重组檞寄生凝集素(rML)

本发明涉及编码成熟后表现檞寄生凝集素二聚体生物活性的前 蛋白原的核酸分子，含有上述核酸分子的载体，由上述载体转化的 宿主和由上述核酸分子编码的多肽和/或多肽二聚体。本发明中所 述的多肽和/或多肽二聚体具有广泛的医疗应用价值。因此，本发 明进一步涉及含有本发明中的多肽和/或多肽二聚体的药物组合物 和免疫毒素，以及含有本发明的核酸分子、本发明的多肽和/或多 肽二聚体和/或可特异性地与本发明的核酸分子杂交的引物的诊断 组合物。最后，本发明还涉及含有本发明的多肽和/或多肽二聚体 的植物保护剂。

几个世纪以来，檞寄生提取物一直用于医疗方面。自本世纪初 以来，用檞寄生制品来治疗癌症已获得不同程度的成功[Bocci 1993；Gabius等1993；Gabius&Gabius 1994；Ganguly&Das 1994]。Hajto等人[1989，1990]表明所谓的檞寄生凝集素 (Viscumins，VAA，欧寄生凝集素)特异性地介导了治疗效果。 除了细胞毒效应外，如今本领域正在讨论其(非特异性的)免疫刺 激作用，其积极效果用于肿瘤患者辅助性治疗和调养。上述患者生 活质量的提高很可能是内源性内啡肽分泌所引起的[Heiny和 Beuth 1994]。大量的体外[Hajto等1990；Mannel等1991；Beuth 等1993]和体内[Hajto，1986；Hajto等1989；Beuth等1991；Beuth 等1992]研究以及临床研究[Beuth等1992]报道了炎症细胞因子 (TNF-α，IL-1，IL-6)释放的增加以及免疫系统中细 胞组分(TH细胞，NK细胞)的活化。

现在，认为檞寄生提取液的基本活性成份是一种分子量为 60KDa可用生化方法从檞寄生提取液中分离得到的檞寄生凝集素 蛋白[Franz等1977；Gabius等1992]。檞寄生凝集素蛋白含两个 由二硫键共价联接的亚基，其A链可导致酶解核糖体失活[Endo等 1988]，B链负责糖基的结合。现在认为，其生物活性主要是B链 的凝集素活性[Hajto等1990]。

然而，对檞寄生凝集素(ML)结构与功能之间的关系了解得 还不清楚。两条单链及各自不同的生化和酶学活性对所观察到的作 用模式和/或医疗效果的贡献至今仍不清楚。由于制品中污染有其 它的檞寄生植物组分，给结构和功能间的关系分析造成了困难 [Stein&Berg 1994]。有争论说提取制品的活性可能依赖于制品中 的不同组分，而这些组分又可能因宿主树种类(比如说，苹果树， 松树，杨树)的不同而不同[Hulsen等1986]。据说，粘毒素 [Garcia-Olmedo等1983；Mendez等1990]和其它的檞寄生凝集 素(如檞寄生凝集素2(ML-2)和檞寄生凝集素3(ML-3))， 都具有相似的作用[Eifler等1994]。既使用生化方法(亲和层析) 高度纯化的檞寄生凝集素制品也是非均一物质(图8)。这种非均 一性与不同链的可生化估价的活性、与在体内或体外激发的疗效， 以及蛋白质结构等方面都有关联。对ML的A链和B链的糖基化 作用的结构变异性以及序列上的变异性都有讨论。Gabius等人 [1992]和Dietrich等人[1992]显示了ML-1的A1链和A2链的序 列变异性。

为对檞寄生凝集素的疗效作更细致的分析，最好能得到结构单 一的纯的物质，而且对科学家而言，能得到大量纯的檞寄生凝集素 或其组份是非常重要的，这样可以大批量地将其用作药物组合物中 的有效组份。但本领域中的现有技术还不足以实现这些目的。依本 领域中的现有技术，从植物材料中分离组分，只能得到非均一的混 合物。因为存在翻译后加工过程，ML-1转变为相应异构体ML -2和ML-3，从而导致了制品的非均一化，因此，檞寄生凝集 素制品因发酵时间和分离方法的不同而含有不同含量的ML-1、 ML-2和ML-3[Jggy等1995]。任一种上述的异构体都具有 很大的微观不均一性，图8中显示了通过等电聚焦法得到的ML- 1的微观不均一性。

本发明要解决的问题是，提供在数量上允许大规模应用的纯檞 寄生凝集素。此问题可由权利要求书中所述的特定实施方案来解 决。

本发明涉及如下的核酸分子，其(a)编码成熟后具檞寄生凝 集素二聚体生物功能的前蛋白原，并具有图4C所示的核苷酸序 列；(b)编码如(a)所述的前蛋白原的片段，此片段含有檞寄生 凝集素二聚体的生物活性部分；(c)由于密码子简并而与(a) 和(b)中所述核酸分子不同；或(d)在严紧条件下可与(a)、 (b)或(c)中所述核酸分子杂交并编码一种具有如(a)或(b) 中所述的生物学功能和/或活性的多肽。

因为第一次提供了檞寄生凝集素的基因序列，所以可以根据所 述序列得到重组的高度纯化的个体单链(rMLA，rMLB)，它们可在 体外重聚，从而形成在蛋白质化学、酶活性和结构上都是均一的 rML全蛋白。这种重聚合的重组蛋白既无可变异性也无微观不均 一性，在一级结构和翻译后修饰(糖基化，磷酸化)方面尤其如此。 因此特别适合以全蛋白或链片段或以次级片段的形式用于治疗。

本发明中所述的解寄生凝集素前蛋白原的“片段”可理解为作 为檞寄生凝集素二聚体生物活性组分的任意片段，不局限于天然存 在的片段。为明确起见必须指出：本领域内的技术人员显然会明 白，这种檞寄生凝集素二聚体的生物活性组分，也可以是二聚体单 链上的部分。所以，本发明也覆盖了由图4C所示序列衍生而来的 单链或其片段。

本发明中，与“檞寄生凝集素组分”相连的术语“天然的”应 理解为具如此特性的片段，或是檞寄生凝集素二聚体中的一条链， 或是上述链中的天然片段。这些片段最好是具有生物活性的。

本发明中，术语生物活性“应理解为这些片段至少具有在说明 书中所述的链或其二聚体的一种生物功能，或具有该单链或二聚体 的任何其它生物功能。另外，“生物活性”还涉及药理活性及免疫 活性，

利用重组ML蛋白还第一次允许通过实验检查ML蛋白的单 一功能域或次级功能域的作用。重组的ML蛋白和重组的亚基/部 分链是相应定义的单纯物质制剂的基础，这些制剂可用作抽提制剂 和标准抽提物的替代物。

当传统的克隆策略失败后，克隆编码檞寄生凝集素的基因，在 令人吃惊的新克隆策略基础上进行。

已知关于凝集素ML-1的一些蛋白质化学数据。除分子量和 亚基结构已知外，Dietrich等人[1992]和Gabius等人[1992][可参 照DE 4221 836]分别独立地描述了短N-端肽的氨基酸序列。由 于A和/或B链的N-端肽的氨基酸组成和相关的高度简并性，为 筛选基因组文库而从这些肽制备可检出ML基因的简并性足够低 的合成寡核苷酸是不可能的。对于在欧寄生多聚(A+)RNA基 础上建的cDNA文库也是同样的。

聚合酶链式反应允许扩增位于已知片段之间的DNA片段 [Erlich等1988]。用一个从ML的A链N端起始的“有义”寡核 苷酸和一个从ML的B链N端起始的“反义”寡核苷酸，如果ML 基因无内含子可对此区间内的基因扩增(图1a)。但实际上，对 B链N端序列的分析表明：可设计的寡核苷酸组合的简并程度太 高，这种技术不可能成功地实现。原因主要是B链N端序列对寡 核苷酸的构建来说是不利的，这就使得从已知序列的区域起始扩增 ML基因是不可行的(图1b)。

当探索用改良的PCR策略来克隆ML基因时，科学家们也试 图通过添加进一步的蛋白质数据来构建用于扩增的寡核苷酸，这些 数据主要基于檞寄生凝集素与I类和II类的核糖体失活蛋白 (RIP)的亲缘关系[Stirpe等1992]，在(a)I型核糖体失活蛋 白和蓖麻蛋白A链以及(b)相思豆毒蛋白B链的多种排列对比 的基础上，在总共八个区位上鉴定出了蓖麻蛋白保守区域。从这些 序列出发，同时考虑相关种类的密码子应用表，合成了共21个寡 核苷酸，并以不同的组合用于200多个扩增实验中。虽然，PCR 的条件，包括复性温度、Mg2+浓度及循环参数都有较大变动，但 没有一个实验获得了特异性扩增产物，

依照上述努力，无论筛选基因组文库和cDNA文库，还是运用 PCR技术都得不到特异性的ML DNA序列。

因此，在构建扩增用的寡核苷酸的过程中有过许多新的尝试， 包括考虑相思豆毒蛋白和蓖麻蛋白的进一步的结构特性，以发现新 的方法。

核糖体失活蛋白，尤指II型RIP蓖麻蛋白，与ML的酶学机 理相似[Endo等1988a+1988b]，所以不能排除它们在一级结构和三 级结构水平上也相似。从蓖麻蛋白的晶体结构出发[Katzin等 1991；Rutenber&Robertus 1991；Weston等1994]，关于蓖麻蛋 白A链的柔性研究发现位于保守区内的一个低活动度的Arg 180。 另外，做了在活性中心区可能发生的氨基酸替换的分析，考虑到与 底物相互作用，活性中心可能由于肽链“骨架”的立体构象而产生。 这些实验的结果与蓖麻蛋白A链和更多的I型核糖体失活蛋白的广 泛的序列排列对比有着密切的关系。

得出特定位置上的特定氨基酸残基的概率数据，对这些序列比 较的结果补充以结构数据。上述数据可用来预测某区域内大量的 ML蛋白理论氨基酸序列，并在这些序列基础上去构建相应的具有 惊人低的密码简并性的寡核苷酸(RMLA2)(图1C)。

尽管上述所有替代方法都已失败，结合RMLA1(由MLA链 N端氨基酸序列所衍生的简并聚核苷酸)和上述实验基础上构建的 “活性部位”寡聚核苷酸RMLA2，在限定的PCR参数下，从全 基因组ML-DNA开始可获得所需的片段。

该基因的序列信息由下述步骤补全：用得自预克隆和测定a 片段(图3)而得到的MLA的部分基因序列的特异非简并寡核苷 酸引物，从RIPI和蓖麻蛋白/相思豆毒蛋白的序列排列对比得出的 简并性寡核苷酸，经另外的PCR扩增而得到。为构建简并的B链 寡核苷酸，应用了相思豆毒蛋白B链和蓖麻蛋白B链的序列对比， 从而在B链区发现了一些高度保守区域。

为确定全蛋白5’和3’末端、  B链的部分片段和5’和3’末端的 非翻译区，从分离的檞寄生RNA通过逆转录合成了cDNA类似物， 并用RACE技术[Frohman等1988]获得了相应的基因片段。一旦 得到许多重叠基因片段(图3)可以从全基因组檞寄生DNA通过 特异的PCR来获得完整的A链和B链基因片段。在图4a和图4b 中，对存在末端修饰的rMLA和rMLB基因序列分别作了描述。 图4C显示了包含5’和3’非翻译区以及内肽和信号肽编码基因的全 ML基因序列。

在本发明中的优选实施方案中，所述片段是如图4a所示核酸 序列编码的檞寄生凝集素A链(MLA)。

在本发明的更优选实施方案的核酸分子是如图4b所示核酸序 列编码的檞寄生凝集素B链(MLB)。

本发明的更优选实施方案涉及的核酸分子是一种DNA分子。

在本发明中，“DNA分子”应理解为涉及基因组的DNA分 子和cDNA分子或(半)合成的DNA分子。在了解了本发明的知 识的情况下，本领域的技术人员，对制备这些不同DNA分子的方 法是非常熟悉的。

在本发明中的更优实施方案中的核酸分子是一种RNA分子。

本发明还进一步涉及本发明中所述的任一种核酸分子的反义 链的核酸分子。这样的一个反义链例如可用于转录的阻遏，从而可 用于植物中的表达和调控研究。

本发明亦涉及含有至少一种本发明的核酸分子的载体。

本发明的载体可以含有例如编码整个檞寄生凝集素前蛋白原 的本发明的单一核酸分子。假定所述载体是一表达载体，则前蛋白 原可在合适的转化宿主中被加工，并且单体可在体内或体外聚合以 产生檞寄生凝集素二聚体。在另一实施方案中，本发明的载体仅用 于本发明的核酸的增殖。

在优选实施方案中，本发明的载体既包含有一个编码檞寄生凝 集素A链或其片段的核酸分子，也包含有一个编码B链或其片段 的核酸分子。优选单体片段具有生物活性。

在另一优选的实施方案中，本发明的载体是一种表达载体。对 本领域的技术人员而言，如何为不同的宿主细胞提供合适的表达载 体是很清楚的。

根据本发明，从全基因组檞寄生DNA起始经特异性PCR产生 编码檞寄生凝集素A链的序列，并用于异源性表达。通过所用引物 寡聚核苷酸的非互补区序列引入翻译控制元件及限制性内切酶识 别序列，使得在前檞寄生凝集素原基因以基因组形式存在的情况 下，对檞寄生凝集素A链加以克隆和单独表达成为可能。

编码对应于酪氨酸1到酪氨酸17的rMLA的5’区序列 [Dietrich等1992；Gabius等1992]，通过将两个寡核苷酸杂交、 克隆，再加入一翻译起始密码，而作为一合成的基因片段而得到。 因此，该基因序列是已考虑到了大肠杆菌中高效表达基因的密码子 选择而优化的，[Gribskov等1984]。通过特异性地将酪氨酸的密 码子从TAC换为TAT，在合成rMLA基因片段3’末端和通过PCR 得到的rMLB基因片段5’端引入一个SspI的限制性酶切位点，从 而在形成载体pML14-17时可将两个rMLA基因片段融合(图 5)。编码rMLA的序列为DNA测序所证实(图4a)。为了在大 肠杆菌中表达rMLA，从载体pML14-17中分离出基因序列， 插入到表达载体pT7-7中，使之处于T7-RNA聚合酶启动子和一 个转录终止子的调控之下[Studier&Moffart，1986]。用得到的表达 载体pT7-MLA(图5)转化大肠杆菌表达菌株BL21。基因表达 的诱导结果特征性地表现为一条对应于非糖基化重组檞寄生凝集 素A的蛋白条带的出现，该蛋白相对分子量为25KDa，用一种特 异的抗MLA的抗体进行蛋白印迹分析来分析和鉴定重组表达产物 (图7)。

为了檞寄生B链的异源表达，从欧寄生全基因组DNA经特异 PCR扩增完整的、编码MLB的序列。翻译调控元件和限制性酶识 别序列是通过所用寡核苷酸引物的非互补区引入的。将生成的 0.8Kbp的PCR产物克隆到TA克隆载体pCRII后，通过插入表达 载体pT7-7而置于转录调控因子控制之下，用得到的表达载体 pT7-MLB转化表达菌株大肠杆菌BL21。

rMLB编码基因的完整性通过DNA测序来证实(图4b)。在 诱导基因表达两小时后，用一特异的抗-MLB的抗体(TB33， Tonevitsky等1995)进行蛋白质印迹来检测表达，出现了一相对 分子量为31KDa的免疫反应蛋白，它对应于非糖基化的、重组檞 寄生凝集素B链(图7b)。对大肠杆菌细胞完全裂解后的细胞级 分分析表明：合成的rMLB链分成上清液中的可溶级分以及在大肠 杆菌细胞裂解沉降物中的不溶性包涵体级分。在诱导4个小时后， 对于总的产量而言，可溶的和不可溶的级分各50％(图7b)。

本发明还进一步涉及由至少一种本发明的载体所转化的宿 主。

根据本领域内技术人员要求的目的不同，本发明中所述的宿主 可以仅用来生产任一单体或两单体的组合，优选的形式是聚合的二 聚体。本发明的宿主可以是真核的或原核的细胞、一种转基因植物 或一种转基因动物。

在优选方案中，本发明的宿主是哺乳动物细胞、植物细胞、细 菌、真菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或转基因植物。

在特别优选的实施方案中，本发明的宿主是大肠杆菌、曲霉属 细胞或灰翅夜蛾属细胞，优选草地夜蛾。

本发明还进一步涉及本发明的核酸分子或载体所编码和/或由 本发明的宿主所生产的多肽。

本发明的多肽优选具有檞寄生凝集素A链或B链的生物学活 性。然而在其它实施方案中，本发明中的多肽可以只表现部分生物 学活性或完全没有生物活性。

在本发明中，“部分生物学活性”应理解为与降低的活性和/ 或与全部的生物活性范畴内的几种活性有关。本发明的多肽可以是 表现上述活性的A或B链的片段。

关于rMLA、rMLB和rML全蛋白特性的检测

(I)相对分子量和结构

用还原条件下的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳加银或考马斯亮 蓝蛋白染色技术或蛋白质印迹分析中的免疫染色来确定相对分子 量。

令人惊讶的是发现重组的非糖基化的檞寄生凝集素A链(相 对分子量25KDa)与天然的A1型和A2型(相对分子量分别为 31KDa和29KDa)A链迥然不同。在相对分子量间的这个差异尤 其让人感到吃惊，因为在现有技术中都认为A链是非糖基化的。重 组檞寄生B链(相对分子量31KDa)比糖基化的天然B链 (36KDa)要轻得多(图7)。

因糖基化和/或基因序列变化而在SDS-凝胶电泳中以宽条带 表现得清楚的天然ML蛋白的不均一性，并没有在任何重组蛋白中 发现。

重聚的rMLA/rMLB全蛋白(rML)的相对分子量加起来是 56KDa，与之相比，天然的nML则要重一些，是65-67KDa。

(II)等电点的均一性

与高度纯化的天然檞寄生凝集素A链相比，rMLA被证明是 等电点为6.8的均一蛋白质，前者可分为四种，各自的等电点为 5.2，5.4，5.7和6.2(图8)。

与高度纯化的天然檞寄生凝集素B链相比，rMLB被证明是 等电点为5.1的均一蛋白质，前者又可分为两种，各自的等电点为 7.1和7.3(图8)。

因此，天然ML全蛋白有多种分子异构体和结合体的可能(图 8、底部)，而对重组檞寄生凝集素，在等电层析中存在唯一的迁 移率，这揭出与天然蛋白种类的微观不均一性相反，rML是均一 的。

(III)rMLA的酶学活性

在一种转录/翻译联合检测中应用免疫亲和纯化的rMLA制品 时，可以检测到rMLA(从表达产物的可溶性组分分离的)和rMLA (从不可溶的“包涵体”组份分离得到的)的抑制翻译活性。

相对于天然檞寄生凝集素A链，rMLA表现出一种不同的抑 制特性，这表现在翻译抑制的剂量依赖性和在网织细胞溶解产物中 残余的非抑制性残留翻译活性方面(见图9)。构成ML全蛋白毒 性作用基础的酶学特性，在重组的蛋白种类中显著地减少了。

(IV)rMLB的糖基结合活性

象在体外重聚合的rMLA/rMLB、rMLA/MLB和MLA/ rMLB全蛋白一样，从初级表达产物复性和重新氧化而产生的 rMLB链具有糖基结合活性，这可通过结合糖基质脱唾液酸胎球蛋 白或胎球蛋白酶联凝集素反应(ELLA)来检测。重组rMLB链 的糖基结合专一性，可由在半乳糖、β-乳糖、N-乙酰半乳糖胺 (GalNAc)和唾液酸(N-乙酰神经氨酸NANA)存在下的竞 争性结合条件下的ELLA系统来测定和定量。令人吃惊的是竞争性 结合的ELLA试验显示在nMLB和rMLB之间存在不同的糖基结 合专一性。结合的亲合力可以由系统特异性的IC50来表征，即固定 化脱唾液酸胎球蛋白-配体的蛋白被半乳糖(IC50 nMLB：4.5mM；IC50 rMLB：由于相互作用太小而无法测定)、β -乳糖(IC50 nMLB：4.9mM；IC50 rMLB：＞70mM)、N-乙酰半 乳糖胺(IC50 nMLB：20.7mM；IC50 rMLB：109mM)或固定化胎球 蛋白-配体的蛋白被唾液酸(IC50 nMLB：49.8mM；IC50 rMLB：47.1mM)半数最大置换时的浓度。

虽然被描述为半乳糖专一性凝集素的nMLB可以象预料的那 样被半乳糖或β-乳糖替换，但从大肠杆菌中重组得到的rMLB 链，对于半乳糖不表现任何可检测的相互作用，并仅对β-乳糖有 弱的相互作用。重组体rMLB对于N-乙酰半乳糖胺和唾液酸具 有明显的亲和力，相对于植物nMLB，惊人地表现为糖基结合专 一性向N-乙酰半乳糖胺/唾液酸糖基专一性凝集素的本质转变。 对于rMLB和含rMLB的全蛋白的生物活性，这将导致配基、受 体、或靶细胞的范围有可能与植物檞寄生凝集素蛋白的不同或超出 后者。

在优选的实施方案中，本发明的多肽至少具有一种化学或酶学 修饰。

这种修饰将会改变、减弱或增强多肽的生物学活性(如果存在 的话)。这样的修饰可以，举例来说，在翻译和多肽分离后，或在 本发明的多肽的化学或半合成制备过程中引入。本领域的技术人员 可利用现有的方法将修饰引入，来改变檞寄生凝集素的药理活性， 优选提高该活性。

在另外一种优选实施方案中，本发明的多肽是一种融合蛋白， 这种蛋白优选具有上述定义的生物活性。

本发明多肽的该实施方案中还优选改变檞寄生凝集素多肽对 细胞水平的靶物质的药理活性，优选提高这种活性。

本发明进一步涉及包含本发明的核酸分子编码的两个单体的 具有檞寄生凝集素生物活性的多肽二聚体。

术语“檞寄生凝集素生物活性”应理解为包含任一种来自于檞 寄生凝集素的全部生物学活性谱的生物学活性。这样的活性，举例 来说，是檞寄生凝集素的药理作用。

植物檞寄生1通过凋亡机制诱导了许多人源的或鼠源肿瘤细 胞系的细胞溶解作用[Janssen 1993]。檞寄生凝集素1或B链自己 可以诱导健康的人血供体的外周单核细胞释放细胞因子[Hajto 1990]。檞寄生凝集素1诱导癌症患者的中性粒细胞释放超氧离子 [Timoskenko 1993]。檞寄生凝集素1诱导健康人血供体的外周淋 巴细胞表达白细胞介素2受体(CD25)的A链和/或HLA DQ抗 原[Beuth，1992]。对小鼠施用檞寄生凝集素1以后，可以观测到胸 腺细胞的数量有所增加，在胸腺中细胞毒性T淋细胞(Lyt-2+) 和辅助性T细胞(L3T4+)的数量以及腹膜中的巨噬细胞，特别 是那些带有活化标记MAC-3的巨噬细胞的数目，亦有所增加 [Beuth，1994]。在试验动物的胸腺中，L3T4/Lyt 2+两种细胞间的 相互联系得到增强。在进行了檞寄生凝集素1的治疗之后，小鼠外 周血的白细胞、淋巴细胞、单核细胞，特别是在细胞表面表达白介 素2受体作为活化标志的淋巴细胞和表达活化标志MAC3的单核 细胞的密度都有所上升[Beuth，1994]。在癌症患者的血液中，檞寄 生凝集素增加了T-淋巴细胞(CD4+，CD8+)、自然杀伤细 胞和B-淋巴细胞的密度[Beuth，1992]。

并且，当服用了檞寄生凝集素1之后，可检测到乳腺癌患者血 浆中内源性阿片递质β-内啡肽的浓度增加[Heiny，1994]。可以进 一步地断定檞寄生凝集素1可提高外周自然杀伤细胞对于K-562 肿瘤细胞的细胞毒作用，同时提高外周血中巨型粒淋巴细胞 (LGL)的密度[Hajto，1989]。檞寄生凝集素1对于小鼠肉瘤细胞 的抗肿瘤迁移作用也可检测到[Beuth，1991]。

在另外一种实施方案中，本发明的多肽二聚体同天然檞寄生凝 集素二聚体具有同样范围的生物学活性。

(V)重组檞寄生凝集素的生物学活性

用在另外的体外步骤中重组合成的单链产生rML全蛋白，从 折叠好的可溶性链产生或在共折叠步骤中从变性的rMLA和 rMLB链产生。在此过程中，rMLB链优选在谷胱甘肽氧化还原系 统存在下和在蛋白质二硫键异构酶部分存在下，与一摩尔过量的 rMLA重新聚合。用N-乙酰半乳糖胺琼脂糖或乳糖基琼脂糖亲和 层析，从重聚合反应产物中分离纯化对应于异二聚体的rML全蛋 白，使之与游离的rMLA和rMLA二聚体分开。同法，制备 rMLA/rMLB(即rML)和rMLA/nMLB异二聚体全蛋白。

细胞毒活性

细胞毒活性作为重聚合的全蛋白生物活性的一个例子在人单 核白细胞系(MOLT4)中检测。观测到B链(表面结合)和A 链(核糖体酶解失活)在细胞毒反应中都起了作用。体外重聚合的 rMLA/rMLB全蛋白以及体外重聚合的rMLA/nMLB全蛋白与两 批天然nML全蛋白相比较。重组的rMLA/rMLB和rMLA/nMLB 全蛋白表现出较高的细胞毒特性，IC值为约10-30pg/ml(图 11)，这揭示了用重组链在体外重聚合的rML全蛋白具有完整的 功能和生物学活性。令人惊讶的是，分离的rMLB单独并没有细胞 毒活性，为了发挥细胞毒作用，B链必须与酶活性的A链可操作 性地相连。所以，在此之前所讨论的檞寄生凝集素B链制品的细胞 毒活性，很可能是因为还有残存的nML全蛋白。单链的重组生产 第一次使得对檞寄生凝集素(两个亚单位)的糖基结合活性和酶活 性分别进行描述和研究成为可能。

凋亡的诱导

重组的rML全蛋白的诱导凋亡的能力(作为檞寄生凝集素生 物活性的例子)用单核细胞系U937证实。用70pg/ml作用于细胞 24小时后，可以检测到rML全蛋白诱导的凋亡(图12)。檞寄生 凝集素作用于MOLT-4细胞和外周血单核细胞(PBMC)的试 验表明：在低剂量范围诱导凋亡的作用是檞寄生凝集素细胞毒活性 的基础。由于细胞因子的诱导作用发生在低细胞毒作用的浓度范围 内(图13，图14)，它与诱导凋亡活性的相关性是有说服力的， 同时，当处于大剂量范围及较长时间孵育时，凋亡作用为坏死作用 所掩盖。以重组B链作用于敏感MOLT-4细胞时，不能检测到 作为凋亡作用结果的细胞毒作用。因此，低剂量范围内的诱导凋亡 的生物学活性，只能解释为全蛋白的作用。

免疫刺激活性

作为重组的檞寄生凝集素全蛋白生物活性的例子，通过对从健 康的人血供体的单核细胞中诱导释放肿瘤坏死因子α(TNF- α)和γ-干扰素(r-IFN)，以及从人原代角质细胞和皮肤成纤 细胞的(Skin2 ZK1200)模型共培养物中诱导释放白介素1α(IL -1α)和白介素6(IL-6)的检测来测定免疫刺激作用。在 PBMC模型中，3-48ng/ml浓度的重组rML全蛋白可诱导剂量 依赖的TNF-α和IFN-γ的释放；在skin2模型中，0.25-8ng/ml 浓度的重组rML全蛋白可诱导剂量依赖的IL-1α和IL-6的 释放。

所有上面所提到的细胞因子都是人免疫系统中相关的刺激介 质，尤其在特异性细胞免疫应答的活化中起重要的作用。

虽然本领域中至今为止的描述都认为，凝集素B链的活性是 主要的免疫刺激活性[Hajto等1990]，然而，重组的rMLB链不能 单独诱导任一种以上所述的细胞因子的释放。免疫刺激活性只能由 功能性联接的rML全蛋白在低的剂量范围内获得。这一惊人的发 现表明：植物rMLB链的免疫刺激制剂中依然含有痕量的nML全 蛋白，而且被归因于rMLB链的免疫刺激作用，也必须归因于nML 的残存。曾经描述过的制备nMLB的方法至今为止不能实现全蛋 白的大量分离，但本发明第一次使檞寄生凝集素的单链重组成为现 实，从而使检测和提供均一的檞寄生凝集素B链制剂成为可能。这 也第一次使得能够对A链和B链的生物活性分别加以描述和利 用，并且第一次区分不同单链和功能性联接的全蛋白的生物活性。

(VI)重组的檞寄生凝集素B链(rMLB)的生物活性

检测细胞表面蛋白CD69的诱导表达，作为免疫活性细胞的活 化标志。在T细胞、B细胞，特别是自然杀伤细胞(NK细胞)活 化后，CD69是首先出现的细胞表面抗原之一。因为静止期的淋巴 细胞不表达细胞表面蛋白，CD69自然具有上述免疫活性细胞群活 化标志的功能。而且，已证明诱导表达的CD69表面蛋白，具有诱 导NK(自然杀伤)细胞和TcRγ/δT细胞的细胞裂解活性的传 导功能[Moretta等1991]。利用抗-CD69 mAb的流式细胞计 (FACS)来检测浓度范围为1-100ng/ml的单核细胞的活化， 检测在细胞表面是否有CD69表面抗原和CD-69阳性细胞的份 额。钟形的剂量依赖性曲线指出，rMLB链两个配基结合位点介导 细胞受体间的联接是必要的。在上述实验中，即使在rMLB的浓度 高达100ng/ml的情况下，也无法证实rMLB在PBMC模式中有细 胞毒作用。

在优选实施方案中，本发明的多肽二聚体包含至少一种经化学 或酶学修饰的本发明多肽单体，或一种本发明的融合蛋白。

既可以通过修饰来提高效力，也可以通过去除某些特性(例 如，B链的糖基结合活性或A链的糖苷酶活性)以消除可能的副 作用，从而产加可能的治疗用途。也可用具修饰特性的多肽来作为 阐明反应机制的工具。对某些特定的治疗来说，需要降低多肽的免 疫原性和抗原性，和/或优化它们的药代动力学特性，而这可能通 过特异性地替换单个氨基酸而做到。

本发明进一步涉及可特异性地结合本发明的多肽和/或多肽二 聚体的抗体或其片段或其衍生物，因而上述物质不能识别天然檞寄 生凝集素或其单链。优选本发明的抗体只结合在天然檞寄生凝集素 上因糖基化而被掩盖的抗原决定族上。抗体可以是单克隆的、多克 隆的或(半)合成的抗体。片段可以是例如，Fab’、F(ab)2或Fv 片段。抗体衍生物是本领域内从所周知的。

本发明进一步涉及制备本发明的多肽和多肽二聚体的方法，在 该方法中，在合适的条件下培养本发明的宿主，并分离获得的多肽 或多肽二聚体。

本领域的技术人员对于培养和分离宿主的合适条件是熟悉 的。举例来说，本发明的多肽和多肽二聚体，可用合适的表达体系 排到宿主之外，从而可从培养基中收集。另一方面，多肽和多肽二 聚体也可以留在细胞内，并从中分离。下面，我们将讨论本发明方 法的另一优选实施方案：

为分离rMLA，先裂解用合适的表达载体转化的大肠杆菌细 胞，细胞碎片中的可溶和不可溶级分通过离心来分开。对于细胞裂 解物的分析表明：因表达条件和表达持续时间的不同，重组的檞寄 生凝集素A链在可溶级分中累积为5-50％，在不可溶蛋白凝集 体(包涵体)中是50-95％。

可溶和不可溶蛋白的同时出现表明，若rMLA蛋白的重折叠 或复性是可行的，则至少存在两种分离rMLA的方法。凝聚成“包 涵体”的rMLA在清洗沉淀除去大肠杆菌蛋白[Babbitt等1990]之 后，在变性条件下溶解，并在90倍稀释的折叠缓冲液中(50mM Tris-HCl，2mM DTT，1mM EDTA，pH8.0)进行重折叠。

通过这种处理方法，可以得到在图9中所描述的可溶性折叠的 蛋白种类，和复性的原变性不溶的rMLA种类一样，具有全部的酶 学活性。复性的rMLA可与可溶性rMLA一样，利用特异性的抗 -MLA的抗体TA5的免疫亲和层析来分离[Tonevitsky等1995]。

rMLB以可溶形式和不可溶的“包涵体”形式存在，说明有两 种分离重组的檞寄生凝集素B的方法。

为从强还原的大肠杆菌细胞基质环境中分离可溶性的rMLB 链，应在含还原态和氧化态的谷胱甘肽的氧化还原体系存在下进行 孵育，以建立链内二硫桥，并在β-乳糖配体存在下孵育，以稳定 活性的折叠产物。从折叠反应体系中通过亲和层析在乳糖基琼脂糖 或N-乙酰半乳糖胺琼脂糖凝胶柱上一步选择性分离和/或纯化可 结合糖基的活性rMLB链。

为从大肠杆菌细胞沉淀中分离以“包涵体”形式存在于不可溶 表达产物级分中的rMLB，对全细胞裂解物进行清洗以除去大肠杆 菌蛋白[Babbitt等1990]，并在变性和还原条件下溶解。在含还原 态和氧化态谷胱甘肽的氧化还原体系和配体β-乳糖存在下稀释 来进行复性。在N-乙酰胖乳糖胺基或乳糖基琼脂糖上亲和层析， 从复性反应体系中选择性地分离纯化可结合糖基的活性rMLB 链。

本发明还进一步涉及含本发明的多肽或多肽二聚体和/或本发 明将在后面描述的免疫毒素和必要时药物可接受载体的药物组合 物。

本发明的多肽、其聚合物或修饰物，类似于已知的天然檞寄生 凝集素的药理特性，在癌症或感染的治疗中具有广泛的应用。

免疫刺激作用可用于肿瘤的治疗，通过直接和/或间接刺激机 体自身的免疫防御体系，使之更有效地抑制肿瘤生长和可能的转 移。对于感染，尤其是病毒感染，也是同样的机理。

本发明的多肽可与其它的免疫刺激剂联合使用，例如干扰素， 细胞因子或集落刺激因子，以获得协同效果，或降低组合制剂的必 需剂量以减小副作用。

通过与细胞生长抑制剂或放射性治疗结合，可减弱或去除白细 胞减少症/骨髓抑制负作用，因而可以减少因传统治疗方式带来的 免疫系统的削弱。

具糖苷酶活性的多肽的直接细胞毒作用导致肿瘤细胞凋亡，因 而也可用于治疗目的。如果本发明的多肽与合适的抗体偶联，该原 理特别可用于免疫毒素的应用上。因此，本发明进一步涉及含至少 一种本发明的多肽或多肽二聚体的免疫毒素。例如，具有活性的A 链或全蛋白，可用蛋白质化学的方法，与抗体或抗体片段偶联。本 领域的技术人员熟知这样的偶联方法，相应的偶联物在许多方面非 常有用[Vitetta，1993]。或者，可以表达相应构建的融合蛋白，使其 含有如来自抗体的抗原结合区域和除此之外的本发明多肽的细胞 毒性片段。

若肿瘤细胞同其它细胞的结合被阻止的话，也就防止了转移的 形成。本发明多肽可利用凝集素的竞争性结合防止肿瘤细胞的这种 结合。

本发明还进一步涉及与本发明的核酸分子或其互补链特异性 地杂交的引物或/和引物对。

本发明还进一步涉及诊断组合物，其至少含有：

a)本发明的核酸分子，

b)可特异地与本发明的核酸分子或其互补链杂交的引物或引 物对；和/或

c)本发明的多肽和/或本发明的多肽二聚体。

包含引物和/或引物对的本发明的诊断组合物，可用来筛选有 机体中存在的凝集素基因，以发现例如一个有可能编码药理学上有 意义的凝集素的凝集素基因。包含在本发明诊断组合物中的本发明 的核酸分子，可以通过例如蛋白质印迹或DNA印迹的方法来筛选 有机体中存在的凝集素基因。通过改变杂交条件的严紧度，可筛选 相关的凝集素基因。多肽(二聚体)可以例如用来生产抗体或抗血 清，这些抗体和抗血清可用本身已知的方法来检测多种有机体中的 特异性的(檞寄生)凝集素。

最后，本发明涉及含有本发明多肽和/或本发明多肽二聚体的 植物保护剂。本发明的多肽、及其聚合体和修饰体，可用作与讨论 到的植物檞寄生凝集素功能相关的植物保护剂。讨论檞寄生凝集素 的抗病毒防护功能是因为它的毒性特性是防止植物被吃掉的防护 措施，还因为它对膜的通透性和组成起作用的特性。

图示

图1初级扩增寡核苷酸的构建

图2初级欧寄生ML扩增产物

图3得到ML基因的克隆策略

图4rMLA和rMLB以及全ML基因序列在表达载体中的插 入序列

图5rMLA表达载体的构建图示

图6rMLB表达载体的构建图示

图7rMLA、rMLB的表达及免疫检测

图8与天然ML比较rMLA和rMLB的IEF聚焦层析

图9rMLA(RIP)的酶学活性

图10rMLB的糖基结合特性

图11rML对MOLT4的细胞毒作用

图12rML对凋亡的诱导

图13在PBMC模型中，重组檞寄生凝集素的免疫刺激作用

图14在skin2模型中，重组檞寄生凝集素的免疫刺激作用

图15在PBMC中细胞表面标志CD69的诱导。

下列实施例用于说明本发明： 实施例1

初级扩增寡核苷酸的构建

檞寄生凝集素(ML)属于核糖体失活蛋白家族[Stirpe等 1992]，该家族在多类植物中广泛存在。根据亚基的活性，ML划 归核糖体失活蛋白中的第II类[Endo等，1988a]。

然而，显而易见的筛选欧寄生cDNA文库和基因组文库的方 法，完全不适合发现ML的基因序列。尽管用了多种DNA探针， 在由欧寄生poly A+RNA而来的基因文库中，没有筛选鉴定出一个 特异的ML克隆。在假定ML基因序列中不含内含子的基础上，采 用了一种PCR策略。由于rMLA和rMLB的N端氨基酸序列都已 知道[Dietrich等1992，Gabius等1992]，用已知肽链衍生出简并 的扩增寡核苷酸，并用于扩增MLA的编码区似乎是可行的(图 1a)。尽管从MLA链的N端可衍生出低简并性的有用寡核苷酸 (RMLA1图1b)，但从MLB链的N端却不能构建一个相应的 有效的特异寡核苷酸(RMLB1、RMLB2、RMLB3，图1b)。

因此，只好采用另一种策略，通过包含相关蛋白数据，有可能 从未知的ML序列区衍生出扩增寡核苷酸。对I型和II型核糖体失 活蛋白的序列分析表明，在某些保守区中有高度的序列一致性。图 1c解释了对于蓖麻蛋白的活性中心，I型和II型的RIP有高度的 亲缘性。有人讨论到序列基元MISEAARF中的E177和R180在酶 学机制中起作用[Kim 1992；Lord等1994]。结论是至少这两个残基 应出现在ML序列中。对个别残基存在的进一步阐述使得成功构建 了扩增寡核苷酸RMLA2，对具有低密码子简并性的残基给予了特 别注意。此寡核苷酸的序列如图1c所示。 实施例2

ML基因特异性DNA片段的制备

根据Baur等人的方法[1993]，从新鲜的欧寄生叶子中分离高 分子量的基因组DNA(宿主树是威尔逊杨)。对于PCR制备ML 基因特异性DNA片段，在每个扩增反应中用了100ng的基因组 DNA。扩增反应的总体积为50μl，含PCR缓冲液(10mM Tris-HCl，1.5mM MgCl2，50mM KCl，0.25mM dNTP，pH8.3)， 78pmol RMLA1引物和50pmol(反应2)或100pmol(反应1) 的RMLA2引物。PCR是用Taq DNA聚合酶(Boehringer Mannheim)在Biometra温度循环器中进行的。PCR参数为：90 ℃变性1分钟；50℃复性1分钟，72℃延伸1分钟，共30个循 环。用5％聚丙烯酰胺凝胶电泳加溴化乙锭染色分析扩增产物(图 2)。在反应2中得到的特异性扩增产物(大约500bp)经凝胶洗 脱后，克隆到TA载体中。 实施例3

克隆策略

在实施例1中描述了初次PCR所用的扩增寡核苷酸的衍生过 程(图1a)，实施例2中描述了欧寄生ML基因的初级基因片段 (以下称为“a”)的制备(图2)。从克隆的“a”片段序列起 始，在假定ML基因无内含子的前提下，可以衍生出序列特异的5’ 寡核苷酸。此寡核苷酸允许“b”、“c”“d”和“e”片段得 以扩增。尽管“c”的3’端寡核苷酸也从“a”的DNA序列中衍 生而来，然而构建扩增基因片段“b”、“d”、“e”和“g” 的简并的3’引物，不得不通过分析I型(“b”)和II型(“d”， “e”，“g”)的RIP蛋白的同源区来进行。又一次用蛋白家族 内的序列比较，来推出单个残基(特别注意了那些在密码子使用上 具有低的密码简并性的残基)的存在。特别用已知的蓖麻蛋白和相 思豆毒蛋白的cDNA及衍生的蛋白质序列，构建了大约50个ML 特异的寡核苷酸组合。图3只显示了能克隆出特异扩增产物并用于 进一步分析的那些。从其它的寡核苷酸组合出发，就得不到ML特 异性的扩增产物。关于基因片段“f”(编码MLA链)和“g” (编码MLB链)的制备将分别在实施例5和实施例6中详细描述。

为了分析ML基因的翻译区和非翻译区序列的5’和3’区，建 立了5’和3’RACE的条件[Frohman等1988]，这些条件导致产生 了片段“h”“i”和“j”。利用RACE-PCR对片段“j”的 扩增是制备全MLB基因片段的一种替代方法。RACE反应是用 cDNA进行的，cDNA是从檞寄生(宿主树为威尔逊杨)的叶子中 分离出的欧寄生总RNA经逆转录得到的。 实施例4

rMLA和rMLB的DNA序列和翻译产物

表达载体pT7-MLA和pT7-MLB插入片段的测序是用多种 ML-特异性寡聚核苷酸(图4a，b)采用“引物步移”策略(检测 两条链的完全重叠的序列)的标准方法测定的。底下划线的序列区 域是指为了克隆进表达载体pT7的限制性酶切位点。这两个基因片 段都依照如实施例5和6中所述表达载体的构建方案做了修饰。图 4c显示了从上述片段衍生而来的全部的ML基因序列。它包括了5’ 和3’非翻译区以及内肽和信号肽编码区。 实施例5

表达载体pT7-MLA的构建

为了进行外源表达，从全基因组檞寄生DNA用特异性PCR制 备编码檞寄生凝集素A链的序列，并经末端修饰过。通过所用的引 物的非互补区域加入翻译调控元件以及限制性酶切位点，从而允许 在前檞寄生凝集素原基因组的基础上克隆和单独表达檞寄生凝集 素A链。

图5b显示了通过PCR制备MLA的编码基因片段。为了扩增 编码MLA的基因序列，在总体积为50μl中用了200ng的欧寄生 基因组DNA、1.5mM(反应1)或2.5mM(反应2)氯化镁、 PML16和PML17引物寡核苷酸各40pmol和PCR缓冲液(10mM Tris-HCl，50mM KCl，0.25mM每种dNTP，pH8.3)。PCR是用 Taq多聚酶(1.5U/反应，Baehringer Mannheim)进行的，总共 30个循环，具体的温度要求为：94℃变性1分钟，52℃复性1分 钟，72℃延伸1.5分钟。扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳和溴化 乙锭染色来分析(图5b)并经凝胶洗脱以用于TA载体克隆。

编码rMLA相应于氨基酸残基酪氨酸1到酪氨酸17[Dietrich 等，1992，Gabius等，1992]的5’区序列，是通过将两个寡核苷酸杂交 并克隆再加上一个起始密码子作为一个合成基因片段而获得的。这 样，基因序列是对于如所描述的在大肠杆菌中高效表达基因的密码 子选择优化了的[Gribskov等，1984]。在合成的rMLA基因片段的 3’端以及经PCR获得的rMLA基因片段的5’端引入一个SspI的限 、制性位点而得到的。该位点的引入是通过将酪氨酸的密码子由TAC 特异地变为TAT而实现的。该位点允许两个rMLA基因片段在获 得载体PML14-17时融合(图5)。

所产生的编码rMLA的全长序列通过DNA测序得到证实(图 4)。为了获得rMLA在大肠杆菌中的表达，将基因序列从载体 PML14-17中分离出来，并通过插入到表达载体pT7-7中将该序 列置于T7-RNA聚合酶启动子和一个转录终止子的控制之下。所 得的表达载体pT7-MLA(图5)被用于转化大肠杆菌菌株BL- 21。 实施例6

表达载体pT7-MLB的构建

为了檞寄生凝集素B链的外源表达，将编码MLB的完整序列 通过特定的PCR从欧寄生全基因组DNA中扩增，并经所用的寡聚 核苷酸引物的非互补区引入翻译调控元件以及限制性酶切位点。

图6b显示了通过PCR制备完全编码rMLB的整个基因片段 的过程。编码rMLB的DNA片段的扩增是在总体积为50μl的PCR 缓冲液(10mM Tris-HCl，50mM KCl，1.5mM MgCl2 0.25mM每种 dNTP，pH8.3)中进行的，其中还加有200ng的欧寄生基因组DNA 和50pmol的RML25寡核苷酸引物以及30pmol(反应1)和10pmol (反应2)的RML26寡核苷酸引物。PCR是用Taq多聚酶(1.5U/ 反应，Boehringer Mannheim)进行的，共30个循环，94℃变 性1分钟，52℃复性1分钟，72℃延伸1.5分钟。PCR产物用1 ％的琼脂糖凝胶和溴化乙锭染色来检测。PCR的结果产物为 0.8kbp，通过凝胶洗脱分离，用于TA载体的克隆。编码rMLB的 基因片段通过插入表达载体pT7-7而置于转录调控元件的调控之 下，并用所得到的表达载体pT7-MLB对大肠杆菌表达菌株BL21 进行转化。PCR产生的、编码rMLB的全序列的完整性由DNA测 序来证实(图4b)。 实施例7

rMLA和rMLB的表达、免疫学分析、重折叠和体外重聚合

(I)rMLA在大肠杆菌中的表达

为表达重组檞寄生凝集素A链，在装有1升LBAMP培养基的 容量2升的沟状组织摇瓶中，接种5ml静置培养的大肠杆菌 BL21/pT7-MLA菌株的预培养物，在37℃条件下进行摇床培养。 利用578nm的浊度测定观测生长。当细胞密度达到了OD578≈ 0.9-1.0时，通过加入0.5mM IPIG诱导基因表达。诱导后两个小时， 通过5000rpm在GS-3离心机上4℃离心20分钟获得菌体沉淀， 而弃去培养基，从而收获得菌体。从1升的培养体积分离到3-4g (湿重)的细胞物质。

细胞裂解是用法式压榨机(SML仪器)进行的。细胞沉淀物 在20ml裂解缓冲液B(50mM Tris-HCl，100mM NaCl，1mM EDTA，5mM DTT，1mM PMSF pH8.0)中重新悬浮，利用法式压榨 机以1500psi进行两步裂解。不溶性的细胞级分和可能存在的包涵 体然后在SS-34离心机中(Sorvall)4℃以10,000rpm离心30 分钟而沉淀，从而与依然在上清液中的可溶性的大肠杆菌蛋白或可 溶性的表达产物分离开。

为了分析表达，等体积的细胞裂解级分用12.5％的SDS聚丙烯 酰胺凝胶电泳和考马斯亮兰染色检查，同时用MLA的特异性抗血 清TA5进行蛋白质印迹分析(图7a)。单克隆抗体TA5[Tonevitsky 等1995]由作者提供。象在本发明中应用的其它抗体一样，它们可 用各自的免疫原通过标准的技术来制备，(对于TA5的制备来说， 免疫原是ML-1或MLA)。为了检测表达，对等体积的大肠杆 菌裂解物可溶性级分(2，4，6，8道)及不溶的“包涵体”级 分(1，3，5，7道)中rMLA组分进行了检测。为了显示表达 的过程，采用了诱导基因表达之前(1，2道)诱导后2小时(3， 4道)、4小时(5，6道)和6小时(7，8道)的样品。表达 在诱导1个小时后，已通过一种对应于rMLA的25KDa的免疫阳 性蛋白的出现得到证实，这种蛋白的最大表达是在诱导后2小时。 诱导后两小时rMLA在可溶性和不溶性细胞级分中的分配是各为 50％，当表达时间延长时，将会引起不溶性“包涵体”形成的增 加。

(II)从不溶性的“包涵体”中分离rMLA

大肠杆菌全细胞裂解物的沉淀，依据Babitt等人[1990]所述的 方法，每次用20ml的STET缓冲液(50mM Tris-HCl，8％(w/v) 蔗糖，50mM EDTA，1.5％(v/v)的Tritonx-100，pH7.4)洗两遍以除 去大肠杆菌蛋白。剩余的沉淀物及其包含的“包涵体”在20毫升 的变性缓冲液(6M盐酸胍，100mM DTT，50mM  Tris-HCl，pH8.0)中溶解，溶解是通过在室温不断搅拌的条件下保温16 小时完成的。

对于rMLA的复性，处于变性缓冲液中的蛋白质溶液被缓慢 地逐滴加入到90倍体积的折叠缓冲液(50mM Tris-HCl 2mM DTT，1mM EDTA pH8.0)中，并在室温和不断搅拌的条件下孵育 16小时。沉淀的蛋白用一台GS-3(Sorvall)离心机，4℃ 6000rpm离心30分钟分离。包含有rMLA的上清液中加入20％ (v/v)的甘油在4℃保存。

(III)通过免疫亲和层析纯化rMLA

对于通过免疫亲和层析对rMLA(可溶性的表达产物级分或重折叠 蛋白)的一步纯化过程，260μg针对檞寄生凝集素A链的抗nMLA的单 克隆抗体IgG(TA5，Tonevitsky等1995)依照Harlow和Spur 〔1988〕所述的方法，共价固定在A蛋白葡聚糖凝胶CL4B(Sigma， Deisenhofen)上。在rMLA样品与免疫亲和基质共孵育后，用10倍床体 积的清洗缓冲液1(1M NaCl，10mM磷酸缓冲液，pH7.0)和10倍床体积 的清洗缓冲液2(10mM磷酸缓冲液，pH7.0)去除非特异性结合蛋白后， 特异性结合的rMLA用洗脱缓冲液(0.1M甘氨酸，pH2.5)洗脱。洗脱液 在包含有1M磷酸缓冲液pH8.0的容器中重调pH值。

(IV)rMLB在大肠杆菌中的表达

为了表达重组的檞寄生凝集素B链，在装有1升LBAMP培养基的容 量为2升的沟状组织摇瓶中，接种5ml静置培养的大肠杆菌BL 21/p77- MLA菌株的预培养物，37℃摇床培养。利用578nm的浊度测试仪观测 生长，当细胞密度达到OD578≈0.9-1.0时加入0.5mM IPTG以诱导基因表 达。为收获菌体，在诱导4小时后，用一个GS-3离心机(Sorvall) 在4℃，以5000rpm离心20分钟以获得沉淀，弃去培养基。

用一台法式榨机TM(SLM机械)进行细胞裂解。细胞沉淀在20ml 裂解缓冲液B(20mM磷酸缓冲液，50nM氯化钠，1mM ED TA， 1mM PMSF，pH7.2)中重悬浮，在1500psi下用法式压榨机2步裂解。 不溶性的细胞级分和可能的“包涵体”，然后在SS-34离心机(Sorvall) 上在4℃下以10,000rpm离心30分钟获得沉淀，并且与可溶性的大肠杆 菌蛋白或依然在上清中的表达产物分离开。

为分析表达，等体积的细胞裂解级分用12.5％SDS-聚丙烯酰胺凝 胶电泳检查和考马斯亮兰染色以及用特异抗MLB的抗血清TB33进行蛋 白质印迹分析(图7b)。单克隆抗体TB33〔Tonevitsky等1995〕由 本作者提供。它们是用标准技术制备的。相应的抗体，可以由本技术领 域内的专业人员用ML-1或MLB作为免疫原利用标准技术制备。为分 析表达，对大肠杆菌的可溶级分(2，4，6，8道)和不可溶级分(1， 3，5，7道)中的rMLB含量做了检测。为了显示表达的过程，采用 了基因表达诱导前(1+2道)，诱导后2小时(3+4道)4小时(5 +6道)、6小时(7+8道)的样品。表达在诱导后1小时已经由相 对应于檞寄生凝集素B链的31KPa的免疫阳性产物的出现而证明，该蛋 白在诱导后4小时达到最高表达。在诱导后4小时，rMLB在可溶性和 不可溶性裂解产物级分中的分配各为约50％，延长表达时间，将会使表 达的rMLB在不溶性“包涵体”中积累。

(V)从不溶性“包涵体”中分离rMLB

大肠杆菌全细胞裂解物的沉淀物，用每次20ml的STET-缓冲液 (50mM Tris-HCl，8％(w/v)蔗糖，50mM EDTA；1.5％(v/v)Triton X- 100pH 7.4)依据Babitt等人〔1990〕所述的方法冲洗两次，以除去大肠 杆菌蛋白。剩余的沉淀物及在其中所包含的“内涵体”通过在室温摇床 上孵育16小时在20ml变性缓冲液(6M盐酸胍，100mM DTT，50mM Tris-HCl，pH8.0)中溶解。

为了rMLB的复性，将处在变性缓冲液中的蛋白溶液，逐滴缓慢地 加入到90倍体积的折叠缓冲液(20mM磷酸缓冲液，50mM KCl，1mM EDTA，100mM葡萄糖，10％(v/v)甘油，10mM β-乳糖pH5.3)中并 在室温搅拌的条件下孵育16小时。沉淀的蛋白用GS-3离心机 (Sorvall)在4℃下以600rpm离心30分钟，从而使之与可溶性的折 叠的rMLG级分分离

(VI)利用N-乙酰-D-半乳糖胺琼脂糖凝胶上的亲和层析分 离rMLB

为了分离具有活性的可结合糖基的rMLB，N-乙酰半乳糖胺琼脂 糖凝胶亲和基质(PIERCE，USA)用10倍床体积的层析缓冲液平衡 (50mM磷酸缓冲液，300mM NaCl，1mM EDTA，10％(v/v)甘油， 0.05％(v/v)Tween-20 pH7.0)。样品的施用是通过将亲和基质分批在含 rMLB样品的溶液中4℃孵育至少2小时进行的。在用层析缓冲液清洗 亲和基质以除去非特异性结合蛋白后，结合的rMLB用竞争性的替代物 在层析缓冲液(pH4.0)中的0.3M N-乙酰半乳糖胺洗脱。

(VII)体外檞寄生凝集素链的重聚合以制备全蛋白

重组的檞寄生凝集素全蛋白(rML)可以从分离的折叠的檞寄生 凝集素A和B链起始，或经共折叠复性从变性蛋白开始制备。

对于分离的折叠的单链的重聚合，分离的檞寄生凝集素B链在 20mM磷酸缓冲液、50mM NaCl、1mM EDTA、pH7.2中，在4℃ 条件下，与过量1摩尔的rMLB共孵育16～48小时。为了形成链间二 硫桥，反应混合物在如下条件下孵育：含6mM谷胱甘肽(还原态与氧化 态之比为5∶1)，或含10mM谷胱甘肽(还原态与氧化态之比为2∶ 1)的氧化还原系统加1mM的蛋白二硫键异构酶(Boehringer Mannheim)。

对于通过共折叠从变性的单链开始的重聚合，rMLB链以2mg/ml的 浓度溶解在6M盐酸胍、1mM ETT、50mM Tris-HCl、pH8.0中， 为了完全还原半胱氨酸残基，将rMLB链溶解在6M盐酸胍、100mM DTT、50mM T-HCl pH8.0中，在室温孵育20分钟后，通过在PD -10上(Pharmacia，Sweden)的凝胶渗透重新更换6M盐酸胍、50mM Tris-HCl pH 8.0的缓冲液，最终将浓度调整到200μg/ml。rMBL与过 量一摩尔的rMLA共折叠来重聚合。以1∶30的比率将胍溶液缓慢地稀 释到偶联缓冲液(50mM磷酸钠缓冲液、50mM KCl、1mM EDTA；10％(v/v)甘油、100mM葡萄糖，10mM乳糖，pH8.0)中， 并在4℃下孵育16小时。为了形成链间二硫桥，反应混合物在含2mM 谷胱甘肽(还原态与氧化态比为1∶1)的氧化还原体系存在下孵育。

偶联反应混合物对贮存缓冲液进行透析(50mM磷酸钠缓冲液、 300mM NaCl、1mM EDTA；10％(v/v)甘油，0.05％(v/v)Tween-20， pH8.0)。异二聚体形成的检测和鉴定是用非还原条件下的SDS-PAGE 和随后的蛋白质印迹分析进行的，后者应用了针对檞寄生凝集素A链 (TA5)或B链的单克隆抗体(TB33)。合成的全蛋白的分离或游离 rMLA单体或rMLA凝聚体的分离，是利用在(VI)中所述的亲和层 析进行的，后者应用了N-乙酰半乳糖胺葡聚糖或乳糖基琼脂糖。

实施例8。

rMLA和rMLB的等电点均一性。

1～2μg rMLA、天然的MLA、rMLB、天然的MLB或ML全 蛋白与IEF标准蛋白(BioRad，USA)一起，在Servalyt PreNets IEF -凝胶(pH3～10 125×123mm，150μm Serva Heidelbeg)上进行等电 聚焦。为了分析，蛋白通过半干电影印(semi-dry electroblotting)法 固定到硝基纤维素膜(0.2μm，Schleicher&Schüll，Dassel)上。利用一个 MLA-特异的单克隆抗体CTA5(Tonevitsky等1995)对rMLA和 nMLA，用一个MLB特异的单克隆抗体(TB33，Tonevitsk等/1995) 对rMLB、nMLB和ML全蛋白进行免疫染色，免疫复合体则利用联接 有碱性磷酸酶的抗鼠IgG-IgG(Sigma Deisenhofen)染色，并与底物NBT 和BCIP反应(图8)。

尽管高度纯化的檞寄生凝集素A链以及B链都是等电点非均一蛋 白，nMLA和nMLB的等电点分别为5.2∶5.4∶5.5∶6.2和7.1∶7.3，重组的 rMLA链和rMLB链都是等电点均一蛋白，各自等电点为6.8和5.1(图 8)。因此，重组的檞寄生凝集素蛋白均一的迁移率证明了rML的均一 性，而自然存在的ML全蛋白存在有大量分子变体，具有微不均一性。

实施例9

rMLA的核糖体失活酶活性的检测：

由免疫亲和层析化纯化的rMLA(重折叠的)或rMLA(可溶性的) 以及天然的MLA链(nMLA)的蛋白浓度按Bradford〔1976〕所述 的方法利用BSA标准来测定。

为了对MLA的rRNA-N-糖苷酶活性进行检测和定量，利用“TNT 偶联的网状细胞体系”(Promega USA)建立了一种非放射性检测系统。每 次反应中，等量(20μl)的TNT体系在30℃先预孵育15分钟。为了 对翻译抑制定量，对照反应中加入2μl相应的缓冲液，而测试反应中加入 2μl的MLA系列稀释液(浓度从350～0pM)。对于每个反应，间隔8 分钟取两个样品，并在液氮中冷冻以中止反应。在生物发光实验中用液 体闪烁计数器测定荧光素酶相对量，(sqrt-cpm)，作为翻译活性的计量。 以各反应在不同时间取样测得的squt-cpm差别作为相对翻译活性的计 量。没有RIP的对照反应中的活性作为零失活率(IAR)。

通过用相对翻译失活率与rMLA的浓度(蛋白浓度)相对照，再利 用非线性回归法得出与对照反应相比具有50％的翻译活性抑制的蛋白浓 度。此IC50值是一个系统依赖性的值，从而可以对rMLA(可溶的)、 rMLB(重折叠的)以及nMLA的酶活力进行检测和定量。

图9显示了重组MLA链的核糖体失活酶活性的检测。通过对可溶 性表达产物(rMLA)的分离和从“包涵体”中分离的蛋白的重折叠(重 折叠的rMLA)，可以获得具有酶活性的表达产物。rMLA(可溶性的) 和rMLA(重折叠的)表现IC50值10.71.3pM或15.6±6.6pM相应的活 性。因此它们表现出比天然MLA链(IC501.1±0.7pM)低的毒性。

实施例10

檞寄生凝集素B链的糖基结合活性

对于檞寄生凝集素B链的糖基结合活性的检测以及对于天然的重组 的檞寄生凝集素B链的糖基结合活性及专一性的比较，是在竞争性糖存 在的情况下，用酶联凝集素反应(ELIA)来进行的。nMLB链和rMLB 链的结合活性通过用主要用于半乳糖以及N-乙酰乳糖胺残基的固定化 脱唾液酸胎球蛋白基质，和主要用于唾液酸的固定化胎球蛋白基质来确 定。

对于糖基质的固定化，将110μl的1.1mg脱唾液酸胎球蛋白(Sigma Deisenhofen)或1.1mg胎球蛋白(Sigma.Deisenhofen)在11ml PBS 中的溶液转移到MaxiSorp C96微孔板(Nunc，Wiesbaden)上，室温孵育 16小时。用150μl/孔PBS-T(10mM磷酸钠缓冲液，130mM NaCl， 0.1％(v/v)Tween-20，pH7.2)冲洗微孔板三次后，微孔板用200μl/孔 PBS-T-1％BSA(10mM磷酸钠缓冲液，130mM NaCl，0.1％(v/v) Tween-20，1％(w/v)BSA，pH7.2)在36℃孵育一个小时，以封闭非特 异性结合位点，然后用上述的溶液冲洗。为进行试验，应用了浓度为100～ 500ng/ml(优选400ng/ml)的100μl的B链制剂。实验浓度通过将样品 稀释在PBS-0.05％ BSA(10mM磷酸钠缓冲液，130mM NaCl， 0.05％(w/v)BSA，pH7.2)中来调整。每个试验浓度和对照准备2-3 份。用PBS-0.05％BSA或相应的制备缓冲液进行对照测定。为了测定 结合的特异性，样品在有游离的、竞争性糖存在的情况下孵育。为了从 脱唾液酸胎球蛋白或胎球蛋白基质上将结合的rMLB、nMLB或ML全 蛋白置换下来，应用的各种糖及相应的浓度范围为：半乳糖在0～280mM 为佳；N-乙酰半乳糖胺0～280mM；乳糖0～140mM；或唾液酸0～ 140mM。

微孔板在上样后在36℃孵育2小时，然后用上述方法冲洗。对于每 一个加样孔，加入10μl/孔羊抗檞寄生凝集素血清(1∶19800稀释于 PBS-T-0.1％BSA-Tx(10mM磷酸钠缓冲液，130mM NaCl， 0.1％(v/v)Tween-20，0.1％(w/v)BSA，1％(v/v)Triton-X100，pH7.2) 中的血清，36℃孵育2小时，然后如上所述冲洗。为检测免疫复合体， 每加样孔中加入辣根过氧化物酶联接的抗羊IgG-IgG(Sigma Deisenhofen)100μl，二抗以1∶3500的稀释在PBS-1％BSA中 (10mM磷酸钠缓冲液，130mM NaCl，1％(w/v)BSA，pH7.2)，36 ℃孵育一小时。各孔然后用150μl/孔的PBS-T洗6次。为了显色，加 入100μl/孔的底物溶液(1片邻苯二胺片剂(Sigma Deinsenhofen)在 25ml 65mM柠檬酸pH5.0中加10μl 30％的过氧化氢)，并在室温暗处 孵育20分钟。通过加入100μl/1M硫酸/孔来终止反应。利用吸收光度计 在450nm(参比波长690nm)处测定，同时用4参数法(4-Parameter Fit)从测得的数据来计算IC50值。

图10显示了从固定化的脱唾液酸胎球蛋白-配基用递增量的D- 半乳糖(图10a)、β-乳糖(图10b)或N-乙酰半乳糖胺(图0c) 置换rMLB和nMLB的数值，图10也显示了用递增量的唾液酸从固定 化的胎球蛋白-配体置换的数值，这些数值是在ELLA体系中观测到 的。nMLB和rMLB的结合特性用相对应于半数最大置换的IC50值描 述。

尽管植物nMLB链的糖基结合主要被半乳糖(IC50＝4.5mM)和β-乳 糖(IC50＝4.9mM)所竞争，重组的rMLB链令人吃惊地具有显著改变的糖 基结合专一性。与nMLB的糖基结合活性不同，rMLB的糖基结合活性 不能被半乳糖(IC50值未定)所竞争，而且仅被β-乳糖有限程度地竞 争(IC50＞70mM)。除了对于半乳糖和β乳糖急剧降低的亲和力外，重 组的rMLB链还具有对N-乙酰半乳糖胺的显著的专一性(IC50＝ 109mM)。对nBLB描述的另一结合唾液酸配体的活性，对于重组的 rMLB链同样也可以检测到(图10d)。对于植物nMLB链 (IC50＝49.8mM)和重组的rMLB链(IC50＝47.1mM)检测到相同的 结合亲和力。

相对于植物的主要是半乳糖/β-乳糖特异结合的nMLB链，重组制 备的MLB链具有一个明显地向N-乙酰半乳糖胺/唾液酸结合方向转移 的明显不同的糖基结合专一性。

实施例11。

在体外重聚合的rML全蛋白对于人淋巴白血病细胞的细胞毒作用 的检测。

檞寄生凝集素全蛋白完整性的检测是通过对人的单核(淋巴性)白 血病细胞系MOLT-4(欧洲动物细胞培养物保藏中心，编号 NO.85011413)的细胞毒作用的定量分析进行的。

MOLT-4细胞培养于无血清的MDC-1培养基(PAN SYSTEMS，Aidenbach)中，并将细胞密度调整至1.5×105MOLT -4细胞/ml，其中活细胞＞98％，以备检测。为了测定细胞毒作用，96 孔微孔板的每孔中，添加相当于18000细胞/孔的90μl MOLT-4细胞 悬液，并混以10μl的样品溶液。

在本实验中，相应地使用了檞寄生凝集素全蛋白制剂(批量号# 220793(Madaus)以及编号BRAIN 12/94，是用乳糖基葡聚糖，用标准技 术，从檞寄生的叶中或檞寄生茶中分离的〔Franz等1977〕)以及体外 重聚合的rML全蛋白，浓度范围是1～100pg/ml(1.6fM-1.66pM)，用 MDC-1细胞培养基系列稀释。各浓度样品和对照准备6个平行样。

细胞在37℃5％CO2的孵育箱中孵育72小时。细胞毒作用的定量 检测是通过用可溶性甲染料测定细胞的生存率来进行的。利用WST- 1方法〔Scudiero等1988〕用相应的细胞增殖试剂WST-1 (Boehringer Mannheim)测生存率。

重组的全蛋白以及杂合的全蛋白rMLB/nMLB相对于天然蛋白，表 现出一致的生物学活性，对于MOLT4-的细胞毒作用的IC50值为10～ 30pg/ml。然而，在测试的浓度范围中(rMLB最高到1ng/ml)，rMLB 并没有表现细胞毒效应。

实施例12

重组的檞寄生凝集素(rML)对人的单核细胞系U937的凋亡诱导。

对于用重组的檞寄生凝集素(rMLA/rMLB)进行的凋亡诱导过程 的检测是用荧光染料DAPI对核染色进行的〔Hotz等1992〕。在核形 态上的典型凋亡变化在显微镜下可见，对每样品计数500-100个细胞 的方法来定量。使用无血清培养基对实验的灵敏度是必要的，因为血清 蛋白的存在会大大减少可用凝集素的数目(10％FCS下减少约40倍， Ribereau-Gayon等1995)。24小时的诱导时间只允许与MOLT实验 部分直接相关，因为细胞毒作用在生存率实验中只有在72小时才明显显 示出，而凋亡是一种可以较早检测出来的效应。如果孵育时间过长，凋 亡就会被二级的坏死所遮盖。

图12显示了在用重组的ML全蛋白作用后，凋亡的U937细胞比率 显著的上升。在70pg/ml浓度下，凋亡细胞的数目在24小时后在无血清 培养的两个不同的培养物中增加3倍。因此，和天然蛋白〔Janssen等 1993〕一样，重组的檞寄生凝集素也可以诱导细胞凋亡。

实施例13

在PBMC模型中，重组的檞寄生凝集素的免疫刺激作用

在人复杂的免疫系统网络中，细胞因子TNF-α(单核细胞，巨噬 细胞)和IFN-rLT辅助细胞)是处于中心地位的介质。

从健康血液供体中得到的人的单核细胞(PBMC，包含单核细胞和 淋巴细胞)依照生产商(Pharmacia，Sweden)的说明；通过FICOLL -PAQUE密度梯度离心法分离。

为了诱导释放TNF-α，细胞(4×106单核细胞/ml)先在 RPMI1640培养基(包含10％(v/v)胎牛血清，100U/ml青霉素， 100μg/ml链霉素)中只与重组的檞寄生凝集素蛋白孵育18小时、然后与 从马流产沙门氏细菌(Solmonella abortus equi)中分离的1μg/ml的脂 多糖作为辅助刺激因子再孵育24小时，孵育是在37℃5％CO2和＞95％ 的相对湿度的条件下，在U形的细胞培养多孔板上，在充气的孵箱中进 行的、然后，在无细胞的上清液中，INF-α的浓度可以用任何ELISA 方法定量(Genzyme Diagnostics，Rüsselsheim)。

对于诱导释放IFN-γ，细胞在上述的培养基中与重组的檞寄生凝 集素单独孵育1个小时，然后，再与作为辅助性刺激因子的植物血凝集 素-L(浓度0.5μg/ml)一起共孵育65小时，方法如上所述。然后在 无细胞上清液中，用ELISA(ENDOGEN INC，Cambridge USA)方 法定量IFN-γ的相应浓度。

实施例14

在skin2 ZK 1200模型中重组檞寄生凝集素的免疫刺激作用。

作为生物检测法确立的skin2模型，由一片三维的包含成纤维细胞的 皮肤，和其自然分泌的基质中的未角质化的角质细胞而来的结构化上皮 组成〔Joller等1996〕。皮肤组织片(11×11mm2，来自人，原代培养 细胞，Advanced Tissue Science ATS，La Jolla USA)提供时放在琼脂 糖中的尼龙网上，接收后立即转移到特殊培养基A(ATS，La Jalla USA)中。

IL-1α和IL-6都是与人免疫系统相关的刺激性细胞因子。为诱 导释放IL-1α和IL-6，皮膜组织片和测试物质，在2ml的特殊培养 基B(ATS，La Jolla USA)中共孵育24小时，用12杯的细胞培养板 (Corning Glass Works Gorning USA)在37℃、5％CO2和＞95％的 相对湿度的情况下进行孵育。在无细胞上清液中，用ELISA对IL-1α (量化人IL-1α实验，R&D Systems.Inc.Minneapolis，USA)和IL -6(人白细胞介素-6 ELISA，Boehringer Mannheim GmbH)进行 定量。

skin2模型表明IL-1α的释放被0.25～8ng rML/ml以剂量依赖方 式诱导，IL-6的释放也以剂量依赖方式为0.5-8ng rML/ml所诱导(图 14)。令人吃惊的是，上述的所有细胞因子的释放都不能由单独的重组 rMLB引起。这个发现与早先本领域内的知识完全相反，以前认为，免 疫刺激作用主要由凝集素的B链活性引起〔Hajto等1990〕。

实施例15

重组的檞寄生凝集素B链(rMLB)对免疫活性细胞的活化。

免疫活性细胞的活化是用细胞表面蛋白CD69的诱导来检验的。 CD 69是T细胞、B细胞特别是自然杀伤细胞(NK细胞)活化后第一 批出现的细胞表面抗原之一，因为其对于肿瘤细胞的识别和裂解作用而 在对肿瘤的自然防御中起主要的作用。CD 69是上述免疫活性细胞群体 的一种活化标志，因为静止期的淋巴细胞不表达该细胞表面蛋白。而且， 对于可诱导的CD 69表面蛋白，可检测到对NK细胞和TcRγ/δT细胞的 细胞裂解活性的传导功能〔Moretta等1991〕。

为用流式细胞计(FACS)检测人单核细胞的表面标记，PBMC 用与实施例13中相似的方法在Hypague(Sigma)中用梯度离心法分离。 在将细胞溶解在含5％FCS的RPMI 160培养基中，并以约250000细 胞/每孔的量接种到微孔板上后，溶液分别与1、10、30和100ng的试 验底物rMLB共孵育4小时。在冰浴中与荧光标记的抗CD 69共孵育20 分钟，接着用含5％FCS的Hank氏液清洗。沉淀的标记细胞被加入到 200μl Sheath液(Sheath Fluid)中，并在FACScan(Becton Dickinson) 中测量。平均荧光值相应于每细胞CD 69标志的数量以及在整个细胞群 体中CD 69阳性细胞所占的份额。

在浓度范围为1～100ng/ml时，按细胞表面CD 69的出现以及按 CD 69阳性细胞的份额计，都可检测到单核细胞的活化。可以观察到一 个钟形的剂量依赖性曲线。在本实例中，既使在最高浓度100ng/ml rMLB 的情况下，也未检测到对PBMC的细胞毒作用。

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