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能够通过提高HIF-1α水平来调节身体氧合的乳酸菌的种、菌株和组合物
申请号	CN202280060998.7	申请日	2022-06-17	公开(公告)号	CN117915934A	公开(公告)日	2024-04-19
申请人	C·德西蒙;			发明人	C·德西蒙;
摘要	本发明涉及乳酸菌的特定物种、菌株和组合物，所述乳酸菌能够提高缺氧诱导因子HIF‑1α的细胞水平以用于在缺氧诱导性病状中维持或增强常氧，所述缺氧诱导性病状例如体力活动、嗜睡、慢性疲劳、缺氧、超越地球大气层的极限的运动模式、眼球的氧化应激和水肺潜水，或者用于治疗缺氧诱导性病状中的缺氧，如神经退行性疾病、与呼吸衰竭相关的肺部影响、新生儿缺氧‑缺血、心肌缺血、代谢紊乱、慢性心脏病和肾病，生殖病症，如先兆子痫和子宫内膜异位症，体位性和运动性震颤加重以及脑缺氧。
权利要求	1.一种嗜酸乳杆菌，其能够正向调节与细胞耗氧量减少相关的缺氧诱导因子HIF‑1α的细胞水平，所述嗜酸乳杆菌用于治疗缺氧诱导性病状，例如体力活动、嗜睡、慢性疲劳、缺氧、超越地球大气层的极限的运动模式、眼球的氧化应激和水肺潜水，或者用于治疗缺氧诱导性病状中的缺氧，如神经退行性疾病、与呼吸衰竭相关的肺部影响、新生儿缺氧‑缺血、心肌缺血、代谢紊乱、慢性心脏病和肾病，生殖病症，如先兆子痫和子宫内膜异位症，体位性和运动性震颤加重以及脑缺氧。 2.根据权利要求1所述的嗜酸乳杆菌，其中嗜酸乳杆菌是由申请人根据《布达佩斯条约(Budapest Treaty)》于2020年9月1日保藏于75724巴黎企业特投15博士大街25号的巴斯德研究所的国家微生物培养物保藏中心(the Collection Nationalede Cultures de Microorganismes,Institut Pasteur,25rue du Docteur Roux,75724Paris Cedex 15)并且登录号为CNCM I‑5567的嗜酸乳杆菌菌株。 3.一种组合物，其包含根据权利要求1或2所述的嗜酸乳杆菌以及任选地一种或多种药学上可接受的赋形剂。 4.根据权利要求3所述的组合物，其进一步包含嗜热链球菌和/或动物双歧杆菌乳酸亚种。 5.根据权利要求4所述的组合物，其中嗜热链球菌是由申请人根据《布达佩斯条约》于 2020年9月1日保藏于75724巴黎企业特投15博士大街25号的巴斯德研究所的国家微生物培养物保藏中心并且登录号为CNCM I‑5570的嗜热链球菌菌株，并且动物双歧杆菌乳酸亚种是由申请人根据《布达佩斯条约》于2020年9月1日保藏于75724巴黎企业特投15博士大街25号的巴斯德研究所的国家微生物培养物保藏中心并且登录号为CNCM I‑5571的动物双歧杆菌乳酸亚种菌株，和/或由申请人根据《布达佩斯条约》于2020年9月1日保藏于75724巴黎企业特投15博士大街25号的巴斯德研究所的国家微生物培养物保藏中心并且登录号为CNCM I‑5572的动物双歧杆菌乳酸亚种菌株。 6.根据权利要求4或5所述的组合物，根据所述组合物的重量，其包含按重量计30％至 50％的嗜酸乳杆菌、按重量计25％至35％的嗜热链球菌和按重量计25％至35％的动物双歧杆菌乳酸亚种。 7.根据权利要求3至6中任一项所述的组合物，其进一步包含短发酵乳杆菌(以前称为短乳杆菌)、植物乳植杆菌植物亚种(以前称为植物乳杆菌)、副干酪乳酪杆菌副干酪亚种(以前称为副干酪乳杆菌副干酪亚种)和瑞士乳杆菌。 8.根据权利要求7所述的组合物，其中短发酵乳杆菌是由申请人根据《布达佩斯条约》于2020年9月1日保藏于75724巴黎企业特投15博士大街25号的巴斯德研究所的国家微生物培养物保藏中心并且登录号为CNCM I‑5566的短发酵乳杆菌菌株，植物乳植杆菌植物亚种是由申请人根据《布达佩斯条约》于2020年9月1日保藏于75724巴黎企业特投15博士大街25号的巴斯德研究所的国家微生物培养物保藏中心并且登录号为CNCM I‑5569的植物乳植杆菌植物亚种的菌株，副干酪乳酪杆菌副干酪亚种是由申请人根据《布达佩斯条约》于2020年 9月1日保藏于75724巴黎企业特投15博士大街25号的巴斯德研究所的国家微生物培养物保藏中心并且登录号为CNCM I‑5568的副干酪乳酪杆菌副干酪亚种的菌株，并且瑞士乳杆菌是由申请人根据《布达佩斯条约》于2020年9月1日保藏于75724巴黎企业特投15博士大街25号的巴斯德研究所的国家微生物培养物保藏中心并且登录号为CNCM I‑5573的瑞士乳杆菌菌株。 9.根据权利要求7或8所述的组合物，基于所述组合物的重量，其包含按重量计30％至 50％的嗜酸乳杆菌、按重量计1％至10％的嗜热链球菌、按重量计1％至20％的动物双歧杆菌乳酸亚种、按重量计1％至10％的短发酵乳杆菌(以前称为短乳杆菌)、按重量计1％至 10％的植物乳植杆菌植物亚种(以前称为植物乳杆菌)、按重量计1％至10％的副干酪乳酪杆菌副干酪亚种(以前称为副干酪乳杆菌副干酪亚种)和按重量计1％至10％的瑞士乳杆菌。 10.根据权利要求3至9中任一项所述的组合物，其适于如以粉末、胶囊、颗粒剂或喷雾剂的形式口服施用。 11.根据权利要求10所述的组合物，其具有高浓度的细菌，在成人中达到至少100亿并且在婴儿中达到至少1亿的程度。 12.根据权利要求10所述的组合物，其适于施用于在缺氧条件下饲养和/或维持的动物。 13.根据前述权利要求中任一项所述的益生菌或组合物，其中供使用的所述细菌是活的、非活的、超声处理的、间歇灭菌的或冻干的。 14.一种用于鉴定嗜酸乳杆菌的方法，所述嗜酸乳杆菌能够正向调节与细胞耗氧量减少相关的缺氧诱导因子HIF‑1α的细胞水平，所述方法包括以下步骤：在存在和不存在用对待评估的所述嗜酸乳杆菌菌株具有特异性的细菌裂解物预处理至少24个小时的情况下，通过蛋白质印迹技术评估适于对靶组织进行适当生理学表示的体外细胞模型中的HIF‑1α的细胞水平；以及在存在和不存在用对待评估的所述嗜酸乳杆菌菌株具有特异性的细菌裂解物预处理至少24个小时的情况下，根据制造商的说明或等效技术使用Seahorse XFe96分析仪(安捷伦公司(Agilent))在相同的细胞模型中评估细胞外酸化率(ECAR)、耗氧率(OCR)和相对糖酵解率(ECAR/OCR比率)。
说明书全文	能够通过提高HIF‑1α水平来调节身体氧合的乳酸菌的种、菌株和组合物技术领域 [0001] 本发明涉及乳酸菌的特定种、菌株和组合物，所述乳酸菌能够提高缺氧诱导因子HIF‑1α的细胞水平以用于在缺氧诱导性病状中维持或增强常氧，所述缺氧诱导性病状例如体力活动、嗜睡、慢性疲劳、缺氧、超越地球大气层的极限的运动模式、眼球的氧化应激和水肺潜水，或者用于治疗缺氧诱导性病状中的缺氧，如神经退行性疾病、与呼吸衰竭相关的肺部影响、新生儿缺氧‑缺血、心肌缺血、代谢紊乱、慢性心脏病和肾病，生殖病症，如先兆子痫和子宫内膜异位症，体位性和运动性震颤加重以及脑缺氧。背景技术 [0002] 氧气(O2)是一种用作有氧生物体细胞代谢和能量产生的关键底物的必需的营养物质。在各种生理和病理状态下，生物体经历有限/不足的O2可用性，所述情况被称为缺氧。 [0003] O2不足在活细胞中产生显著的应激。这种情况与自由基的不适当积聚有关，自由基会对细胞的蛋白质组分以及其所含的遗传物质造成另外的应激。为了应对缺氧应激情况，细胞激活一系列适应性应答以使O2供应与代谢、生物能量和氧化还原需求相匹配。具体地，其使细胞周期暂时地停滞，减少能量消耗，并且分泌存活因子和促血管生成因子。肠粘膜接收总心输出量的10％至35％，并且在正常条件下，胃肠道的所估计的表面积为约250‑2 300m (Lundquist等人，2016)。肠道的特征在于由不同因素组合产生的独特的氧合曲线，包括由于食物摄入导致的血液灌注中的巨大波动(Matheson等人,2000)。到达肠道的血液量的变化极大地影响了剩余身体区域可获得的O2量。因此，肠道在确定生物体可获得的总O2的分配方面发挥关键作用。 [0004] 在小肠中，由于消化、分泌和吸收过程，增加的氧气可用性通过具有高能量需求的高增殖性干细胞和分化的有丝分裂后细胞维持高能量消耗(Rangel‑Huerta等人，2017；Van Der Schoor等人，2002)。小肠中氧合和耗氧量的特性使得能够假设其调节可能对身体整体可获得的O2的再分配产生重大影响。在基础生理条件下，肠粘膜上皮细胞受到相对低的O2水平的影响，其先前描述为“生理缺氧”(Karhausen等人，2005)。在这种情况下，肠上皮细胞不断适应(Shepherd，1982；Albenberg等人，2014)。 [0005] 缺氧诱导因子(HIF)构成了肠上皮适应其O2不足微环境的关键介体(Ramakrishnan等人，2016)。这些介体负责通过抑制丙酮酸向乙酰CoA转化，抑制线粒体生物发生并激活线粒体自噬来减少线粒体中的耗氧量(Goda和Kanai，2012)。使用PHD抑制剂产生的证据支持了与HIF相关的细胞耗氧量的减少以及随后的氧气在细胞周围微环境中的再分配(Susser等人，2020)。HIF是由两个分别称为α和β的亚基构成的异二聚体，其中第二个亚基由真核细胞组成性地表达。HIF‑α亚基属于基本转录因子的螺旋‑环‑螺旋Per‑Arnt‑Sim(bHLH‑PAS)家族(Schito等人，2016)。脊椎动物具有三个亚基α：HIF‑1α、HIF‑2α和HIF‑3α。这些亚基的N末端区域包括DNA结合和异二聚化所需的结构域(Wu等人，2015)。HIF‑α亚基具有高度保守的氧依赖性降解(ODD)结构域。ODD结构域包括HIF‑1α和HIF‑2α两者中的两种羟基化脯氨酸(Chan等人，2005)。HIF‑α的羟基化导致蛋白酶体降解。HIF‑α亚基通过属于脯氨酰羟化酶结构域(PHD)酶组的特异性酶PHD1(EGLN2)、PHD2(EGLN1)和PHD3(EGLN3)进行羟基化，所述酶代表细胞中的主要氧传感器。在常氧条件下，PHD使用O2以ODD中存在的脯氨酸水平对HIF‑α亚基进行羟基化。羟基化允许希佩尔‑林道抑癌蛋白(Von Hippel‑Lindau oncosuppressor protein，VHL)的结合，其作为E3泛素连接酶，能够降解HIF‑α(Ivan等人， 2001)。在低氧可用性的条件下，PHD酶无法对HIF‑α进行羟基化，所述PHD酶是通过与HIF‑β亚基的异二聚化来稳定的(Wang等人，1995)。所生成的异二聚体能够与存在于靶基因的启动子内的遗传元件(被称为HIF应答元件(HRE))结合。由于此类结合，靶基因的表达允许细胞对缺氧条件产生适应性应答(Toescu等人，2004；Wiener等人，1996)。尽管HIF‑1α和HIF‑2α密切相关，并且能够激活HRE依赖性表达，但这两个亚基的反式激活结构域不同，意味着其具有不同的基因靶标。具体地，科学证据表明，HIF‑1α优先诱导糖酵解途径，并且因此适应在O2缺乏时的能量产生(Hu等人，2003)。与HIF活性相关的缺氧适应涉及细胞代谢中的许多变化。其中最主要的是通过将能量产生从线粒体氧化磷酸化转移到厌氧糖酵解来减少耗氧量。在肠环境中，对HIF的调控受到与细胞代谢和微生物作用两者相关的多种因素的影响(Singhal等人，2020)。 [0006] 在存在各种各样的病理病状(急性和慢性)的情况下，经常观察到缺氧条件。缺氧相关病理学包括新生儿缺氧‑缺血、心肌缺血、代谢紊乱、慢性心脏病和肾病，生殖病症，如先兆子痫和子宫内膜异位症，体位性和运动性震颤加重，脑缺氧以及神经退行性疾病(Chen等人，2020；Legros等人，2010；Nalivaeva等人，2019；Merelli等人，2020)。缺氧在肺表面呼吸功能丧失引起的病理病状中具有相关重要性。在这种情况下，应强调由新型大流行冠状病毒Sars‑CoV‑2感染引起的急性呼吸窘迫的病状(Gibson等人，2020；Ramírez等人，2020)。另外，缺氧条件与长期停留在低O2可用性条件下的生理病状和病理表现的改变的发作密切相关。在这种情况下，有必要强调与在高海拔处进行的活动相关的肺部、神经和肌肉损伤。与针对益生菌微生物的科学文献中的报告相比(Esfandiary等人，2016；Deepak等人，2015； Chen等人，2020；Han等人，2020)，申请人惊讶地发现，口服施用嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、或嗜酸乳杆菌和嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)和/或动物双歧杆菌乳酸亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)，优选地添加短发酵乳杆菌(Levilactobacillus brevis)(以前称为短乳杆菌(Lactobacillus brevis))、植物乳植杆菌植物亚种(以前称为植物乳杆菌)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、副干酪乳酪杆菌副干酪亚种(Lacticaseibacillus paracasei subsp.paracasei)(以前称为副干酪乳杆菌副干酪亚种(Lactobacillus paracasei subsp.paracasei))能够增加HIF‑1α的表达/稳定，并且乳酸菌的特定物种、菌株和组合物因此能够在缺氧诱导性病状中维持或增强常氧，所述缺氧诱导性病状例如体力活动、嗜睡、慢性疲劳、缺氧、超越地球大气层的极限的运动模式、眼球的氧化应激和水肺潜水，或者用于治疗涉及缺氧的病状中的缺氧，如神经退行性疾病、与呼吸衰竭相关的肺部影响、新生儿缺氧‑缺血、心肌缺血、代谢紊乱、慢性心脏病和肾病，生殖病症，如先兆子痫和子宫内膜异位症，体位性和运动性震颤加重以及脑缺氧。发明内容 [0007] 本发明的目的是一种嗜酸乳杆菌(其能够正向调节与细胞耗氧量减少相关的缺氧诱导因子HIF‑1α的细胞水平，所述嗜酸乳杆菌用于治疗缺氧诱导性病状，例如体力活动、嗜睡、慢性疲劳、缺氧、超越地球大气层的极限的运动模式、眼球的氧化应激和水肺潜水，或者用于治疗涉及缺氧的病状中的缺氧，如神经退行性疾病、与呼吸衰竭相关的肺部影响、新生儿缺氧‑缺血、心肌缺血、代谢紊乱、慢性心脏病和肾病，生殖病症，如先兆子痫和子宫内膜异位症，体位性和运动性震颤加重以及脑缺氧。 [0008] 根据本发明的一方面，上文所提及的嗜酸乳杆菌是由申请人根据《布达佩斯条约(Budapest Treaty)》于2020年9月1日保藏于75724巴黎企业特投15博士大街25号的巴斯德研究所的国家微生物培养物保藏中心(the Collection Nationalede Cultures de Microorganismes,Institut Pasteur,25rue du Docteur Roux,75724Paris Cedex 15)并且登录号为CNCM I‑5567的嗜酸乳杆菌菌株。 [0009] 本发明的另外的目的是一种组合物，所述组合物包含前述的嗜酸乳杆菌以及任选地一种或多种药学上可接受的赋形剂。 [0010] 根据本发明的一方面，所述组合物进一步包含嗜热链球菌和/或动物双歧杆菌乳酸亚种。 [0011] 根据本发明的另外的方面，嗜热链球菌是由申请人根据《布达佩斯条约》于2020年9月1日保藏于75724巴黎企业特投15博士大街25号的巴斯德研究所的国家微生物培养物保藏中心并且登录号为CNCM I‑5570的嗜热链球菌菌株，并且动物双歧杆菌乳酸亚种是由申请人根据《布达佩斯条约》于2020年9月1日保藏于75724巴黎企业特投15博士大街25号的巴斯德研究所的国家微生物培养物保藏中心并且登录号为CNCM I‑5571的动物双歧杆菌乳酸亚种菌株，和/或由申请人(Richidente)根据《布达佩斯条约》于2020年9月1日保藏于75724巴黎企业特投15博士大街25号的巴斯德研究所的国家微生物培养物保藏中心并且登录号为CNCM I‑5572的动物双歧杆菌乳酸亚种菌株。 [0012] 根据本发明的另外的方面，根据所述组合物的重量，其包含按重量计30％至50％的嗜酸乳杆菌、按重量计25％至35％的嗜热链球菌和按重量计25％至35％的动物双歧杆菌乳酸亚种。 [0013] 根据另外的方面，所述组合物可以另外地包含短发酵乳杆菌(Levilactobacillus brevis)(以前称为短乳杆菌(Lactobacillus brevis))、植物乳植杆菌植物亚种(以前称为植物乳杆菌)、副干酪乳酪杆菌副干酪亚种(Lacticaseibacillus paracasei subsp.paracasei)(以前称为副干酪乳杆菌副干酪亚种(Lactobacillus paracasei subsp.paracasei))和瑞士乳杆菌。 [0014] 根据另外的方面，所述短发酵乳杆菌菌株是由申请人根据《布达佩斯条约》于2020年9月1日保藏于75724巴黎企业特投15博士大街25号的巴斯德研究所的国家微生物培养物保藏中心并且登录号为CNCM I‑5566的短发酵乳杆菌菌株，植物乳植杆菌植物亚种是由申请人根据《布达佩斯条约》于2020年9月1日保藏于75724巴黎企业特投15博士大街25号的巴斯德研究所的国家微生物培养物保藏中心并且登录号为CNCM I‑5569的植物乳植杆菌植物亚种的菌株，副干酪乳酪杆菌副干酪亚种是由申请人根据《布达佩斯条约》于2020年9月1日保藏于75724巴黎企业特投15博士大街25号的巴斯德研究所的国家微生物培养物保藏中心并且登录号为CNCM I‑5568的副干酪乳酪杆菌副干酪亚种的菌株，并且瑞士乳杆菌是由申请人根据《布达佩斯条约》于2020年9月1日保藏于75724巴黎企业特投15博士大街25号的巴斯德研究所的国家微生物培养物保藏中心并且登录号为CNCM I‑5573的瑞士乳杆菌菌株。 [0015] 根据另外的方面，根据所述组合物的重量，所述组合物包含按重量计30％至50％的嗜酸乳杆菌、按重量计1％至10％的嗜热链球菌、按重量计1％至20％的动物双歧杆菌乳酸亚种、按重量计1％至10％的短发酵乳杆菌(以前称为短乳杆菌)、按重量计1％至10％的植物乳植杆菌植物亚种(以前称为植物乳杆菌)、按重量计1％至10％的副干酪乳酪杆菌副干酪亚种((以前称为副干酪乳杆菌副干酪亚种)和按重量计1％至10％的瑞士乳杆菌。 [0016] 根据另外的方面，根据本发明所述的组合物适于如以粉末、胶囊或颗粒剂的形式口服施用。所述组合物优选地具有高浓度的细菌，在成人中达到至少100亿并且在婴儿中达到至少1亿的程度。 [0017] 根据另外的方面，根据本发明的所述组合物适于如以粉末、胶囊、颗粒剂或喷雾剂的形式口服施用于在缺氧条件下饲养和/或维持的动物，例如在位于海平面以上相关高度的农场中。 [0018] 供使用的益生菌可以是活的、非活的、超声处理的、间歇灭菌(tindalized)的或冻干的。 [0019] 最后，本发明涉及一种用于鉴定嗜酸乳杆菌的方法，所述嗜酸乳杆菌能够正向调节与细胞耗氧量的减少相关的缺氧诱导因子HIF‑1α的细胞水平，所述方法包括以下步骤： [0020] 在存在和不存在用对待评估的所述嗜酸乳杆菌菌株具有特异性的细菌裂解物处理24个小时的情况下，通过蛋白质印迹技术评估适于对靶组织进行适当生理学表示的体外细胞模型中的HIF‑1α的细胞水平；以及 [0021] 在存在和不存在用对待评估的所述嗜酸乳杆菌菌株具有特异性的细菌裂解物处理24个小时的情况下，根据制造商的说明或等效技术使用Seahorse XFe96分析仪(安捷伦公司(Agilent))在相同的细胞模型中评估细胞外酸化率(ECAR)、耗氧率(OCR)和相对糖酵解率(ECAR/OCR比率)。附图说明 [0022] 图1示出了在常氧和缺氧条件下用益生菌菌株处理对HIF‑1α水平的影响。在常氧和缺氧条件下在分化的Caco‑2细胞上对HIF‑1α进行6天的蛋白质印迹，温育24天：在a)存在或b)不存在菌株短发酵乳杆菌CNCM I‑5566、嗜酸乳杆菌CNCM I‑5567、植物乳植杆菌植物亚种CNCM I‑5569、瑞士乳杆菌CNCM I‑5573、副干酪乳酪杆菌副干酪亚种CNCM I‑5568、动物双歧杆菌乳酸亚种CNCM I‑5571和嗜热链球菌CNCM I‑5570(100μg/ml)的细菌裂解物的可溶性部分的情况下；在存在(c)或不存在(d)除了上文列出的那些之外还包括细菌菌株动物双歧杆菌乳酸亚种CNCM I‑5572的益生菌菌株的特定组合的情况下。在密度测定分析之后，将所获得的值相对于β肌动蛋白归一化。示出的数据表示为重复实验的平均值±SD。通过单向方差分析(ANOVA)，随后进行邓尼特检验(Dunnet's test)，对数据进行比较。p<* *** 0.05，p<0.01， p<0.001。图中还示出了显示HIF‑1α和β肌动蛋白的定量的代表性免疫印迹。 [0023] 图2示出了用来自益生菌菌株混合物的细菌裂解物处理Caco‑2细胞对(a)L‑乳酸水平、(b)细胞外酸化率(ECAR)、(c)耗氧率(OCR)和(d)ECAR/OCR比率的影响。用或不用细菌裂解物(100μg/ml)处理Caco‑2细胞24小时。通过比色测定分析乳酸水平。通过Seahorse XF细胞外流动分析仪获得ECAR值和OCR值。数值表示为三个独立实验的平均值±SEM，一式三份地进行。为了在两个平均值之间进行比较，使用了未配对数据的斯图登氏t检验* *(Student's t test)。(p<0.05；p<0.01)。 [0024] 图3示出了用上述益生菌菌株的混合物处理对野生型(wt)小鼠和用作阿尔茨海默氏病(Alzheimer's disease)小鼠模型的3xTg‑AD小鼠的脑匀浆中的HIF‑1α水平的影响。对8周龄时以及处理开始后16周和48周后处死的豚鼠的脑提取物进行分析。在密度测定分析之后，将所获得的值相对于甘油醛‑3‑磷酸脱氢酶(GAPD)归一化。示出的数据表示为三个实验的平均值±SD，一式两份地进行。通过单向方差分析(ANOVA)，随后进行邦费罗尼检验 (Bonferroni's test)，对数据进行比较。p<0,05。图中还示出了显示HIF‑1α和GAPD的定量的代表性免疫印迹。 [0025] 图4示出了在实践耐力运动的受试者中，服用特定益生菌制剂对(a)耗氧量、(b)运动最后5分钟的平均心率和(c)血液乳酸水平的影响。示出的数据表示为一式三份实验的平均值±SD。在没有益生菌摄入的情况下进行的试验与服用特定口服细菌疗法之后进行的试验的组之间的统计显著性通过配对数据的斯图登氏t检验确定。：p≤0.05。 [0026] 图5示出了展示从常规实验室分析中获得的所考虑的血液参数值分布的箱线图。如果存在的话，在每个时间点报告MTD与MTD+BO组之间的统计显著性，以及每个组随时间推 * 移的统计显著性。：p≤0.05；：p≤0.001；：p≤0.0001。具体实施方式 [0027] 体外研究 [0028] HIF‑1α表示调控氧气稳态并优先诱导糖酵解途径的关键介体，并且因此适应在O2缺乏时的能量产生，这通过将能量代谢转移到所述途径来减少耗氧量(Hu等人,2003)。 [0029] 发明人对肠衍生的细胞模型进行了体外测定，以评估单独或组合的特定细菌菌株在调节与细胞耗氧量的减少相关的HIF‑1α积聚方面的能力。所获得的结果表明，在常氧条件下，与未经处理的对照相比，Caco‑2细胞暴露于以下的细菌裂解物与细胞内HIF‑1α水平的显著增加相关：短发酵乳杆菌CNCM I‑5566、嗜酸乳杆菌CNCM I‑5567、植物乳杆菌CNCM I‑5569、瑞士乳杆菌CNCM I‑5573、副干酪乳杆菌CNCM I‑5568、乳酸双歧杆菌CNCM I‑5571和嗜热链球菌CNCM I‑5570(图1a)。嗜热链球菌CNCM I‑5570、乳酸双歧杆菌CNCM I‑5571和嗜酸乳杆菌CNCM I‑5567是最有效的(嗜酸乳杆菌CNCM I‑5567使水平增加约2.2倍，并且嗜热链球菌CNCM I‑5570和乳酸双歧杆菌CNCM I‑5571使水平增加约2倍)。在缺氧条件下，与未经处理的细胞相比，菌株没有诱导显著变化，嗜酸乳杆菌CNCM I‑5567除外，与对照相比，其添加导致了HIF‑1α水平显著增加(图1b)。将Caco‑2细胞暴露于在50和100μg/ml浓度下的组合的细菌提取物与在常氧和缺氧条件下HIF‑1α在细胞积聚中的显著增加相关(图2a和b)。值得注意的是，在常氧条件下，针对在100μg/ml浓度下的组合的细菌裂解物记录的HIF‑1α积聚水平与针对与单独嗜酸乳杆菌CNCM菌株I‑5567有关的裂解物在相同浓度下确定的水平相当。在缺氧条件下，已经达到50μg/ml的浓度，与益生菌菌株的组合有关的细菌裂解物诱导了HIF‑1α的细胞积聚，这类似于在更高浓度下针对单独嗜酸乳杆菌菌株CNCM I‑ 5567记录的细胞积聚。考虑到嗜酸乳杆菌菌株CNCM I‑5567在数量上表示了益生菌组合内存在的细菌的少数部分，观察到的结果表明，所测试的特定益生菌菌株的组合使用的特征在于在诱导HIF‑1α的细胞积聚方面具有协同效应。 [0030] 研究了裂解的细菌菌株对细胞能量代谢和细胞耗氧量的影响。为此，在培养基内评估了作为糖酵解途径的关健代谢物的L‑乳酸的水平；培养物的作为反映糖酵解的参数的细胞外酸化率(ECAR)；以及用于确定氧化磷酸化的耗氧率(OCR)。将Caco‑2细胞系暴露于总细菌裂解物24小时的结果表明，与未经处理的对照相比，存在显著更低的OCR值，证明细胞耗氧量的减少(图2c)。相比之下，将细胞系暴露于细菌裂解物与乳酸水平、ECAR值和ECAR/OCR比率的显著增加相关，从而证明糖酵解增加(图2a、2b和2d)。 [0031] 结论 [0032] 以肠水平条件调用的氧合血液的量影响了肠外身体区域(包括如脑、心脏、肾和肝等必需器官)中的O2的可用性。 [0033] 在肠中，氧稳态在很大程度上取决于HIF。益生菌微生物有可能调节HIF并影响由其调控的过程。属于菌种副干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、卷曲乳杆菌(L.crispatus)、鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)和长双歧杆菌(B.longum)的菌株能够在体外抑制HIF‑1α在各种细胞模型中的表达(Han等人，2020；Esfandiary等人，2016；Deepak等人，2015；Chen等人，2020)。与文献中的报告相反，发明人的结果令人惊讶地显示，所测试的益生菌微生物能够正向调节HIF‑1α的积聚。这种对比效应在HIF‑1α的调控反映了不同分子机制的参与的这一事实中找到解释。另外，益生菌产生的有益作用取决于宿主细胞的特定生理状态(McFarland等人，2018)。由所测试的细菌物种诱导的HIF‑1α的积聚增加与肠细胞中耗氧量的显著减少和厌氧代谢的诱导相关，这使其能够在这种气体稀缺的条件下存活。由所测试的细菌诱导的节氧可以调节肠中此类气体的消耗。所述身体区域未消耗的O2量可能会被其它必需器官和组织利用。 [0034] 材料和方法 [0035] 细胞培养和处理 [0036] 将人结肠腺癌细胞系(Caco‑2)在包含10％(v/v)胎牛血清、1％非必需氨基酸、1mM丙酮酸钠、2mM谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100μg/ml 链霉素的DMEM(杜氏改良伊氏培养基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium))培养基中培养，并在37℃下在具有5％ CO2的湿4 2 润气氛中孵育。在达到80％汇合度后，将细胞分离并以6x 10个细胞/cm的浓度平板接种在 6个多孔板中。通过光学显微镜监测细胞生长。为了评估关于细胞外酸化率和耗氧率的细胞HIF‑1α水平，将在汇合后14天时分化的细胞用或不用指定浓度的益生菌预处理30分钟，并且然后在标准培养条件下的常氧下(约21％ O2)或在使用“缺氧温育室”(1％O2)的缺氧条件下孵育24个小时。 [0037] 细菌裂解物的可溶性部分的制备 [0038] 细菌裂解物的可溶性部分制备如下：将每个样品洗涤三次(在4℃下以8,600x g持续20分钟)，并重悬于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。将细菌悬浮液超声处理30分钟，交替超声处理10秒并暂停10秒，并在4℃下以17.949x g离心20分钟。将上清液通过0.22μm 过滤器过滤，以去除任何剩余的完整细菌，并确定蛋白质浓度。对于单独细菌菌株的测试，细菌裂解物的可溶性部分的浓度确定为100μg/ml。分别以总细菌裂解物可溶性部分的10、50和100μg/ml的递增浓度进行关于益生菌菌株组合的测定。用于评估菌株组合的作用所进行的测定是对益生菌制剂执行的，其中化合物中的每个单独菌株的细菌细胞占总细菌细胞的百分比如下：35.46％短发酵乳杆菌CNCM I‑5566、1.42％嗜酸乳杆菌CNCM I‑5567、5.32％植物乳杆菌CNCM I‑5569、0.71％瑞士乳杆菌CNCM I‑5573、2.13％副干酪乳杆菌CNCM I‑5568、17.73％乳酸双歧杆菌CNCM I‑5571、1.77％乳酸双歧杆菌CNCM I‑5572和35.46％的嗜热链球菌CNCM I‑5570。如此制备的样品冷冻在‑80℃下，直至使用。未经处理的细胞被视为对照。 [0039] 蛋白质印迹 [0040] 通过蛋白质印迹评估HIF‑1α的表达。在冰上使用包括蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液裂解细胞30分钟。在细胞裂解之后，将样品在4℃的温度下以17,949x g离心20分钟。回收上清液并进行总蛋白测定。将样品缓冲液和巯基乙醇添加到等同于25g蛋白质的上清液体积中，并将样品煮沸5分钟，并且通过十二烷基硫酸钠(SDS)‑聚丙烯酰胺10％凝胶电泳(SDS‑PAGE)进行分离。在4℃下在恒定70伏特下将样品转移到硝基纤维素膜(0.45μm)上，持续1小时，并且将硝基纤维素过滤器用非特异性位点阻断溶液在室温下孵育1小时，然后与单克隆抗HIF‑1α或抗β肌动蛋白抗体在4℃下孵育过夜。在用与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的第二抗体孵育之后，通过化学发光使免疫反应性带可视化。然后对与HIF‑1α相对应的带进行密度测定分析，并将所获得的值相对于β肌动蛋白的值归一化。 [0041] L‑乳酸产生测定 [0042] 根据制造商的说明书，使用L‑乳酸测定试剂盒(英国剑桥的艾博抗公司(Abcam,Cambridge,UK))测定细胞培养上清液中的L‑乳酸水平。用10‑kDa NMWCO离心过滤单元(Amicon，密理博公司(Millipore))使上清液脱蛋白，并将滤液添加到反应孔中。通过在570nm处的分光光度读数来测量吸光度。 [0043] 代谢研究 [0044] 按照制造商的说明书，使用Seahorse XFe96分析仪(安捷伦公司)评估如上文所描述地处理的细胞的细胞外酸化率(ECAR)和耗氧率(OCR)，以计算糖酵解率(ECAR/OCR)。简而言之，在测试当天，将培养基更换成补充有葡萄糖(10mmol/L)、丙酮酸盐(1mmol/L)和谷氨酰胺(2mmol/L)(安捷伦公司)的Seahorse XF DMEM培养基pH 7.4，并允许细胞在非CO2孵育箱中平衡1小时；然后测量OCR和ECAR。XFp Mito应激测试试剂盒用于测试线粒体功能。注射寡霉素(1μM)、羰基氰‑4(三氟甲氧基)苯腙(FCCP，1μM)以及鱼藤酮和抗霉素A的混合物(1μM)使得能够确定关键的生物能参数：基础呼吸、ATP产生相关的呼吸(ATP产生)、最大呼吸、储备呼吸量、非线粒体呼吸、质子渗漏和偶联效率。 [0045] 统计分析 [0046] 使用ANOVA检验，随后是邓尼特检验或图基事后检验(Tuckey post hoc test)，以检查所测试的不同条件之间的统计显著性差异，同时在两组的情况下，通过未配对的斯图登氏t检验进行平均值之间的比较。p值≤0.05被认为是统计学上显著的。使用R 4.0.3统计软件进行分析。 [0047] 体内研究 [0048] 脑的氧气供应的减少在衰老过程期间在神经退行性变中起着关键作用(Ogunshola和Antoniou,2009)。病理过程，如氧化应激、氧气或葡萄糖供应受损以及铁稳态破坏在神经退行性疾病中是常见的(Correia和Moreira,2010；Gironi等人,2011； Benarroch,2009)。先前在阿尔茨海默氏病(AD)模型中已经证明，脑中的HIF‑1α水平的降低与负责葡萄糖摄取的GLUT1和GLUT2受体的表达降低相关。发明人进行了体内测定，以评估特定细菌组合在调节3xTg‑AD小鼠的脑组织中的HIF‑1α积聚的能力。这种可靠的人类AD模型显示出斑块和缠结病理两者，其中在三月龄时可检测到细胞内Aβ免疫反应性，并且在12月龄与15月龄之间发生tau蛋白的过度磷酸化(Oddo等人,2003)。实验设计的特性以及脑提取物的制备与Bonfili等人先前在2018年报告的一致(Bonfili等人,2018)。将四十八只八周龄的3xTg‑AD豚鼠分为2组。将第一组(n＝24)用包含嗜热链球菌CNCM I‑5570、动物双歧杆菌乳酸亚种CNCM I‑5571、动物双歧杆菌乳酸亚种CNCM I‑5572、嗜酸乳杆菌CNCM I‑ 5567、瑞士乳杆菌CNCM I‑5573、副干酪乳酪杆菌副干酪亚种CNCM I‑5568、植物乳植杆菌植物亚种CNCM I‑5569和短乳杆菌CNCM I‑5566的特定益生菌制剂处理，而未经处理的另一组(n＝24)用作对照。同时，也将48只同龄的野生型(wt)小鼠分为数量相等的2组，其中仅一组用相同的益生菌制剂处理。剂量(2000亿个细菌/千克/天)是使用如先前在文献中报告的体表面积归一化来确定的(Crawford等人,1950)。在24周龄和56周龄(治疗开始后的16周和48周)处死小鼠以进行生化分析，并将脑储存在‑80℃下，直至产生脑匀浆。使用ANOVA，随后是邦费罗尼检验以测试HIF‑1α表达水平的统计学显著差异。p值≤0.05被认为是统计学上显著的。如先前所描述，通过蛋白质印迹测定分析脑匀浆中的HIF‑1α亚基的水平(Bonfili等人,2018)。所获得的结果表明，与同龄的wt小鼠相比，未经处理的3xTg‑AD小鼠的脑中HIF‑1α水平显著较低。令人惊讶的是，在3xTg‑AD小鼠中施用益生菌制剂与脑中HIF‑1α水平的显著增加相关。出乎意料的是，用益生菌处理将HIF‑1α的表达恢复到同龄wt小鼠记录的水平(图3)。观察到的脑中HIF‑1α水平的升高表明，施用所测试的特定益生菌制剂可以改善脑中的氧稳态和葡萄糖代谢，从而构成了治疗神经退行性疾病的可行治疗方法。 [0049] 对人类进行的研究 [0050] 首次人类研究 [0051] 在这项研究中，评估了服用特定益生菌制剂对实践耐力运动的受试者的呼吸、心脏和代谢参数的影响。为此，招募了4名男性铁人三项练习者受试者(年龄：平均值±DS，37±5岁；体重：平均值±DS 70±3kg)。进行了两组试验，第一组试验表示“之前(PRE)”，涉及在没有摄入特定益生菌制剂的情况下执行方案。在被称为“之后(POST)”的第二组试验中，相同的受试者在摄入由以下组成的细菌组合物之后重复测试：嗜热链球菌CNCM I‑5570、动物双歧杆菌乳酸亚种CNCM I‑5571、动物双歧杆菌乳酸亚种CNCM I‑5572、嗜酸乳杆菌CNCM I‑5567、瑞士乳杆菌I‑5573、副干酪乳酪杆菌副干酪亚种CNCM I‑5568、植物乳植杆菌植物亚种CNCM I‑5569和短乳杆菌CNCM I‑5566。摄入的益生菌的量由单剂量摄入的约4000亿个细菌细胞组成。受试者被要求在测试前一天的晚餐中消耗其最后一餐，并在指定的时间禁食，仅允许饮水；在“之后(POST)”测试组中，所述受试者被要求在最后一餐后不早于5小时和测试前至少5小时服用益生菌制剂。测试在一周的中间进行，以尽量减少周末期间体力活动的影响。每个受试者在同一天且同一时间重复两组测试。测试在帕纳塔跑步机模型(Panatta Treadmill model)T‑190(意大利帕纳塔公司(Panatta,Italy))上进行，其固定带倾斜度为1％。在受试者佩戴代谢计口罩之后，允许所述受试者在自由强度但低于测试强度下进行5'热身。接着，在没有中断的情况下，意向性增加到另一个10'的阈值。此值是使用单独受试者对自身无氧阈值强度的了解来选择的，并且表示跑步20km总距离的适当运动强度。使用与心率监测带(意大利博能公司(POLAR,Italy))接口的Fitmate PRO设备(意大利科时迈公司(COSMED,Italy))获取最后5分钟运动的平均心率以及身体能够提取并随后以肌肉收缩时间单位(VO2)使用的氧气量的测量结果。通过在阈值强度步骤结束时从耳垂进行毛细管取样来确定血液乳酸浓度。关于所考虑的参数，通过配对数据的斯图登氏t检验来评估之前(PRE)与之后(POST)测试组之间是否存在显著差异。p值≤0.05被认为是统计学上显著的。当在缺氧条件下进行时，乳酸表示糖锂循环的最终产物，因此其浓度反映了厌氧代谢的水平。心率和VO2构成了另外的参数，所述参数可以指示有氧代谢的水平，因为这些参数的减少指示有氧代谢的提高，并且因此提高了氧气的可用性。通常，心率、VO2和血液乳酸浓度的降低表明与益生菌制剂的摄入相关的有氧代谢效率的提高(图4)。 [0052] 这些结果与以下假设一致，即由肠中的特定益生菌菌株的作用诱导的HIF‑1α的正向调节将使得减少所述区域的O2消耗。益生菌摄入引起的节氧将使得这种气体在血液循环中变得更容易获得，并且从而重新分配到其它身体区域。 [0053] 二次人类研究 [0054] 缺氧在许多疾病状态中是一种常见的病状，在与急性肺损伤相关的病状中具有特殊的相关性(Lee等人,2019)。本发明工作的目的是研究细菌菌株在缓解具有与Sars‑CoV‑2感染相关的肺部影响的受试者的呼吸系统病状方面所发挥的基线作用。另外，评估了这种有益效果显现的早期性。为此，对两组患者的应答进行了检查，一组用最佳可用疗法(BAT)治疗，另一组另外地补充口服细菌疗法(BAT+OB)。通过比较两组在治疗开始时和随后二十四小时内的血液氧合参数氧分压(pO2)、吸入氧分数(FiO2)、氧合血红蛋白(O2Hb)、pO2/FiO2比率和氧饱和血红蛋白(SaO2)来评估益生菌摄入的效果。另外地测量递送的氧气量(升/分钟)。表1总结了两组患者的主要特性。 [0055] 表1 [0056] [0057] IQR：四分位距 [0058] 除了性别之外，通过施用益生菌制剂确定的两组在所有临床考虑的变量上都是同质的，包括用于治疗SARS‑CoV‑2感染的药物疗法、血液氧合参数和给氧量(中值；IQR BAT 4；1‑6升/分钟；BAT+OB 1.5；1‑6升/分钟，p＝0.31)。在第一次益生菌给药后二十四小时，BAT+OB组显示出的pO2/FiO2比率和pO2的值显著高于BAT组的值，而FiO2值则是相反的情况(图5a‑c)。对O2Hb和SaO2水平的分析产生了与先前描述的pO2和pO2/FiO2比率一致的结果(图 5e和5f)。总体结果显示，在治疗开始24小时后，施用益生菌制剂的组比仅使用标准疗法的组具有更好的血液氧合水平，尽管随时间的推移，BAT组经历的氧气递送量显著增加(图 5d)。 [0059] 在BAT+OB组中观察到的血液氧合参数的改进与以下假设一致，即在肠道水平下，由特定益生菌菌株的作用诱导的HIF‑1α的正向调节将允许减少O2消耗，而所述O2消耗将通过在血流水平下变得更易可获得而重新分配。 [0060] 患者和方法 [0061] 研究设计、受试者群体、数据收集和治疗 [0062] 对SARS‑CoV‑2感染的成年患者(>18岁)进行这项研究，在自主呼吸方案下通过文丘里面罩(Venturi mask)施用氧气疗法支持。通过逆转录酶聚合酶链式反应(RT‑PCR)对SARS‑CoV‑2E和S基因进行两次口咽和鼻咽拭子阳性检测来阐明SARS‑CoV‑2感染的诊断。将纳入研究的患者安置在两个专门用于管理COVID‑19的不同病房：在第一病房，按照意大利传染病和热带疾病学会(Società Italiana di Malattie Infettive e Tropicali，SIMIT)(意大利传染病和热带疾病学会，Italian Society of Infectious and Tropical Diseases)和意大利医药局(Italian Medicine Agency，AIFA)临时指南的建议，仅施用BAT，按照AIFA指南，包括地塞米松(Dexamethasone)(每天6mg，持续10天)加低分子量肝素(预防剂量)+/‑阿奇霉素(azithromycin)(每天500mg)；瑞德西韦(Remdesevir)。在第二病房，BAT与口服施用细菌疗法组合，所述口服细菌疗法由每天总计24,000亿个细菌组成，包括嗜热链球菌CNCM I‑5570、乳酸双歧杆菌CNCM I‑5571、乳酸双歧杆菌CNCM I‑5572、嗜酸乳杆菌CNCM I‑5567、瑞士乳杆菌CNCM I‑5573、副干酪乳杆菌CNCM I‑5568、植物乳杆菌CNCM I‑5569以及短发酵乳杆菌CNCM I‑5566菌株。考虑的变量包括1)病史数据；2)既往病史(合并症)；3)当前病史、治疗和实验室数据。使用在治疗开始后24小时从桡动脉采集的血液进行动脉血气分析(ABG测试)。 [0063] 统计学分析 [0064] 使用具有耶茨连续性修正(Yates continuity correction)的χ2检验对包括性别、抗病毒药物疗法和抗生素施用的分类变量进行比较，以考虑有限的样品量，并示出为绝对频率和百分比。双侧曼‑惠特尼U检验(Mann‑Whitney U‑test)用于所有连续变量，包括呼吸变量(pO2、FiO2、pO2/FiO2、与治疗开始相比提供的氧气的变化、O2Hb、SaO2)、生物化学变量(血糖、乳酸盐、血细胞比容)和人口统计变量和临床变量(年龄、BMI、ALT、AST、查尔森指数)，以确定各组在每个考虑的时间点时的统计学显著差异，同时对于每组，使用威尔科克森检验(Wilcoxon test)来评估连续时间点之间的显著差异。在所有情况下，p值≤0.05被认为是统计学上显著的。 [0065] 参考文献 [0066] Albenberg L,Esipova TV,Judge CP,Bittinger K,Chen J,Laughlin A,Grunberg S,Baldassano RN,Lewis JD,Li H,Thom SR,Bushman FD,Vinogradov SA,Wu GD,管腔内氧梯度与肠微生物群径向分区之间的相关性(Correlation between intraluminal oxygen gradient and radial partitioning of intestinal microbiota)《, 胃肠病学(Gastroenterology)》,2014年11月；147(5):1055‑63.e8.doi: 10.1053/j.gastro.2014.07.020.电子版2014年7月18日.PMID:25046162；PMCID: PMC4252572。 [0067] Benarroch EE,脑铁稳态与神经退行性疾病(Brain iron homeostasis and neuro‑degenerative disease)《, 神经学(Neurology)》,2009年4月21日；72(16):1436‑40.doi:10.1212/WNL.0b013e3181a26b30.PMID:19380704。 [0068] Bonfili L,Cecarini V,Cuccioloni M,Angeletti M,Berardi S,Scarpona S,Rossi G,Eleuteri AM,SLAB51益生菌制剂激活SIRT1途径，从而促进AD小鼠模型中的抗氧化和神经保护作用(SLAB51 Probiotic Formulation Activates SIRT1 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