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首页 / 专利库 / 重寄生 / 一种小麦蚜虫及其寄生蜂的多重PCR检测试剂盒

一种小麦蚜虫及其寄生蜂的多重PCR检测试剂盒
申请号 CN201710385325.X 申请日 2017-05-26 公开(公告)号 CN107177668B 公开(公告)日 2020-11-10
申请人 中国农业科学院植物保护研究所; 发明人 陆宴辉; 杨帆;
摘要 本发明提供了一种小麦蚜虫及其寄生蜂的多重PCR检测试剂盒，属于多重PCR检测技术领域。本发明的试剂盒包括了三个多重PCR和五个单重PCR检测体系，三个多重PCR检测体系使用的特异性引物序列分别如SEQ ID NO.1‑8、SEQ ID NO.9‑16、SEQ ID NO.17‑22所示，五个单重PCR检测体系的特异性引物序列分别如SEQ ID NO.23‑32所示。本发明的试剂盒能够对4种小麦蚜虫及其12种寄生蜂实现准确检测，具有灵敏度高、特异性强，耗时短、简便快速的优点，具有良好的应用前景。
权利要求

1.一种检测小麦蚜虫及其寄生蜂的试剂盒，其特征在于，含有以下引物对：用于检测麦无网长管蚜的特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示；

用于检测麦长管蚜的特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.3-4所示；

用于检测麦二叉蚜的特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.5-6所示；

用于检测禾谷缢管蚜的特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.7-8所示；

用于检测翼蚜外蚜茧蜂的特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.9-10所示；

用于检测乌兹别克蚜茧蜂的特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.11-12所示；

用于检测阿尔蚜茧蜂的特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.13-14所示；

用于检测烟蚜茧蜂的特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.15-16所示；

用于检测脊柄金小蜂属的通用引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.17-18所示；

用于检测蚜虫宽缘金小蜂的特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.19-20所示；

用于检测Phaenoglyphis villosa的特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.21-22所示；

用于检测Alloxysta sp1的特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.23-24所示；

用于检测Alloxysta sp2的特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.25-26所示；

用于检测Alloxysta sp3的特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.27-28所示；

用于检测合沟细蜂的特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.29-30所示；

用于检测黄足分盾细蜂的特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.31-32所示；

且所述引物对构成3个多重PCR检测体系和5个单重PCR检测体系，其中，第1个多重PCR检测体系所用的特异性引物序列如SEQ ID NO.1-8所示；第2个多重PCR检测体系所用的特异性引物序列如SEQ ID NO.9-16所示；第3个多重PCR检测体系所用的特异性引物序列如SEQ ID NO.17-22所示；

5个单重PCR检测体系所用的特异性引物序列分别如SEQ ID NO.23-32所示。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括Multiplex Master Mix，ddH2O，牛血清蛋白溶液、四甲基氯化铵、标准阳性模板。

3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，其工作程序包括以下步骤：(1)提取待测样品的核酸；

(2)以步骤(1)的核酸为模板，分别进行3个多重PCR和5个单重PCR；

(3)分析PCR产物；

第1个多重PCR检测体系中：

若PCR产物片段为97bp，则为麦无网长管蚜；

若PCR产物片段为156bp，则为麦长管蚜；

若PCR产物片段为296bp，则为麦二叉蚜；

若PCR产物片段为395bp，则为禾谷缢管蚜；

第2个多重PCR检测体系中：

若PCR产物片段为185bp，则为翼蚜外蚜茧蜂；

若PCR产物片段为246bp，则为乌兹别克蚜茧蜂；

若PCR产物片段为433bp，则为阿尔蚜茧蜂；

若PCR产物片段为554bp，则为烟蚜茧蜂；

第3个多重PCR检测体系中：

若PCR产物片段为173bp，则为脊柄金小蜂属；

若PCR产物片段为328bp，则为蚜虫宽缘金小蜂；

若PCR产物片段为413bp，则为Phaenoglyphis villosa；

5个单重PCR检测体系中：

若PCR产物片段为244bp，则为Alloxysta sp1；

若PCR产物片段为193bp，则为Alloxysta sp2；

若PCR产物片段为223bp，则为Alloxysta sp3；

若PCR产物片段为100bp，则为合沟细蜂；

若PCR产物片段为137bp，则为黄足分盾细蜂。

4.如权利要求1-3任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述多重PCR反应，其工作体系为：所述MP1为第1个多重PCR，MP2为第2个多重PCR，MP3为第3个多重PCR。

5.如权利要求1-3任一项所述的试剂盒，其特征在于，5个单重PCR体系试剂组分皆为ddH2O，1.5μL；2×Multiplex PCR Master Mix，5.0μL；10μM的上下游引物各1.0μL；DNA模板，1.5μL。

6.如权利要求1-3任一项所述的试剂盒，其特征在于，PCR反应条件为：95℃预变性15分钟；94℃变性30秒，退火温度退火1分钟30秒，72℃延伸1分钟，共35个循环；72℃后延伸10分钟；各体系退火温度为：MP1-MP3分别为第1-3个多重PCR；SP1-SP5分别为第1-5个单重PCR。

7.权利要求1-6任一项所述的试剂盒在检测小麦蚜虫及其寄生蜂中的应用。
说明书全文

一种小麦蚜虫及其寄生蜂的多重PCR检测试剂盒

技术领域

[0001] 本发明涉及多重PCR检测技术领域，特别是涉及检测华北地区小麦蚜虫及其寄生蜂的试剂盒及其应用。

背景技术

[0002] 小麦蚜虫是世界性农业害虫，在我国小麦产区也广泛分布，吸食小麦叶片汁液、影响光合作用、传播小麦病毒病，导致小麦产量和质量严重下降。华北地区麦田蚜虫种类有麦长管蚜Sitobion avenae(Fabricius)，禾谷缢管蚜Rhopalosiphum padi(Linnaeus),麦二叉蚜Schizaphisgraminum(Rondani)，麦无网长管蚜Metopolophium dirhodum(Walker)。小麦蚜虫种群发生数量大，每年造成麦田大量减产，百株蚜量逾2000，小麦千粒重减少45％。
[0003] 小麦蚜虫寄生蜂群落是麦田生态系统中生物种群的重要组成部分，也是影响麦蚜种群变化的重要天敌类群之一。田间小麦蚜虫的寄生率可达到70-80％，个别田块甚至达到90％。因此，我们需要对蚜虫-寄生蜂食物网关系和寄生蜂对蚜虫的控制效率进行深入全面的研究。传统的研究方法包括解剖、饲养出蜂和形态学鉴定等，不仅费时费力，且有时由于蚜虫和寄生蜂体型微小，很难根据形态鉴定特征鉴定到具体的物种。为了准确评估小麦田寄生蜂对蚜虫的控制作用，需要建立一套快速准确的分子检测方法，但目前未有针对麦田蚜虫和寄生蜂的系统性标准检测方法。多重PCR检测技术在PCR检测技术的基础上，可以实现同一反应检测多个物种的目标。所以多重PCR检测技术不仅具有灵敏度高、特异性强等特点，在同一反应中，同时检测3-4个物种，不同物种可通过扩增出的不同大小的特异性目标条带区分，大大提高检测效率，为准确鉴定物种和评估寄生蜂对蚜虫的控制作用提供有效手段支撑。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于提供一种检测小麦蚜虫及其寄生蜂的试剂盒及其应用，以实现对小麦蚜虫及其寄生蜂的快速检测，为准确鉴定物种和评估寄生蜂对蚜虫的控制作用提供有效帮助。
[0005] 引物是多重PCR的关键因素，本发明在设计引物时，(1)首先应该在保守性高的核苷酸片段中选择特异性较高的引物，但本发明设计引物的同时，不仅考虑了每种目标物种之间的高度保守区，而且还必需保证每段高度保守区之间的特异性，这样不同的目标物种才易区分开。(2)避免引物之间形成二级结构，例如自身发夹结构、上下游引物之间或者是引物与探针之间形成二聚体，同时引物避免与靶基因错配，如果一个引物与靶基因多个地方结合，会造成非特异性片段出现。(3)引物的3’端必需保持高度保守，在退火过程中，引物的3’端是开始延伸的地方，这样才能进行最大效率的复制。(4)Tm值为设计引物的重要决定因素，为引物的最佳退火温度提供参考数据，上下游引物的Tm值应可能的接近，同时考虑到所有上下游引物Tm值最多不能超过10℃，为多重PCR做准备。
[0006] 为实现上述目的，根据线粒体DNA序列，设计筛选得到16对分别针对小麦蚜虫及其寄生蜂特异性引物，如表1。除一般的引物设计原则外，根据以下标准筛选引物：(1)扩增产物大小在100bp-500bp之间；(2)多重PCR检测体系结果中，不同扩增产物大小相差5bp以上。
[0007] 表1引物序列信息
[0008]
[0009]
[0010] 由此，本发明首先提供了一种同时检测4种小麦蚜虫的特异性引物对组合，含有以下引物对：
[0011] 用于检测麦无网长管蚜【Metopolophium dirhodum(Walker)】的特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示；
[0012] 用于检测麦长管蚜【(Sitobion avenae(Fabricius)】的特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.3-4所示；
[0013] 用于检测麦二叉蚜【(Schizaphis graminum(Rondani)】的特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.5-6所示；
[0014] 用于检测禾谷缢管蚜【(Rhopalosiphum padi(Linnaeus)】的特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.7-8所示。
[0015] 本发明提供了上述特异性引物对组合在制备小麦蚜虫检测试剂盒中的用途。
[0016] 进一步地，本发明提供一种检测小麦蚜虫及其寄生蜂的特异性引物对组合，含有以下引物对：
[0017] 用于检测麦无网长管蚜【Metopolophium dirhodum(Walker)】的特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示；
[0018] 用于检测麦长管蚜【(Sitobion avenae(Fabricius)】的特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.3-4所示；
[0019] 用于检测麦二叉蚜【(Schizaphis graminum(Rondani)】的特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.5-6所示；
[0020] 用于检测禾谷缢管蚜【(Rhopalosiphum padi(Linnaeus)】的特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.7-8所示；
[0021] 用于检测翼蚜外蚜茧蜂(Paron volucre Haliday)的特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.9-10所示；
[0022] 用于检测乌兹别克蚜茧蜂(Aphidius uzbekistanicus Luzhetski)的特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.11-12所示；
[0023] 用于检测阿尔蚜茧蜂(Aphidius ervi Haliday)的特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.13-14所示；
[0024] 用于检测烟蚜茧蜂【Aphidius gifuensis(Ashmead)】的特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.15-16所示；
[0025] 用于检测脊柄金小蜂属(Asaphes)的通用引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.17-18所示；
[0026] 用于检测蚜虫宽缘金小蜂【Pachyneuron aphidis(Bouché)】的特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.19-20所示；
[0027] 用于检测【Phaenoglyphis villosa(Hartig)】的特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.21-22所示；
[0028] 用于检测Alloxysta sp1的特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.23-24所示；
[0029] 用于检测Alloxysta sp2的特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.25-26所示；
[0030] 用于检测Alloxysta sp3的特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.27-28所示；
[0031] 用于检测合沟细蜂【Dendrocerus carpenteri(Curtis)】的特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.29-30所示；
[0032] 用于检测黄足分盾细蜂【Dendrocerus laticeps(Hedicke)】的特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.31-32所示。
[0033] 本发明所述的脊柄金小蜂属Asaphes包括宽肩阿莎金小蜂【Asaphessuspensus(Nees)】和蚜茧蜂金小蜂(Asaphes vulgaris Walker)。
[0034] 本发明还提供一种检测试剂盒，含有上述特异性引物对组合，且所述特异性引物对组合构成3个多重PCR检测体系和5个单重PCR检测体系，其中：第1个多重PCR检测体系所用的特异性引物序列如SEQ ID NO.1-8所示；第2个多重PCR检测体系所用的特异性引物序列如SEQ ID NO.9-16所示；第3个多重PCR检测体系所用的特异性引物序列如SEQ ID NO.17-22所示；
[0035] 5个单重PCR检测体系所用的特异性引物序列分别如SEQ ID NO.23-32所示。
[0036] 进一步地，本发明的上述试剂盒还包括Multiplex Master Mix，ddH2O，牛血清蛋白溶液(BSA，10μg/μL)、四甲基氯化铵(TMAC，5M)、标准阳性模板。
[0037] 本发明的试剂盒，其工作程序包括以下步骤：
[0038] (1)提取待测样品的核酸；
[0039] (2)以步骤(1)的核酸为模板，分别进行3个多重PCR和5个单重PCR；
[0040] (3)分析PCR产物；
[0041] 第1个多重PCR检测体系中：
[0042] 若PCR产物片段为97bp，则为麦无网长管蚜；
[0043] 若PCR产物片段为156bp，则为麦长管蚜；
[0044] 若PCR产物片段为296bp，则为麦二叉蚜；
[0045] 若PCR产物片段为395bp，则为禾谷缢管蚜；
[0046] 第2个多重PCR检测体系中：
[0047] 若PCR产物片段为185bp，则为翼蚜外蚜茧蜂；
[0048] 若PCR产物片段为246bp，则为乌兹别克蚜茧蜂；
[0049] 若PCR产物片段为433bp，则为阿尔蚜茧蜂；
[0050] 若PCR产物片段为554bp，则为烟蚜茧蜂；
[0051] 第3个多重PCR检测体系中：
[0052] 若PCR产物片段为173bp，则为脊柄金小蜂属；
[0053] 若PCR产物片段为328bp，则为蚜虫宽缘金小蜂；
[0054] 若PCR产物片段为413bp，则为Phaenoglyphis villosa；
[0055] 5个单重PCR检测体系中：
[0056] 若PCR产物片段为244bp，则为Alloxysta sp1；
[0057] 若PCR产物片段为193bp，则为Alloxysta sp2；
[0058] 若PCR产物片段为223bp，则为Alloxysta sp3；
[0059] 若PCR产物片段为100bp，则为合沟细蜂；
[0060] 若PCR产物片段为137bp，则为黄足分盾细蜂。
[0061] 所述多重PCR反应，其工作体系为：
[0062]
[0063] 所述MP1为第1个多重PCR，MP2为第2个多重PCR，MP3为第3个多重PCR。
[0064] 进一步地，本发明试剂盒的5个单重PCR体系试剂组分皆为ddH2O，1.5μL；2×Multiplex PCR Master Mix，5.0μL；10μM的上下游引物各1.0μL，DNA模板，1.5μL。
[0065] 本发明试剂盒PCR反应条件为：95℃预变性15分钟；94℃变性30秒，退火温度退火1分钟30秒，72℃延伸1分钟，共35个循环；72℃后延伸10分钟；各体系退火温度为：
[0066]
[0067] MP1-MP3分别为第1-3个多重PCR；SP1-SP5分别为第1-5个单重PCR。
[0068] 本发明提供了上述特异性引物对组合或含有该特异性引物对组合的试剂盒在检测小麦蚜虫及其寄生蜂中的应用。
[0069] 本发明的有益效果在于：本发明根据GenBank中公布的基因序列(Accession No.见下表2)，设计一系列特异性引物，而这些引物仅对目标物种有扩增效果，对麦田其它蚜虫和寄生蜂无扩增能力，产物片段大小和灵敏度DNA浓度检出限见表2。
[0070] 表2目标物种对应GenBank序列号、片段大小及DNA浓度检出限
[0071]
[0072] 本发明在小麦蚜虫、寄生蜂检测方面具有很高的价值，通过三次多重PCR和五次单重PCR能够对4种小麦蚜虫及其12种寄生蜂实现准确检测，具有灵敏度高、特异性强，耗时短、简便快速的优点，特别是在检测大量样品时，大大缩短检测时间和降低人力，提高检测效率，具有良好的应用前景。

附图说明

[0073] 图1为本发明实施例1中MP1混合引物溶液在各蚜虫，寄生蜂物种中的检测结果；从左至右分别为1,2麦无网长管蚜,3,4麦长管蚜,5,6麦二叉蚜,7,8禾谷缢管蚜,9,10翼蚜外蚜茧蜂,11,12乌兹别克蚜茧蜂,13,14阿尔蚜茧蜂,15,16烟蚜茧蜂,17,18宽肩阿莎金小蜂,19,20蚜茧蜂金小蜂,21,22蚜虫宽缘金小蜂,23,24 Phaenoglyphis villosa,25,26 Alloxysta sp.,27,28蚜虫跳小蜂,29,30 Syrphophagus eliavae,31,32 Syrphophagus sp.,33,34Syrphophagus taeniatus,35,36合沟细蜂,37,38黄足分盾细蜂，“M”代表DNA Marker(20bp DNA Ladder,Takara)，“NC”代表阴性对照。
[0074] 图2为本发明实施例2中MP2混合引物溶液在各蚜虫，寄生蜂物种中的检测结果；从左至右分别为1,2翼蚜外蚜茧蜂,3,4乌兹别克蚜茧蜂,5,6阿尔蚜茧蜂,7,8烟蚜茧蜂,9,10宽肩阿莎金小蜂,11,12蚜茧蜂金小蜂,13,14蚜虫宽缘金小蜂,15,16 Phaenoglyphis villosa,17,18Alloxysta sp.,19,20蚜虫跳小蜂,21,22 Syrphophagus eliavae,23,24Syrphophagus sp.,25,26 Syrphophagus taeniatus,27,28合沟细蜂,29,30黄足分盾细蜂,31,32麦无网长管蚜,33,34麦长管蚜,35,36麦二叉蚜,37,38禾谷缢管蚜，“M”代表DNA Marker(20bp DNA Ladder,Takara)，“NC”代表阴性对照。
[0075] 图3为本发明实施例3中MP3混合引物溶液在各蚜虫，寄生蜂物种中的检测结果；从左至右分别为1,2宽肩阿莎金小蜂,3,4蚜茧蜂金小蜂,5,6蚜虫宽缘金小蜂,7,8 Phaenoglyphis villosa,9,10翼蚜外蚜茧蜂,11,12乌兹别克蚜茧蜂,13,14阿尔蚜茧蜂,
15,16烟蚜茧蜂,17,18 Alloxysta sp.,19,20蚜虫跳小蜂,21,22 Syrphophagus eliavae,
23,24Syrphophagus sp.,25,26 Syrphophagus taeniatus,27,28合沟细蜂,29,30黄足分盾细蜂,31,32麦无网长管蚜,33,34麦长管蚜,35,36麦二叉蚜,37,38禾谷缢管蚜，“M”代表DNA Marker(20bp DNA Ladder,Takara)，“NC”代表阴性对照。
[0076] 图4为本发明实施例4中SP1目标物种特异性引物在各蚜虫，寄生蜂物种中的检测结果；从左至右分别为1,2Alloxysta sp1,3阿尔蚜茧蜂,4烟蚜茧蜂,5乌兹别克蚜茧蜂,6翼蚜外蚜茧蜂,7麦二叉蚜,8麦无网长管蚜,9麦长管蚜,10禾谷缢管蚜,11 Alloxysta sp3,12 Alloxysta sp2,13 Phaenoglyphis villosa,14蚜虫跳小蜂,15 Syrphophagus eliavae,16 Syrphophagus sp.,17S yrphophagus taeniatus,18蚜虫宽缘金小蜂,19合沟细蜂,20黄足分盾细蜂,21宽肩阿莎金小蜂,22蚜茧蜂金小蜂，“M”代表DNA Marker(50bp DNA Ladder,天根)，“NC”代表阴性对照。
[0077] 图5为本发明实施例5中SP2目标物种特异性引物在各蚜虫，寄生蜂物种中的检测结果；从左至右分别为1,2 Alloxysta sp2,3阿尔蚜茧蜂,4烟蚜茧蜂,5乌兹别克蚜茧蜂,6翼蚜外蚜茧蜂,7麦二叉蚜,8麦无网长管蚜,9麦长管蚜,10禾谷缢管蚜,11 Alloxysta sp1,12 Alloxysta sp3,13 Phaenoglyphis villosa,14蚜虫跳小蜂,15 Syrphophagus eliavae,16 Syrphophagus sp.,17 Syrphophagus taeniatus,18蚜虫宽缘金小蜂,19合沟细蜂,20黄足分盾细蜂,21宽肩阿莎金小蜂,22蚜茧蜂金小蜂，“M”代表DNA Marker(50bp DNA Ladder,天根)，“NC”代表阴性对照。
[0078] 图6为本发明实施例6中SP3目标物种特异性引物在各蚜虫，寄生蜂物种中的检测结果；从左至右分别为1,2 Alloxysta sp3,3阿尔蚜茧蜂,4烟蚜茧蜂,5乌兹别克蚜茧蜂,6翼蚜外蚜茧蜂,7麦二叉蚜,8麦无网长管蚜,9麦长管蚜,10禾谷缢管蚜,11 Alloxysta sp1,12 Alloxysta sp2,13 Phaenoglyphis villosa,14蚜虫跳小蜂,15 Syrphophagus eliavae,16 Syrphophagus sp.,17 Syrphophagus taeniatus,18蚜虫宽缘金小蜂,19合沟细蜂,20黄足分盾细蜂,21宽肩阿莎金小蜂,22蚜茧蜂金小蜂，“M”代表DNA Marker(50bp DNA Ladder,天根)，“NC”代表阴性对照。
[0079] 图7为本发明实施例7中SP4目标物种特异性引物在各蚜虫，寄生蜂物种中的检测结果；从左至右分别为1,2合沟细蜂,3阿尔蚜茧蜂,4烟蚜茧蜂,5乌兹别克蚜茧蜂,6翼蚜外蚜茧蜂,7麦二叉蚜,8麦无网长管蚜,9麦长管蚜,10禾谷缢管蚜,11 Alloxysta sp1,12 Alloxysta sp3,13 Alloxysta sp2,14 Phaenoglyphis villosa,15蚜虫跳小蜂,16 Syrphophagus eliavae,17 Syrphophagus sp.,18 Syrphophagus taeniatus,19蚜虫宽缘金小蜂,20黄足分盾细蜂,21宽肩阿莎金小蜂,22蚜茧蜂金小蜂，“M”代表DNA Marker(50bp DNA Ladder,天根)，“NC”代表阴性对照。
[0080] 图8为本发明实施例8中SP5目标物种特异性引物在各蚜虫，寄生蜂物种中的检测结果；从左至右分别为1,2黄足分盾细蜂,3阿尔蚜茧蜂,4烟蚜茧蜂,5乌兹别克蚜茧蜂,6翼蚜外蚜茧蜂,7麦二叉蚜,8麦无网长管蚜,9麦长管蚜,10禾谷缢管蚜,11 Alloxysta sp1,12 Alloxysta sp3,13 Alloxysta sp2,14 Phaenoglyphis villosa,15蚜虫跳小蜂,16 Syrphophagus eliavae,17 Syrphophagus sp.,18 Syrphophagus taeniatus,19蚜虫宽缘金小蜂,20合沟细蜂,21宽肩阿莎金小蜂,22蚜茧蜂金小蜂，“M”代表DNA Marker(50bp DNA Ladder,天根)，“NC”代表阴性对照。
[0081] 图9为本发明实施例9中MP1混合引物溶液各目标物种的DNA浓度梯度检测结果；从左至右分别为1麦无网长管蚜COI-1000,2麦无网长管蚜COI-500,3麦无网长管蚜COI-100,4麦无网长管蚜COI-50,5麦无网长管蚜COI-10,6麦无网长管蚜COI-5,7麦长管蚜COI-1000,8麦长管蚜COI-500,9麦长管蚜COI-100,10麦长管蚜COI-50,11麦长管蚜COI-10,12麦长管蚜COI-5,13麦二叉蚜COI-1000,14麦二叉蚜COI-500,15麦二叉蚜COI-100,16麦二叉蚜COI-50,17麦二叉蚜COI-10,18麦二叉蚜COI-5,19禾谷缢管蚜COI-1000,20禾谷缢管蚜COI-500,
21禾谷缢管蚜COI-100,22禾谷缢管蚜COI-50,23禾谷缢管蚜COI-10,24禾谷缢管蚜COI-5,
25MSSR mix COI-1000,26MSSR mix COI-500,27MSSR mix COI-100,28MSSR mix COI-50,
29MSSR mix COI-10,30MSSR mix COI-5，“M”代表DNA Marker(20bp DNA Ladder,Takara)，“NC”代表阴性对照。
[0082] 图10为本发明实施例10中MP2混合引物溶液各目标物种的DNA浓度梯度检测结果；从左至右分别为1翼蚜外蚜茧蜂COI-1000,2翼蚜外蚜茧蜂COI-500,3翼蚜外蚜茧蜂COI-
100,4翼蚜外蚜茧蜂COI-50,5翼蚜外蚜茧蜂COI-10,6翼蚜外蚜茧蜂COI-5,7乌兹别克蚜茧蜂COI-1000,8乌兹别克蚜茧蜂COI-500,9乌兹别克蚜茧蜂COI-100,10乌兹别克蚜茧蜂COI-
50,11乌兹别克蚜茧蜂COI-10,12乌兹别克蚜茧蜂COI-5,13阿尔蚜茧蜂COI-1000,14阿尔蚜茧蜂COI-500,15阿尔蚜茧蜂COI-100,16阿尔蚜茧蜂COI-50,17阿尔蚜茧蜂COI-10,18阿尔蚜茧蜂COI-5,19烟蚜茧蜂COI-1000,20烟蚜茧蜂COI-500,21烟蚜茧蜂COI-100,22烟蚜茧蜂COI-50,23烟蚜茧蜂COI-10,24烟蚜茧蜂COI-5,25PAAA mix COI-1000,26PAAA mixCOI-
500,27PAAA mix COI-100,28PAAA mix COI-50,29PAAA mixCOI-10,30PAAA mix COI-5，“M”代表DNA Marker(20bp DNA Ladder,Takara)，“NC”代表阴性对照。
[0083] 图11为本发明实施例11中MP3混合引物溶液各目标物种的DNA浓度梯度检测结果；从左至右分别为1宽肩阿莎金小蜂COI-1000,2宽肩阿莎金小蜂COI-500,3宽肩阿莎金小蜂COI-100,4宽肩阿莎金小蜂COI-50,5宽肩阿莎金小蜂COI-10,6宽肩阿莎金小蜂COI-5,7蚜茧蜂金小蜂COI-1000,8蚜茧蜂金小蜂COI-500,9蚜茧蜂金小蜂COI-100,10蚜茧蜂金小蜂COI-50,11蚜茧蜂金小蜂COI-10,12蚜茧蜂金小蜂COI-5,13蚜虫宽缘金小蜂COI-1000,14蚜虫宽缘金小蜂COI-500,15蚜虫宽缘金小蜂COI-100,16蚜虫宽缘金小蜂COI-50,17蚜虫宽缘金小蜂COI-10,18蚜虫宽缘金小蜂COI-5,19P.villosa COI-1000,20P.villosa COI-500,
21P.villosa COI-100,22P.villosa COI-50,23P.villosa COI-10,24P.villosa COI-5,
25AAPP mix COI-1000,26AAPP mix COI-500,27AAPP mix COI-100,28AAPP mix COI-50,
29AAPP mix COI-10,30AAPP mix COI-5，“M”代表DNA Marker(20bp DNA Ladder,Takara)，“NC”代表阴性对照。
[0084] 图12为本发明实施例12中SP1目标物种特异性引物DNA浓度梯度检测结果；从左至右分别为1 Alloxysta sp1.16S-1000,2 Alloxysta sp1.16S-500,3 Alloxysta sp1.16S-100,4 Alloxysta sp1.16S-50,5 Alloxysta sp1.16S-10,6 Alloxysta sp1.16S-5，“M”代表DNA Marker(50bp DNA Ladder,天根)，“NC”代表阴性对照。
[0085] 图13为本发明实施例13中SP2目标物种特异性引物DNA浓度梯度检测结果；从左至右分别为1 Alloxysta sp2.16S-1000,2 Alloxysta sp2.16S-500,3 Alloxysta sp2.16S-100,4 Alloxysta sp2.16S-50,5 Alloxysta sp2.16S-10,6 Alloxysta sp2.16S-5，“M”代表DNA Marker(50bp DNA Ladder,天根)，“NC”代表阴性对照。
[0086] 图14为本发明实施例14中SP3目标物种特异性引物DNA浓度梯度检测结果；从左至右分别为1 Alloxysta sp3.16S-1000,2 Alloxysta sp3.16S-500,3 Alloxysta sp3.16S-100,4 Alloxysta sp3.16S-50,5 Alloxysta sp3.16S-10,6 Alloxysta sp3，“M”代表DNA Marker(50bp DNA Ladder,天根)，“NC”代表阴性对照。
[0087] 图15为本发明实施例15中SP4目标物种特异性引物DNA浓度梯度检测结果；从左至右分别为1合沟细蜂16S-1000,2合沟细蜂16S-500,3合沟细蜂16S-100,4合沟细蜂16S-50,5合沟细蜂16S-10,6合沟细蜂16S-5，“M”代表DNA Marker(50bp DNA Ladder,天根)，“NC”代表阴性对照。
[0088] 图16为本发明实施例16中SP5目标物种特异性引物DNA浓度梯度检测结果；从左至右分别为1黄足分盾细蜂16S-1000,2黄足分盾细蜂16S-500,3黄足分盾细蜂16S-100,4黄足分盾细蜂16S-50,5黄足分盾细蜂16S-10,6黄足分盾细蜂16S-5，“M”代表DNA Marker(50bp DNA Ladder,天根)，“NC”代表阴性对照。

具体实施方式

[0089] 以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
[0090] 若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；若未特别指明，实施例中所用试剂均为市售。
[0091] 实施例1多重PCR体系MP1对目标物种的特异性扩增效果
[0092] 1、目标蚜虫物种基因组的制备
[0093] 单头麦无网长管蚜、麦长管蚜、麦二叉蚜和禾谷缢管蚜分别放入1.5mL离心管中进行组织研磨并提取DNA，将贮存不同蚜虫DNA溶液的离心管标注上物种名，-20℃备用。
[0094] 2、合成多重PCR体系MP1中所需引物，见表1中的MP1体系对应的4对引物。将各对引物按比例配制成混合引物溶液，各条引物在反应体系中的终浓度为见表1。
[0095] 3、PCR扩增 反应体系以10μL计，包括ddH2O，2.0μL；2×Multiplex PCR Master Mix，5.0μL；Primer Mix，1.0μL；10μg/μL BSA，0.5μL和DNA模板，1.5μL。
[0096] PCR反应条件为：95℃预变性15分钟；94℃变性30秒，63℃退火1分钟30秒，72℃延伸1分钟，共35个循环。
[0097] 4、PCR产物鉴定 取5.0μL PCR扩增产物，200 V电压下，用4％琼脂糖凝胶电泳分离。凝胶电泳经GelRed染色后，在凝胶成像仪中可以显示扩增DNA条带，根据条带大小判断是否为目标物种及混合引物溶液特异性。
[0098] 5、结果 以MP1体系中目标蚜虫物种(麦无网长管蚜、麦长管蚜、麦二叉蚜和禾谷缢管蚜)为模板，并以麦田常见寄生蜂种类15种为对照进行PCR扩增，结果如图1所示，仅有1、2泳道对应的麦无网长管蚜扩增出97bp的条带，3、4泳道对应的麦长管蚜扩增出156bp的条带，5、6泳道对应的麦二叉蚜扩增出296bp的条带，7、8泳道对应的禾谷缢管蚜扩增出395bp的条带，即MP1的引物仅对目标物种DNA具有扩增作用，说明本发明的引物特异性强。回收上述目标物种条带，测序所得条带如SEQ ID No.33、34、35、36。
[0099] 实施例2多重PCR体系MP2对目标物种的特异性扩增效果
[0100] 1、目标寄生蜂物种基因组的制备
[0101] 单头翼蚜外蚜茧蜂、乌兹别克蚜茧蜂、阿尔蚜茧蜂和烟蚜茧蜂分别放入1.5mL离心管中进行组织研磨并提取DNA，将贮存不同寄生蜂DNA溶液的离心管标注上物种名，-20℃备用。
[0102] 2、合成多重PCR体系MP2中所需引物见表1中的MP2体系对应的引物。将各对引物按比例配制成混合引物溶液，各条引物在反应体系中的终浓度表1。
[0103] 3、PCR扩增 反应体系以10μL计，包括ddH2O，1.8μL；2×Multiplex PCR Master Mix，5.0μL；Primer Mix，1.0μL；10μg/μL BSA，0.5μL；5M TMAC，0.2μL和DNA模板，1.5μL。
[0104] PCR反应条件为：95℃预变性15分钟；94℃变性30秒，61℃退火1分钟30秒，72℃延伸1分钟，共35个循环。
[0105] 4、PCR产物鉴定 取5.0μL PCR扩增产物，200V电压下，用4％琼脂糖凝胶电泳分离。凝胶电泳经GelRed染色后，在凝胶成像仪中可以显示扩增DNA条带，根据条带大小判断是否为目标物种及混合引物溶液特异性。
[0106] 5、结果 以MP2体系中目标蚜虫物种(翼蚜外蚜茧蜂、乌兹别克蚜茧蜂、阿尔蚜茧蜂和烟蚜茧蜂)为模板，并以麦田常见蚜虫、寄生蜂种类15种为对照进行PCR扩增，结果如图2所示，仅有1、2泳道对应的翼蚜外蚜茧蜂扩增出185bp的条带，3、4泳道对应的乌兹别克蚜茧蜂扩增出246bp的条带，5、6泳道对应的阿尔蚜茧蜂扩增出433bp的条带，7、8泳道对应的烟蚜茧蜂扩增出554bp的条带，即MP1的引物仅对目标物种DNA具有扩增作用，说明本发明的引物特异性强。回收上述目标物种条带，测序所得条带如SEQ ID No.37、38、39、40。
[0107] 实施例3多重PCR体系MP3对目标物种的特异性扩增效果
[0108] 1、目标寄生蜂物种基因组的制备
[0109] 脊柄金小蜂属、蚜虫宽缘金小蜂和Phaenoglyphis villosa提取方法参见实施例2。
[0110] 2、合成多重PCR体系MP3中所需引物，体系中引物序列和各条引物在反应体系中的终浓度见表1。
[0111] 3、PCR扩增 反应体系以10μL计，包括ddH2O，2.0μL；2×Multiplex PCR Master Mix，5.0μL；Primer Mix，1.0μL；10μg/μL BSA，0.5μL和DNA模板，1.5μL。
[0112] PCR反应条件为：95℃预变性15分钟；94℃变性30秒，58℃退火1分钟30秒，72℃延伸1分钟，共35个循环。
[0113] 4、PCR产物鉴定 取5.0μL PCR扩增产物，200V电压下，用4％琼脂糖凝胶电泳分离。凝胶电泳经GelRed染色后，在凝胶成像仪中可以显示扩增DNA条带，根据条带大小判断是否为目标物种及混合引物溶液特异性。
[0114] 5、结果 以MP3体系中目标蚜虫物种(宽肩阿莎金小蜂、蚜茧蜂金小蜂、蚜虫宽缘金小蜂和Phaenoglyphis villosa)为模板，并以麦田常见蚜虫、寄生蜂种类15种为对照进行PCR扩增，结果如图3所示，仅有1、2泳道对应的宽肩阿莎金小蜂扩增出173bp的条带，3、4泳道对应的蚜茧蜂金小蜂扩增出173bp的条带，5、6泳道对应的蚜虫宽缘金小蜂扩增出328bp的条带，7、8泳道对应的Phaenoglyphis villosa扩增出413bp的条带，即MP1的引物仅对目标物种DNA具有扩增作用，说明本发明的引物特异性强。回收上述目标物种条带，测序所得条带如SEQ ID No.41、42、43。
[0115] 实施例4单重PCR体系SP1对目标物种的特异性扩增效果
[0116] 1、Alloxysta sp1基因组的制备参见实施例2。
[0117] 2、合成Alloxysta sp1的特异性引物见表1。
[0118] 3、PCR扩增 反应体系以10μL计，包括ddH2O，1.5μL；2×MultiplexPCR Master Mix，5.0μL；上下游引物各1.0μL；DNA模板，1.5μL。
[0119] PCR反应条件为：95℃预变性15分钟；94℃变性30秒，58℃退火1分钟30秒，72℃延伸1分钟，共35个循环。
[0120] 4、PCR产物鉴定 取5.0μL PCR扩增产物，200V电压下，用2％琼脂糖凝胶电泳分离。凝胶电泳经GelRed染色后，在凝胶成像仪中可以显示扩增DNA条带，根据条带大小判断是否为目标物种及混合引物溶液特异性。
[0121] 5、结果 以SP1体系中Alloxysta sp1为模板，并以麦田常见蚜虫、寄生蜂种类20种为对照进行PCR扩增，结果如图4所示，仅有1、2泳道对应的Alloxysta sp1扩增出244bp的条带，SP1的引物仅对目标物种DNA具有扩增作用，说明本发明的引物特异性强。回收上述目标物种条带，测序所得条带如SEQ ID No.44。
[0122] 实施例5单重PCR体系SP2对目标物种的特异性扩增效果
[0123] 1、Alloxysta sp2基因组的制备参见实施例2。
[0124] 2、Alloxysta sp2的特异性引物见表1。
[0125] 3、PCR扩增反应体系以10μL计，参见实施例4。PCR反应条件为：95℃预变性15分钟；94℃变性30秒，58℃退火1分钟30秒，72℃延伸1分钟，共35个循环。
[0126] 4、PCR产物鉴定 取5.0μL PCR扩增产物，200V电压下，用2％琼脂糖凝胶电泳分离。凝胶电泳经GelRed染色后，在凝胶成像仪中可以显示扩增DNA条带，根据条带大小判断是否为目标物种及混合引物溶液特异性。
[0127] 5、结果 以SP2体系中Alloxysta sp2为模板，并以麦田常见蚜虫、寄生蜂种类20种为对照进行PCR扩增，结果如图5所示，仅有1、2泳道对应的Alloxysta sp2扩增出193bp的条带，SP2的引物仅对目标物种DNA具有扩增作用，说明本发明的引物特异性强。回收上述目标物种条带，测序所得条带如SEQ ID No.45。
[0128] 实施例6单重PCR体系SP3对目标物种的特异性扩增效果
[0129] 1、Alloxysta sp3基因组的制备参见实施例2。
[0130] 2、合成Alloxysta sp3的特异性引物见表1。
[0131] 3、PCR扩增体系见实施例4，PCR反应条件为：95℃预变性15分钟；94℃变性30秒，58℃退火1分钟30秒，72℃延伸1分钟，共35个循环。
[0132] 4、PCR产物鉴定
[0133] 取5.0μL PCR扩增产物，200V电压下，用2％琼脂糖凝胶电泳分离。凝胶电泳经GelRed染色后，在凝胶成像仪中可以显示扩增DNA条带，根据条带大小判断是否为目标物种及混合引物溶液特异性。
[0134] 5、结果 以SP3体系中Alloxysta sp3为模板，并以麦田常见蚜虫、寄生蜂种类20种为对照进行PCR扩增，结果如图6所示，仅有1、2泳道对应的Alloxysta sp3扩增出223bp的条带，SP2的引物仅对目标物种DNA具有扩增作用，说明本发明的引物特异性强。回收上述目标物种条带，测序所得条带如SEQ ID No.46。
[0135] 实施例7单重PCR体系SP4对目标物种的特异性扩增效果
[0136] 1、合沟细蜂基因组的制备参见实施例2。
[0137] 2、合成合沟细蜂的特异性引物见表1。
[0138] 3、PCR扩增反应体系以10μL计，参见实施例4。
[0139] PCR反应条件为：95℃预变性15分钟；94℃变性30秒，62℃退火1分钟30秒，72℃延伸1分钟，共35个循环。
[0140] 4、PCR产物鉴定参见实施例6。
[0141] 5、结果 以SP4体系中合沟细蜂为模板，并以麦田常见蚜虫、寄生蜂种类20种为对照进行PCR扩增，结果如图7所示，仅有1、2泳道对应的合沟细蜂扩增出100bp的条带，SP4的引物仅对目标物种DNA具有扩增作用，说明本发明的引物特异性强。回收上述目标物种条带，测序所得条带如SEQ ID No.47。
[0142] 实施例8单重PCR体系SP5对目标物种的特异性扩增效果
[0143] 1、黄足分盾细蜂基因组的制备同实施例2。
[0144] 2、合成黄足分盾细蜂的特异性引物见表1。
[0145] 3、PCR扩增反应体系以10μL计参见实施例4。
[0146] PCR反应条件为：95℃预变性15分钟；94℃变性30秒，63℃退火1分钟30秒，72℃延伸1分钟，共35个循环。
[0147] 4、PCR产物鉴定同实施例6。
[0148] 5、结果 以SP5体系中黄足分盾细蜂为模板，并以麦田常见蚜虫、寄生蜂种类20种为对照进行PCR扩增，结果如图8所示，仅有1、2泳道对应的合沟细蜂扩增出137bp的条带，SP4的引物仅对目标物种DNA具有扩增作用，说明本发明的引物特异性强。回收上述目标物种条带，测序所得条带如SEQ ID No.48。
[0149] 实施例9多重PCR体系MP1对目标物种最低检出限的测定
[0150] 1、通用引物扩增 按实施例1提取单头麦无网长管蚜、麦长管蚜、麦二叉蚜和禾谷缢管蚜DNA，COI通用引物(Forward:5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’,Reverse:5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’)扩增，反应体系以10μL计，包括ddH2O，1.5μL；2×Multiplex PCR Master Mix，5.0μL；ForwardPrimer(10μM)，1.0μL；Reverse Primer(10μM)，1.0μL和DNA模板，1.5μL。PCR反应条件为：95℃预变性15分钟；94℃变性30秒，50℃退火1分钟30秒，72℃延伸1分钟，共35个循环。
[0151] 2、检出限测定 PCR产物送测序并检测浓度，计算拷贝数，原模板溶液单独进行稀释并混合，分别为1000、500、100、50、10和5拷贝数。取1.0μL稀释溶液作PCR扩增的模板，反应体系和条件同实施例1中的描述。PCR扩增产物也按实施例1中的凝胶电泳分析判断。
[0152] 3、结果 如图9所示，单独DNA模板检出限皆为50拷贝，混合DNA模板达到100拷贝。
[0153] 实施例10多重PCR体系MP2对目标物种最低检出限的测定
[0154] 1、通用引物扩增 按实施例2提取单头翼蚜外蚜茧蜂、乌兹别克蚜茧蜂、阿尔蚜茧蜂和烟蚜茧蜂DNA，COI通用引物(Forward:5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’,Reverse:5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’)扩增，反应体系以10μL计，包括ddH2O，1.5μL；2×Multiplex PCR Master Mix，5.0μL；ForwardPrimer(10μM)，1.0μL；Reverse Primer(10μM)，1.0μL和DNA模板，1.5μL。PCR反应条件为：95℃预变性15分钟；94℃变性30秒，50℃退火1分钟30秒，72℃延伸1分钟，共35个循环。
[0155] 2、检出限测定 PCR产物送测序并检测浓度，计算拷贝数，原模板溶液单独进行稀释并混合，分别为1000、500、100、50、10和5拷贝数。取1.0μL稀释溶液作PCR扩增的模板，反应体系和条件同实施例2中的描述。PCR扩增产物也按实施例2中的凝胶电泳分析判断。
[0156] 3、结果 如图10所示，单独DNA模板检出限皆为50拷贝，混合DNA模板达到100拷贝。
[0157] 实施例11多重PCR体系MP3对目标物种最低检出限的测定
[0158] 1、通用引物扩增  按实施例3提取脊柄金小蜂属、蚜虫宽缘金小蜂和Phaenoglyphis villosa的DNA，16S通用引物(Forward:5’-CACCTGTTTATCAAAAACAT-3’,Reverse:5’-TCGATTTGAACTCARATCATGTA-3’)扩增宽肩阿莎金小蜂和蚜茧蜂金小蜂序列，COI通用引物(Forward:5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’,Reverse:5’-
TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’)扩增蚜虫宽缘金小蜂和Phaenoglyphis villosa，反应体系以10μL计，包括ddH2O，1.5μL；2×Multiplex PCR Master Mix，5.0μL；Forward Primer(10μM)，1.0μL；Reverse Primer(10μM)，1.0μL和DNA模板，1.5μL。PCR反应条件为：95℃预变性15分钟；94℃变性30秒，50℃退火1分钟30秒，72℃延伸1分钟，共35个循环。
[0159] 2、检出限测定 PCR产物送测序并检测浓度，计算拷贝数，原模板溶液单独进行稀释并混合，分别为1000、500、100、50、10和5拷贝数。取1.0μL稀释溶液作PCR扩增的模板，反应体系和条件同实施例3中的描述。PCR扩增产物也按实施例3中的凝胶电泳分析判断。
[0160] 3、结果如图11所示，单独DNA模板检出限皆为10拷贝，混合DNA模板达到100拷贝。
[0161] 实施例12单重PCR体系SP1对Alloxysta sp1最低检出限的测定
[0162] 1、通用引物扩增 按实施例4提取单头Alloxysta sp1的DNA，16S通用引物(Forward:5’-CACCTGTTTATCAAAAACAT-3’,Reverse:5’-TCGATTTGAACTCARATCATGTA-3’)扩增，反应体系以10μL计，包括ddH2O，1.5μL；2×Multiplex PCR Master Mix，5.0μL；ForwardPrimer(10μM)，1.0μL；Reverse Primer(10μM)，1.0μL和DNA模板，1.5μL。PCR反应条件为：95℃预变性15分钟；94℃变性30秒，50℃退火1分钟30秒，72℃延伸1分钟，共35个循环。
[0163] 2、检出限测定 PCR产物送测序并检测浓度，计算拷贝数，原模板溶液单独进行稀释并混合，分别为1000、500、100、50、10和5拷贝数。取1.0μL稀释溶液作PCR扩增的模板，反应体系和条件同实施例4中的描述。PCR扩增产物也按实施例4中的凝胶电泳分析判断。
[0164] 3、结果 如图12所示单独DNA模板检出限为50拷贝。
[0165] 实施例13单重PCR体系SP2对Alloxysta sp2最低检出限的测定
[0166] 1、通用引物扩增 按实施例5提取单头Alloxysta sp2的DNA，16S通用引物(Forward:5’-CACCTGTTTATCAAAAACAT-3’,Reverse:5’-TCGATTTGAACTCARATCATGTA-3’)扩增，反应体系以10μL计，包括ddH2O，1.5μL；2×Multiplex PCR Master Mix，5.0μL；Forward Primer(10μM)，1.0μL；Reverse Primer(10μM)，1.0μL和DNA模板，1.5μL。PCR反应条件为：95℃预变性15分钟；94℃变性30秒，50℃退火1分钟30秒，72℃延伸1分钟，共35个循环。
[0167] 2、检出限测定 PCR产物送测序并检测浓度，计算拷贝数，原模板溶液单独进行稀释并混合，分别为1000、500、100、50、10和5拷贝数。取1.0μL稀释溶液作PCR扩增的模板，反应体系和条件同实施例5中的描述。PCR扩增产物也按实施例5中的凝胶电泳分析判断。
[0168] 3、结果 如图13所示，单独DNA模板检出限为500拷贝。
[0169] 实施例14单重PCR体系SP3对Alloxysta sp3最低检出限的测定
[0170] 1、通用引物扩增 按实施例6提取单头Alloxysta sp3的DNA，16S通用引物(Forward:5’-CACCTGTTTATCAAAAACAT-3’,Reverse:5’-TCGATTTGAACTCARATCATGTA-3’)扩增，反应体系以10μL计，包括ddH2O，1.5μL；2×Multiplex PCR Master Mix，5.0μL；Forward Primer(10μM)，1.0μL；Reverse Primer(10μM)，1.0μL和DNA模板，1.5μL。PCR反应条件为：95℃预变性15分钟；94℃变性30秒，50℃退火1分钟30秒，72℃延伸1分钟，共35个循环。
[0171] 2、检出限测定 PCR产物送测序并检测浓度，计算拷贝数，原模板溶液单独进行稀释并混合，分别为1000、500、100、50、10和5拷贝数。取1.0μL稀释溶液作PCR扩增的模板，反应体系和条件同实施例6中的描述。PCR扩增产物也按实施例6中的凝胶电泳分析判断。
[0172] 3、结果 如图14所示，单独DNA模板检出限为500拷贝。
[0173] 实施例15单重PCR体系SP4对合沟细蜂最低检出限的测定
[0174] 1、通用引物扩增 按实施例6提取单头合沟细蜂的DNA，COI通用引物(Forward:5’-GGTCAACAAATCATAAAGATA TTGG-3’,Reverse:5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’)扩增，反应体系以10μL计，包括ddH2O，1.5μL；2×Multiplex PCR Master Mix，5.0μL；ForwardPrimer(10μM)，1.0μL；Reverse Primer(10μM)，1.0μL和DNA模板，1.5μL。PCR反应条件为：95℃预变性15分钟；94℃变性30秒，50℃退火1分钟30秒，72℃延伸1分钟，共35个循环。
[0175] 2、检出限测定 PCR产物送测序并检测浓度，计算拷贝数，原模板溶液单独进行稀释并混合，分别为1000、500、100、50、10和5拷贝数。取1.0μL稀释溶液作PCR扩增的模板，反应体系和条件同实施例7中的描述。PCR扩增产物也按实施例7中的凝胶电泳分析判断。
[0176] 3、结果 如图15所示，单独DNA模板检出限为500拷贝。
[0177] 实施例16单重PCR体系SP5对黄足分盾细蜂最低检出限的测定
[0178] 1、通用引物扩增 按实施例6提取单头黄足分盾细蜂的DNA，COI通用引物(Forward:5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’,Reverse:5’-
TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’)扩增，反应体系以10μL计，包括ddH2O，1.5μL；2×Multiplex PCR Master Mix，5.0μL；Forward Primer(10μM)，1.0μL；Reverse Primer(10μM)，1.0μL和DNA模板，1.5μL。PCR反应条件为：95℃预变性15分钟；94℃变性30秒，50℃退火1分钟30秒，72℃延伸1分钟，共35个循环。
[0179] 2、检出限测定 PCR产物送测序并检测浓度，计算拷贝数，原模板溶液单独进行稀释并混合，分别为1000、500、100、50、10和5拷贝数。取1.0μL稀释溶液作PCR扩增的模板，反应体系和条件同实施例7中的描述。PCR扩增产物也按实施例7中的凝胶电泳分析判断。
[0180] 3、结果 如图16所示，单独DNA模板检出限为500拷贝。

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