XP‑型肽释放能力的两种蛋白酶； [0054] (5)步骤(3)所述蛋白酶组合的选择一种具有XP‑型肽切割能力的氨肽酶A和另一种具有XP‑型肽切割能力的木瓜蛋白酶； [0055] (6)步骤(3)所述蛋白酶组合木瓜蛋白酶和氨肽酶A的质量比为1:1； [0056] (7)将步骤(3)酶解结束后的溶液，在100℃沸水浴10min灭酶，得到酶解液； [0057] (8)将步骤(5)所述酶解液8000rpm，离心10min，静置，获取上清液； [0058] (9)将步骤(6)所述上清液，冷冻干燥，得到酪蛋白源XP‑型DPP‑Ⅳ抑制肽。 [0059] 实施例2 [0060] 按照实施例1制备酪蛋白肽，与实施例1的区别仅在于：步骤(2)的酪蛋白溶液中加入总含量酶底比0.2％蛋白酶组合，然后进行酶解反应，酶解温度：45℃，酶解时间：24h；步骤(6)中木瓜蛋白酶和氨肽酶A质量比为4:1； [0061] 实施例3 [0062] 按照实施例1制备酪蛋白肽，与实施例1的区别仅在于：步骤(2)的酪蛋白溶液中加入总含量酶底比4％蛋白酶组合，然后进行酶解反应，酶解温度：65℃，酶解时间：2h；步骤(6)中木瓜蛋白酶和氨肽酶A质量比为1:4。 [0063] 实施例4 [0064] 按照实施例1制备酪蛋白肽，与实施例1的区别仅在于：步骤(3)的蛋白酶组合为木瓜蛋白酶和风味蛋白酶，然后进行酶解反应。 [0065] 实施例5 [0066] 按照实施例1制备酪蛋白肽，与实施例1的区别仅在于：步骤(3)的蛋白酶组合为风味蛋白酶和氨肽酶A，然后进行酶解反应。 [0067] 实施例6 [0068] 按照实施例1制备酪蛋白肽，与实施例1的区别仅在于：步骤(3)的蛋白酶组合为菠萝蛋白酶和氨肽酶A，然后进行酶解反应。 [0069] 对比例1 [0070] 按照实施例1制备酪蛋白肽，与实施例1的区别仅在于：步骤(3)中使用蛋白酶组合：氨肽酶A和氨肽酶A。图1中制备酶解物DPP‑Ⅳ抑制活性最好的蛋白酶为氨肽酶A。因此，依据DPP‑Ⅳ活性导向选择蛋白酶组合为：氨肽酶A和氨肽酶A。 [0071] 对比例2 [0072] 按照实施例1制备酪蛋白肽，与实施例1的区别仅在于：步骤(3)中使用蛋白酶组合为：氨肽酶A和复合蛋白酶。根据图2，蛋白酶解位点分析，氨肽酶A具有最高P1为酶切特异性，复合蛋白酶具有最高P1’酶切特异性。因此，依据酶切位点特异性，选择蛋白酶组合为：氨肽酶A和复合蛋白酶。 [0073] 对比例3 [0074] 按照实施例1制备酪蛋白肽，与实施例1的区别仅在于：步骤(3)中使用蛋白酶组合：Alcalase和中性蛋白酶。 [0075] 对比例4 [0076] 按照实施例1制备酪蛋白肽，与实施例1的区别仅在于：步骤(3)中使用蛋白酶组合为：氨肽酶A和Alcalase。 [0077] 对比例5 [0078] 按照实施例1制备酪蛋白肽，与实施例1的区别仅在于：步骤(3)中使用蛋白酶组合为：风味蛋白酶和Alcalase。 [0079] 效果验证例1 [0080] 多肽鉴定和定量在超高效液相色谱质谱联用系统上进行，该系统由ACQUITY UPLC系统和Impact II四极杆飞行时间质谱仪组成。多肽鉴定和定量的质谱参数为：雾化器压力，1.5bar；干燥气流量:8l/min；干燥气体温度，200℃。色谱柱为Waters ACQUITY UPLC HSS T3柱(2.1mm×100mm,1.8μm, )。以0.1％甲酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B。肽分离使用以下梯度洗脱：0～10min，5～40％ B；10～12min,40～90％ B；12～14min,90％ B；14～15min,90～5％B；15～18min,5％B，流速0.2mL/min。使用Mascot软件或Compass Data Analysis 4.4软件对数据进行分析。长度大于6的肽段用Mascot软件收集，长度在2到 6之间的肽段用Compass Data Analysis 4.4软件收集。多肽的峰面积采用Compass Data Analysis 4.4软件收集。 [0081] 实验结果：如图4中a所示，实施例相比与对比例具有更高的XP‑型肽的相对峰面积，说明实施例1～6比对比例1～5含有更多的XP‑型肽。 [0082] 效果验证例2 [0083] DPP‑Ⅳ抑制活性测定如下：配制反应溶液及样品溶液，0.5mM底物(Gly‑Pro‑pNA，甘氨酰‑脯氨酰‑对硝基苯胺对甲苯磺酸盐)反应液、12.5mU/mL DPP‑IV反应液、pH 8.0的Tris‑HCl缓冲液，Tris‑HCl缓冲液用于稀释样品溶液；接着在96孔酶标板中，加入样品溶液与底物，混合后在37℃下孵育10min，然后加入上述DPP‑IV酶液，混匀后在37℃下精确孵育120min，期间每隔2min测一次405nm下的吸光值；根据下列公式计算待测样品的DPP‑IV抑制率，样品浓度均保持3mg/mL；选取两个时间点T1和T2，其吸光值在线性范围内变化，计算斜率△A/min；斜率Slope＝(A2‑A1)/(T2‑T1)；DPP‑IV抑制率(％)＝(Slope对照组‑Slope样品组)*100/Slope对照组；IC50值表示在抑制率为50％时，样品的浓度。 [0084] 实验结果：如图4中b所示，实施例相比与对比例具有更低的DPP‑Ⅳ抑制活性IC50值，表示实施例1～6比对比例1～5的DPP‑Ⅳ抑制活性更强。 [0085] 效果验证例3 [0086] 雄性C57BL/BSK‑db/db(体重:41±2g)和C57BL/BSK‑db/m(体重:23±2g)小鼠(6～8周龄，购于中广东耀康生物医药科技有限公司)，适应性饲养一周。将db/db小鼠随机分为3组(每组8只):DC组(db/db对照组，以生理盐水处理)；CH‑L(低剂量肽处理组:100mg/(kg d))；CH‑H(高剂量肽处理组:600mg/(kg d))；NC组(以db/m小鼠8只为正常对照，生理盐水处理)，其中低剂量肽和高剂量肽组使用的肽为实施例1制备得到的酪蛋白源XP‑型DPP‑Ⅳ抑制肽。灌胃间隔1周使用血糖测定空腹血糖。第四周后将小鼠解剖，收集血浆，并测定血浆中谷草转氨酶,谷丙转氨酶,肌酐和尿素氮的含量 [0087] 实验结果如图5所示，结果表明实施例1制备得到的酪蛋白源XP‑型DPP‑Ⅳ抑制肽具有体内降糖效果。同时糖尿病小鼠相对于正常小鼠的增加了血液中谷草转氨酶,谷丙转氨酶,肌酐和尿素氮的含量，表明肝脏和肾脏损伤。而实施例1显著降低了糖尿病鼠血液中谷草转氨酶,谷丙转氨酶,肌酐和尿素氮的含量，说明实施例1还具有肝脏和肾脏保护的效果。 [0088] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。