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一种通过电荷修饰增强药物靶向生物分子凝聚体的方法
申请号	CN202311720617.6	申请日	2023-12-14	公开(公告)号	CN117907290A	公开(公告)日	2024-04-19
申请人	中国科学院深圳先进技术研究院;			发明人	黄良宇; 杨晴晴;
摘要	本发明公开了一种通过电荷修饰增强药物靶向生物分子凝聚体的方法，包括如下步骤：(1)确定与疾病有关的目标生物分子在体外或细胞内所形成的或者所富集的凝聚体的静电势范围；(2)对已知靶点药物进行电荷修饰，其中已知靶点药物为对步骤(1)中所述疾病具有预防和/或治疗效果的药物，修饰后的已知靶点药物与所述凝聚体具有相反净电荷，电荷修饰后的已知靶点药物即可增强已知靶点药物的靶向性。本发明基于目标生物分子凝聚体的电势电位，对已知靶点药物进行电荷修饰，通过添加拥有与目标生物分子凝聚体反向净电荷的官能团或者氨基酸，增强已知靶点药物的靶向性，从而提升药物的治疗效果。
权利要求	1.一种通过电荷修饰增强药物靶向生物分子凝聚体的方法，其特征在于，包括如下步骤： (1)确定与疾病有关的目标生物分子在体外或细胞内所形成的或者所富集的凝聚体的静电势范围； (2)对已知靶点药物进行电荷修饰，其中已知靶点药物为对步骤(1)中所述疾病具有预防和/或治疗效果的药物，电荷修饰后的已知靶点药物与所述凝聚体具有相反净电荷，电荷修饰后的已知靶点药物即可增强已知靶点药物的靶向性。 2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述已知靶点药物为小分子化合物或多肽，通过官能团或氨基酸残基对已知靶点药物进行电荷修饰；所述官能团包括带正电荷和带负电荷的官能团；所述氨基酸残基包括带正电荷和带负电荷的氨基酸残基。 3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，通过官能团对小分子化合物进行电荷修饰；通过氨基酸残基对多肽进行电荷修饰。 4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述带正电荷的官能团选自烷基胺、季铵盐、吡咯烷、哌啶、胍盐和芳基重氮盐中的一种或多种；所述带负电荷的官能团选自羧酸盐、磷酸盐和磺酸盐中的一种或多种；所述带正电荷的氨基酸残基选自精氨酸和/或赖氨酸；所述带负电荷的氨基酸残基选自天冬氨酸和/或谷氨酸。 5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述目标生物分子为目标蛋白。 6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述目标蛋白在细胞内所形成的或者所富集的凝聚体的静电势范围的确定方法包括步骤：1)构建表达目标蛋白与荧光蛋白mCherry的融合蛋白的第一表达载体；2)构建分别表达带有不同净电荷荧光蛋白的第二表达载体； 3)将第一表达载体分别与每一个第二表达载体共转染至细胞中；3)根据细胞内相分离体系中的荧光强度，以及凝聚体外的荧光强度分布，计算带有不同净电荷荧光蛋白的分配系数，分配系数为凝聚体内外的荧光强度比值，根据分配系数来确定凝聚体是否持有正的或者负的静电势，当目标蛋白在细胞内所形成的或者所富集的凝聚体内第二表达载体表达的荧光强度低于凝聚体外时，所形成的或者所富集的凝聚体与第二表达载体表达的荧光蛋白带有同性电荷。 7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括对电荷修饰后的已知靶点药物进行筛选，靶向性高且与已知靶点药物具有相同功能的电荷修饰后的已知靶点药物，即为目标药物。 8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述筛选方法为：将带有荧光标记或自身带有荧光的电荷修饰后的已知靶点药物作用于生物分子凝聚体，检测相分离体系中的荧光强度，以及凝聚体外的荧光强度分布，计算电荷修饰后的已知靶点药物的分配系数，分配系数为凝聚体内外的荧光强度比值，分配系数与靶向性成正比关系，分配系数数值越高，电荷修饰后的已知靶点药物的靶向性越高。 9.权利要求6‑8任一项所述方法得到的电荷修饰后的已知靶点药物。
说明书全文	一种通过电荷修饰增强药物靶向生物分子凝聚体的方法技术领域 [0001] 本发明属于药物筛选技术领域，具体涉及一种通过电荷修饰增强药物靶向生物分子凝聚体的方法。背景技术 [0002] 生物大分子如蛋白质的液相分离现象在组织细胞的分子分布、功能调控、细胞信号传导和疾病发展中起着重要的作用。神经退行性疾病例如阿尔茨海默病、帕金森病等，以及某些类型的癌症例如淋巴瘤、多发性骨髓瘤等，通常都与蛋白质异常聚集并且形成不溶的淀粉样沉积物有关。研究表明，蛋白质的相分离过程失调有可能会促进其液态到固态的转变，从而加速蛋白质的沉积。因此，研发药物靶向由相分离介导形成的生物分子凝聚体，将有望干预目标蛋白的聚集过程并延缓疾病的发展，是具有巨大潜力的崭新治疗策略。 [0003] 以往人们简单地认为小分子药物进入细胞中会均匀地分布。然而，在2020年RichardA.Young团队将抗肿瘤药物的药效差异性与生物大分子相分离机制联系起来，提出生物分子凝聚体对小分子药物的选择性分配和浓缩有助于药物发挥作用，同时细胞还可以通过改变凝聚体的特性从而发展出对药物的耐药性。在另一项Christian Betzel团队的研究报导中，小分子苏拉明通过静电作用有效地将Tau蛋白:RNA凝聚体溶解为Tau 单体，并且可以干扰细胞内Tau凝聚体的形成和稳定性。这两项研究所给予的启发是，我们有可能可以通过小分子药物的化学修饰增强其对目标凝聚体的靶向性，从而提升药物的作用。 [0004] 增强小分子药物对特定生物分子凝聚体的靶向性，将有助于提升药物的作用。至今领域里的研究方法都还是根据筛药的理念，从化合物库里去寻找对目标凝聚体靶向性有所改善或者可以改变其凝聚相特性的分子。然而，静电作用在生物分子凝聚体的靶向性质所扮演的重要角色还未被发掘。发明内容 [0005] 为了解决现有技术中的不足，本发明旨在提供一种通过电荷修饰增强药物靶向生物分子凝聚体的方法。 [0006] 具体技术方案如下： [0007] 本发明提供一种通过电荷修饰增强药物靶向生物分子凝聚体的方法，包括如下步骤： [0008] (1)确定与疾病有关的目标生物分子在体外或细胞内所形成的或者所富集的凝聚体的静电势范围； [0009] (2)对已知靶点药物进行电荷修饰，其中已知靶点药物为对步骤(1)中所述疾病具有预防和/或治疗效果的药物，电荷修饰后的已知靶点药物与所述凝聚体具有相反净电荷，电荷修饰后的已知靶点药物即可增强已知靶点药物的靶向性。 [0010] 进一步地，所述已知靶点药物为小分子化合物或多肽，通过官能团或氨基酸残基对已知靶点药物进行电荷修饰； [0011] 所述官能团包括带正电荷和带负电荷的官能团； [0012] 所述氨基酸残基包括带正电荷和带负电荷的氨基酸残基。 [0013] 进一步地，通过官能团对小分子化合物进行电荷修饰；通过氨基酸残基对多肽进行电荷修饰。 [0014] 进一步地，所述带正电荷的官能团选自烷基胺、季铵盐、吡咯烷、哌啶、胍盐和芳基重氮盐中的一种或多种； [0015] 所述带负电荷的官能团选自羧酸盐、磷酸盐和磺酸盐中的一种或多种； [0016] 所述带正电荷的氨基酸残基选自精氨酸和/或赖氨酸； [0017] 所述带负电荷的氨基酸残基选自天冬氨酸和/或谷氨酸。 [0018] 进一步地，所述目标生物分子为目标蛋白。 [0019] 进一步地，所述目标蛋白在细胞内所形成的或者所富集的凝聚体的静电势范围的确定方法包括步骤：1)构建表达目标蛋白与荧光蛋白mCherry的融合蛋白的第一表达载体；2)构建分别表达带有不同净电荷荧光蛋白的第二表达载体；3)将第一表达载体分别与每一个第二表达载体共转染至细胞中；3)根据细胞内相分离体系中的荧光强度，以及凝聚体外的荧光强度分布，计算带有不同净电荷荧光蛋白的分配系数，分配系数为凝聚体内外的荧光强度比值，根据分配系数来确定凝聚体是否持有正的或者负的静电势。 [0020] 优选地，当目标蛋白在细胞内所形成的或者所富集的凝聚体内第二表达载体表达的荧光强度低于凝聚体外时，所形成的或者所富集的凝聚体与第二表达载体表达的荧光蛋白带有同性电荷，且凝聚体外第二表达载体表达的荧光强度越强，则凝聚体所带静电势越正或越负。 [0021] 进一步地，所述方法还包括对电荷修饰后的已知靶点药物进行筛选，靶向性高且与已知靶点药物具有相同功能的电荷修饰后的已知靶点药物，即为目标药物。 [0022] 进一步地，所述筛选方法为：将带有荧光标记或自身带有荧光的电荷修饰后的已知靶点药物作用于生物分子凝聚体，检测相分离体系中的荧光强度，以及凝聚体外的荧光强度分布，计算电荷修饰后的已知靶点药物的分配系数，分配系数为凝聚体内外的荧光强度比值，分配系数与靶向性成正比关系，分配系数数值越高，电荷修饰后的已知靶点药物的靶向性越高。 [0023] 本发明还提供所述方法得到的电荷修饰后的已知靶点药物。 [0024] 本发明的有益效果为： [0025] 本发明基于目标生物分子凝聚体的电势电位，对已知靶点药物进行电荷修饰，通过添加拥有与目标生物分子凝聚体反向净电荷的官能团或者氨基酸，增强已知靶点药物的靶向性，从而提升药物的治疗效果。本发明方案直接对已知药物进行化学修饰，添加拥有对应反向净电荷的官能团或者氨基酸，再从中筛选出靶向性最高的候选药物分子，本发明方案能够在很大程度上缩小优化药物靶向的搜索区域，继而降低药物研发的成本，提高发现新药的成功率。附图说明 [0026] 图1‑a)分子A、分子B和分子C的分子结构式； [0027] 图1‑b)在α‑突触核蛋白的体外相分离体系中的荧光共聚焦成像，图内白色迹线表示在凝聚体外的荧光强度分布； [0028] 图1‑c)分子A、分子B和分子C在体外相分离体系中的分配系数，括号里为平均值； [0029] 图2‑A实施例2中αSyn‑mCherry表达载体和mEGFP(‑8)表达载体共转染SH‑SY5Y细胞后的荧光图； [0030] 图2‑B实施例2中αSyn‑mCherry表达载体和mNeonGreen(‑1)表达载体共转染SH‑SY5Y细胞后的荧光图； [0031] 图3本发明所列举的官能团结构式。具体实施方式 [0032] 为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例及附图进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。实施例中，各原始试剂材料均可商购获得，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照仪器制造商所建议的条件。 [0033] 实施例1 [0034] 申请人发现α‑突触核蛋白在体外与细胞内所形成的凝聚体均具有较高的静电势，从而调控生物大分子以及化学小分子的空间分配。实施例1以α‑突触核蛋白的体外相分离实验为例，详细说明通过电荷修饰增强药物对目标蛋白所形成的凝聚体的靶向性。具体步骤如下： [0035] (1)通过一般文献记载的α‑突触核蛋白在大肠杆菌的过表达与纯化方法，获得冻干后α‑突触核蛋白，将冻干后蛋白样品溶于缓冲液(25mM HEPES,150mM NaCl,pH 7.4)，再加入20％(w/v)的PEG8000，在室温下、蛋白最终浓度高于400μM的情况下，蛋白发生相分离，α‑突触核蛋白的体外相分离体系中形成α‑突触核蛋白凝聚体。通过测量zetapotential确定α‑突触核蛋白在体外所形成的凝聚体的静电势范围。经测量，体外所形成的α‑突触核蛋白凝聚体持有负静电势。 [0036] (2)选取自身带有荧光的有机小分子通过化学修饰对其进行改性，分别得到在pH 7.4生理条件下带有不同净电荷的分子A(‑2)、分子B(‑1)和分子C(+1)，分子A、分子B和分子C的结构式如图1‑a)所示。 [0037] (3)将分子A(‑2)、分子B(‑1)和分子C(+1)加入步骤(1)制备的持有负静电势的α‑突触核蛋白凝聚体中，检测分子A、分子B和分子C在α‑突触核蛋白的体外相分离体系中的荧光强度，以及凝聚体外的荧光强度分布，计算分子A、分子B和分子C的分配系数。分配系数为凝聚体内外的荧光强度比值。分配系数与分子靶向性成正比关系，也就是数值越高靶向性越好。 [0038] 分子A、分子B和分子C在α‑突触核蛋白的体外相分离体系中的荧光强度，以及凝聚体外的荧光强度分布如图1‑b)所示。计算得到的分子A、分子B和分子C在体外相分离体系中的分配系数如图1‑c)所示。 [0039] 由图1‑c)结果可知，三者的分配系数有明显差异，并随着正电荷的增多呈指数级增大。由此证明了本发明通过对药物进行反向的电荷修饰，从而增强其靶向目标凝聚体的方法和原理具有可行性。 [0040] 实施例2 [0041] 本实施例中申请人在人源神经母细胞瘤细胞(SH‑SY5Y)细胞体系中表达α‑突触核蛋白，通过同时表达带有不同净电荷的荧光蛋白，验证了α‑突触核蛋白在细胞内所形成的凝聚体均具有较高的负静电势。具体步骤如下： [0042] (1)SH‑SY5Y细胞培养及分化。37℃下在5％二氧化碳温育箱中，在含有10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素的DMEM培养基中培养SH‑SY5Y细胞。在细胞汇合度达到80‑90％后，使用移液管去除培养基，用PBS涉涤一次。将胰蛋白酶‑EDTA(0.05％)加入到培养中，并将其在37℃细胞温育箱中温育2分钟。加入两倍体积的培养基以停止消化，并轻吹细胞以将细胞悬浮成均匀的细胞悬浮液。将细胞颗粒重悬于DMEM培养基(10％胎牛血清，1％青霉素/链霉素)中，并铺在细胞悬浮液加入4孔板中(ibidi GmbH)。24小时后，将培养基切换为含有10μM全反式维甲酸(EC23)的DMEM/F12(5％FBS)，促进分化并诱导神经元表型。3天后，将培养基切换为含有50ng/mL脑源性神经营养因子(BDNF)的神经基础培养基。之后，每2‑3天更换一次培养基。 [0043] (2)SH‑SY5Y细胞的转染。在本实施例中，第一表达载体为在α‑突触核蛋白的C端接上了荧光蛋白mCherry的pcDNA3.1+表达载体；第二表达载体为荧光蛋白mEGFP‑stop的pcDNA3.1+表达载体以及第二表达载体为荧光蛋白mNeonGreen‑stop的pcDNA3.1+表达载体。在pH 7.4生理条件下，荧光蛋白mEGFP和mNeonGreen带有不同净电荷，分别为(‑8)和(‑1)。将各自的DNA构建体克隆到含有CMV启动子的pcDNA3.1(+)载体中，获得相应质粒。使用TM Lipo6000 溶液加入DNA中，充分混合，再加入培养的SH‑SY5Y细胞中，培养48小时后采集数据。 [0044] (3)在SH‑SY5Y细胞中，将αSyn‑mCherry分别和带有不同净电荷荧光蛋白mEGFP(‑8)与mNeonGreen(‑1)共转染，均可以观察到的大量αSyn液滴的形成。在本实施例中，αSyn‑mCherry液滴与荧光蛋白mNeonGreen共定位。但在共转染的mEGFP细胞中观察到大量空腔，αSyn‑mCherry液滴内mEGFP的荧光强度明显低于液滴外，表明αSyn‑mCherry液滴对mEGFP有较强的排斥作用，即说明αSyn‑mCherry凝聚物内存在负静电势(图2)。根据带有不同负电荷的mEGFP(‑8)与mNeonGreen(‑1)在α‑突触核蛋白的细胞内相分离体系中的荧光强度，以及凝聚体外的荧光强度分布，计算荧光蛋白的分配系数(r)。分配系数为凝聚体内外的荧光强度比值。rmNeonGreen/rmEGFP比值越大，说明凝聚体所带静电势越负。 [0045] 因此，根据上述观察结果，在SH‑SY5Y细胞模型中，α‑突触核蛋白在细胞内富集形成带负静电势的凝聚体。 [0046] 显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。