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一种小鼠动静脉血管联合显像的方法

申请号 CN202311806611.0 申请日 2023-12-26 公开(公告)号 CN117838365A 公开(公告)日 2024-04-09
申请人 首都医科大学宣武医院; 发明人 于嘉兴; 张世榉; 涂天琦; 张彤宇; 张鸿运; 周原; 洪韬; 张鸿祺;
摘要 本 发明 提供一种小鼠动静脉血管联合显像方法,包括:在完成手术准备的小鼠腹部切口,打开小鼠 腹腔 ,分离并充分暴露小鼠的腹主动脉和下腔静脉;在小鼠腹主动脉上切口并插入 导管 ;经导管向小鼠腹主动脉内依次灌注缓冲液和 生物 样本固定液;经导管向小鼠腹主动脉内灌注由 溶剂 、明胶微粒和着色组分A混合构成的静脉显色灌注液;明胶微粒的相对分子 质量 范围在50000~100000;经导管向小鼠腹主动脉内灌注由溶剂、乳胶微粒和着色组分B混合构成的动脉显色灌注液;乳胶微粒的粒径范围在0.8‑1.2μm;着色组分A与所述的着色组分B之间存在肉眼可识别的色差。本发明所述的方法能够清楚地显示小鼠脑部动脉和静脉结构,并实现动脉和静脉之间的显著区分。
权利要求

1.一种小鼠动静脉血管联合显像方法,包括以下步骤:
1)在完成手术准备及麻醉后的小鼠腹部切口,打开小鼠腹腔,分离并充分暴露小鼠的腹主动脉和下腔静脉;
2)在暴露的小鼠腹主动脉上开口,插入导管并固定;
3)在小鼠下腔静脉上开口;
4)经导管向小鼠腹主动脉内依次灌注缓冲液和生物样本固定液,完成冲洗和组织固定;
5)经导管向小鼠腹主动脉内灌注由溶剂、明胶微粒和着色组分A混合构成的静脉显色灌注液;所述的明胶微粒的相对分子质量约为50000~100000;直至观察到小鼠肝脏静脉、胃肠道静脉和缘静脉均显示着色组分A的颜色
6)接着经导管向小鼠腹主动脉内灌注由溶剂、乳胶微粒和着色组分B混合构成的动脉显色灌注液;所述的乳胶微粒的粒径范围在0.8‑1.2μm,更优选1.0μm;直至观察到胃肠道动脉显示着色组分B的颜色;所述的着色组分A与所述的着色组分B之间存在肉眼可识别的色差。
2.权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤5)所述的静脉显色灌注液中明胶浓度在
30.0‑50.0mg/ml;优选40.0mg/ml。
3.权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤5)所述的静脉显色灌注液通过以下方法制备:将明胶、溶剂和着色组分A混合,得到混合溶液A,然后热浴至明胶融化,搅拌至颜色均匀,控制混合溶液A中明胶的浓度为30.0~50.0mg/ml,得到静脉显色灌注液。
4.权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤6)所述的动脉显色灌注液中乳胶微粒的质量百分比浓度在13%‑18%;优选16%。
5.权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤6)所述的动脉显色灌注液通过以下方法制备:将溶剂、乳胶溶液和着色组分B混合,所述的乳胶溶液,按重量百分比计,含橡胶成分
27%‑41%、水44%‑70%;得到混合溶液B,然后充分搅拌至颜色均匀,控制混合溶液B中乳胶的浓度为13%‑18%,得到动脉显色灌注液。
6.权利要求1‑5任意一项所述的方法,其特征在于:步骤5)和步骤6)所述的溶剂是生理盐水或磷酸盐缓冲液PBS溶液;优选生理盐水。
7.权利要求1‑5任意一项所述的方法,其特征在于:步骤5)所述的着色组分A是蓝色颜料,优选451号酞菁蓝颜料;步骤6)所述的着色组分B是红色颜料,优选400号胭脂红颜料。
8.权利要求1‑5任意一项所述的方法,其特征在于:步骤5)所述的静脉显色灌注液的灌注用量是步骤6)所述的动脉显色灌注液的灌注用量的1.8‑2.4倍,优选2倍。
9.权利要求1‑5任意一项所述的方法,其特征在于:步骤5)所述的静脉显色灌注液的灌注速度为0.1‑0.2ml/s;优选0.15ml/s。
10.权利要求1‑5任意一项所述的方法,其特征在于:步骤6)所述的动脉显色灌注液的灌注速度为0.05‑0.15ml/s;优选0.1ml/s。

说明书全文

一种小鼠动静脉血管联合显像的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种血管灌注方法,具体涉及一种小鼠动静脉血管经灌注实现联合显像的方法。

背景技术

[0002] 对小鼠动静脉进行具有区分度的联合显像具有重要的临床和教学意义。在临床上,深入了解脑血管畸形的病变起源是发生在动脉还是静脉、神经血管重塑过程起源是发生在动脉还是小静脉等问题,能够帮助我们更好的探索疾病机制。在教学中,学生也需要基于小鼠动静脉具有区分度的联合显像才能更好地学习小鼠脑/胃肠道动静脉的解剖学信息(例如肠系膜血管中动脉和静脉的分布情况)以及血流动学过程(例如肠系膜动脉和肠系膜静脉的血流速度、血管内阻力等)。
[0003] 现有技术中,通常通过乳胶灌注、明胶染色磁共振成像荧光成像等方法对小鼠血管进行显像或定位。这些方法尽管在一定程度上可以为研究人员提供帮助,但是仍然存在诸多局限性,尤其是无法实现对于动静脉的区分显像。
[0004] 乳胶灌注是通过将蓝色乳胶微球颗粒注入小鼠的血管系统中,注射后乳胶会沿着小鼠的血管系统进行扩散填充,固化后可以看到血管结构。该成像技术的缺点是:因为蓝色乳胶微球颗粒直径较大,不能通过毛细血管进入静脉端,所以通过乳胶灌注只能看到动脉,不能显示静脉血管结构。
[0005] 明胶染色是在80℃浴锅加热下,将明胶融化于墨汁,注入小鼠体内,随后墨汁会沿着血管系统扩散到目标区域,最后取材后在显微镜下观察,分析描述血管结构。该成像技术的缺点是:墨汁染色的配比是30ml墨汁+0.6g明胶颗粒,墨汁灌注成功后还需要进行冷藏处理,取材后通过小鼠脑组织透明化、切片后才能观察,整个过程持续时间长,需要1周时间,此外,墨汁染色后所有血管(包括动脉、小动脉、毛细血管、后微静脉和静脉)都被染色,因而不能区分小鼠的动脉和静脉,不能进一步了解探索疾病的发生发展过程。
[0006] 磁共振血管成像是基于实验需求选择适合的脑血管成像序列,利用磁共振技术对小鼠脑血管系统进行成像和可视化。小鼠脑血管磁共振血管成像可以进一步分为磁共振动脉血管成像和磁共振静脉血管成像,经后期重建后可以显示脑血管的三维结构图像。但是这种成像方式的缺点是:①只能看到大、中型血管的形态,看不到毛细血管形态(例如毛细血管畸形);②不能同时看到小鼠动脉和静脉结构;③需要高分辨率的成像设备和适当的图像处理方法,④小鼠磁共振扫描费用较高。
[0007] 荧光成像是通过使用荧光染料,如血管标记抗体(抗CD31抗体)注入血管,然后荧光染料会在血液中扩散,标记血管结构,最后通过荧光显微镜分析描述血管结构。该成像技术的缺点是:因为目前缺乏小鼠动脉和静脉特异性的标记抗体/Marker,所以通过该成像方式也不能区分小鼠动脉和静脉,此外该种方法成像时间长,扫描时费用也较高。
[0008] 综上所述,由于小鼠脑动脉和静脉在解剖结构、显像特性上的相似性,且目前缺乏区分小鼠动脉和静脉的特异性标志物,所以导致目前的血管成像方式对于小鼠的脑部动脉和静脉均不能实现很好地区分和定位,因而在临床上和教学中都无法深入研究、探索血管疾病的发生发展过程。然而,如上所述,准确区分小鼠脑动静脉是一个非常有必要的研究前提。因此,有必要提供一种能够明确区分小鼠动脉和静脉的显像方法,以便更清楚地了解小鼠脑组织血流动力学和供应模式和很多疾病的病理生理机制和发生发展过程。

发明内容

[0009] 鉴于上述背景,本发明的目的是提供一种小鼠动静脉血管联合显像的方法,能够清楚地显示小鼠动脉和静脉结构,并实现动脉和静脉之间的显著区分。
[0010] 本发明的上述目的通过以下技术方案实现:
[0011] 本发明提供一种小鼠动静脉血管联合显像方法,包括以下步骤:
[0012] 1)在完成手术准备及麻醉后的小鼠腹部切口,打开小鼠腹腔,分离并充分暴露小鼠的腹主动脉和下腔静脉;
[0013] 2)在暴露的小鼠腹主动脉上开口,插入导管并固定;
[0014] 3)在小鼠下腔静脉上剪一小口;
[0015] 4)经导管向小鼠腹主动脉内依次灌注缓冲液和生物样本固定液,完成冲洗和组织固定;
[0016] 5)经导管向小鼠腹主动脉内灌注由溶剂、明胶微粒和着色组分A混合构成的静脉显色灌注液;直至观察到小鼠肝脏、胃肠道血管和缘静脉均显示着色组分A的颜色
[0017] 6)接着经导管向小鼠腹主动脉内灌注由溶剂、乳胶微粒和着色组分B混合构成的动脉显色灌注液;直至观察到胃肠道动脉显示着色组分B的颜色;所述的着色组分A与所述的着色组分B之间存在肉眼可识别的色差。
[0018] 本发明所述的方法中,所述的静脉显色灌注液所含的明胶微粒指通常用于食用或药用的明胶(Gelatin)在溶剂中分散形成的微粒。本发明方法优选的明胶的相对分子质量约为50000~100000,通常为固体形式,呈颗粒状,加热后可以熔化形成胶体样物质,在溶剂中分散形成的微粒粒径小于小鼠毛细血管内径,从而可顺利通过小鼠毛细血管进入静脉端。本发明最优选的方法中,所述明胶来自Servicevio公司,CAS:9000‑70‑8,Lot:CR2101053。
[0019] 所述的静脉显色灌注液中,明胶的浓度会影响显色灌注液整体的粘度和流动性。过高的明胶浓度会导致显色灌注液粘度过高、流动性差,在血管内流速过慢;过低的明胶浓度会导致显色灌注液粘度太低、流动性太强,冷却后不易形成凝胶。因此本发明的方案中,所述的静脉显色灌注液中明胶浓度优选在30.0mg/ml‑50.0mg/ml;更优选在40.0mg/ml。
[0020] 本发明所述的方法中,所述的静脉显色灌注液优选通过以下方法制备:将明胶、溶剂和着色组分A混合,得到混合溶液A,然后热水浴中加热至明胶融化,搅拌至颜色均匀,控制混合溶液A中明胶的浓度为30.0‑50.0mg/ml,得到静脉显色灌注液。
[0021] 本发明所述的方法中,所述的动脉显色液所含的乳胶微粒指的是化学组成为橡胶的微型球状物,所述的橡胶烃可以是天然橡胶烃,也可以是合成橡胶烃;优选天然橡胶烃。进一步优选的乳胶微粒粒径范围在0.8‑1.2μm,更优选1μm。
[0022] 所述的动脉显色灌注液中,乳胶微粒的浓度会影响动脉显色灌注液整体的粘度和流动性。过高的乳胶微粒浓度会导致动脉显色灌注液粘度过高、流动性差,极容易凝固,容易在到达动脉最远端之前发生凝固;而过低的乳胶微粒浓度又会导致动脉显色灌注液粘度太低、流动性太强,导致灌注显像失败。因此本发明优选的方案中,所述的动脉显色灌注液中乳胶微粒的浓度在13%‑18%;更优选在16%。
[0023] 本发明所述的方法中,所述的动脉显色灌注液优选通过以下方法制备:将溶剂、乳胶溶液和着色组分B混合,得到混合溶液B,所述的乳胶溶液,按重量百分比计,含橡胶成分27%‑41%、水44%‑70%;然后充分搅拌至颜色均匀,控制混合溶液B中乳胶的浓度为13%‑
18%,得到动脉显色灌注液。
[0024] 本发明所述的方法中,各显色灌注液用到的溶剂没有特别的限制,凡是现有技术中能够用于血管灌注的无色透明溶剂都可以用于本发明的组合制剂;优选的方案中,所述的溶剂可以是生理盐水、磷酸盐缓冲液PBS等;最优选生理盐水。
[0025] 本发明所述的方法中,静脉显色灌注液中所述的着色组分A和动脉显色灌注液中所述的着色组分B的种类没有特别的限制,可以是现有技术中适合用于血管灌注的各种颜料或其他着色剂;优选的方案中,所述的着色组分A是蓝色颜料,例如利Z6032国画颜料中国画颜料451酞菁蓝颜料;优选的方案中,所述的着色组分B是红色颜料,例如马利Z6032国画颜料中国画颜料400号胭脂红颜料。
[0026] 本发明所述的方法中,步骤4)所述的缓冲液和生物样本固定液的灌注用量均为5‑12ml,可以根据小鼠体型大小和冲洗要求进行实际灌注量的调节。
[0027] 本发明所述的方法中,步骤5)所述的静脉显色灌注液的灌注用量是步骤6)所述的动脉显色灌注液的灌注用量的1.8‑2.4倍,优选2倍。
[0028] 本发明所述的方法中,步骤5)所述的静脉显色灌注液的灌注速度优选0.1‑0.2ml/s;更优选0.15ml/s。本发明所述的方法中,步骤6)所述的动脉显色灌注液的灌注速度优选0.05‑0.15ml/s;更优选0.1ml/s。对小鼠动静脉进行具有区分度的联合显像具有重要的临床和教学意义。在临床上,深入了解脑血管畸形的病变起源是发生在动脉还是静脉、神经血管重塑过程起源是发生在动脉还是静脉等问题,能够帮助我们更好的探索疾病机制。在教学中,学生也需要基于小鼠动静脉具有区分度的联合显像才能更好地学习小鼠脑/胃肠道动静脉的解剖学信息(例如肠系膜血管中动脉和静脉的分布情况)以及血流动力学过程(例如肠系膜动脉和肠系膜静脉的血流速度、血管内阻力等)。但是现有技术目前缺乏区分小鼠动脉和静脉的特异性标志物,现有的研究方法不能对小鼠脑或胃肠道动静脉进行定位,因而在临床上和教学中都无法深入研究、探索血管疾病的发生发展过程。
[0029] 与现有技术相比,本发明的显像方法的核心在于先后依次灌注含不同粒径微粒(明胶微粒和乳胶微粒)的两种灌注液,并对两种灌注液中的微粒分别采用不同的颜料染色,由此本发明的方法结合了粒径差和色差两种原理,最终可在小鼠的动脉和静脉内分别以肉眼可识别的色差显像,由此显著区分了小鼠的动脉和静脉血管。本发明方法中使用的静脉显色灌注液和动脉显色灌注液分别含有明胶微粒和乳胶微粒,它们在灌注显像过程中发挥着多方面的作用:一方面作为灌注液的填充组分发挥填充固化作用;另一方面作为不同颜色染料的载体,可基于不同的粒径分别到达不同的血管部位,由此将不同的颜料带入不同的血管部位用于显像;再一方面,它们还作为各自所在灌注液的粘度调节剂发挥作用。本发明中,由于静脉显色灌注液和动脉显色灌注液本身都具有一定的易凝固性质,所以基于常规的小鼠血管灌注速度应用时,需要它们各自具有合适的浓度和流动性,这样才能够恰到好处地实现顺利灌注和有效显色区分动静脉。静脉显色灌注液中合适的明胶颗粒浓度会为灌注液带来合适的粘度和流动性,使静脉显色灌注液在常规灌注速度下,既能够顺利到达静脉端又能够在到达后尽快凝固而不会流失;此外合适的明胶颗粒浓度还会让静脉显色灌注液中的显色成分更好地与明胶颗粒结合。同理,动脉显色灌注液中合适的乳胶颗粒浓度会为灌注液带来合适的粘度和流动性,同时还能让显色成分与乳胶颗粒充分有效地结合,使动脉显色灌注液在常规灌注速度下,既能够顺利到达小动脉,又不会有多余的显色成分通过毛细血管进入静脉端造成显色干扰和流失。本发明人通过大量试验筛选得到了最合适的灌注液配比浓度,按照本发明方法进行灌注后,含有较小粒径的明胶微粒的静脉显色灌注液能够从动脉透过毛细血管完全进入静脉端,而含有较大粒径乳胶微粒的动脉显色灌注液能从动脉灌注点顺利到达小动脉且不会过早凝固。由此实现了不同颜色的灌注液分别进入动脉和静脉显色,从而使研究人员可以根据灌注后血管的颜色来区分小鼠动脉血管(例如通常对动脉灌注红色灌注液)和静脉血管(例如通常对静脉灌注蓝色灌注液),可实现对小鼠的动脉和静脉血管进行精确而充分的定位定性,有利于探究动静脉血管的解剖结构和疾病的发生发展过程。
[0030] 总之,本发明所述的灌注显像方法能够实现小鼠动静脉的联合显像,可以广泛应用于神经病学研究和胃肠血管显像。
[0031] 所述的神经病学研究包括:脑血管病理学研究或神经血管重塑研究;所述的脑血管病理学研究中,可使用本发明所述的组合制剂区分小鼠脑动脉和静脉,从而定位、观察和探索脑血管疾病(动脉瘤、动静脉畸形、动静脉瘘等)的发生发展过程;所述的神经血管重塑研究包括小鼠脑血管发育的研究或神经退行性疾病(例如阿尔茨海默病)的研究,通过使用本发明所述的组合制剂进行动静脉血管联合显像,可以观察和研究小鼠脑血管的新生、重塑、扩张,从而揭示神经血管重塑的机制和影响因素。
[0032] 所述的胃肠血管显像可用于胃肠道血管解剖学研究(通过胃肠道动静脉显像了解有关胃肠道血管网络的详细解剖结构信息,进而帮助了解胃肠道动脉和静脉的分布情况),或用于血流动力学研究(帮助观察、测量小鼠胃肠动脉或者静脉的血流动力学特性,如血管阻力参数等)。附图说明
[0033] 图1是按照本发明实施例3的方法灌注后小鼠脑组织取材的照片。
[0034] 图2是按照本发明实施例3的方法灌注后小鼠胃肠道取材的照片。
[0035] 图3是按照对比例5的方法灌注后小鼠脑组织取材的照片。
[0036] 图4是按照对比例5的方法灌注后小鼠胃肠道取材的照片。
[0037] 图5是按照对比例6的方法灌注后小鼠脑组织取材的照片。
[0038] 图6是按照对比例6的方法灌注后小鼠胃肠道取材的照片。
[0039] 图7是按照对比例7的方法灌注后小鼠脑组织取材的照片。

具体实施方式

[0040] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单的介绍,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来说,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0041] 显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例,不能理解为对本发明专利范围的限制。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,均属于本发明保护的范围。
[0042] 实施例1.制备小鼠动静脉联合显像灌注液
[0043] 一种用于小鼠动静脉联合显像的灌注液,包括静脉显色灌注液和动脉显色灌注液。
[0044] 静脉显色灌注液的配制方法包括:向50ml离心管内加入1.2g明胶(Servicebio CAS:9000‑70‑8,Lot:CR2101053)、30.0ml生理盐水(中国大冢制药有限公司,国药准字H12020024)和1ml酞菁蓝颜料(马利Z6032国画颜料中国画山水画颜料451酞菁蓝),然后在80℃水浴锅中加热使明胶熔化,搅拌至颜色混匀后,通过四层粗纱布过滤后备用。
[0045] 动脉显色灌注液的配制方法包括:向50ml离心管内加入14.5ml生理盐水(中国大冢制药有限公司,国药准字H12020024)、14.0ml乳胶溶液(latex)和4ml胭脂红色(马利Z6032国画颜料中国画山水画颜料400胭脂红色),充分搅拌至颜色混匀后,通过四层粗纱布过滤后备用。
[0046] 注意以上各制剂应现用现配,以避免配制后时间太长导致灌注液发生凝固。
[0047] 实施例2.制备小鼠动静脉联合显像灌注液
[0048] 一种用于小鼠动静脉联合显像的灌注液,包括静脉显色灌注液和动脉显色灌注液。
[0049] 静脉显色灌注液的配制方法包括:向50ml离心管内加入1.0g明胶(Servicebio CAS:9000‑70‑8,Lot:CR2101053)、32ml生理盐水(中国大冢制药有限公司,国药准字H12020024)和1.2ml酞菁蓝颜料(马利Z6032国画颜料中国画山水画颜料451酞菁蓝),然后在80℃水浴锅中加热使明胶熔化,搅拌至颜色混匀后,通过四层粗纱布过滤后备用。
[0050] 动脉显色灌注液的配制方法包括:向50ml离心管内加入14ml生理盐水(中国大冢制药有限公司,国药准字H12020024)、15ml乳胶溶液(latex)和3ml胭脂红色(马利Z6032国画颜料中国画山水画颜料400胭脂红色),充分搅拌至颜色混匀后,通过四层粗纱布过滤后备用。
[0051] 注意以上各制剂应现用现配,以避免配制后时间太长导致灌注液发生凝固。
[0052] 对比例1.对照的联合显像灌注液I(静脉显色灌注液浓度适中;动脉显色灌注液浓度过高)
[0053] 一种用于小鼠动静脉联合显像的灌注液,包括静脉显色灌注液和动脉显色灌注液。
[0054] 静脉显色灌注液的配制方法包括:向50ml离心管内加入1.2g明胶(Servicebio CAS:9000‑70‑8,Lot:CR2101053)、30ml生理盐水(中国大冢制药有限公司,国药准字H12020024)和1.0ml酞菁蓝颜料(马利Z6032国画颜料中国画山水画颜料451酞菁蓝),然后在80℃水浴锅中加热使明胶熔化,搅拌至颜色混匀后,通过四层粗纱布过滤后备用。
[0055] 动脉显色灌注液的配制方法包括:向50ml离心管内加入13ml生理盐水(中国大冢制药有限公司,国药准字H12020024)、16ml乳胶溶液(latex)和4ml胭脂红色(马利Z6032国画颜料中国画山水画颜料400胭脂红色),充分搅拌至颜色混匀后,通过四层粗纱布过滤后备用。
[0056] 注意以上各制剂应现用现配,以避免配制后时间太长导致灌注液发生凝固。
[0057] 对比例2.对照的联合显像灌注液II(静脉显色灌注液浓度适中;动脉显色灌注液浓度过低)
[0058] 一种用于小鼠动静脉联合显像的灌注液,包括静脉显色灌注液和动脉显色灌注液。
[0059] 静脉显色灌注液的配制方法包括:向50ml离心管内加入1.2g明胶(Servicebio CAS:9000‑70‑8,Lot:CR2101053)、30ml生理盐水(中国大冢制药有限公司,国药准字H12020024)和1.0ml酞菁蓝颜料(马利Z6032国画颜料中国画山水画颜料451酞菁蓝),然后在80℃水浴锅中加热使明胶熔化,搅拌至颜色混匀后,通过四层粗纱布过滤后备用。
[0060] 动脉显色灌注液的配制方法包括:向50ml离心管内加入17ml生理盐水(中国大冢制药有限公司,国药准字H12020024)、13ml乳胶溶液(latex)和4ml胭脂红色(马利Z6032国画颜料中国画山水画颜料400胭脂红色),充分搅拌至颜色混匀后,通过四层粗纱布过滤后备用。
[0061] 注意以上各制剂应现用现配,以避免配制后时间太长导致灌注液发生凝固。
[0062] 对比例3.对照的联合显像灌注液III(动脉显色灌注液浓度过低;静脉显色灌注液浓度过低)
[0063] 一种用于小鼠动静脉联合显像的灌注液,包括静脉显色灌注液和动脉显色灌注液。
[0064] 静脉显色灌注液的配制方法包括:向50ml离心管内加入0.4g明胶(Servicebio CAS:9000‑70‑8,Lot:CR2101053)、32ml生理盐水(中国大冢制药有限公司,国药准字H12020024)和0.8ml酞菁蓝颜料(马利Z6032国画颜料中国画山水画颜料451酞菁蓝),然后在80℃水浴锅中加热使明胶熔化,搅拌至颜色混匀后,通过四层粗纱布过滤后备用。
[0065] 动脉显色灌注液的配制方法包括:向50ml离心管内加入16ml生理盐水(中国大冢制药有限公司,国药准字H12020024)、13.5ml乳胶溶液(latex)和4ml胭脂红色(马利Z6032国画颜料中国画山水画颜料400胭脂红色),充分搅拌至颜色混匀后,通过四层粗纱布过滤后备用。
[0066] 注意以上各制剂应现用现配,以避免配制后时间太长导致灌注液发生凝固。
[0067] 对比例4.对照的联合显像灌注液IV(动脉显色灌注液浓度适中;静脉显色灌注液浓度过低)
[0068] 一种用于小鼠动静脉联合显像的灌注液,包括静脉显色灌注液和动脉显色灌注液。
[0069] 静脉显色灌注液的配制方法包括:向50ml离心管内加入0.4g明胶(Servicebio CAS:9000‑70‑8,Lot:CR2101053)、32ml生理盐水(中国大冢制药有限公司,国药准字H12020024)和0.8ml酞菁蓝颜料(马利Z6032国画颜料中国画山水画颜料451酞菁蓝),然后在80℃水浴锅中加热使明胶熔化,搅拌至颜色混匀后,通过四层粗纱布过滤后备用。
[0070] 动脉显色灌注液的配制方法包括:向50ml离心管内加入14.5ml生理盐水(中国大冢制药有限公司,国药准字H12020024)、14.0ml乳胶溶液(latex)和4ml胭脂红色(马利Z6032国画颜料中国画山水画颜料400胭脂红色),充分搅拌至颜色混匀后,通过四层粗纱布过滤后备用。
[0071] 注意以上各制剂应现用现配,以避免配制后时间太长导致灌注液发生凝固。
[0072] 实施例3.小鼠血管灌注动静脉联合显像
[0073] 使用本发明实施例1的灌注液对小鼠进行血管灌注,灌注方法如下:
[0074] (1)准备灌注耗材及溶液:PBS(Solarbio,Cat:No.P1020,Lot.No.2306002)、PFA(Biosharp,REF:BL539A,LOT:23206277)、10%水合氯、实施例1的联合显像灌注液(包括静脉显色灌注液和动脉显色灌注液)、四环牌碘伏消毒液(北京四环卫生药械厂有限公司)、备皮刀、眼科剪、显微镊子、显微剪刀、5ml注射器2支,1ml注射器2支、5ml冲洗器1支。
[0075] (2)操作流程:
[0076] 1)准备小鼠:通过腹腔注射10%水合氯醛麻醉小鼠,麻醉剂量为0.01ml/g小鼠,如果小鼠状态较差,可酌情减少注射量。
[0077] 2)准备手术区域:对小鼠进行剃毛和消毒后,在腹部手术区域(腹部正中线)做一纵向切口。
[0078] 3)分离腹主动脉和下腔静脉:通过腹部切口暴露腹主动脉和下腔静脉,腹主动脉位于小鼠腹腔中线位置,用镊子将肠管向两侧牵拉后即可充分显露目标血管。
[0079] 4)插入导管:在腹主动脉上剪一个小切口,插入冲洗器管头,用11‑0缝合线固定。
[0080] 5)在小鼠下腔静脉上剪一小口;
[0081] 6)灌注10ml PBS溶液。
[0082] 7)灌注10ml PFA溶液用于固定小鼠组织。
[0083] 8)按照常规小鼠血管灌注速度,例如0.15ml/s的速度,灌注2ml静脉显色灌注液,直到可以看到肝脏、胃肠道血管、耳缘静脉变蓝。
[0084] 9)按照常规小鼠血管灌注速度,例如0.1ml/s的速度,灌注1ml动脉显色灌注液,直到可以看到肠道动脉变红色。
[0085] 注意在灌注过程中注射器内不能有气体。灌注完成后,将小鼠脑组织取材可以看到小鼠脑表面非常清晰的血管结构,如图1所示,蓝色为静脉,红色为动脉;同时将小鼠胃肠组织取材可以观察到非常清晰的小鼠红蓝相间的胃肠道血管结构,如图2所示,其中蓝色为静脉,红色为动脉。从图1、2可以看出,按照本发明的方法灌注后,小鼠的动脉和静脉能够联合显像,显像颜色区别明显,结构一目了然。
[0086] 灌注结束后可以根据实验需求,取出小鼠组织或器官后进行进一步的分析,可以通过显微镜观察、采集图像、制备切片等详细分析和描述血管和组织的结构。
[0087] 对比例5.小鼠血管灌注动静脉联合显像
[0088] 按照实施例3的方法,对与上述被灌注小鼠没有显著性差异的随机分组的小鼠灌注对比例1的对照的联合显像灌注液I,灌注结果如图3、4所示。由于动脉显色灌注液中乳胶浓度过高,灌注液粘度大,灌注阻力大,极易凝块,按照常规灌注速度灌注0.2ml后感觉灌注阻力特别大,遂停止灌注。灌注后在小鼠脑组织仅能看到蓝色血管构筑,即小鼠脑动脉和静脉均呈现蓝色(图3);灌注后小鼠胃肠道取材可以看到胃肠道血管基本上全部被染成蓝色,即图4中显示蓝色的血管包括了动脉和静脉结构(图4)。由此可以看出,如果动脉显色灌注液配比不合适导致乳胶微粒浓度过高时,就会导致小鼠灌注动静脉联合显色失败,无法区分小鼠动脉和静脉血管结构。
[0089] 对比例6.小鼠血管灌注动静脉联合显像
[0090] 按照实施例3的方法,对与上述被灌注小鼠没有显著性差异的随机分组的小鼠灌注对比例2的对照的联合显像灌注液II,结果如图5、6所示。由于动脉显色灌注液中乳胶浓度过低,其中的红色着色剂分子大部分未能与乳胶颗粒结合,容易随着粘度低、流动性强的灌注液进入静脉端,导致静脉部分也被红色着色剂着色。从图5中可以看到,小鼠脑血管几乎全部被染成红色,难以区分。此外如图6所示,小鼠胃肠道取材虽然隐约看到显示蓝色的一部分静脉,但大部分静脉和动脉一起显示为红色,无法观察到像实施例3(图2)那样非常清晰明显的红蓝相间的胃肠道血管结构,可见灌注效果差。
[0091] 对比例7.小鼠血管灌注动静脉联合显像
[0092] 按照实施例3的方法,对与上述被灌注小鼠没有显著性差异的随机分组的小鼠灌注对比例3的对照的联合显像灌注液III,结果如图7所示,由于静脉显色灌注液浓度过低,不易凝固塑形,按照常规灌注速度灌注浓度较低的动脉显色灌注液,灌注后可见小鼠静脉显色灌注液从腹腔静脉切口流失,而动脉显色灌注液中因乳胶浓度过低,导致显色成分难以与乳胶颗粒结合,乳胶颗粒因粒径较大不能通过毛细血管进入静脉端,而显色成分却通过毛细血管进入静脉端亦发生流失,所以最终灌注结果动静脉都没能显像。提示经过较低浓度的静脉显色灌注液和动脉显色灌注液序贯灌注后,小鼠脑部动静脉显示效果均较差。
[0093] 以上案例提示我们动脉显色灌注液和静脉显色灌注液的浓度及粘度可以在极大程度上影响灌注结果,浓度太高或太低都会导致灌注失败,无法很好的显示小鼠动静脉血管结构。