一种人畜共患寄生虫多重PCR检测方法

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一种人畜共患寄生虫多重PCR检测方法
申请号	CN202110903484.0	申请日	2021-08-06	公开(公告)号	CN113604581A	公开(公告)日	2021-11-05
申请人	上海市农业科学院;			发明人	戴建军; 孙玲伟; 张德福; 陈旭; 吴彩凤; 徐皆欢; 张树山;
摘要	本申请公开了一种人畜共患寄生虫多重PCR检测方法，包括从动物血液中和粪便中分别获取DNA；将获得的血液DNA和粪便DNA，分别制备成浓度为25ng/μL的DNA溶液，并将两者的DNA溶液混合，混合后按照10倍倍比稀释成若干个浓度梯度；对获得的若干浓度梯度的DNA溶液进行多重PCR扩增；利用琼脂糖凝胶电泳观察，以不出现明显条带的前一个浓度为最低检测浓度，并对最低检测浓度及以上浓度的扩增溶液，进行DNA结构和功能的分析，进而判断出寄生虫的种类。本方案，具有较高的实用性且方便快捷，使临床上检测人畜共患寄生虫疾病所用时间大幅缩减，检测效率得到有效保障，为检测山羊易患的人畜共患寄生虫疾病提供技术支撑。
权利要求	1.一种人畜共患寄生虫多重PCR检测方法，其特征在于，具体包括以下步骤：S1、获取DNA，从动物血液中和粪便中分别获取DNA； S2、混合，将获得的血液DNA和粪便DNA，分别制备成浓度为25ng/μL的DNA溶液，并将两者的DNA溶液混合，混合后按照10倍倍比稀释成若干个浓度梯度； S3、多重PCR扩增，对获得的若干浓度梯度的DNA溶液进行多重PCR扩增，多重PCR扩增的参数为：混合底物1μL，上下游引物各0.5μL，2×HiFiAmplification Mix 10μL，ddH2O补足 20μL，94℃预变性2min，98℃变性10s，60℃退火30s，68℃延伸15s，重复35个循环，即完成扩增过程； S4、获得结果，利用琼脂糖凝胶电泳观察，以不出现明显条带的前一个浓度为最低检测浓度，并对最低检测浓度及以上浓度的扩增溶液，进行DNA结构和功能的分析，进而判断出寄生虫的种类。 2.如权利要求1所述的一种人畜共患寄生虫多重PCR检测方法，其特征在于，所述S1中，获取DNA的具体方式为，先获取血液样本和粪便样本，分别按照血液DNA提取试剂盒和粪便DNA提取试剂盒操作要求提取DNA，即可获得血液DNA和粪便DNA。 3.如权利要求1所述的一种人畜共患寄生虫多重PCR检测方法，其特征在于，所述S2中， 1 0 ‑1 浓度梯度设置有9个，且各浓度梯度分别为2.5×10 ng/μL、2.5×10ng/μL、2.5×10 ng/μ‑2 ‑3 ‑4 ‑5 ‑6 L、2.5×10 ng/μL、2.5×10 ng/μL、2.5×10 ng/μL、2.5×10 ng/μL、2.5×10 ng/μL和‑7 2.5×10 ng/μL。 4.如权利要求1所述的一种人畜共患寄生虫多重PCR检测方法，其特征在于，所述S3中，‑5 循环个数的确定方式为：分别设计循环数为20、25、30、35和40个循环，2.5×10 ng/μL DNA混合物1μL，上下游引物各0.5μL，2×HiFi Amplification Mix 10μL，ddH2O加至20μL，94℃预变性2min，98℃变性10s，60℃退火30s，68℃延伸15s，琼脂糖凝胶电泳观察，以出现明显条带的那一个循环数为最佳的循环数，最佳的循环数为35。 5.如权利要求1或4所述的一种人畜共患寄生虫多重PCR检测方法，其特征在于，所述琼脂糖凝胶电泳观察的具体方式为：用2％的琼脂糖凝胶，120V电压下电泳35min，EB溴乙锭染色紫外仪下观察，且配胶体系如下：小胶：0.4g琼脂粉、20ml TAE、2μL EB，微波炉加热2～3min直至溶液透明清亮，倒入容器，插入梳子；中胶：0.8g琼脂粉、40ml TAE、4μL EB，微波炉加热2～3min直至溶液透明清亮，倒入容器，插入梳子；大胶：1.6g琼脂粉、80ml TAE、8μL EB，微波炉加热3～4min直至溶液透明清亮，倒入容器，插入梳子。 6.如权利要求1所述的一种人畜共患寄生虫多重PCR检测方法，其特征在于，所述S3中，退火温度的确定方式为：设置50℃、52℃、54℃、56℃、58℃和60℃的退火温度，观察扩增条带的明暗与清晰度来选择最佳的退火温度，最佳的退火温度为60℃。
说明书全文	一种人畜共患寄生虫多重PCR检测方法技术领域 [0001] 本申请涉及人畜共患疫病技术领域，具体而言，涉及一种人畜共患寄生虫多重PCR检测方法。背景技术 [0002] 山羊等养殖动物易患多种人畜共患疫病，一方面对动物健康造成影响，使养殖经济效益下滑，另一方面严重危害养殖从业人员、消费者和科技工作人员的身体健康。目前针对这些疫病的检测技术大部分采用单一病原的ELISA或PCR检测，效率较为低下，有待开发同时针对多个病原的高效检测技术。发明内容 [0003] 本申请的主要目的在于提供一种人畜共患寄生虫多重PCR检测方法，以改善相关技术中,检测效率低下的问题。 [0004] 为了实现上述目的，本申请提供了一种人畜共患寄生虫多重PCR检测方法，具体包括以下步骤： [0005] S1、获取DNA，从动物血液中和粪便中分别获取DNA； [0006] S2、混合，将获得的血液DNA和粪便DNA，分别制备成浓度为25ng/μL的DNA溶液，并将两者的DNA溶液混合，混合后按照10倍倍比稀释成若干个浓度梯度； [0007] S3、多重PCR扩增，对获得的若干浓度梯度的DNA溶液进行多重PCR扩增，多重PCR扩增的参数为：混合底物1μL，上下游引物各0.5μL，2×HiFi Amplification Mix 10μL，ddH2O 补足20μL，94℃预变性2min，98℃变性10s，60℃退火30s，68℃延伸15s，重复35个循环，即完成扩增过程； [0008] S4、获得结果，利用琼脂糖凝胶电泳观察，以不出现明显条带的前一个浓度为最低检测浓度，并对最低检测浓度及以上浓度的扩增溶液，进行DNA结构和功能的分析，进而判断出寄生虫的种类。 [0009] 在本申请的一种实施例中，所述S1中，获取DNA的具体方式为，先获取血液样本和粪便样本，分别按照血液DNA提取试剂盒和粪便DNA提取试剂盒操作要求提取DNA，即可获得血液DNA和粪便DNA。 [0010] 在本申请的一种实施例中，所述S2中，浓度梯度设置有9个，且各浓度梯度分别为1 0 ‑1 ‑2 ‑3 2.5×10ng/μL、2.5×10ng/μL、2.5×10 ng/μL、2.5×10 ng/μL、2.5×10 ng/μL、2.5× ‑4 ‑5 ‑6 ‑7 10 ng/μL、2.5×10 ng/μL、2.5×10 ng/μL和2.5×10 ng/μL。 [0011] 在本申请的一种实施例中，所述S3中，循环个数的确定方式为：分别设计循环数为‑5 20、25、30、35和40个循环，2.5×10 ng/μL DNA混合物1μL，上下游引物各0.5μL，2×HiFi Amplification Mix 10μL，ddH2O加至20μL，94℃预变性2min，98℃变性10s，60℃退火30s， 68℃延伸15s，琼脂糖凝胶电泳观察，以出现明显条带的那一个循环数为最佳的循环数，最佳的循环数为35。 [0012] 在本申请的一种实施例中，所述琼脂糖凝胶电泳观察的具体方式为：用2％的琼脂糖凝胶，120V电压下电泳35min，EB溴乙锭染色紫外仪下观察，且配胶体系如下： [0013] 小胶：0.4g琼脂粉、20ml TAE、2μL EB，微波炉加热2～3min直至溶液透明清亮，倒入容器，插入梳子； [0014] 中胶：0.8g琼脂粉、40ml TAE、4μL EB，微波炉加热2～3min直至溶液透明清亮，倒入容器，插入梳子； [0015] 大胶：1.6g琼脂粉、80ml TAE、8μL EB，微波炉加热3～4min直至溶液透明清亮，倒入容器，插入梳子。 [0016] 在本申请的一种实施例中，所述S3中，退火温度的确定方式为：设置50℃、52℃、54℃、56℃、58℃和60℃的退火温度，观察扩增条带的明暗与清晰度来选择最佳的退火温度，最佳的退火温度为60℃。 [0017] 与现有技术相比，本申请的有益效果是：通过上述设计的人畜共患寄生虫多重PCR检测方法，可同时对多种寄生虫进行检测，既高效又便捷，不仅节约时间，还节省试剂，具有很大的临床意义；且具有较高的实用性且方便快捷，使临床上检测人畜共患寄生虫疾病所用时间大幅缩减，检测效率得到有效保障，为检测山羊易患的人畜共患寄生虫疾病提供技术支撑。附图说明 [0018] 图1为根据本申请实施例提供的人畜共患寄生虫多重PCR检测方法的实验中，六种人畜共患寄生虫单重PCR扩增片段大小示意图； [0019] 图2为根据本申请实施例提供的人畜共患寄生虫多重PCR检测方法的实验中，四种人畜共患寄生虫单一PCR和多重PCR同时进行扩增,扩增片段大小示意图； [0020] 图3为根据本申请实施例提供的人畜共患寄生虫多重PCR检测方法的实验中，两种人畜共患寄生虫单一PCR和多重PCR同时进行扩增,扩增片段大小示意图； [0021] 图4为根据本申请实施例提供的人畜共患寄生虫多重PCR检测方法的实验中，对四重PCR的退火温度进行优化，扩增片段大小示意图； [0022] 图5为根据本申请实施例提供的人畜共患寄生虫多重PCR检测方法的实验中，对两重PCR的退火温度进行优化，扩增片段大小示意图； [0023] 图6为根据本申请实施例提供的人畜共患寄生虫多重PCR检测方法的实验中，检测多重PCR反应体系的灵敏度，扩增片段大小示意图； [0024] 图7为根据本申请实施例提供的人畜共患寄生虫多重PCR检测方法的实验中，四种血液寄生虫混合DNA，挑选合适的扩增循环数，扩增片段大小示意图； [0025] 图8为根据本申请实施例提供的人畜共患寄生虫多重PCR检测方法的实验中，两种血液寄生虫混合DNA，挑选合适的扩增循环数，扩增片段大小示意图； [0026] 图9为根据本申请实施例提供的人畜共患寄生虫多重PCR检测方法的实验中，多重PCR体系对临床上68份血液样品进行扩增的第一示意图； [0027] 图10为根据本申请实施例提供的人畜共患寄生虫多重PCR检测方法的实验中，多重PCR体系对临床上68份血液样品进行扩增的第二示意图； [0028] 图11为根据本申请实施例提供的人畜共患寄生虫多重PCR检测方法的实验中，多重PCR体系对临床上68份血液样品进行扩增的第三示意图； [0029] 图12为根据本申请实施例提供的人畜共患寄生虫多重PCR检测方法的实验中，多重PCR体系对临床上40份粪便样品进行扩增的第一示意图； [0030] 图13为根据本申请实施例提供的人畜共患寄生虫多重PCR检测方法的实验中，多重PCR体系对临床上40份粪便样品进行扩增的第二示意图； [0031] 图14为根据本申请实施例提供的人畜共患寄生虫多重PCR检测方法的实验中，多重PCR体系对临床上40份粪便样品进行扩增的第三示意图。具体实施方式 [0032] 为了使本技术领域的人员更好地理解本申请方案，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本申请保护的范围。 [0033] 需要说明的是，本申请的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本申请的实施例。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。 [0034] 在本申请中，术语“上”、“下”、“左”、“右”、“前”、“后”、“顶”、“底”、“内”、“外”、“中”、“竖直”、“水平”、“横向”、“纵向”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系。这些术语主要是为了更好地描述本申请及其实施例，并非用于限定所指示的装置、元件或组成部分必须具有特定方位，或以特定方位进行构造和操作。 [0035] 并且，上述部分术语除了可以用于表示方位或位置关系以外，还可能用于表示其他含义，例如术语“上”在某些情况下也可能用于表示某种依附关系或连接关系。对于本领域普通技术人员而言，可以根据具体情况理解这些术语在本申请中的具体含义。 [0036] 另外，术语“多个”的含义应为两个以及两个以上。 [0037] 需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本申请。 [0038] 实施例1 [0039] 请参阅图1‑图14，本申请提供了一种人畜共患寄生虫多重PCR检测方法，具体包括以下步骤： [0040] S1、获取DNA，从动物血液中和粪便中分别获取DNA； [0041] S2、混合，将获得的血液DNA和粪便DNA，分别制备成浓度为25ng/μL的DNA溶液，并将两者的DNA溶液混合，混合后按照10倍倍比稀释成若干个浓度梯度； [0042] S3、多重PCR扩增，对获得的若干浓度梯度的DNA溶液进行多重PCR扩增，多重PCR扩增的参数为：混合底物1μL，上下游引物各0.5μL，2×HiFi Amplification Mix 10μL，ddH2O 补足20μL，94℃预变性2min，98℃变性10s，60℃退火30s，68℃延伸15s，重复35个循环，即完成扩增过程； [0043] S4、获得结果，利用琼脂糖凝胶电泳观察，以不出现明显条带的前一个浓度为最低检测浓度，并对最低检测浓度及以上浓度的扩增溶液，进行DNA结构和功能的分析，进而判断出寄生虫的种类。 [0044] 在本申请的一种实施例中，所述S1中，获取DNA的具体方式为，先获取血液样本和粪便样本，分别按照血液DNA提取试剂盒和粪便DNA提取试剂盒操作要求提取DNA，即可获得血液DNA和粪便DNA。 [0045] 在本申请的一种实施例中，所述S2中，浓度梯度设置有9个，且各浓度梯度分别为1 0 ‑1 ‑2 ‑3 2.5×10ng/μL、2.5×10ng/μL、2.5×10 ng/μL、2.5×10 ng/μL、2.5×10 ng/μL、2.5× ‑4 ‑5 ‑6 ‑7 10 ng/μL、2.5×10 ng/μL、2.5×10 ng/μL和2.5×10 ng/μL。 [0046] 在本申请的一种实施例中，所述S3中，循环个数的确定方式为：分别设计循环数为‑5 20、25、30、35和40个循环，2.5×10 ng/μL DNA混合物1μL，上下游引物各0.5μL，2×HiFi Amplification Mix 10μL，ddH2O加至20μL，94℃预变性2min，98℃变性10s，60℃退火30s， 68℃延伸15s，琼脂糖凝胶电泳观察，以出现明显条带的那一个循环数为最佳的循环数，最佳的循环数为35。 [0047] 在本申请的一种实施例中，所述琼脂糖凝胶电泳观察的具体方式为：用2％的琼脂糖凝胶，120V电压下电泳35min，EB溴乙锭染色紫外仪下观察，且配胶体系如下： [0048] 小胶：0.4g琼脂粉、20ml TAE、2μL EB，微波炉加热2～3min直至溶液透明清亮，倒入容器，插入梳子； [0049] 中胶：0.8g琼脂粉、40ml TAE、4μL EB，微波炉加热2～3min直至溶液透明清亮，倒入容器，插入梳子； [0050] 大胶：1.6g琼脂粉、80ml TAE、8μL EB，微波炉加热3～4min直至溶液透明清亮，倒入容器，插入梳子。 [0051] 在本申请的一种实施例中，所述S3中，退火温度的确定方式为：设置50℃、52℃、54℃、56℃、58℃和60℃的退火温度，观察扩增条带的明暗与清晰度来选择最佳的退火温度，最佳的退火温度为60℃。 [0052] 经过试验验证，具体的试验步骤如下： [0053] 将‑80℃保存的68份山羊血样和40份山羊粪便(均来自上海市农业科学院崇明食草动物试验站)取出，4℃条件下解冻，分别按照血液DNA提取试剂盒和粪便DNA提取试剂盒操作要求提取DNA，使用本研究建立的四重PCR和两重PCR体系对提取的两种DNA进行检测。 [0054] 如图1所示：6种人畜共患寄生虫分别进行单重PCR扩增，第一孔至第六孔所加样品依次为：微小隐孢子虫、泰勒氏焦虫、新孢子虫、十二指肠贾第虫、伊氏锥虫、弓形虫。扩增片段的大小依次为：700bp、492bp、221bp、447bp、556bp、124bp。每孔结果均与预计的目的产物长度一致。 [0055] 如图2所示，将四种人畜共患寄生虫的单一PCR和多重PCR同时进行扩增，可作为对照来检验多重PCR扩增产物是否正确，第一孔至第四孔所加样品依次为：泰勒氏焦虫、新孢子虫、伊氏锥虫、弓形虫。扩增片段的大小依次为：492bp、221bp、556bp、124bp。所有产物均符合预计目的片段大小。 [0056] 如图3所示：将两种人畜共患寄生虫的单一PCR和多重PCR同时进行扩增，可作为对照来检验多重PCR扩增产物是否正确，第一孔为微小隐孢子虫扩增序列，大小为700bp；第二孔为十二指肠贾第虫扩增序列，大小为447bp；第三孔为两种肠道寄生虫多重PCR扩增序列。所有产物均符合预计目的片段大小。 [0057] 如图4所示：对四重PCR的退火温度进行优化。设置不同的退火温度，通过扩增条带的明暗与清晰度来选择最佳退火温度，第一孔至第六孔所设退火温度分别为：50℃、52℃、 54℃、56℃、58℃、60℃。每孔道扩增出的4条条带均符合大小，选择60℃最佳。 [0058] 如图5所示，对两重PCR的退火温度进行优化。设置不同的退火温度，通过扩增条带的明暗与清晰度来选择最佳退火温度，第一孔至第六孔所设退火温度分别为：50℃、52℃、 54℃、56℃、58℃、60℃。每个孔道扩增出的两条条带均符合大小，选择60℃最佳。 [0059] 如图6所示：对浓度为25ng/μL的6种底物DNA混合模板做10倍倍比稀释，检测多重0 ‑1 PCR反应体系的灵敏度，第一孔为25ng/μL，第二孔为2.5×10 ng/μL，第三孔为2.5×10 ng/ ‑2 ‑3 ‑4 μL，第四孔为2.5×10 ng/μL，第五孔为2.5×10 ng/μL，六孔为2.5×10 ng/μL，第七孔为 ‑5 ‑6 ‑7 2.5×10 ng/μL，第八孔为2.5×10 ng/μL，第九孔2.5×10 ng/μL。1～7孔道扩增出的4条核酸片段的大小均正确。 [0060] 如图7所示，挑选浓度为2.5×10‑5ng/μL的四种血液寄生虫混合DNA，分别设置不同的循环数，挑选合适的扩增循环数，第一孔为20个循环，第二孔为25个循环，第三孔为30个循环，第四孔为35个循环，第五孔为40个循环。经序列对比，4～5孔道扩增出的片段符合预计大小，选择35个循环数最佳。 [0061] 如图8所示：挑选浓度为2.5×10‑5ng/μL的2种肠道寄生虫混合DNA，分别设置不同的循环数，挑选合适的扩增循环数，第一孔为20个循环，第二孔为25个循环，第三孔为30个循环，第四孔为35个循环，第五孔为40个循环。经序列对比，4～5孔道扩增出的条带大小均正确，选择35个循环数最佳。 [0062] 如图9‑11所示：使用上面建立的多重PCR体系对临床上68份血液样品进行扩增，全部检测结果如表1所示； [0063]名称弓形虫泰勒氏焦虫伊氏锥虫新孢子虫阳性检出量(份) 0 0 0 0 阳性检出率(％) 0 0 0 0 [0064] 表1 68份血液样品检测结果 [0065] 如图12‑14所示：使用上面建立的多重PCR体系对临床上40份粪便样品进行扩增，全部检测结果如表2所示； [0066]名称十二指肠贾第虫微小隐孢子虫阳性检出量(份) 0 0 阳性检出率(％) 0 0 [0067] 表2 40份粪便样品检测结果 [0068] 灵敏度测试； [0069] 将浓度为25ng/μL的人畜共患寄生虫DNA混合后，10倍倍比稀释成9个浓度梯度，分1 0 ‑1 ‑2 ‑3 别为：2.5×10 ng/μL、2.5×10ng/μL、2.5×10 ng/μL、2.5×10 ng/μL、2.5×10 ng/μL、 ‑4 ‑5 ‑6 ‑7 2.5×10 ng/μL、2.5×10 ng/μL、2.5×10 ng/μL、2.5×10 ng/μL，进行多重PCR。反应体系为：混合底物1μL，上下游引物各0.5μL，2×HiFi Amplification Mix 10μL，ddH2O补足20μ L。94℃预变性2min，98℃变性10s，60℃退火30s，68℃延伸15s，重复35个循环。琼脂糖凝胶电泳观察，以不出现明显条带的前一个浓度为最低检测浓度。 [0070] 循环数的优化； [0071] 分别设计循环数为20、25、30、35、40个循环，2.5×10‑5ng/μL DNA混合物1μL，上下游引物各0.5μL，2×HiFi Amplification Mix 10μL，ddH2O加至20μL。94℃预变性2min，98 ℃变性10s，60℃退火30s，68℃延伸15s。琼脂糖凝胶电泳观察，以出现明显条带的那一个循环数为最佳循环数。 [0072] 琼脂糖凝胶电泳检测； [0073] 琼脂糖凝胶电泳：本实验用2％的琼脂糖凝胶，120V电压下电泳35min，EB溴乙锭染色紫外仪下观察。配胶体系如下： [0074] 小胶：0.4g琼脂粉、20ml TAE、2μL EB，微波炉加热2～3min直至溶液透明清亮，倒入容器，插入梳子。 [0075] 中胶：0.8g琼脂粉、40ml TAE、4μL EB，微波炉加热2～3min直至溶液透明清亮，倒入容器，插入梳子。 [0076] 大胶：1.6g琼脂粉、80ml TAE、8μL EB，微波炉加热3～4min直至溶液透明清亮，倒入容器，插入梳子。 [0077] 综上所述，该人畜共患寄生虫多重PCR检测方法，可同时对多种寄生虫进行检测，既高效又便捷，不仅节约时间，还节省试剂，具有很大的临床意义；且具有较高的实用性且方便快捷，使临床上检测人畜共患寄生虫疾病所用时间大幅缩减，检测效率得到有效保障，为检测山羊易患的人畜共患寄生虫疾病提供技术支撑。 [0078] 以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。