防治小麦条锈病的重寄生真菌分离、鉴定及菌剂

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防治小麦条锈病的重寄生真菌分离、鉴定及菌剂
申请号	CN202011531153.0	申请日	2020-12-22	公开(公告)号	CN112625918A	公开(公告)日	2021-04-09
申请人	西北农林科技大学;			发明人	王晓杰; 王宁; 张珊; 胡泽宇; 樊昕; 王建锋; 汤春蕾; 康振生;
摘要	本发明属于农业生物防治与微生物生物制剂技术领域，公开了一种防治小麦条锈病的重寄生真菌分离、鉴定及菌剂，本发明中所鉴定使用的重寄生菌株是在自然条件下发现的菌系，该重寄生菌是从小麦条锈菌表面的白色寄生菌及灰褐色寄生菌分离得到的，能有效地抑制小麦条锈菌对小麦植株的侵染和危害，该分离物还降低了小麦条锈菌的产生和活力；在生产上具有很高的应用价值；此种寄生菌能够显著的抑制小麦条锈菌的生长发育和孢子的产生，并且，该重寄生菌培养方式简单易操作，是潜在能够广泛应用的防治小麦条锈病的新型菌系。
权利要求	1.一种防治小麦条锈病的重寄生真菌，其特征在于，所述防治小麦条锈病的重寄生真菌为枝状枝孢菌和拟青霉菌；保藏编号：CGMCC No.20276。 2.一种由权利要求1所述防治小麦条锈病的重寄生真菌制备的生物菌剂。 3.一种如权利要求2所述生物菌剂在防治小麦条锈病中的应用。 4.一种由权利要求1所述防治小麦条锈病的重寄生真菌建立的防治小麦条锈病的菌系。 5.一种如权利要求1所述防治小麦条锈病的重寄生真菌的分离方法，其特征在于，所述防治小麦条锈病的重寄生真菌的分离方法包括以下步骤：第一步，采集培养箱中小麦条锈病的发病叶片，在条锈菌接种16天时，条锈菌表现为橙黄色的孢子堆；第二步，培养箱中发现孢子堆表面呈现出灰褐色，采取发病部位的叶段，用剪刀剪成 5mm的小段，经过ddH2O漂洗，70％酒精表面消毒处理，1％NaClO表面消毒，再经过无菌水洗 3‑5次；第三步，接种于新鲜配置的PDA培养基上，分离25℃培养一周后，挑选生长单一的菌体利用打孔法将培养的菌体打成5mm直径的菌块，转接至新的PDA培养基上，25℃培养1周，获得纯化的菌体。 6.如权利要求5所述的防治小麦条锈病的重寄生真菌的分离方法，其特征在于，所述防治小麦条锈病的重寄生真菌的分离方法的固体培养基：重寄生菌的分离和培养采用固体马铃薯葡萄糖琼脂PDA培养基，将发病的叶片接种到PDA固体平板培养基上经过分离纯化获得重寄生菌。 7.一种如权利要求1所述防治小麦条锈病的重寄生真菌的分子鉴定方法，其特征在于，所述防治小麦条锈病的重寄生真菌的分子鉴定方法包括以下步骤：从25℃黑暗培养5天的菌落中分离得到R23Bo菌丝；采用十六烷基三甲基溴化铵法从菌丝体中提取DNA；用真核核糖体DNA的引物进行PCR扩增；PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶中分离，采用琼脂糖凝胶DNA提取纯化试剂盒收集纯化。
说明书全文	防治小麦条锈病的重寄生真菌分离、鉴定及菌剂技术领域 [0001] 本发明属于农业生物防治与微生物生物制剂技术领域，尤其涉及一种防治小麦条锈病的重寄生真菌、分离和鉴定方法、菌剂。背景技术 [0002] 目前，最接近的现有技术：小麦条锈病是由小麦条型柄锈菌小麦转化型(Puccinia striiformis f.sp.Tritici,Pst)引起的危害全球小麦产区的重大病害，小麦条锈菌是一种低温气传性病害，能够危害小麦的整个生长周期。小麦条锈病的防治主要依赖化学农药的使用，但是过度的依赖化学农药是以牺牲环境为代价的。 [0003] 综上所述，现有技术存在的问题是： [0004] (1)抗病品种创造速度受限，抗病品种利用率下降。 [0005] (2)化学农药的过度使用严重影响我国粮食生产安全。 [0006] (3)小麦条锈病产生了抗药性，需要研制新型的化学或者生物制剂。 [0007] 解决上述技术问题的难度：开发对环境更友好的生物制剂对于小麦条锈病的防治。 [0008] 解决上述技术问题的意义：研制和开发新型的生物制剂对小麦条锈菌的防控至关重要。发明内容 [0009] 针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种防治小麦条锈病的重寄生真菌、分离和鉴定方法、菌剂。 [0010] 本发明是这样实现的，一种防治小麦条锈病的重寄生真菌拟青霉菌，其保藏编号CGMCC No.20276，分类命名Simplicillium obclavatum，菌株名称RV26，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。由2020年9月 30日起保存三十年；保藏中心于2020年9月30日检测，结果是存活；请求保藏人：西北农林科技大学。 [0011] 所述防治小麦条锈病的重寄生真菌为枝状枝孢菌和拟青霉菌，通过制备孢子悬浮液喷洒至小麦叶片表苗。分离菌来自于自然条件下扩繁的条锈菌上，喷施的孢子浓度为1.0 6 ‑1 ×10孢子·mL 。 [0012] 本发明的另一目的在于提供一种由所述防治小麦条锈病的重寄生真菌制备的生物菌剂。 [0013] 本发明的另一目的在于提供一种所述生物菌剂在防治小麦条锈病中的应用。 [0014] 本发明的另一目的在于提供一种由所述防治小麦条锈病的重寄生真菌建立的防治小麦条锈病的菌系。 [0015] 本发明的另一目的在于提供一种所述防治小麦条锈病的重寄生真菌的分离方法，所述防治小麦条锈病的重寄生真菌的分离方法包括以下步骤： [0016] 第一步，采集培养箱中小麦条锈病的发病叶片，在条锈菌接种16天时，条锈菌表现为橙黄色的孢子堆； [0017] 第二步，培养箱中发现孢子堆表面呈现出灰褐色，采取发病部位的叶段，用剪刀剪成5mm的小段，经过ddH2O漂洗，70％酒精表面消毒处理，1％NaClO 表面消毒，再经过无菌水洗3‑5次； [0018] 第三步，接种于新鲜配置的PDA培养基上，分离25℃培养一周后，挑选生长单一的菌体利用打孔法将培养的菌体打成5mm直径的菌块，转接至新的PDA 培养基上，25℃培养1 周，获得纯化的菌体。 [0019] 进一步，所述防治小麦条锈病的重寄生真菌的分离方法的固体培养基：重寄生菌的分离和培养采用固体马铃薯葡萄糖琼脂PDA培养基，将发病的叶片接种到PDA固体平板培养基上经过分离纯化获得重寄生菌。 [0020] 本发明的另一目的在于提供一种所述防治小麦条锈病的重寄生真菌的分子鉴定方法，所述防治小麦条锈病的重寄生真菌的分子鉴定方法包括以下步骤：从25℃黑暗培养5 天的菌落中分离得到R23Bo菌丝；采用十六烷基三甲基溴化铵法从菌丝体中提取DNA；用真核核糖体DNA的引物进行PCR扩增；PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶中分离，采用琼脂糖凝胶DNA 提取纯化试剂盒收集纯化。 [0021] 综上所述，本发明的优点及积极效果为：本发明基于在自然繁殖小麦条锈菌的过程中发现的能够显著性抑制小麦条锈菌生长发育和孢子的产生，对小麦条锈病的生物防治存在潜在的应用价值。本发明的鉴定发现的两种重寄生真菌能够高效的抑制小麦条锈菌的生长发育和孢子的产生，且这两种病菌容易培养获得，利用其能够重寄生于小麦条锈菌的表面的特点，可将其制备成生物药剂，用于小麦条锈病的生物防治。 [0022] 本发明利用鉴定获得的两种能够重寄生在小麦条锈菌上的菌株，对此两种菌株进行大规模扩繁喷施或者注射于被小麦条锈菌感染的小麦上，小麦条锈病能够被有效的防治。小麦条锈菌中分离出鉴定发现的重寄生菌，经过鉴定发现其为枝状枝孢菌 C.cladosporioides，拟青霉菌S.obclavatum，在进行抑菌效果实验的过程发现这两种重寄生菌对小麦条锈菌的生长发育有明显的抑制作用，并且这两种寄生菌在PDA培养基上就能完成生长并产生分生孢子，并对小麦的生长发育没有不良影响，能够作为潜在的用于防治小麦条锈菌的生物制剂。 [0023] 小麦条锈病是一种由条型柄锈菌小麦转化型Puccinia striiformis f.sp.tritici 引起的专性生物营养真菌。在此，从小麦条锈菌中分离出鉴定发现了两种重寄生菌，并对其进行了形态学鉴定和分子标记的多位点分析发现其为枝状枝孢菌 Cladosporium cladosporioides和拟青霉菌Simplicillium obclavatum。该重生菌是从小麦条锈菌表面的灰褐色寄生菌分离得到的，能有效地抑制小麦条锈菌对小麦植株的侵染和危害，该分离物还降低了小麦条锈菌的产生和活力。因此，两种分离株C.cladosporioides 和S.obclavatum对小麦条锈病的生物防治具有潜在的应用价值。 [0024] 本发明中所鉴定使用的重寄生菌株是在自然条件下培养箱内发现的菌系，在生产上具有很高的应用价值；此两种寄生菌能够显著的抑制小麦条锈菌的生长发育和孢子的产生，并且，菌的培养方式简单易操作，是潜在能够广泛应用的防治小麦条锈病的新型菌系。附图说明 [0025] 图1是本发明实施例提供的防治小麦条锈病的重寄生真菌的分离方法流程图。 [0026] 图2是本发明实施例提供的分离鉴定得到的枝状枝孢菌C.cladosporioides 生长形态特征示意图；A‑B为培养的菌丝形态，其中A，培养平板正面照片；B，培养平板正面照片。 [0027] 图3是本发明实施例提供的分离鉴定得到的枝状枝孢菌C.cladosporioides 显微形态特征示意图。 [0028] 图4是本发明实施例提供的分离鉴定得到的枝状枝孢菌C.cladosporioides 孢子悬浮液对小麦条锈菌的防效示意图。 [0029] 图5是本发明实施例提供的分离鉴定得到的拟青霉菌S.obclavatum生长形态特征示意图；A‑B为培养的菌丝形态，其中A，培养平板正面照片；B，培养平板正面照片。 [0030] 图6是本发明实施例提供的分离鉴定得到的拟青霉菌S.obclavatum显微形态特征示意图。 [0031] 图7是本发明实施例提供的分离鉴定得到的拟青霉菌S.obclavatum孢子悬浮液对小麦条锈菌的防效示意图。具体实施方式 [0032] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。 [0033] 针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种防治小麦条锈病的重寄生真菌、分离和鉴定方法、菌剂，下面结合附图对本发明作详细的描述。 [0034] 本发明实施例提供的防治小麦条锈病的重寄生真菌为枝状枝孢菌 Cladosporium cladosporioides和拟青霉菌Simplicillium obclavatum。保藏编号： CGMCC 20276。 [0035] 如图1所示，本发明实施例提供的防治小麦条锈病的重寄生真菌的分离方法包括以下步骤： [0036] S101：采集培养箱中小麦条锈病的发病叶片，在条锈菌接种16天时，条锈菌表现为橙黄色的孢子堆； [0037] S102：培养箱中发现孢子堆表面呈现出灰褐色，采取发病部位的叶段，用剪刀剪成5mm的小段，经过ddH2O漂洗，70％酒精表面消毒处理，1％NaClO 表面消毒，再经过无菌水洗 3‑5次； [0038] S103：接种于新鲜配置的PDA培养基上，分离25℃培养一周后，挑选生长单一的菌体利用打孔法将培养的菌体打成5mm直径的菌块，转接至新的PDA 培养基上，25℃培养1周，获得纯化的菌体。 [0039] 本发明实施例提供的防治小麦条锈病的重寄生真菌的分离和鉴定方法包括以下步骤： [0040] 步骤一：重寄生菌的分离纯化 [0041] 采集培养箱中小麦条锈病的发病叶片，在条锈菌接种16天时，条锈菌表现为橙黄色的孢子堆，培养箱中偶然发现孢子堆表面呈现出灰褐色，采取发病部位的叶段，用剪刀剪成5mm的小段，经过ddH2O漂洗，70％酒精表面消毒处理， 1％NaClO表面消毒，再经过无菌水洗3‑5次，接种于新鲜配置的PDA培养基上，分离25℃培养一周后，挑选生长单一的菌体利用打孔法将培养的菌体打成5mm 直径的菌块，转接至新的PDA培养基上，25℃培养1周，从而获得纯化的菌体。 [0042] 步骤二：重寄生菌的形态学观察 [0043] 对分离得到的纯培养重寄生菌R23Bo，取直径为5毫米菌块，呈三角状放置在新的PDA培养基平板上，在相同的条件下培养10d。将培养好的菌体对正面反面分别拍照记录，在光显微镜下观察和测量菌落、菌丝、分生孢子和分生孢子梗等菌的形态。 [0044] 样品用先前描述的方法制备(Zheng et al.,2017)，首先，样品在4℃的戊二醛溶液中固定，用PBS缓冲10分钟洗4次，15‑20分钟脱水，5个浓度梯度(30％，50％，70％，80％， 90％)乙醇。在乙酸异戊酯中浸泡10‑20分钟，然后用二氧化碳干燥器处理脱水样品。最后，用喷漆炸弹方法对样品进行处理。样品在扫描电镜观察SEM(Scanning electron microscope)下观察到菌的显微形态。 [0045] 步骤三：重寄生菌的分子鉴定 [0046] 从25℃黑暗培养5天的菌落中分离得到R23Bo菌丝。采用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法从菌丝体中提取DNA(Wang et al.2015)。用ITS(真核核糖体DNA)的引物进行PCR 扩增。PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶中分离，采用琼脂糖凝胶DNA提取纯化试剂盒(Takara, Japan)收集纯化。扩增片段由AuGCT 公司(北京，中国)测序。 [0047] 步骤四：重寄生菌的抑菌分析 [0048] 小麦Fielder在培养箱中生长20天(16℃，16h光照；12℃，8h黑暗)，首先，接种小麦条锈菌CYR31夏孢子，在16℃的黑暗保湿培养24h，然后放置在生长培养箱中培养条件同上。 6 在接种小麦条锈菌三，五，七，十天后，植物在不同的分离菌株的孢子悬浮液(1.0×10 孢子/ml)，16℃黑暗保湿24h，然后回到相同条件下的生长培养箱。以只接种小麦条锈菌的植物为对照，记录症状和表型，用Image J number counting software对叶片表面的孢子进行统计。同时，为了进一步评价分离的重寄生菌对条锈菌的防治效果，分别采取不同接种时间的叶片组织提取DNA，测定真菌生物量(Pst‑DNA/小麦DNA比值)。用扫描电镜(SEM)对小麦条锈菌接种后不同处理的受感染叶片样品进行超微结构分析，从而揭示重寄生菌对小麦条锈菌的生长发育的影响。 [0049] 本发明的培养条件包括： [0050] 固体培养基：重寄生菌的分离和培养采用固体马铃薯葡萄糖琼脂PDA培养基，将发病的叶片接种到PDA固体平板培养基上经过分离纯化获得重寄生菌； [0051] 液体培养基：在研究重寄生菌对小麦条锈病的防治效果，将培养的好的菌饼接种到PDA液体培养基中，25℃震荡培养3‑4天获得重寄生菌的悬浮液，对其进行处理计数后用于接种。 [0052] 下面结合附图对本发明的技术效果作详细的描述。 [0053] 在本发明中分离鉴定获得了两种能够在培养箱内重寄生在小麦条锈菌的寄生菌，通过分子鉴定和显微学观察发现其为枝状枝孢菌C.cladosporioides菌株 R23Bo和拟青霉菌S.obclavatum菌株RV26，对条锈菌侵染的小麦叶片注射这两种菌的孢子悬浮液发现，小麦条锈菌的发病显著减弱，产孢数量也明显减少，病害被显著性抑制。 [0054] 在研究重寄生菌对小麦条锈病的防治效果，将培养的好的菌饼接种到PDA 液体培养基中，25℃震荡培养3‑4天获得重寄生菌的悬浮液，对其进行处理计数后用于接种，孢子 6 悬浮液的个数为1.0×10个/mL。并对条锈菌感染的小麦进行接种，采集接种后小麦叶片进行扫描电镜观察和表型的观察，并对发表的叶片表面的夏孢子堆数目进行统计。结果证实在接种了两种重寄生菌后小麦条锈菌的生长发育受到了显著的抑制，产孢数量明显减少。 [0055] 枝状枝孢菌C.cladosporioides菌株R23Bo和拟青霉菌S.obclavatum菌株 RV26能够成功侵入小麦条锈菌夏孢子，通过芽管在小麦条锈菌表面定植，吸收营养完成自身的生长发育，产生大量的分生孢子再次侵染小麦条锈菌，直到完全摧毁小麦条锈菌。 [0056] 扫描电镜观察进一步表明，分离得到的R23Bo和RV26两个菌株能有效地寄生于小麦条锈菌。在接种R23Bo 36h，C.cladosporioides分生孢子产生生芽管与开始侵入小麦条锈菌夏孢子。在接种120h C.cladosporioides产生大量的孢子完全摧毁条锈菌的夏孢。进一步明确了RV26菌株S.obclavatum能有效寄生于小麦条锈菌以及对Pst的影响。扫描电镜下观察接种S.obclavatum的Pst的外观形态特征S.obclavatum通芽管侵入Pst夏孢子，并逐渐包围Pst，直到S. obclavatum末端在120h和168h时完全定植Pst夏孢子。 [0057] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。