用于多重PCR检测血液寄生虫的引物组及试剂盒

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用于多重PCR检测血液寄生虫的引物组及试剂盒
申请号	CN201610800142.5	申请日	2016-08-31	公开(公告)号	CN106319060A	公开(公告)日	2017-01-11
申请人	北京卓诚惠生生物科技股份有限公司;			发明人	王雷; 王彦威; 王晓艳; 张志强;
摘要	本发明提供了多重PCR检测八种血液寄生虫用引物组，其中，该引物组包括SEQ ID NO.1和3-18所示的引物。本发明还提供了一种多重PCR检测八种血液寄生虫的试剂盒，所述试剂盒包括本发明所述的多重PCR引物组和DNA聚合酶。通过上述技术方案本发明显著地提高了对八种血液寄生虫同时进行检测的最低检出限、特异性和简便性。
权利要求	1.一种多重PCR检测八种血液寄生虫用引物组，其中，该引物组包括SEQ ID NO.1和3- 18所示的引物；所述八种血液寄生虫包括间日疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫、恶性疟原虫、诺氏疟原虫、刚地弓形虫、利什曼原虫和巴贝斯虫。 2.根据权利要求1所述的引物组，其中，所述引物组还包括SEQ ID NO.19-20所示的引物。 3.八种血液寄生虫的检测方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：(1)提取待测样本的总DNA； (2)以所述总DNA为模板，并使用权利要求1或2所述的引物组，进行多重PCR反应，获得多重PCR扩增后的物料； (3)对所述多重PCR扩增后的物料进行核酸电泳检测，得到核酸电泳检测的结果；如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有397bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有间日疟原虫；如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有452bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有三日疟原虫；如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有161bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有卵形疟原虫；如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有308bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有恶性疟原虫；如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有337bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有诺氏疟原虫；如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有181bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有刚地弓形虫；如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有202bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有利什曼原虫；如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有249bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有巴贝斯虫。 4.根据权利要求3所述的检测方法，其中，SEQ ID NO.3-20所示的引物的最终使用浓度各自为0.1-0.8μM，SEQ ID NO.1所示的引物的最终使用浓度为0.4-0.8μM。 5.根据权利要求3或4所述的检测方法，其中，步骤(2)的反应条件包括如下a-h的程序：a：94-96℃，3-6min； b：94-96℃，15-60s， c：50-60℃，15-60s， d：71-73℃，60-120s，进行10-15个b-d的循环； e：94-96℃，15-60s， f：55-65℃，15-60s， g：71-73℃，30-60s，进行30-35个e-g的循环； h：71-73℃，5-10min。 6.根据权利要求3或4所述的检测方法，其中，所述核酸电泳检测包括核酸凝胶电泳和/或核酸毛细管电泳。 7.一种多重PCR检测八种血液寄生虫的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括权利要求1或2所述的多重PCR引物组和DNA聚合酶；所述八种血液寄生虫包括间日疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫、恶性疟原虫、诺氏疟原虫、刚地弓形虫、利什曼原虫和巴贝斯虫。 8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR反应缓冲液和dNTP。 9.权利要求1或2所述的引物组在制备检测八种血液寄生虫的试剂盒中的用途；其中，所述八种血液寄生虫包括间日疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫、恶性疟原虫、诺氏疟原虫、刚地弓形虫、利什曼原虫和巴贝斯虫。
说明书全文	用于多重PCR检测血液寄生虫的引物组及试剂盒技术领域 [0001] 本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及多重PCR检测八种血液寄生虫引物组和试剂盒及其检测方法。背景技术 [0002] 血液寄生虫，指寄生于动物体血液或血细胞中的寄生虫。一般可能会造成血粘稠度增高、血栓、脑供血不足及贫血营养不良等，对健康危害极大。凡寄生于血液和血细胞内的寄生虫均可在血液中查到，这些原虫寄生于人的血液中和红细胞内，需通过血液检查或骨髓检查来进行确诊。我国常见的血液寄生虫有：疟疾(恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、三日疟原虫及诺氏疟原虫)、刚地弓形虫、利什曼原虫和巴贝斯虫。 [0003] 血液寄生虫的实验室诊断方法大致可以分为三类：病原学诊断方法、血清学诊断方法和分子生物学诊断法。病原学检查具确诊意义，方法主要有涂片染色法、动物接种分离法或细胞培养法查找虫体等。血清诊断已成为当今广泛应用的诊断手段，方法种类较多，主要有染色试验、间接血凝试验(IHA)、间接免疫荧光接体试验(IFA)及酶联免疫吸附试验(ELISA)。但病原学、血清学检测方法存在耗时较长，灵敏度底；且检测通量低，难以实现自动化结果分析。不同寄生虫间存在交叉反应性等因素均有可能影响检测结果。 [0004] 分子生物学技术核酸检测诊断为病原生物的检测提供了快速、高效、灵敏的诊断新方法。PCR技术以其高敏感性、高特异性等特点，被广泛应用于生命科学的各个领域。现已有应用于多种血液寄生虫的核酸检测报道，并显示出较高的敏感性和较强的特异性。但传统的PCR技术非常容易受到污染而产生假阳性，而且一般只能进行疟原虫的检测，要进行虫种的鉴别就必须设计多对引物，进行多轮PCR反应。在我国，对血液寄生虫的研究往往局限于种属间的鉴别或是虫体的鉴定。如专利公开号为CN103911447的专利公开了：采用不对称PCR法结合液相芯片技术建立了检测疟原虫的引物探针法；专利公开号为CN104263847的专利申请建立了用于四种疟原虫(恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫及三日疟原虫)多重荧光分型检测的引物探针组和试剂盒，可以对四种疟原虫进行分型鉴别；如专利公开号为CN102010910的专利申请，建立了基于环介导等温扩增技术的疟原虫属和种的核酸筛查方法实现对四种疟原虫的分型鉴别；如专利公开号为CN101613751的专利申请，使用实时荧光PCR方法建立了快速检测弓形虫的检测试剂盒；如专利公开号为CN101613752的专利申请，建立了快速检测杜氏利什曼原虫的荧光定量PCR试剂盒，用于杜氏利什曼原虫的定性定量检测；如专利公开号为CN103710433的专利，建立了用于检测巴贝斯虫的引物和实时荧光定量PCR试剂盒。国外可见专利与国内专利类似，多见使用PCR技术检测寄生虫的种属，如日本专利2007-282601建立了一对特异性引物用于检测刚地弓形虫；美国专利8936920建立了四种疟原虫属和种鉴定的引物组，用于疟疾的诊断。但是，上述专利只能对1-4种血液寄生虫的核酸进行同时性检测，不能在同一反应体系中完成8种常见的血液寄生虫的同时性检测，因此不利于相关病原的快速检测。且检测的敏感性、特异性不尽如人意，对病原体繁殖不活跃或者潜伏期感染的样本，有漏检的风险。发明内容 [0005] 本发明的目的在于解决现有血液寄生虫检测漏检率较高和难以全面筛检的问题，提供一种新的血液寄生虫检测引物和方法。 [0006] 为达到以上目的，本发明提供了一种多重PCR检测八种血液寄生虫用用引物组，其中，该引物组包括SEQ ID NO.1和3-18所示的引物；所述八种血液寄生虫包括间日疟原虫(Plasmodiμm vivax)、三日疟原虫(Plasmodiμm malariae)、卵形疟原虫(Plasmodiμm ovale)、恶性疟原虫(Plasmodiμm falciparμm)、诺氏疟原虫(Plasmodiμm knowlesi)、刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)、利什曼原虫(Leishmania spp)和巴贝斯虫(Babesiidae ssp)。 [0007] 本发明还提供了八种血液寄生虫的检测方法，该方法包括如下步骤： [0008] (1)提取待测样本的总DNA； [0009] (2)以所述总DNA为模板，并使用本发明所述的引物组，进行多重PCR反应，获得多重PCR扩增后的物料； [0010] (3)对所述多重PCR扩增后的物料进行核酸电泳检测，得到核酸电泳检测的结果； [0011] 如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有397bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有间日疟原虫； [0012] 如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有452bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有三日疟原虫； [0013] 如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有161bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有卵形疟原虫； [0014] 如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有308bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有恶性疟原虫； [0015] 如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有337bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有诺氏疟原虫； [0016] 如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有181bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有刚地弓形虫； [0017] 如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有202bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有利什曼原虫； [0018] 如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有249bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有巴贝斯虫。 [0019] 本发明还提供了多重PCR检测八种血液寄生虫的试剂盒，所述试剂盒包括本发明所述的引物组和DNA聚合酶。 [0020] 另一方面，本发明还提供了如上所述的引物组在制备检测八种血液寄生虫的试剂盒中的用途；其中，所述八种血液寄生虫包括间日疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫、恶性疟原虫、诺氏疟原虫、刚地弓形虫、利什曼原虫和巴贝斯虫。 [0021] 通过上述技术方案，本发明建立了八种血液寄生虫多重PCR检测方法，能够克服其他技术手段多重检测能力的不足之处，达到以下的检测效果： [0022] (一)多重检测覆盖全面 [0023] 本发明所建立的检测方法能够在一个PCR反应中同时筛查包括间日疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫、恶性疟原虫、诺氏疟原虫、刚地弓形虫、利什曼原虫和巴贝斯虫的八种常见血液寄生虫，可以快速获得检测结果，节省时间、人力和物力成本。 [0024] (二)特异性高 [0025] 本发明所建立的检测方法特异性主要体现在一整套引物的特异性，所有引物都经过blast比对分析，具有高度的保守性和特异性；同时经过特异性验证，能够很好的区分与检测目标生存环境相似的细菌和其他寄生虫，包括金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、单核细胞增生性李斯特氏菌、无乳链球菌、大肠埃希氏菌、脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、A族链球菌、伯氏疟原虫、马来丝虫、卫氏并殖吸虫、旋毛虫、猪囊尾蚴以及广州管圆线虫等，证明检测方法具有高度的特异性，能够将非目标细菌和寄生虫准确分辨出来。 [0026] (三)灵敏度高 [0027] 本发明所建立的检测方法能够实现八个目标寄生虫核酸的同时筛检，在每一个反应体系中每个目标寄生虫核酸的检测灵敏度可达到0.0002ng/μl。本发明灵敏度提高的主要原因是本发明针对所有目标基因的特异性引物对序列设计了特定的LHP序列，LHP序列中的同源通用引物能够在第二阶段PCR中提高多重PCR反应的扩增效率，降低多重PCR反应的非特异性扩增和引物二聚体的产生，而LHP中的6个碱基连接序列能够保证同源通用引物扩增不同毒力基因时具有相同的扩增效率，避免多重PCR扩增过程中不同目标基因产量的失衡，从而在总体上提高多重PCR检测的灵敏度。 [0028] (四)成本较低 [0029] 本发明所建立的多重PCR检测方法在操作性上降低了人力成本和时间成本，原来单重检测需要八次人工和八倍时间，现在使用此方法只需要一次人工和一次反应的时间；该多重检测方法同时节省了重复检测同一个样本的试剂消耗，最大可节省50％以上的试剂成本。 [0030] (五)预防假阴性结果 [0031] 本发明反应体系中添加的阳性内对照，可以有效的提示因为反应体系抑制原因造成的假阴性检测结果。 [0032] 综上所述，本发明提供了一种多重PCR检测八种常见血液寄生虫的引物组，并建立一种基于普通PCR平台的多重PCR检测方法。本发明采用高灵敏度和特异性的引物序列，保证检测结果的质量；该检测方法操作简单，省时省力；检测通量高，试剂耗材成本低；可以直接对血液样本进行检测，相比较于传统检测方法，将能够提前24-72小时锁定可疑寄生虫；对检测平台和检测人员的要求低，能够在检验检疫第一线广泛推广。 [0033] 本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。附图说明 [0034] 附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中： [0035] 图1是使用试剂盒对15种无关病原体基因组DNA检测的毛细管电泳结果。 [0036] 其中，泳道A1：金黄色葡萄球菌；泳道A2：表皮葡萄球菌；泳道A3：单核细胞增生性李斯特氏菌；泳道A4：无乳链球菌；泳道A5：大肠埃希氏菌；泳道A6：脑膜炎奈瑟菌；泳道A7：流感嗜血杆菌；泳道A8：肺炎链球菌；泳道A9：A族链球菌；泳道A10：伯氏疟原虫；泳道A11：马来丝虫；泳道A12：卫氏并殖吸虫；泳道A13：旋毛虫；泳道A14：猪囊尾蚴；泳道A15：广州管圆线虫；M：100-1500bp Size Marker；PC：阳性对照；NTC：阴性对照。 [0037] 图2是使用试剂盒对八种血液寄生虫基因组DNA检测的毛细管电泳结果。 [0038] 其中，泳道B1：间日疟原虫；泳道B2：三日疟原虫；泳道B3：卵形疟原虫；泳道B4：恶性疟原虫；泳道B5：诺氏疟原虫；泳道B6：刚地弓形虫；泳道B7：利什曼原虫；泳道B8：巴贝斯虫；M：100-1500bp Size Marker；PC：阳性对照；NTC：阴性对照。具体实施方式 [0039] 以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。 [0040] 本发明提供了一种多重PCR检测八种血液寄生虫用引物组，其中，该引物组包括SEQ ID NO.1和3-18所示的引物；所述八种血液寄生虫包括间日疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫、恶性疟原虫、诺氏疟原虫、刚地弓形虫、利什曼原虫和巴贝斯虫。 [0041] 其中，所述引物组还包括SEQ ID NO.19-20所示的引物。SEQ ID NO.19-20所示的引物是以pET28a质粒为模板设计的一对引物，作为阳性内对照引物对。 [0042] 本发明的PCR引物组检测目标基因包括间日疟原虫18S核糖体RNA基因；三日疟原虫18S核糖体RNA基因；卵形疟原虫18S核糖体RNA基因；恶性疟原虫18S核糖体RNA基因；诺氏疟原虫18S核糖体RNA基因；刚地弓形虫甘油-3-磷酸脱氢酶基因；利什曼原虫动基体DNA基因；巴贝斯虫18S核糖体RNA基因(如表1所示)。 [0043] 表1八种血液寄生虫多重PCR检测目标基因 [0044]目标寄生虫检测目标基因检测目标基因代码间日疟原虫 18S核糖体RNA p.v-18S 三日疟原虫 18S核糖体RNA p.m-18S 卵形疟原虫 18S核糖体RNA p.o-18S 恶性疟原虫 18S核糖体RNA p.f-18S 诺氏疟原虫 18S核糖体RNA p.k-18S 刚地弓形虫甘油-3-磷酸脱氢酶基因 T-B1 利什曼原虫动基体DNA L-km 巴贝斯虫 18S核糖体RNA B-18S [0045] SEQ ID NO.3-18所示的8对引物序列中均含有与之匹配的LHP序列(基于连接序列的同源通用引物based on ligation-sequence homogenous Primer，LHP)。LHP序列与每条特异性引物连接后使用，同源通用引物单独使用，序列详见表2。 [0046] 表2八种血液寄生虫多重PCR引物汇总表 [0047] [0048] 在本发明的一种实施方式中，涉及多重PCR检测八种血液寄生虫的检测方法，其特征在于，该方法包括如下步骤： [0049] (1)提取待测样本的总DNA； [0050] (2)以所述总DNA为模板，并使用本发明的引物组，进行多重PCR反应，获得多重PCR扩增后的物料； [0051] (3)对所述多重PCR扩增后的物料进行核酸电泳检测，得到核酸电泳检测的结果； [0052] 如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有397bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有间日疟原虫； [0053] 如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有452bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有三日疟原虫； [0054] 如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有161bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有卵形疟原虫； [0055] 如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有308bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有恶性疟原虫； [0056] 如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有337bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有诺氏疟原虫； [0057] 如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有181bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有刚地弓形虫； [0058] 如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有202bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有利什曼原虫； [0059] 如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有249bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有巴贝斯虫。 [0060] 其中，优选地，SEQ ID NO.3-20所示的引物的最终使用浓度各自为0.1-0.8μM，SEQ ID NO.1所示的引物的最终使用浓度为0.4-0.8μM。 [0061] 其中，优选地，多重PCR反应的条件包括如下a-h的步骤： [0062] a：94-96℃，3-6min； [0063] b：94-96℃，15-60s， [0064] c：50-60℃，15-60s， [0065] d：71-73℃，60-120s，进行10-15个b-d的循环； [0066] e：94-96℃，15-60s， [0067] f：55-65℃，15-60s， [0068] g：71-73℃，30-60s，进行30-35个e-g的循环； [0069] h：71-73℃，5-10min。 [0070] 在本发明的一种实施方式中，多重PCR反应体系的配置如下： [0071] Taq DNA聚合酶1-2U，5×PCR buffer(Tris-HCl 100mM(pH8.3)，KCl250mM，tween-20 0.2％)5μL，10mm的dNTP 0.5-1.5μL，25mM的MgCl21-5μL，10x引物混合物2.5μL(包括阳性内对照在内的每个待测目标的长引物浓度1μm-8μm，同源通用引物浓度4μm-8μm)，pET28a 0.0003-0.01ng，DNA模板2-5μL，超纯水补至25μL。 [0072] 其中，所述待测样本可以包括但不限于食品、药品、排泄物、呕吐物和体液中的至少一种。优选地，本发明的多重PCR检测方法不用于诊断。或者说，检测结果与疾病是否发生没有一一对应的相关性，不属于诊断结果，但是检测结果能够作为中间信息，供临床医生参考。 [0073] 其中，优选地，所述核酸电泳检测包括核酸凝胶电泳和/或核酸毛细管电泳。 [0074] 在本发明的一种实施方式中，采用QIaxcel全自动毛细管电泳分析仪作为结果分析的平台。基于QIaxcel的全自动操作和设定的智能化结果分析程序，从而实现结果的自动判定分析。 [0075] 本发明的一个方面还提供了一种多重PCR检测八种血液寄生虫的试剂盒，其中，该试剂盒包括本发明所述的多重PCR引物组和DNA聚合酶；所述八种血液寄生虫包括间日疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫、恶性疟原虫、诺氏疟原虫、刚地弓形虫、利什曼原虫和巴贝斯虫。 [0076] 优选的，所述试剂盒还包括PCR反应所需的PCR反应试剂，所述反应试剂可以为PCR反应缓冲液和dNTP。 [0077] 另一方面，本发明还提供了如上所述的引物组在制备检测八种血液寄生虫的试剂盒中的用途；其中，所述八种血液寄生虫包括间日疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫、恶性疟原虫、诺氏疟原虫、刚地弓形虫、利什曼原虫和巴贝斯虫。 [0078] 下面结合实施例对本发明进行说明。 [0079] 实施例1 [0080] 1、引物合成：进行SEQ ID NO.1和3-20的引物合成。以物质的量为单位，将SEQ ID NO.3-20的引物各取1份，与4份的SEQ ID NO.1的引物混合，构成本实施例的引物组。引物汇总表见表3。 [0081] 表3 PCR引物序列汇总表 [0082] [0083] [0084] 2、特异性验证： [0085] 选择15种无关病原体作为模拟干扰样本，均来自中国医学细菌保藏管理中心：分别提取金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、单核细胞增生性李斯特氏菌、无乳链球菌、大肠埃希氏菌、脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、A族链球菌、伯氏疟原虫、马来丝虫、卫氏并殖吸虫、旋毛虫、猪囊尾蚴和广州管圆线虫的基因组。 [0086] 上述模拟干扰样本用于特异性评估，分别进行总核酸的提取，每种样本提取得到的总核酸溶解于TE缓冲液中，浓度为1ng/μL。 [0087] 使用上述得到的每种样本的总核酸分别与等量的阳性内对照(pET28a质粒)混合，作为模板，用上述得到的引物组进行多重PCR扩增。以八种血液寄生虫混合模板作为阳性对照。 [0088] 按照如下操作配制反应体系：5U/μL Taq DNA聚合酶0.4μL，5×PCR缓冲液(Tris·HCl 100mM(pH8.3)，KCl 250mM，tween-20 0.2％)5μL，10mM的dNTP 0.75μL，25mM的MgCl2 2.5μL，10x引物混合物2.5μL，DNA模板5μL，超纯水补至25μL。引物浓度如表4所示。 [0089] 表4引物浓度表 [0090]引物编号 10×引物混合物 SEQ ID NO.1 8μM SEQ ID NO.3-20 2μM/每条引物 [0091] 反应的条件包括如下a-h的步骤：a：95℃，5min；b：95℃，15s，c：60℃，30s，d：72℃，60s，进行15个b-d的循环；e：95℃，15s，f：55℃，15s，g：72℃，30s，进行30个e-g的循环；h：72℃，5min。 [0092] 多重PCR产物置于QIAxcel全自动毛细管电泳分析仪中进行分析，结果显示，15种无关病原体样本的总核酸与等量的阳性内对照混合作为模板所进行的多重PCR全部扩增到了532bp的阳性内对照条带，但除阳性内对照条带外，均没有扩增出其它条带。由此证明，本实施例的引物组难以被无关病原体所干扰，具有较高的特异性(如图1所述)。 [0093] 实施例2 [0094] 1、多重PCR检测试剂盒的组建 [0095] 该试剂盒由2×反应体系缓冲液、DNA聚合酶、10×引物混合液、阳性对照、超纯水构成，其具体组分如下：2×PCR Buffer(Tris-HCl 40Mm(pH 8.3)，KCl 100mM，tween-20 0.08％，0.0006ng/μL pet28a，1mM dNTP、8mM MgCl2)；25×DNA聚合酶(2U/μL)；10×引物混合液(包括IAC在内的长引物对浓度各2μM，同源通用引物SEQ ID NO.1浓度为8μm)；阳性对照(含有8种血液寄生虫的混合模板，每种均为0.02ng/μl)。 [0096] 2、基因组的提取 [0097] 按照文献报道方法对八种血液寄生虫进行虫体的收集，采用DNA提取试剂盒提取DNA模板。 [0098] 3、反应体系的配制 [0099] 取200μL的PCR管配置25μL的反应体系，其配置如下：2×PCR Buffer12.5μL；DNA聚合酶1μL；10×引物混合物2.5μL；模板5μL，超纯水4μL。 [0100] 4、PCR反应 [0101] 将PCR管放入Bio-Rad C1000型PCR仪中，开启热盖后，按照如下程序进行PCR反应：a：95℃5min；b：95℃15s，c：50℃30s，d：72℃90s，b-d循环10个反应；e：95℃15s，f：60℃30s，g：72℃30s，e-g循环35个反应；h：72℃5min。 [0102] 5、全自动毛细管电泳分析PCR产物 [0103] 将PCR反应管放入全自动毛细管电泳仪Qiaxcel Advanced(凯捷公司)，使用DNA High Resolution Kit卡夹，选择15bp-2000bp的Alignment marker，100-1500bp的size marker，自动分析目标条带的大小。 [0104] 6、结果判断 [0105] 包括空白对照在内的所有泳道均至少有一个条带扩增，空白对照泳道有阳性内对照(532bp)的扩增，其他检测有目标条带和(或)阳性内对照的扩增，表明所有PCR反应均成立，排除假阴性的结果。否则视实验无效，需要重复。根据刚地弓形虫181bp、间日疟原虫397bp、三日疟原虫452bp、卵形疟原虫161bp、恶性疟原虫308bp、诺氏疟原虫337bp、利什曼原虫202bp、巴贝斯虫249bp。判定血液样本中是否含有寄生虫及寄生虫种类。 [0106] 结果显示，每个泳道都出现2条PCR产物，均扩增出了532bp的阳性内对照扩增条带，同时各泳道分别扩增出了刚地弓形虫181bp的扩增条带、间日疟原虫397bp的扩增条带、三日疟原虫452bp的扩增条带、卵形疟原虫161bp的扩增条带、恶性疟原虫308bp的扩增条带、诺氏疟原虫337bp的扩增条带、利什曼原虫202bp、巴贝斯虫249bp的扩增条带(如图2所示)。 [0107] 实施例3试剂盒的最低检出限试验 [0108] 评估用检测样本：选择间日疟原虫18S核糖体RNA基因，三日疟原虫18S核糖体RNA基因，卵形疟原虫18S核糖体RNA基因，恶性疟原虫18S核糖体RNA基因，诺氏疟原虫18S核糖体RNA基因，刚地弓形虫甘油-3-磷酸脱氢酶基因，利什曼原虫动基体DNA基因，巴贝斯虫18S核糖体RNA基因质粒模板。将8个模板的浓度分别调整至20ng/μl，等比例混合成综合模板。将综合模板梯度稀释成2ng/μl，0.2ng/μl，0.02ng/μl，0.002ng/μl，0.0002ng/μl， 0.00002ng/μl的检测样品。 [0109] 使用本发明试剂盒分别检测不同稀释度的模板。根据实施例2的方法进行操作和结果判断，试剂盒检测8个目标基因(不含IAC)的最低检出限试验结果如表5所示： [0110] 表5试剂盒检测血液寄生虫8个目标基因最低检出限试验结果 [0111] [0112] 从表5看出，试剂盒检测八种寄生虫核酸的最低检出限均为0.0002ng/μl，试剂盒总体的最低检出限为每个反应0.0002ng/μl。 [0113] 对比例1试剂盒检测与文献方法的比较 [0114] 按照文献《疟疾复合PCR检测系统的建立》中所提供的方法进行最低检出限试验，结果表明，文献方法检测间日疟原虫与恶性疟原虫核酸的最低检出限均为0.02ng/μl，显著低于本试剂盒对间日疟原虫与恶性疟原虫核酸检测的最低检出限。 [0115] 对比例2 [0116] 按照实施例1的方法制备对比引物21-36，见表6。 [0117] 表6对比引物序列表 [0118] [0119] [0120] 区别仅在于，将实施例1的引物组中SEQ ID NO.3-4所示的引物替换为SEQ ID NO.21-22所示的引物获得对比引物组1。 [0121] 将实施例1的引物组中SEQ ID NO.5-6所示的引物替换为SEQ ID NO.23-24所示的引物获得对比引物组2。 [0122] 将实施例1的引物组中SEQ ID NO.7-8所示的引物替换为SEQ ID NO.25-26所示的引物获得对比引物组3。 [0123] 将实施例1的引物组中SEQ ID NO.9-10所示的引物替换为SEQ ID NO.27-28所示的引物获得对比引物组4。 [0124] 将实施例1的引物组中SEQ ID NO.11-12所示的引物替换为SEQ ID NO.29-30所示的引物获得对比引物组5。 [0125] 将实施例1的引物组中SEQ ID NO.13-14所示的引物替换为SEQ ID NO.31-32所示的引物获得对比引物组6。 [0126] 将实施例1的引物组中SEQ ID NO.15-16所示的引物替换为SEQ ID NO.33-34所示的引物获得对比引物组7。 [0127] 将实施例1的引物组中SEQ ID NO.17-18所示的引物替换为SEQ ID NO.35-36所示的引物获得对比引物组8。 [0128] 实施例1的引物组中SEQ ID NO.3-18所示的引物替换为SEQ ID NO.21-36所示的引物获得对比引物组9。 [0129] 其中，用对比引物组1扩增间日疟原虫标准品质粒样品； [0130] 用对比引物组2扩增三日疟原虫标准品质粒样品； [0131] 用对比引物组3扩增卵形疟原虫标准品质粒样品； [0132] 用对比引物组4扩增恶性疟原虫标准品质粒样品； [0133] 用对比引物组5扩增诺氏疟原虫标准品质粒样品； [0134] 用对比引物组6扩增刚地弓形虫标准品质粒样品； [0135] 用对比引物组7扩增利什曼原虫标准品质粒样品； [0136] 用对比引物组8扩增巴贝斯虫标准品质粒样品； [0137] 用对比引物组9与SEQ ID NO.19-20扩增8种血液寄生虫标准品质粒与阳性内对照混合物样品。 [0138] 用对比引物组9与SEQ ID NO.19-20扩增15种无关病原体样本的总核酸与等量的阳性内对照的混合样本。 [0139] 分别按照与实施例1和2相同的方法进行特异性和最低检出限试验，结果显示对比例的引物21-36的特异性、最低检出限和覆盖率均差于实施例1的引物。 [0140] 各实验组都检测出了血液寄生虫；但对比引物组2、3和6未扩增出对应目标的条带，其检出目标的最低检出限为0.002ng/μl，较本试剂盒较差；在对15种无关病原体样本的总核酸与等量的阳性内对照的混合样本的特异性展示中，除了阳性内对照外还有其余的杂带，说明其特异性较差。 [0141] 以上详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。 [0142] 另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。 [0143] 此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。