[0001] 本发明涉及一种PCR检测实验猫体内寄生虫的引物，尤其是一种用于多重PCR检测实验猫体内寄生虫的引物。

[0002] 由于猫的反射机能与人相似，其循环系统、神经系统和肌肉等实验效果更接近于人，且比小鼠和大鼠便于观察和解剖等实验处理，故猫作为实验动物已广泛用于神经学、生理学和毒物学等医药方面的研究。然而，猫体内携带有多种寄生虫，若体内寄生虫超标，则直接影响实验结果的准确性，导致重现性差，故猫体内寄生虫控制是实验动物质量控制的一个重要方面。现有的寄生虫检测一般采用镜检法、ELISA法等，存在着检测灵敏度低，特异性及时效性差等缺点。

[0003] 多重PCR(multiplex PCR)又称多重引物PCR，是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，具有高效性、系统性及经济简便性。但是，如果引物设计不合理，则一个物种的引物可能会对另一个物种的扩增造成干扰，往往会出现二聚体或出现非特异性扩增现象。因此，迄今为止并没有基于多重PCR检测实验猫体内寄生虫的相关报道。

[0004] 本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种用于多重PCR检测实验猫体内寄生虫的引物。

[0005] 本发明的技术解决方案是：一种用于多重PCR检测实验猫体内寄生虫的引物，由1~5号引物对构成，所述1 5号引物对上游引物F1 F5及下游引物R1 R5的DNA序列分别如下：
~ ~ ~
1号 F1：5'‑ agcaacaggggtctatgaaagg‑ 3'；
R1：5'‑ acatcctgaggcgaaccaaaa ‑3'；
2号F2：5'‑ ggttgcatcaagggagacga ‑3'；
R2：5'‑ gactccatctttcccgcaca ‑3'；
3号F3：5'‑ tcgtttggagttggctaaacct ‑3'；
R3：5'‑ gggtgtcccaacgtactcaa ‑3'；
4号F4：5'‑ gtttaggggctggtgttggt ‑3'； R4：5'‑ accctgctacccaaacacac‑3'；
5号F5：5'‑ tcctcacaggcaagaacgtc ‑3'； R5：5'‑ gcttctcctcgttgaaccca ‑3'。

[0006] 本发明以蛔虫ITS1基因、钩虫CO1基因、弓形虫B1基因、绦虫cox1基因及鞭虫GDH基因为鉴定标记物，只需一次扩增即可同时检测实验猫体内携带的蛔虫、钩虫、弓形虫、绦虫及鞭虫等常见寄生虫，具有快速、简便、准确、特异性好及灵敏度高等优点，有助于筛选符合标准的实验猫个体用于生产及使用，加速猫的实验动物化进程。

[0007] 本发明的一种用于多重PCR检测实验猫体内寄生虫的引物由1 5号引物对~构成，所述1 5号引物对上游引物F1 F5及下游引物R1 R5的DNA序列分别如下：
~ ~ ~
1号 F1：5'‑ agcaacaggggtctatgaaagg‑ 3'；
R1：5'‑ acatcctgaggcgaaccaaaa ‑3'；
2号F2：5'‑ ggttgcatcaagggagacga ‑3'；
R2：5'‑ gactccatctttcccgcaca ‑3'；
3号F3：5'‑ tcgtttggagttggctaaacct ‑3'；
R3：5'‑ gggtgtcccaacgtactcaa ‑3'；
4号F4：5'‑ gtttaggggctggtgttggt ‑3'； R4：5'‑ accctgctacccaaacacac‑3'；
5号F5：5'‑ tcctcacaggcaagaacgtc ‑3'； R5：5'‑ gcttctcctcgttgaaccca ‑3'。

[0008] 检测方法如下：a.用试剂盒提取猫的组织、血液或粪便等样本的DNA；
b. 以所得到的猫DNA为模板，以1 5号引物对进行多重PCR反应；
~
多重PCR反应条件为：94℃预变性5min；然后94℃变性30s，56℃退火30s，70℃延伸
30s，35个循环；再72℃延伸8min。

[0009] 多重PCR反应体系为：50μL反应体系，10×PCR反应缓冲液5μL，MgCl（2 25mM）6μL、每种浓度为2.5mM的dNTP5μL，TaqDNA聚合酶（5U/μL）1μL，每种浓度为10μM的上游引物组合1μL，每种浓度为10μM的下游引物组合1μL，模板DNA 2μL，加ddH2O至50μL。

[0010] c. 用琼脂糖凝胶电泳检验PCR产物，根据扩增片段长度判断寄生虫种类：扩增片段长度107bp为蛔虫ITS1基因；扩增片段长度183bp为弓形虫 B1 基因；扩增片段长度303bp为钩虫CO1基因；扩增片段长度502bp为绦虫COX1基因；扩增片段长度258bp为鞭虫GDH基因。

[0011] 本发明分别取蛔虫、钩虫、弓形虫、绦虫及鞭虫的DNA为阳性对照，并分别以对应的1 5号引物对寄生虫DNA进行单重PCR反应，其中1号引物对为蛔虫ITS1基因引物，2号引物对~
为弓形虫 B1 基因引物，3号引物对为钩虫CO1基因引物，4号引物对为绦虫COX1基因引物，5号引物对为鞭虫GDH基因引物，最后进行琼脂糖凝胶电泳。电泳结果表明：5种单重PCR反应产物的扩增片段长度与多重PCR反应产物一致，均为对应基因的目标片段，说明本发明用于多重PCR检测实验猫体内寄生虫的引物设计合理，具有较好的特异性及灵敏度。