一种寄生蜂OBPs重组蛋白及其可溶性表达的方法

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一种寄生蜂OBPs重组蛋白及其可溶性表达的方法
申请号	CN202310606368.1	申请日	2023-05-26	公开(公告)号	CN116640202A	公开(公告)日	2023-08-25
申请人	江苏科技大学;			发明人	王俊; 李易江成; 陈洪超; 谷凤明; 宋文淼; 盛晟; 吴福安;
摘要	本发明公开了一种寄生蜂OBPs重组蛋白及其可溶性表达的方法，属于基因工程领域。为解决在原核表达系统中寄生蜂OBPs重组蛋白极易产生包涵体蛋白等问题，通过构建冷休克pCold‑TF表达载体，使用亲和层析分离纯化OBPs重组蛋白，经凝血酶消化标签后，硫酸铵沉淀获得可溶性高表达的寄生蜂OBPs重组蛋白。本发明有效避免了OBPs重组蛋白的包涵体表达，省去了通过蛋白质变性纯化分离包涵体OBPs蛋白，再通过蛋白质复性重折叠的过程。本发明可制备大量可溶性表达的寄生蜂OBPs重组蛋白，为体外OBPs蛋白的功能研究提供了可靠的蛋白样品。
权利要求	1.一种寄生蜂OBPs重组蛋白，其特征在于，所述寄生蜂OBPs重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。 2.根据权利要求1所述的一种寄生蜂OBPs重组蛋白，其特征在于，编码寄生蜂OBPs重组蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。 3.一种重组载体，其特征在于，含有编码权利要求1所述寄生蜂OBPs重组蛋白的核苷酸序列的质粒。 4.根据权利要求1所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒的构建选用的引物序列分别如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示。 5.一种重组菌株，其特征在于，表达权利要求3所述的重组质粒。 6.基于权利要求1所述的寄生蜂OBPs重组蛋白的可溶性表达的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，桑蟥聚瘤姬蜂OBPs重组质粒的构建利用pCold TF冷休克表达载体，通过同源重组技术，将目标OBPs序列重组到载体上，冷休克载体融合了Trigger Factor（TF）因子，可有效引导OBPs蛋白折叠，大大增加OBPs重组蛋白的可溶性表达，减少包涵体蛋白的形成；步骤2，桑蟥聚瘤姬蜂OBPs重组蛋白的表达将重组的pCold TF‑IkuwOBPs表达载体转入Trans B感受态细胞中，经培养，加入诱导剂异丙基硫代半乳糖苷（IPTG），表达桑蟥聚瘤姬蜂OBPs重组蛋白，Trans B感受态细胞中包含硫氧还原酶（trx B）和谷胱甘肽还原酶（gor），可以促进OBP重组蛋白二硫键的形成以及正确折叠；步骤3，桑蟥聚瘤姬蜂OBPs重组蛋白的验证通过离心收集菌体，弃上清后使用PBS缓冲液清洗和重悬菌体，利用超声破碎仪释放菌体内表达的OBPs重组蛋白，离心分别收集上清和沉淀，利用SDS‑PAGE检测OBPs重组蛋白的表达情况；步骤4，桑蟥聚瘤姬蜂OBPs重组蛋白的纯化使用亲和层析技术，将含有OBPs重组蛋白的上清液利用镍柱纯化，使用不同浓度的咪唑洗脱液洗脱，获得分离纯化后的OBPs重组蛋白；步骤5，桑蟥聚瘤姬蜂OBPs重组蛋白的标签去除利用凝血酶进行消化，切割OBPs重组蛋白N末端的TF因子以及His标签，随后，利用硫酸铵沉淀不含标签的OBPs重组蛋白，离心弃上清后，加入50 mM Tris‑HCl（pH 7.4）复溶，获得可溶的桑蟥聚瘤姬蜂OBPs重组蛋白。 7.根据权利要求6所述的的寄生蜂OBPs重组蛋白的可溶性表达的方法，其特征在于，步骤2中的培养条件为在37℃，220 rpm，在菌液培养至OD600 = 0.6 ~ 0.8时，加入终浓度为 0.5 mM的诱导剂，低温15℃、180 rpm培养24 h。 8.根据权利要求6所述的的寄生蜂OBPs重组蛋白的可溶性表达的方法，其特征在于，步骤4中利用镍柱纯化的流速为0.03 mL/s，使用咪唑洗脱液的流速0.06 mL/s。 9.根据权利要求6所述的的寄生蜂OBPs重组蛋白的可溶性表达的方法，其特征在于，步骤4中使用咪唑洗脱依次选用的浓度为20、50、100、200、300和500 mM。 10.根据权利要求6所述的的寄生蜂OBPs重组蛋白的可溶性表达的方法，其特征在于，步骤5中所用的硫酸铵的终浓度为60%，硫酸铵沉淀的反应体系为4℃、150 rpm反应2 h；离心机4℃、8000 rpm离心15 min，弃上清，加入等体积的50 mM Tris‑HCl复溶。
说明书全文	一种寄生蜂OBPs重组蛋白及其可溶性表达的方法技术领域 [0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种寄生蜂OBPs重组蛋白及其可溶性表达的方法。背景技术 [0002] 气味结合蛋白（odorant‑binding proteins，OBPs）是一类小分子酸性蛋白，广泛存在于昆虫的触角淋巴液中，其在昆虫嗅觉系统中起着关键的识别、结合气味分子的作用，从而调控昆虫的取食、交配、产卵等各种行为。OBPs作为昆虫嗅觉系统中关键结合蛋白，可与环境中疏水性的气味分子的相结合，这是昆虫专一性地识别外界气味物质的第一步生化反应。因此，开展关于昆虫OBPs功能研究是探究昆虫嗅觉系统对于气味识别分子机制以及挖掘昆虫特异性响应的靶标气味物质的关键。 [0003] 目前，主流的研究方法是采用体外原核表达系统表达OBPs重组蛋白，通过研究OBPs重组蛋白与气味配体的结合能力来筛选靶标气味物质。然而，昆虫的OBPs分子量约为13 20 kDa，具有保守的6个半胱氨酸残基，在蛋白折叠过程中形成稳定的3个二硫键，这~ 使得原核表达的OBPs极易发生包涵体表达，并且通过优化诱导体系，甚至更换表达载体与感受态细胞都无法做到大量表达可溶性的OBPs蛋白，加之使用荧光竞争结合实验来探究OBPs与气味物质的结合特性时，需要大量的OBPs重组蛋白。因此，包涵体表达的OBPs重组的纯化过程需要涉及到蛋白的变性及复性，加之荧光竞争结合实验要求OBPs重组蛋白不含有融合标签，这使得在获得高质量的可溶性OBPs重组蛋白的实验步骤复杂，制备耗时周期长，成为开展昆虫嗅觉研究的困难之处。发明内容 [0004] 本发明针对在体外表达OBPs重组蛋白的实验步骤复杂、制备耗时长、极易产生包涵体蛋白等问题，提供了一种寄生蜂OBPs重组蛋白及其可溶性表达的方法，旨在通过优化原核表达体系，高效制备高质量可溶性寄生蜂OBPs重组蛋白。 [0005] 为解决现有技术问题，本发明采取的技术方案为：一种寄生蜂OBPs重组蛋白，所述寄生蜂OBPs重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示。 [0006] 作为改进的是，编码寄生蜂OBPs重组蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。 [0007] 一种重组载体，含有编码上述寄生蜂OBPs重组蛋白的核苷酸序列的质粒。 [0008] 作为改进的是，所述重组质粒的构建选用的引物序列分别如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示。 [0009] 一种重组菌株，表达上述的重组质粒。 [0010] 上述的寄生蜂OBPs重组蛋白的可溶性表达的方法，包括以下步骤：步骤1，桑蟥聚瘤姬蜂OBPs重组质粒的构建利用pCold TF冷休克表达载体，通过同源重组技术，将目标OBPs序列重组到载体上，冷休克载体融合了Trigger Factor（TF）因子，可有效引导OBPs蛋白折叠，大大增加OBPs重组蛋白的可溶性表达，减少包涵体蛋白的形成；步骤2，桑蟥聚瘤姬蜂OBPs重组蛋白的表达将重组的pCold TF‑IkuwOBPs表达载体转入Trans B感受态细胞中，经培养，加入诱导剂异丙基硫代半乳糖苷（IPTG），表达桑蟥聚瘤姬蜂OBPs重组蛋白，Trans B感受态细胞中包含硫氧还原酶（trx B）和谷胱甘肽还原酶（gor），可以促进OBP重组蛋白二硫键的形成以及正确折叠；步骤3，桑蟥聚瘤姬蜂OBPs重组蛋白的验证通过离心收集菌体，弃上清后使用PBS缓冲液清洗和重悬菌体，利用超声破碎仪释放菌体内表达的OBPs重组蛋白，离心分别收集上清和沉淀，利用SDS‑PAGE检测OBPs重组蛋白的表达情况；步骤4，桑蟥聚瘤姬蜂OBPs重组蛋白的纯化使用亲和层析技术，将含有OBPs重组蛋白的上清液利用镍柱纯化，使用不同浓度的咪唑洗脱液洗脱，获得分离纯化后的OBPs重组蛋白；步骤5，桑蟥聚瘤姬蜂OBPs重组蛋白的标签去除利用凝血酶进行消化，切割OBPs重组蛋白N末端的TF因子以及His标签，随后，利用硫酸铵沉淀不含标签的OBPs重组蛋白，离心弃上清后，加入50 mM Tris‑HCl复溶，获得可溶的桑蟥聚瘤姬蜂OBPs重组蛋白。 [0011] 作为改进的是，步骤2中的培养条件为在37℃，220 rpm，在菌液培养至OD600 = 0.6 0.8时，加入终浓度为0.5 mM的诱导剂，低温15℃、180 rpm培养24 h。 ~ [0012] 作为改进的是，步骤4中利用镍柱纯化的流速为0.03 mL/s，使用咪唑洗脱的流速0.06 mL/s。 [0013] 作为改进的是，步骤4中使用咪唑洗脱依次选用的浓度为20、50、100、200、300和500 mM。 [0014] 作为改进的是，步骤4中使用咪唑洗脱依次选用的浓度为20、50、100、200、300和500 mM。 [0015] 作为改进的是，步骤5中所用的硫酸铵的终浓度为60%，硫酸铵沉淀的反应体系为4℃、150 rpm反应2 h；离心机4℃、8000 rpm离心15 min，弃上清，加入等体积的50 mM Tris‑HCl（pH 7.4）复溶。有益效果 [0016] 本发明详细完整的阐述了一种寄生蜂OBPs重组蛋白及其可溶性表达的制备方法，通过使用冷休克载体pCold‑TF构建重组表达质粒，经诱导可获得大量可溶性表达的OBPs重组蛋白，并且通过凝血酶消化和硫酸铵沉淀分离获得不含TF因子和His标签的特异OBPs重组蛋白。本发明为开展寄生蜂体外OBPs蛋白的结合特性、蛋白晶体结构及结构生物学特性等研究提供了高质量的OBPs重组蛋白制备方法，也为利用寄生蜂OBPs蛋白筛选响应活体行为选择的靶标气味物质并应用于害虫治理中提供了重要基础。附图说明 [0017] 图1为pET‑28a/IkuwOBP2、pET‑32a/IkuwOBP2和pCold‑TF/IkuwOBP2可溶性表达检测，其中，Marker：180 kDa预染蛋白Marker，CK：未加诱导剂的细胞粗提液；上清：添加诱导剂破碎细胞离心后的上清液，沉淀：添加诱导剂破碎细胞离心后的沉淀物质，箭头所指分别为pET‑28a/IkuwOBP2、pET‑32a/IkuwOBP2和pCold‑TF/IkuwOBP2重组蛋白表达情况；图2为pCold‑TF/IkuwOBP2重组蛋白的纯化，Marker：180 kDa预染蛋白Marker，CK：未加诱导剂的细胞粗提液；诱导：添加诱导剂破碎细胞离心后的上清液。过柱残余液体：上清液流经镍柱后的残余液。20、50、100、200、300和500 mM：分别表示含有20、50、100、200、 300和500 mM咪唑浓度的洗脱液洗脱后的蛋白溶液，箭头所指为已纯化分离的pCold‑TF/IkuwOBP2重组蛋白；图3为pCold‑TF/IkuwOBP2重组蛋白的标签消化，其中，Marker：180 kDa预染蛋白Marker；诱导：添加诱导剂破碎细胞离心后的上清液；纯化：经镍柱纯化分离后的蛋白溶液。消化：经凝血酶消化后的蛋白溶液，箭头所指为与TF+His tag分离的IkuwOBP2重组蛋白。 [0018] 图4为硫酸铵沉淀法分离IkuwOBP2重组蛋白，其中，Marker：180 kDa预染蛋白Marker。20、30、40、50、60%：分别表示使用20、30、40、50、60%终浓度的饱和硫酸铵溶液沉淀IkuwOBP2重组蛋白，箭头所指为成功获得可溶性表达的IkuwOBP2重组蛋白。实施方式 [0019] 下面的实施例可使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。 [0020] 需要交代的是，本发明中所用的试剂及生物材料均为常规市售产品。 [0021] 实施例1：桑蟥聚瘤姬蜂IkuwOBP2质粒的构建桑蟥聚瘤姬蜂是桑树害虫桑蟥、桑螟的优势寄生天敌，具有开发成为生防产品的巨大潜力。在桑蟥聚瘤姬蜂IkuwOBP2的完整开放阅读框（ORF）序列的基础上，去除N末端的 22个氨基酸的信号肽序列，从而形成成熟IkuwOBP2的序列。编码成熟IkuwOBP2的核苷酸序列（5’‑3’）如下： GACACTGCCTTGAAATCCAAGAGAATGACCGTCCCACAACTAAGAAATGCTTTGAAGGGAATGGCCAAGACTTGCCTCTCGAAAACTGGTGTCGATCCAGGAATCGCGGCCGCTACCAGAAAAGGTGAATTTCCACCTGACCCAAAGTTGCAGTGCTATTTCTTGTGTGTGTTCGGACAAATGAAAATCCTCAAAGAAGGCAAATTAAGTCTCGATTCGATAAACAAGCAAATCGATGCTGTGATGGTGACAGATGTGATAGCGAGAGCAAAAGAAGTCTCGGCTGGATGCTACGATTCAGCGGATAGCACCGAATTTTGCGAACACAGTTGGCAGTTCATAAAATGTTTCTTCGAAACGGACCAGTCGATATACTTCTTCCCGTGA（SEQ ID NO:1）。 [0022] 编码成熟IkuwOBP2的氨基酸序列（5’‑3’）如下：DTALKSKRMTVPQLRNALKGMAKTCLSKTGVDPGIAAATRKGEFPPDPKLQCYFLCVFGQMKILKEGKLSLDSINKQIDAVMVTDVIARAKEVSAGCYDSADSTEFCEHSWQFIKCFFETDQSIYFFP（SEQ ID NO:2）。 [0023] 分别选择pET‑28a、pET‑32a和pCold‑TF表达载体，设计带有BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位点的特异性引物，采用的引物对为：IkuwOBP2_28a_F:cagcaaatgggtcgcggatccGACACTGCCTTGAAATCCAAGAG（SEQ ID NO:3）； IkuwOBP2_28a_R:ctcgagtgcggccgcaagcttTCACGGGAAGAAGTATATCGACTG（SEQ ID NO:4）； IkuwOBP2_32a_F:gccatggctgatatcggatccGACACTGCCTTGAAATCCAAGAG（SEQ ID NO:5）； IkuwOBP2_32a_R:ctcgagtgcggccgcaagcttTCACGGGAAGAAGTATATCGACTG（SEQ ID NO:6）； IkuwOBP2_TF_F:ctcggtaccctcgagggatccGACACTGCCTTGAAATCCAAGAG（SEQ ID NO: 7）； IkuwOBP2_TF_R:agactgcaggtcgacaagcttTCACGGGAAGAAGTATATCGACTG（SEQ ID NO:8）。 [0024] 使用桑蟥聚瘤姬蜂触角cDNA作为模板，利用高保真PCR聚合酶扩增并纯化获得目的片段；使用限制性核酸内切酶BamH Ⅰ和Hind Ⅲ分别线性化pET‑28a、pET‑32a和pCold‑TF表达载体；使用重组酶将目的片段连接至相应表达载体上，转化入DH5α感受态细胞中，挑取单菌落进行菌液PCR及测序验证，成功构建获得pET‑28a/IkuwOBP2、pET‑32a/IkuwOBP2和pCold‑TF/IkuwOBP2重组质粒。 [0025] 实施例2：桑蟥聚瘤姬蜂IkuwOBP2蛋白的诱导表达将实施例1中分别构建好的pET‑28a/IkuwOBP2、pET‑32a/IkuwOBP2和pCold‑TF/IkuwOBP2质粒转入Trans B感受态细胞中，挑取pET‑28a/IkuwOBP2单菌落于10 mL含有终浓度为30 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中；分别挑取pET‑32a/IkuwOBP2和pCold‑TF/IkuwOBP2单菌落于5 mL含有终浓度为100 μg/mL氨苄抗生素的LB液体培养基中。 [0026] 37℃、220 rpm培养至OD600值为0.6时，加入终浓度为0.5 mM的IPTG，pET‑28a/IkuwOBP2和pET‑32a/IkuwOBP2于28℃、180 rpm诱导培养12 h；pCold‑TF/IkuwOBP2于15℃、180 rpm诱导培养24 h。 [0027] 实施例3：桑蟥聚瘤姬蜂IkuwOBP2蛋白的表达验证分别取实施例2中分别诱导表达完成的1 mL菌液在8000 rpm、4℃条件下离心收集菌体。加入500 μL PBS缓冲液重悬菌体，使用超声破碎仪在冰上超声裂解（250 W、5 s工作、 5 s停息、20次）。破碎完成的粗提液离心（8000 rpm、4℃、2 min）后吸取40 μL上清液。弃上清后，在沉淀中加入40 μL PBS缓冲液吹打混匀。在所有40 μL样品中加入10 μL 5 × loading buffer，吹打混匀后于PCR仪上98℃反应10 min。 [0028] 反应完成后利用12.5%的SDS‑PAGE检测蛋白表达情况。如图1所示，pET‑28a/IkuwOBP2与pET‑32a/IkuwOBP2均以包涵体的形式在沉淀中表达；pCold‑TF/IkuwOBP2则成功以可溶性的形式在上清中高度表达。 [0029] 实施例4：桑蟥聚瘤姬蜂IkuwOBP2蛋白的纯化TM 使用HisTrap FF crude以及恒流泵进行蛋白纯化。吸取上清表达的pCold‑TF/IkuwOBP2重组蛋白，以流速0.03 mL/s过柱；分别使用含有20、50、100、200、300和500 mM咪唑浓度的洗脱液洗脱OBPs重组蛋白，流速为0.06 mL/s。利用12.5%的SDS‑PAGE检测蛋白纯化情况。如图2所示，pCold‑TF/IkuwOBP2重组蛋白被20 mM咪唑浓度洗脱液分离，获得不含杂蛋白的pCold‑TF/IkuwOBP2重组蛋白。 [0030] 实施例5：桑蟥聚瘤姬蜂OBPs重组蛋白的标签消化将纯化后的OBPs蛋白溶液透析至凝血酶反应体系（20 mM Tris‑HCl、150 mM NaCl、pH 8.0），按每100 μg蛋白加0.5 U凝血酶，于37℃酶切反应6 h。如图3所示，利用 12.5%的SDS‑PAGE检测凝血酶消化结果，可见IkuwOBP2与TF+His tag分离，酶切效率良好。 [0031] 实施例6：桑蟥聚瘤姬蜂OBPs重组蛋白与标签的分离将凝血酶消化反应后的蛋白溶液分装为5管，分别加入饱和硫酸铵溶液至终浓度为20、30、40、50、60%，置于摇床中4℃、150 rpm反应2 h使OBPs蛋白沉淀。使用离心机4℃、 8000 rpm离心15 min，弃上清，加入等体积的50 mM Tris‑HCl（pH 7.4）复溶。利用12.5%的SDS‑PAGE检测硫酸铵沉淀分离情况，如图4所示，IkuwOBP2重组蛋白于60%的饱和硫酸铵溶液沉淀分离，最终获得可溶性表达的IkuwOBP2重组蛋白。