抑制革兰氏阳性病原菌的组合物

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抑制革兰氏阳性病原菌的组合物
申请号	CN201680018680.7	申请日	2016-03-17	公开(公告)号	CN107708434A	公开(公告)日	2018-02-16
申请人	佩什托普公司;			发明人	F·范伊默西尔; K·范德里斯彻; R·迪卡泰尔; C·G·施瓦泽;
摘要	本发明涉及一种甘油酯组合物，其包含从戊酸和甘油以1:0.8至1:1.2的摩尔比反应获得的反应产物，用于减少和/或抑制革兰氏阳性病原菌的生长。本发明还涉及用于预防和/或减轻禽类胃肠道中坏死性肠炎的所述甘油酯组合物。
权利要求	1.一种甘油酯组合物，其包含从戊酸和甘油以1:0.8至1:1.2的摩尔比反应获得的反应产物，用于减少和/或抑制革兰氏阳性病原菌的生长。 2.根据权利要求1所述的甘油酯组合物，其中所述革兰氏阳性病原菌包括以下属的细菌：梭菌(Clostridia)。 3.根据权利要求1所述的甘油酯组合物，其中所述革兰氏阳性病原菌包括以下种的细菌：产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)。 4.一种甘油酯组合物，其包含从戊酸和甘油以1:0.8至1:1.2的摩尔比反应获得的反应产物，用于预防和/或减轻禽类胃肠道中的坏死性肠炎。 5.根据权利要求4所述的甘油酯组合物，其中坏死性肠炎是由产气荚膜梭菌引起的。 6.根据权利要求4或5所述的甘油酯组合物，其中所述禽类是鸡形目(galliformes)，如鸡、火鸡、松鸡或雉。 7.根据权利要求4或5所述的甘油酯组合物，其中所述禽类是雁形目(anseriforms)，如鸭、鹅或天鹅。 8.根据权利要求1-7中任一项所述的甘油酯组合物，其中所述甘油酯组合物包含至少 30重量％的甘油单戊酸酯、低于20重量％的甘油二戊酸酯和低于5重量％的甘油三戊酸酯。 9.根据权利要求1-7中任一项所述的甘油酯组合物，其中所述甘油酯组合物包含至少 40重量％的甘油单戊酸酯、低于15重量％的甘油二戊酸酯和低于2重量％的甘油三戊酸酯。 10.根据权利要求1-9中任一项所述的甘油酯组合物，其中所述甘油酯组合物中游离戊酸的量低于0.5重量％。 11.根据权利要求1-9中任一项所述的甘油酯组合物，其中所述甘油酯组合物中游离戊酸的量低于0.1重量％。 12.根据权利要求4-11中任一项所述的甘油酯组合物，其中所述甘油酯组合物以所述禽类每日饲料配给量的0.01至1.0重量％的量饲喂给所述禽类。 13.根据权利要求4-11中任一项所述的甘油酯组合物，其中所述甘油酯组合物以所述禽类每日饲料配给量的0.05至0.7重量％的量饲喂给所述禽类。 14.根据权利要求1-13中任一项所述的甘油酯组合物，其中所述甘油酯组合物被吸附在载体如二氧化硅载体上，从而使所述甘油酯组合物作为干燥产品进行分配。
说明书全文	抑制革兰氏阳性病原菌的组合物发明领域 [0001] 本发明涉及一种甘油酯组合物，其包含从戊酸和甘油以1:0.8至1:1.2的摩尔比反应获得的反应产物，用于减少和/或抑制革兰氏阳性病原菌的生长。它还涉及用于预防和/或减轻禽类(galloanserans)胃肠道(gastric tract)中坏死性肠炎的所述甘油酯组合物。 [0002] 发明背景 [0003] 革兰氏染色通过检测存在于革兰氏阳性细菌中的厚层中的肽聚糖通过其细胞壁的化学和物理性质来区分细菌。在革兰氏染色检测中，革兰氏阳性细菌保留结晶紫色染料，而在结晶紫之后添加的复染色素(通常是番红或品红)会使所有革兰氏阴性细菌呈红色或粉红色。 [0004] 在革兰氏阳性菌中是梭菌属(Clostridium)、李斯特菌属(Listeria)、芽孢杆菌属(Bacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)和链球菌属(Streptococcus)，它们都是人的病原菌。梭菌属包含约100个种，包括常见的自生细菌以及重要的病原体。 [0005] 梭菌属的种之一的产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)是普遍存在的孢子形成病原体，其产生至少15种导致人类和动物严重疾病的强有力的毒素(Popoff and Bouvet,2009)。 [0006] 产气荚膜梭菌引起人类广泛的症状，从食物中毒到气性坏疽，其为坏死、组织腐败和气体产生。气体在肌肉中形成气泡(捻发音)，在分解组织中形成特征气味。在快速和破坏性的局部扩散(可能只需要几个小时)之后，细菌和细菌毒素的全身扩散可能会导致死亡。这是重大创伤中和军事背景下的一个问题。 [0007] 普遍认为，产气荚膜梭菌毒素型A是肉鸡中几种不同疾病的原因，包括临床坏死性肠炎，其特征是峰值死亡率的爆发。2006年禁用动物饲料中抗微生物生长促进剂后，欧盟的肉鸡已经出现了这种经典急性临床形式的坏死性肠炎(Van Immerseel et al.,2009)。许多动物死亡而没有先兆征，在某些情况下，死亡率升高至高达50％(Wijewanta and Senevirtna,1971)。 [0008] 然而，产气荚膜梭菌也可引起不明显的感染或亚临床疾病，其特征在于小肠粘膜存在小溃疡性病变。普遍认为，这些小肠病变导致消化吸收差。此外，在屠宰肉的肉检查期间可以发现多灶性肝脏病变。这些红色或白色病灶是由于大量的产气荚膜梭菌引起定殖肝脏，导致多灶性胆管性肝炎(Kaldhusdahl and Hofshagen,1992)。 [0009] 所有这些病变导致体重增量下降和饲料转化比升高(Kaldhusdahl et al.,2001)。饲料转化比定义为饲料质量输入与体重输出的比。亚临床坏死性肠炎的经济影响被认为比临床坏死性肠炎的经济影响要重要得多。已经表明在20％的肉鸡中会发生亚临床坏死性肠炎。这导致饲料转化率提高10.9％，对经济造成严重影响。 [0010] 在世界范围内，坏死性肠炎可能是家禽中最广泛的肠道疾病之一，对受影响群体的表现产生相当大的影响。它可以表现为死亡率突然增加或作为一种徐发的亚临床疾病。坏死性肠炎的指征是在小肠粘膜中存在坏死性病变。坏死性肠炎的诊断是在尸检时进行的。 [0011] 除了在受影响的动物中造成严重的健康问题和巨大的经济损失外，诸如产气荚膜梭菌的病原体也可以从感染的动物传播到人类。处理这些动物的人们或动物或动物产品的消费者有被感染的危险，如上所述，发展成严重的疾病。 [0012] 抗菌耐药性的新问题导致2006年欧盟禁止生长促进抗生素。这需要采取新的替代方法来抵抗人类和动物中的病原菌。 [0013] 本领域众所周知的是，各种短链脂肪酸以及它们各自的甘油单酯具有抗菌性质。短链脂肪酸作为甘油酯分配伴随若干益处。甘油酯的腐蚀性低于相应的游离酸，便于处理和运输产品。一些短链脂肪酸，例如丁酸和戊酸，具有令人非常不愉快的气味。这些酸的相应甘油酯或多或少无臭味。此外，甘油酯结合短链脂肪酸，使得它们在吸附到血流之前能够到达人或动物的胃肠道中更靠下的部位。 [0014] 关于丙酸和丁酸的甘油酯作为抗菌剂的用途，已经公开了很多研究。然而，没有描述甘油单戊酸酯的具体抗菌作用。 [0015] 本发明显示甘油单戊酸酯比用甘油单丙酸酯或甘油单丁酸酯更有效地在体外用于减少和/或抑制革兰氏阳性细菌产气荚膜梭菌。在肉鸡的体内研究中证实了甘油单戊酸酯对产气荚膜梭菌的抗菌作用。 [0016] 发明详述 [0017] 本发明涉及一种甘油酯组合物，其包含从戊酸和甘油以1:0.8至1:1.2的摩尔比反应获得的反应产物，用于减少和/或抑制革兰氏阳性病原菌的生长。在本发明的上下文中，病原性应理解为在多种物种中引起临床或亚临床疾病，例如在禽类和/或人类中。被根据本发明的甘油酯组合物减少和/或抑制生长的革兰氏阳性病原菌可以是例如梭菌属、李斯特菌属和/或芽孢杆菌属。特别地，通过使用所述甘油酯组合物，革兰氏阳性细菌产气荚膜梭菌的生长被减少和/或抑制。 [0018] 本发明还涉及甘油酯组合物，其包含从戊酸和甘油以1:0.8至1:1.2的摩尔比反应获得的反应产物，用于预防和/或缓解禽类如鸡或火鸡的胃肠道中坏死性肠炎。 [0019] 根据本发明的一个实施方案，甘油酯组合物包含至少30重量％的甘油单戊酸酯、低于20重量％的甘油二戊酸酯和低于5重量％的甘油三戊酸酯。 [0020] 根据本发明的优选实施方案，甘油酯组合物包含至少40重量％的单戊酸甘油酯、低于15重量％的甘油二戊酸酯和低于2重量％的甘油三戊酸酯。 [0021] 游离戊酸具有令人不愉快的气味，导致处理问题。通过以甘油酯的形式将戊酸分配出来可以避免这些问题。根据本发明的一个实施方案，甘油酯组合物中游离戊酸的量低于0.5重量％，优选低于0.1重量％。保持游离戊酸的量低也可确保甘油酯组合物中的pH保持在甘油酯不会水解成甘油和游离酸的水平，因此产物保持稳定。 [0022] 根据本发明的一个实施方案，甘油酯组合物被吸附在惰性载体如二氧化硅载体上。这允许组合物作为干燥产品进行分配。这种二氧化硅载体优选包含平均粒径为20-70μm的多孔二氧化硅颗粒。根据本发明的一个实施方案，甘油酯组合物以50-80％甘油酯和20-50％二氧化硅颗粒的重量比吸附在二氧化硅颗粒上。分配吸附在二氧化硅载体上的甘油酯组合物有助于降低组合物中的水量，从而抑制甘油酯水解成甘油和游离酸。产品保持更稳定，与游离戊酸相关的气味问题得以最小化。 [0023] 根据本发明的甘油酯组合物可以添加到任何可商购的禽类饲料中。甘油酯组合物可以直接掺入市售饲料中或补充市售饲料。根据本发明的甘油酯组合物也可以添加到饮用水中。 [0024] 根据本发明的一个实施方案，饲喂给禽类的甘油酯组合物的量为禽类每日饲料配给量的0.01至1.0重量％，优选0.05至0.7重量％。实施例 [0025] 实施例1：一些短链脂肪酸及其各自的甘油单酯对产气荚膜梭菌的抗菌作用的体外实验。 [0026] 对于戊酸、丙酸和丁酸以及这些酸的相应的甘油单酯，测定针对产气荚膜梭菌的MIC(最小抑制浓度)值。结果可以在下表1中看出。 [0027] 表1. [0028]产气荚膜梭菌 MIC(mmol) 戊酸 15 丙酸 62 丁酸 62 甘油单戊酸酯 15 甘油单丙酸酯 250 甘油单丁酸酯 125 [0029] 从表1可以看出，戊酸比丙酸或丁酸对产气荚膜梭菌更有效。有趣地注意到的是，当使用戊酸的单酯时，仍然保留对产气荚膜梭菌所需的低抑制浓度的戊酸。在丙酸的情况下，与游离酸相比，单酯的MIC高四倍。用丁酸时，与游离酸相比，单酯的MIC翻倍。这使得甘油单戊酸酯是减少和/或抑制革兰氏阳性细菌如产气荚膜梭菌的极佳替代方案。 [0030] 实施例2：体内实验：使用甘油单戊酸酯来控制肉鸡产气荚膜梭菌诱导的坏死性肠炎 [0031] 研究了甘油单戊酸酯对肉鸡产气荚膜梭菌诱导的坏死性肠炎的影响。 [0032] 细菌菌株和疫苗 [0033] 在体内试验中使用的攻击菌株，产气荚膜梭菌，分离自一个具有体重增量问题的鸡群的具有坏死性病变的肉鸡的肠。该菌株被分类为A型菌株(netB阳性，β-2和肠毒素阴性)。 [0034] 将菌株在Brain Heart Infusion肉汤(BHI，Oxoid，Basingstoke，England)中培养12天(一天)或6小时用于接种。 [0035] 在本研究中使用了十倍剂量的抗球虫疫苗 -5(Schering-Plough Animal Health，Brussels，Belgium)，其包含以下球虫的活的、减毒卵囊：Eimeria(E.)acervulina、E.maxima(两个品系)、E.mitis和E.tenella。 [0036] 在饮用水中给予Nobilis Gumboro D 78疫苗(Schering-Plough Animal Health，Brussels，Belgium)。 [0037] 动物和饲养 [0038] 在该实验中，来自商业孵化场132只一日龄的Ross 308混合性别的肉鸡被分到2平方米的笼子，每个处理组33只鸡。在试验前，所有房间都用 (Clim'oMedic)和商业化抗球虫消毒剂(Bi-OO- Biolink Ltd,York,UK)消毒。给予鸡饮用水并随意饲养。应用23小时/1小时的光暗程序。 [0039] 实验研究设计： [0040] 前7天，鸡被喂以开口饲料(starter diet)，从第8天直到第15天则喂以中雏饲料(grower diet)。 [0041] 开口饲料和中雏饲料都是基于小麦/黑麦(43％/7.5％)的饲料，其中大豆粉作为蛋白质来源。从第17天开始，除了使用鱼粉(30％)作为蛋白质来源，使用相同的饲料。饲料由农业和渔业研究所(Institute for Agricultural and Fisheries Research，ILVO)提供。将测试的产品在饲料中混合。所有组在第16天在饮用水中给予Gumboro疫苗。所有组都在第17、18、19和20天，每天口服三次(8.00h；14.00h，20.00h)、大约5.108cfu的产气荚膜梭菌菌株56进行攻击。在第18天，所有的鸡都口服接种十倍剂量Paracox-5TM。在第21天，通过静脉注射戊巴比妥钠注射将所有动物安乐死。 [0042] 模型： [0043] 表2.体内研究的时间表。 [0044] [0045] 测试的产品： [0046] ·第1组：阴性对照(没有用产气荚膜梭菌的攻击) [0047] ·第2组：阳性对照 [0048] ·第3组：较低浓度的甘油单戊酸酯(吸附在二氧化硅载体上) [0049] ·第4组：较高浓度的甘油单戊酸酯(吸附在二氧化硅载体上) [0050] 将甘油单戊酸酯以下表3所示的两种不同的浓度序列添加到饲料中： [0051] 表3.添加到饲料中的产品的浓度(kg/吨) [0052] [0053] 小肠(十二指肠至回肠)肠道病变如下盲法评分： [0054] 0：无严重病变 [0055] 1：堵塞的肠粘膜 [0056] 2：小灶性坏死或溃疡(1-5个病灶) [0057] 3：局灶性坏死或溃疡(5-16个病灶) [0058] 4：局灶性坏死或溃疡(16个或更多个病灶) [0059] 5：坏死块2-3厘米长 [0060] 6：现场典型病例弥漫性坏死 [0061] 2或者更高的病变评分被分类为坏死性肠炎阳性 [0062] 统计分析 [0063] GraphPad Prism Software，Inc用于确定组间是否有显著性差异。P值<0.05确定为统计学上显著。 [0064] 结果 [0065] 图1显示了每组中宏观病变评分≥2的鸡的百分比。 [0066] [0067] (P≤0.01，*P≤0.001) [0068] 图1.阳性鸡的百分比(宏观病变评分≥2)。 [0069] 较低浓度的甘油单戊酸酯得到最好的结果，其中组内27％的动物被诊断为坏死性肠炎阳性。与阳性对照组(未向饲料添加甘油单戊酸酯)(其中71％的动物被诊断为坏死性肠炎阳性)相比，这是显著的改善。