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一种检测PDE5和SSRI的方法及其应用
申请号 CN202410142972.8 申请日 2024-02-01 公开(公告)号 CN117665174B 公开(公告)日 2024-04-23
申请人 巴中市产品质量检验检测中心; 发明人 李榕; 张文波; 朱斌; 闫芋君; 刘隆兴;
摘要 本 申请 公开了一种检测PDE5和SSRI的方法及其应用，涉及仪器分析技术领域。一种检测PDE5和SSRI的方法，其步骤包括样品处理和仪器分析；其应用于食品、保健品和中成药，能够对样品中所含有的PDE5和SSRI类 抑制剂 物质进行检测分析，进而对产品是否非法添加了此类化合物进行判断，以保障消费者的权益；其检测方法简单，成本低廉，且分离效能好，定量准确，重复性好，专属性强，具有极高的应用价值。
权利要求

1.一种检测PDE5和SSRI的方法，其特征在于，其包括如下步骤：
样品处理：取待测样品加入乙腈后进行超声处理，冷却至室温后再进行离心处理，取上清液过滤后作为待测试样溶液；
仪器分析：使用HPLC‑PDA设备对待测试样溶液进行检测，检测样品中所含有的PDE5类物质和SSRI类物质；
所述样品处理步骤中，所述待测样品为液体样品或固定样品；
所述待测样品为液体样品时：取10ml液体样品置于50ml容量瓶中，加入30ml乙腈，进行超声处理，冷却至室温后再定容至50ml，再进行离心处理并取上清液过滤后作为待测试样溶液；
所述待测样品为固体样品时，将固体样品研磨粉碎，取等同于该样品一次口服剂量的粉碎后的固体样品，置于50ml容量瓶中，加入30ml乙腈，进行超声处理，冷却至室温后再定容至50ml，再进行离心处理并取上清液过滤后作为待测试样溶液；
所述仪器分析步骤中，SSRI类物质为盐酸达泊西汀、盐酸氟西汀和盐酸舍曲林；
PDE5类物质为那红地那非、红地那非、硫代艾地那非、西地那非、豪莫西地那非、那莫西地那非、氨基他达拉非、他达拉非、枸橼酸羟基豪莫西地那非、伐地那非和伪伐地那非；
所述仪器分析步骤中，液相色谱条件为：采用规格为250×4.6mm，5µm的C18柱为色谱柱；
流动相A为乙腈，流动相B为含有0.1%三乙胺的10mmol/L的乙酸铵溶液；柱温30～35℃，进样体积为5～10µL，流速：1.0mL/min，梯度洗脱65min；
所述仪器分析步骤中，将那红地那非、红地那非、硫代艾地那非、西地那非、豪莫西地那非、盐酸达泊西汀和那莫西地那非作为一类物质；将氨基他达拉非、他达拉非、枸橼酸羟基豪莫西地那非、盐酸氟西汀、伐地那非、盐酸舍曲林和伪伐地那非作为二类物质；
当检测筛查对象为样品中的一类物质时，流动相B用冰醋酸调节pH为2.5～5.5，检测波长为254nm；
当检测筛查对象为样品中的二类物质时，流动相B用冰醋酸调节pH为6.5～7.5，检测波长为238nm；
所述仪器分析步骤中，梯度洗脱程序为：
0～8min，流动相A占比由10%升至30%，流动相B占比由90%降至70%；
8～16min，流动相A占比由30%升至37%，流动相B占比由70%降至63%；
16～23min，流动相A占比保持37%，流动相B占比保持63%；
23～23.1min，流动相A占比由37%升至41%，流动相B占比由63%降至59%；
23.1～28min，流动相A占比保持41%，流动相B占比保持59%；
28～50min，流动相A占比由41%升至60%，流动相B占比由59%降至40%；
50～65min，流动相A占比保持60%，流动相B占比保持40%。
2.根据权利要求1所述的一种检测PDE5和SSRI的方法，其特征在于，所述样品处理步骤中，于300W功率，40kHz频率下超声处理15min；于7000r/min的转速，20℃的条件下离心处理
5min；上清液用0.22μm微孔有机滤膜过滤。
3.根据权利要求1所述的一种检测PDE5和SSRI的方法，其特征在于，所述固体样品为胶囊、片剂、颗粒剂等任意药剂学可接受的固体制剂。
4.一种如权利要求1～3任意一项所述的检测PDE5和SSRI的方法在检测食品、保健品或中成药中的应用。
说明书全文

一种检测PDE5和SSRI的方法及其应用

技术领域

[0001] 本申请涉及仪器分析技术领域，具体涉及一种检测PDE5和SSRI的方法及其应用。

背景技术

[0002] 当前市场上具有补肾壮阳功效的中成药和保健品种类繁多，而部分食品、中成药和保健产品中，可能会添加有一些用于补肾壮阳的化学药物。由于添加化学药物的种类及添加剂量的不确定性，消费者在不知情的情况下长期或过量服用，可能引发诸多不良反应，给消费者的健康带来极大的安全隐患。
[0003] 目前针对补肾壮阳检测类物质成分主要以5型磷酸二酯酶(PDE5)抑制剂及其衍生物为主。用于治疗男性早泄的5‑羟色胺再摄取抑制剂(SSRI)类药物，如盐酸达泊西汀、盐酸氟西汀、盐酸舍曲林等，具有起效迅速且疗效确切的特点，也可能成为补肾壮阳类食品、保健品及中成药中非法添加的另一个趋势。
[0004] 目前食品、保健食品或中成药的检验方法中涉及SSRI类药品的报道较少，且缺乏同时涉及PDE5和两种以上SSRI的检验方法。同时目前针对食品、保健品及中成药中非法添加化学物质的检测方法中，大多采用质谱法，但该方法涉及的仪器价格昂贵，检测成本高，不易于基层检验的推广。发明内容
[0005] 本申请的目的在于提供一种检测PDE5和SSRI的方法，其能够有效检测样品中所含有的PDE5和SSRI类物质，其检测分离效能好、定量准确、重复性好，有利于推广应用。
[0006] 本申请的另一目的在于提供检测PDE5和SSRI的方法在检测食品、保健品或中成药中的应用，其能够有效对补肾壮阳类食品、保健品以及中成药中所添加的PDE5和SSRI类物质进行检测分析。
[0007] 本申请的技术方案如下：
[0008] 一方面，本申请实施例提供了一种检测PDE5和SSRI的方法，其包括如下步骤：
[0009] 样品处理：取待测样品加入乙腈后进行超声处理，冷却至室温后再进行离心处理，取上清液过滤后作为待测试样溶液；
[0010] 仪器分析：使用HPLC‑PDA设备对待测试样溶液进行检测，检测样品中所含有的PDE5和SSRI类抑制剂物质；
[0011] 上述样品处理步骤中，上述待测样品为液体样品或固定样品；
[0012] 上述待测样品为液体样品时：取10ml液体样品置于50ml容量瓶中，加入30ml乙腈，进行超声处理，冷却至室温后再定容至50ml，再进行离心处理并取上清液过滤后作为待测试样溶液；
[0013] 上述待测样品为固体样品时，将固体样品研磨粉碎，取等同于该样品一次口服剂量的粉碎后的固体样品，置于50ml容量瓶中，加入30ml乙腈，进行超声处理，冷却至室温后再定容至50ml，再进行离心处理并取上清液过滤后作为待测试样溶液。
[0014] 进一步的，在本申请的一些实施例中，上述样品处理步骤中，于300W功率，40kHz频率下超声处理15min；于7000r/min的转速，20℃的条件下离心处理5min；上清液用0.22μm微孔有机滤膜过滤。
[0015] 进一步的，在本申请的一些实施例中，上述仪器分析步骤中，SSRI类物质为盐酸达泊西汀、盐酸氟西汀和盐酸舍曲林，PDE5类物质为那红地那非、红地那非、硫代艾地那非、西地那非、豪莫西地那非、那莫西地那非、氨基他达拉非、他达拉非、枸橼酸羟基豪莫西地那非、伐地那非、伪伐地那非。
[0016] 进一步的，在本申请的一些实施例中，上述仪器分析步骤中，液相色谱条件为：采用规格为250×4.6mm，5µm的C18柱为色谱柱；流动相A为乙腈，流动相B为10mmol/L的含0.1%三乙胺的乙酸铵水溶液；柱温30～35℃，进样体积为5～10µL，流速：1.0mL/min，梯度洗脱65min。
[0017] 进一步的，在本申请的一些实施例中，上述仪器分析步骤中，梯度洗脱程序为：
[0018] 0～8min，流动相A占比由10%升至30%，流动相B占比由90%降至70%；
[0019] 8～16min，流动相A占比由30%升至37%，流动相B占比由70%降至63%；
[0020] 16～23min，流动相A占比保持37%，流动相B占比保持63%；
[0021] 23～23.1min，流动相A占比由37%升至41%，流动相B占比由63%降至59%；
[0022] 23.1～28min，流动相A占比保持41%，流动相B占比保持59%；
[0023] 28～50min，流动相A占比由41%升至60%，流动相B占比由59%降至40%；
[0024] 50～65min，流动相A占比保持60%，流动相B占比保持40%。
[0025] 进一步的，在本申请的一些实施例中，上述仪器分析步骤中，将那红地那非、红地那非、硫代艾地那非、西地那非、豪莫西地那非、盐酸达泊西汀和那莫西地那非作为一类物质；将氨基他达拉非、他达拉非、枸橼酸羟基豪莫西地那非、盐酸氟西汀、伐地那非、盐酸舍曲林和伪伐地那非作为二类物质；
[0026] 当检测筛查对象为样品中的一类物质时，流动相B用冰醋酸调节pH为2.5～5.5，检测波长为254nm；
[0027] 当检测筛查对象为样品中的二类物质时，流动相B用冰醋酸调节pH为6.5～7.5，检测波长为238nm。
[0028] 进一步的，在本申请的一些实施例中，上述固体样品为胶囊、片剂、颗粒剂等任意药剂学可接受的固体制剂。
[0029] 另一方面，本申请实施例还提供了一种检测PDE5和SSRI的方法在检测食品、保健品或中成药中的应用。
[0030] 相对于现有技术，本申请的实施例至少具有如下优点或有益效果：
[0031] 针对第一方面，本申请实施例提供了一种检测PDE5和SSRI的方法，其能够对不同的固体或液体样品进行处理，并采用高效液相色谱‑二极管阵列检测（HPLC‑PDA）技术，可通过峰保留时间和紫外特征光谱图，对样品中所含有的PDE5和SSRI类抑制剂物质进行检测分析，进而对食品、保健品、中成药中是否添加有此类物质进行判断。其检测方法简单，成本低廉，且分离效能好，定量准确，重复性好，专属性强，具有极高的应用价值。
[0032] 针对第二方面，本申请实施例还提供了一种上述检测PDE5和SSRI的方法在检测食品、保健品或中成药中的应用，能够通过上述检测方法来对市面上补肾壮阳类的食品、保健品以及中成药进行检验，判断其中是否含有PDE5和SSRI类抑制剂成分，为市面上产品的安全监管提供技术支持，以保障消费者的权益。附图说明
[0033] 为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本申请的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
[0034] 图1为本申请试验例1中专属性验证实验结果图；
[0035] 图2为本申请试验例2中实施例2方案的检测结果图；
[0036] 图3为本申请试验例2中对比例1方案的检测结果图；
[0037] 图4为本申请试验例2中对比例2方案的检测结果图；
[0038] 图5为本申请试验例2中对比例3方案的检测结果图；
[0039] 图6为本申请试验例3中标准方案的色谱图；
[0040] 图7为本申请试验例3中实施例1方案的色谱图。

具体实施方式

[0041] 为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0042] 需要说明的是，术语“包括”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括……”限定的要素，并不排除在包括上述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
[0043] 需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
[0044] 下面将参考具体实施例来详细说明本申请。
[0045] 实施例1
[0046] 本实施例提供了一种检测PDE5和SSRI的方法，其包括如下步骤：
[0047] 分组：将那红地那非、红地那非、西地那非、豪莫西地那非、盐酸达泊西汀、硫代艾地那非、和那莫西地那非作为一类物质；
[0048] 将氨基他达拉非、他达拉非、枸橼酸羟基豪莫西地那非、盐酸氟西汀、伐地那非、盐酸舍曲林和伪伐地那非作为二类物质。
[0049] 标准溶液配置：用乙腈制备上述一类物质的混合对照品储备液Ⅰ，其中，一类物质的各成分在混合对照品储备液Ⅰ中的质量浓度均为400µg/mL。从混合对照品储备液Ⅰ中分别取0.125、0.25、0.5、1、2、5、10mL，用乙腈稀释至10mL，得到混合标准系列溶液Ⅰ：s1～s7，该系列溶液用于测定一类物质中7种成分的线性关系；
[0050] 用乙腈制备质量上述二类物质的混合对照品储备液Ⅱ，其中，二类物质的各成分在混合对照品储备液Ⅱ中的质量浓度均为250µg/mL。从混合对照品储备液Ⅱ中分别取0.1、0.2、0.4、1、2、5、10mL，用乙腈稀释至10mL，得到混合标准系列溶液Ⅱ：q1～q7，该系列溶液用于测定另外7种成分的线性关系；混合标准系列溶液Ⅰ和混合标准系列溶液Ⅱ均现用现配。
[0051] 样品处理：取待测样品加入乙腈后进行超声处理，冷却至室温后再进行离心处理，取上清液过滤后作为待测试样溶液；
[0052] 其中，上述待测样品为液体样品时：取100ml液体样品充分混匀后精密量取10ml置于50ml容量瓶中，加入30ml乙腈，于300W功率，40kHz频率下超声处理15min，冷却至室温后再用乙腈定容至50ml，于7000r/min的转速，20℃的条件下离心处理5min，取上清液用0.22μm微孔有机滤膜过滤，得到待测试样溶液；
[0053] 上述待测样品为固体样品时，按照该样品所规定的服用剂量，取10次服用剂量的样品，研磨混匀，再精密称取相当于1次服用剂量的样品，置于50ml容量瓶中，加入30ml乙腈，于300W功率，40kHz频率下超声处理15min，冷却至室温后再用乙腈定容至50ml，于7000r/min的转速，20℃的条件下离心处理5min，取上清液用0.22μm微孔有机滤膜过滤，得到待测试样溶液；
[0054] 其中，上述待测样品为食品、保健品或中成药；上述固体样品为胶囊、片剂、颗粒剂等任意药剂学可接受的固体制剂。
[0055] 仪器分析：使用HPLC‑PDA设备对待测试样溶液进行检测，检测样品中所含有的PDE5类物质和SSRI类物质；其中SSRI类物质为盐酸达泊西汀、盐酸氟西汀和盐酸舍曲林，PDE5类物质为那红地那非、红地那非、硫代艾地那非、西地那非、豪莫西地那非、那莫西地那非、氨基他达拉非、他达拉非、枸橼酸羟基豪莫西地那非、伐地那非、伪伐地那非；
[0056] 检测时液相色谱条件为：采用规格为250×4.6mm，5µm的C18柱为色谱柱；流动相A为乙腈，流动相B为10mmol/L的含0.1%三乙胺的乙酸铵水溶液；柱温30～35℃，进样体积为5～10µL，流速：1.0mL/min，梯度洗脱65min，其梯度洗脱程序如表1：梯度洗脱程序表所示：
[0057] 表1：梯度洗脱程序表
[0058]
[0059] 当检测筛查对象为样品中的一类物质时，流动相B用冰醋酸调节pH为2.5～5.5，检测波长为254nm，其色谱条件作为色谱条件Ⅰ；
[0060] 当检测筛查对象为样品中的二类物质时，流动相B用冰醋酸调节pH为6.5～7.5，检测波长为238nm，其色谱条件作为色谱条件Ⅱ
[0061] 阴性样品对照溶液配置：取确定不含有上述一类物质、二类物质的样品，按照上述样品处理步骤的方法，制备得到阴性样品对照溶液。
[0062] 以化合物的保留时间和紫外特征光谱图进行定性，以外标法进行定量检测。
[0063] 在初步判定是阳性的样品中加入混合对照品溶液，若样品中疑似峰与对照品色谱峰能完全重合，并且疑似峰与对照品色谱峰紫外吸收特征谱图相似度大于99.0%.则判定是阳性样品。配制检出成分的对照品溶液，使对照品色谱峰面积与阳性样品中检出成分峰面积接近，以外标法计算阳性样品中检出成分的含量。
[0064] 实施例2
[0065] 本实施例基于实施例1，区别在于：
[0066] 样品处理：取20粒胶囊样品称重后将内容物和胶囊壳剪碎后放入乳钵中研碎并混匀。取出相当于1次服用量（2粒）的试样，置于50ml容量瓶中，加入30ml乙腈，于300W功率，40kHz频率下超声处理15min，冷却至室温后再用乙腈定容至50ml，于7000r/min的转速，20℃的条件下离心处理5min，取上清液用0.22μm微孔有机滤膜过滤。取滤液作为供试品溶液。
[0067] 检测时液相色谱条件如下：
[0068] 色谱条件Ⅰ：
[0069] 色谱柱：Agilent HC‑C18（2）柱（250×4.6mm，5µm）；
[0070] 流动相A：乙腈
[0071] 流动相B：10mmol/L乙酸铵溶液（含0.1%三乙胺，冰醋酸调pH至5.0）；
[0072] 流速：1.0 mL/min；
[0073] 柱温：30℃；
[0074] 进样量：10µL
[0075] 色谱条件Ⅱ：
[0076] 色谱柱：Agilent HC‑C18（2）柱（250×4.6mm，5µm）；
[0077] 流动相A：乙腈
[0078] 流动相B：10mmol/L乙酸铵溶液（含0.1%三乙胺，冰醋酸调pH至7.0）；
[0079] 流速：1.0 mL/min；
[0080] 柱温：30℃；
[0081] 进样量：10µL
[0082] 其余步骤方法同实施例1。
[0083] 对比例1
[0084] 本对比例基于实施例2，与实施例2的区别在于：改变有机相的乙腈为甲醇。
[0085] 对比例2
[0086] 本对比例基于实施例2，与实施例2的区别在于：改变色谱条件Ⅰ以及色谱条件Ⅱ中的流动相B的pH均为6.0。
[0087] 对比例3
[0088] 本对比例基于实施例2，与实施例2的区别在于：改变色谱柱柱温为25℃。
[0089] 试验例1
[0090] 采用实施例1提供的方法对待测样品进行处理并检测分析，其中，待测样品源自常规市售补肾壮阳类食品、保健品、中成药产品20批以及含有非法添加PDE5和SSRI类药物的同类型产品共计30批样品，样品剂型包括胶囊剂、片剂、口服液、功能饮料、固体饮料、保健酒。
[0091] 试验中所使用的试剂和仪器如下：
[0092] 那红地那非（批号：520039‑201902，含量：96.5%）；硫代艾地那非（批号：520048‑202002，含量99.3%）；西地那非（批号：510068‑202102，含量100%）；豪莫西地那非（批号：
520046‑202002，含量99.7%）；那莫西地那非（批号：520040‑202102，含量：99.4%）；枸橼酸羟基豪莫西地那非（批号：510032‑201301，含量：98.8%）；他达拉非（批号：510170‑202102，含量：99.8%）；伐地那非（批号：510169‑202001，含量：99.7%）；盐酸舍曲林（批号：100702‑
202103，含量：99.9%）；伪伐地那非（批号：520041‑202202，含量：100%）；盐酸氟西汀（批号：
100513‑202203，含量：99.8%）；氨基他达拉非（批号：520042‑202002，含量99.5%）购自中国食品药品检定研究院；盐酸达泊西汀（批号：23071，含量99.02%）购自Hong Kong Institute of standard substance，China。
[0093] 乙腈（色谱纯，Sigma公司，）；甲醇（色谱纯，Sigma公司，）；乙酸铵（色谱纯，西亚化学工业有限公司，）；三乙胺（色谱纯，科密欧化学试剂有限公司，）；冰醋酸（色谱纯，科密欧化学试剂有限公司，）实验用水为超纯水。
[0094] SHIMADZU LC‑2050C 3D高效液相色谱仪（日本岛津公司，配有PDA检测器）；Mettler Toledo XSE205电子天平（瑞士梅特勒‑托利多公司）；JP‑060S型超声仪（深圳市洁盟清洗设备有限公司）；eppendor 5430R 高速冷冻离心机（德国艾本德公司）SevenMulti型pH测量仪（瑞士梅特勒‑托利多公司）；ULPHW‑IV型超纯水仪（四川优普超纯水科技有限公司）。
[0095] 在本试验例中，所有图谱中所标注的标号1～14分别对应14种化学药物，具体为：1.那红地那非；2.红地那非；3.西地那非；4.豪莫西地那非；5.盐酸达泊西汀；6. 硫代艾地那非；7.那莫西地那非；8.氨基他达拉非；9.他达拉非；10.枸橼酸羟基豪莫西地那非；11.盐酸氟西汀；12.伐地那非；13.盐酸舍曲林；14.伪伐地那非。
[0096] 方法学验证：
[0097] 参照中国药典 2020 年版四部 9101分析方法验证指导原则对 HPLC 的专属性、线性、检出限、定量限等项目进行了考察，结果均符合相应的要求；具体如下：
[0098] 专属性验证：
[0099] 依照实施例1中的色谱条件，分别对混合对照品溶液、阴性样品溶液和阴性样品加标溶液进行了分析。实验结果如图1所示，阴性样品杂质的主要色谱峰与14种补肾壮阳化学药没有保留时间上的重叠，且通过PDA谱图可以排除基质效应对检测的干扰。因此，该方法具有较好的专属性。
[0100] 线性关系考察、检测限和定量限：
[0101] 分别对混合标准系列溶液Ⅰ和混合标准系列溶液Ⅱ进行分析，并以质量浓度（µg/mL）为横坐标（x），峰面积为纵坐标（y），绘制标准曲线，并建立线性回归方程。14种补肾壮阳类化学药物在各自的线性范围内均呈现出良好的线性关系，其线性回归方程和相关系数（r）如表2：线性关系考察、检测限和定量限结果数据表所示。所有相关系数（r）均大于等于0.9999；
[0102] 将对照品溶液进行逐级稀释，并以信噪比RSN≥ 3和RSN≥ 10时的浓度分别作为检测限（LOD）和定量限（LOQ）。各种药物的LOD和LOQ同见表2。
[0103] 表2：线性关系考察、检测限和定量限结果数据表
[0104]
[0105] 回收率试验：
[0106] 精密称取不含14种补肾壮阳类化学药物的阴性样品约一次服用量，共9份，分3组，每组3份。分别向每组样本中加入不同量的混合对照品储备液Ⅰ或混合对照品储备液Ⅱ，按照实施例1中的方法制备成低、中、高三个加标浓度水平（具体加标浓度见表3：回收率试验结果数据表；表3中，每一种化合物的加标浓度部分，由上至下依次为低、中、高加标浓度水平）的阴性样品加标溶液，浓度范围分别在s3 （20 µg/mL）、s4（40 µg/mL）、s5（80 µg/mL）和q3（10 µg/mL）、q4（25 µg/mL）、q5（50 µg/mL）水平上并进行检测分析，绘制色谱图。计算各加标溶液中14种补肾壮阳类化学药物的加标回收率和相对标准偏差（RSD）。
[0107] 结果如表3：回收率试验结果数据表所示；结果显示，所有药物的回收率均在97.8～102.8%之间，RSD均小于2%（n=3或n=9），说明该方法具有较好的准确性。
[0108] 表3：回收率试验结果数据表
[0109]
[0110] 精密度试验：
[0111] 仪器精密度：吸取同一回收率试验中的阴性样品加标溶液混合对照品Ⅰ组中的加标浓度在s4（40 µg/mL）水平上，混合对照品Ⅱ组的加标浓度在q4（25 µg/mL）水平上，照实施例1中的色谱条件，连续测定6次，记录14个目标组分峰面积，并计算RSD。结果显示，那红地那非、红地那非、西地那非、豪莫西地那非、盐酸达泊西汀、硫代艾地那非、那莫西地那非、氨基他达拉非、他达拉非、枸橼酸羟基豪莫西地那非、盐酸氟西汀、伐地那非、盐酸舍曲林、伪伐地那非色谱峰峰面积的RSD（n=6）分别为0.57%、0.52%、0.51%、0.49%、0.33%、0.47%、0.48%、0.64%、0.70%、1.18%、0.76%、0.77%、0.52%、0.68%，均低于2%，说明仪器具有良好的精密度。
[0112] 日内精密度和日间精密度：分别配制3个浓度水平的混合对照品溶液Ⅰ和混合对照品溶液Ⅱ，浓度范围分别s1（5 µg/mL）、s4（40 µg/mL）、s7（400 µg/mL）和q1（2.5 µg/mL）、q4（25µg/mL）、q7（250 µg/mL）水平上，每4小时测定一次，连续24小时，作为日内精密度试验；每12小时测定一次，连续3天，作为日间精密度试验。计算各组分的峰面积RSD。
[0113] 结果如表4：精密度试验结果数据表所示，表明该方法具有良好的精密度。
[0114] 表4：精密度试验结果数据表
[0115]
[0116] 重复性试验：
[0117] 取同一批号含有非法添加PDE5和SSRI类药物的阳性样品，按实施例1方法独立制备6份供试品溶液，进行检测分析，以外标法分别计算含量，西地那非的含量为9.87mg/粒，RSD（n=6）为1.1%，表明该方法重复性良好。
[0118] 稳定性试验：
[0119] 取同一回收率试验中阴性样品加标溶液（混合对照品Ⅰ组的加标浓度约为40µg/mL， 混合对照品Ⅱ组的加标浓度为约25µg/mL），在配制后的0、2、4、8、12、24h，分别进行分析，并记录各组分的峰面积。计算结果显示，24h内，14个目标组分的峰面积RSD（n=6）为0.49%～1.08%，表明样品溶液在24h内相对稳定。
[0120] 试验例2
[0121] 本试验例所选用的试剂来源、仪器，以及图谱中的标号对应关系均同试验例1；
[0122] 按实施例2提供的方法对样品进行检测，检测结果如图2所示，其能够有效对样品中含有的14中PDE5和SSRI类物质进行定性、定量分析。
[0123] 同时，按照对比例1～3中的方法对样品进行检测，结果分别如图3～图5所示。
[0124] 根据结果可得到结论：
[0125] 对比例1方案中，由于甲醇的洗脱能力相对较弱，在单独使用甲醇时不能将14个目标化合物全部洗脱（如图3所示），而在使用乙腈时，14种化合物被全部洗脱，并达到基线分离。
[0126] 对比例2方案中，流动相的pH会直接影响化合物在其中的存在形式（可能全部以分子状态存在或者全部以离子状态存在或同时以两种形式存在），从而改变化合物在色谱柱上的保留行为，进而影响化合物的分离效果。如图4所示，当色谱条件Ⅰ中流动相B的pH为6.0，大于5.5时，西地那非和毫莫西地那非无法有效分离。当色谱条件Ⅱ中流动相B的pH为
6.0，小于6.5时，他达拉非和枸橼酸羟基毫莫西地那非以及盐酸氟西汀和伐地那非两对化合物无法达到基线分离。此外，一般色谱的耐受pH范围为2～8，当pH为2以下或者8及以上都会柱损伤色谱柱的键合相，导致柱效下降、缩短色谱柱的使用寿命。因此综合考虑各化合物的分离效果、方法的普适性以及经济成本，色谱条件Ⅰ的pH值选择2.5～5.5，色谱条件Ⅱ的pH值选择6.5～7.5。
[0127] 对比例3方案中，不同的柱温会影响化合物在色谱柱上保留的强弱，从而影响化合物的分离效果。如图5所示，当25℃时他达拉非和枸橼酸羟基毫莫西地那非完全重合，无法分离；西地那非和豪莫西地那非也无法有效分离。但当温度在35℃以上时，会降低色谱柱的使用寿命。因此综合考虑经济成本和化合物的分离度，选择色谱柱柱温为30～35℃。
[0128] 试验例3
[0129] 本试验例所选用的试剂来源、仪器，以及图谱中的标号对应关系均同试验例1；
[0130] 如图6所示，其为依照国家食品药品监督管理局推荐标准BJS2009030方案得到的SSRI、PDE5类物质色谱图；
[0131] 如图7所示，其为依照本申请方案实施例1方法得到的SSRI、PDE5类物质色谱图。
[0132] 对比可见，标准方法中无法对本申请方案所涉及的三种SSRI类物质（盐酸氟西汀、盐酸达泊西汀、盐酸舍曲林）进行检测，且本申请方案对其余11种PDE5药物的分离效果更佳，标准方案中羟基豪莫西地那非和西地那非无法达到基线分离。可见，本申请方案的定量准确性更高，适用范围更广。
[0133] 综上，本申请实施例提供了一种检测PDE5和SSRI的方法及其应用，其应用于食品、保健品和中成药，能够对样品中所含有的PDE5和SSRI类抑制剂物质进行检测分析，进而对产品是否非法添加了此类化合物进行判断，以保障消费者的权益；其检测方法简单，成本低廉，且分离效能好，定量准确，重复性好，专属性强，具有极高的应用价值。
[0134] 以上所描述的实施例是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。本申请的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本申请的范围，而是仅仅表示本申请的选定实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

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