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    • 3. 发明专利
    • 產製非人類之哺乳動物嵌合胚的方法
    • 产制非人类之哺乳动物嵌合胚的方法
    • TWI322183B
    • 2010-03-21
    • TW092136457
    • 2003-12-22
    • 財團法人台灣動物科技研究所
    • 李坤雄王慧雯張惠溶林之任杜清富
    • C12N
    • C12N15/8775
    • 本發明係關於一種產製非人類之哺乳動物嵌合胚(chimeric embryo)的方法,係利用去除透明帶(zona pellucida)之非人類1-細胞期胚至桑椹胚(morula)在微量離心管(Eppendorf vial)中與新鮮或剛解凍之細胞混合培養液共同培養(coculture)以得到非人類之哺乳動物嵌合胚;前述之嵌合胚經胚移置(embryo transfer)至非人類受胚動物,妊娠滿期之後,可得到具性腺遺傳能力之非人類嵌合動物及由非人類胚幹細胞所形成之動物(embryonic stem,ES,cell-derived animal)。 【創作特點】 有別於習知嵌合胚、嵌合動物製造技術之缺失,本發明係提供一種產製非人類之哺乳動物嵌合胚的方法,其步驟係包括:取得細胞;取得去除透明帶(zona pellucida)之非人類1-細胞期胚至桑椹胚(morula);將前述細胞與前述去除透明帶(zona pellucida)之非人類1-細胞期胚至桑椹胚(morula)於微量離心管(Eppendorf vial)中混合培養液共同培養(coculture)一段時間以得到非人類「胚-細胞」聚合體(embryo-cell aggregate);以及繼續培養非人類「胚-細胞」聚合體以獲得非人類嵌合胚(chimeric embryo)。
      前述之產製非人類之哺乳動物嵌合胚的方法,係可進一步包括以下步驟:將前述之非人類嵌合胚經由胚移置(embryo transfer)入非人類受胚動物(recipient)體內;以及使前述非人類嵌合胚於前述非人類受胚動物體內發育至妊娠滿期而得到非人類嵌合動物(chimera)或得到由非人類胚幹細胞所形成之動物(embryonic stem cell-derived animal)。本發明之另一目的係提供一種產製非人類之嵌合哺乳動物的方法,其步驟係包括:取得細胞;取得去除透明帶(zona pellucida)之非人類1-細胞期胚至桑椹胚(morula);將前述細胞與前述去除透明帶(zona pellucida)之非人類1-細胞期胚至桑椹胚(morula)於微量離心管(Eppendorf vial)中混合培養液共同培養(coculture)一段時間以得到非人類「胚-細胞」聚合體(embryo-cell aggregate);繼續培養非人類「胚-細胞」聚合體以獲得非人類嵌合胚(chimeric embryo);將前述之非人類嵌合胚經由胚移置(embryo transfer)入非人類受胚動物(recipient)體內;以及使前述非人類嵌合胚於前述非人類受胚動物體內發育至妊娠滿期而得到非人類嵌合動物(chimera)或得到由非人類胚幹細胞所形成之動物(embryonic stem cell-derived animal)。
      利用本發明之產製非人類之哺乳動物嵌合胚的方法係可成功地將前述非人類嵌合胚成功埋植(implantation)入非人類受胚動物,並於妊娠滿期時,可自然分娩或剖腹產得到非人類嵌合動物(chimera)或得到由非人類胚幹細胞所形成之動物(embryonic stem cell-derived animal)。
      前述在微量離心管中共同培養時,係可視實際操作需要而使用合適的培養液,包括,例如,但不限於:STO、KSOM、KSOM-AA、CZB或M16培養液等;亦可依照需要,於培養液中添加有合適濃度之血清(serum)或化學粘著劑,例如:凝集素(lectins)。
      前述在「胚-細胞」聚合體、嵌合胚培養所用之培養液,係可視實際操作需要而使用合適的培養液,包括,例如,但不限於:STO、KSOM、KSOM-AA、CZB或M16培養液等;亦可依照需要,於培養液中添加有合適濃度之血清。
      前述之方法所使用之細胞可為所有種類細胞株(cell line)細胞或非株化初代細胞(primary cell);可以是經純化(purified)或未經純化處理之細胞;亦可以是遺傳物質(DNA或RNA)未經改變或經過改變之細胞,例如:基因隨機插入(random insertion)、基因定位(gene targeting)等改變者。
      前述之去除透明帶1-細胞期胚~桑椹胚可以是正常染色體二套(2n)或多套,例如:四套(4n)或八套(8n)者。
      前述之取得去除透明帶之非人類1-細胞期胚至桑椹胚之方式係包括活體內(in vivo)發育、活體外(in vitro)培養系統或混合活體內發育和活體外培養系統所得。
      前述之方法所使用之細胞及去除透明帶之非人類1-細胞期胚至桑椹胚之來源係為同種(species)或不同種非人類之哺乳動物。
      前述方法所述之胚移置入非人類受胚動物體內非人類受胚動物之體內係包括移置入非人類受胚動物之輸卵管、子宮或子宮角。
      前述方法所使用之微量離心管係可為任何規格管狀產品,其材質為可供滅菌處理(例如,但不限於,高壓滅菌、γ-射線照射、酒精滅菌、紫外線滅菌、乾熱滅菌等)、其容量不拘。
      前述之“哺乳動物”係指韋氏醫學桌上辭典407(Webster’s Medical Desk Dictionary 407)(1986)所定義之較高等脊椎動物(higher vertebrate),包括哺乳動物綱(Mammalia class)之任何組員,本發明之方法係可使用於除人類以外之前述定義之哺乳動物。
    • 本发明系关于一种产制非人类之哺乳动物嵌合胚(chimeric embryo)的方法,系利用去除透明带(zona pellucida)之非人类1-细胞期胚至桑椹胚(morula)在微量离心管(Eppendorf vial)中与新鲜或刚解冻之细胞混合培养液共同培养(coculture)以得到非人类之哺乳动物嵌合胚;前述之嵌合胚经胚移置(embryo transfer)至非人类受胚动物,妊娠满期之后,可得到具性腺遗传能力之非人类嵌合动物及由非人类胚干细胞所形成之动物(embryonic stem,ES,cell-derived animal)。 【创作特点】 有别于习知嵌合胚、嵌合动物制造技术之缺失,本发明系提供一种产制非人类之哺乳动物嵌合胚的方法,其步骤系包括:取得细胞;取得去除透明带(zona pellucida)之非人类1-细胞期胚至桑椹胚(morula);将前述细胞与前述去除透明带(zona pellucida)之非人类1-细胞期胚至桑椹胚(morula)于微量离心管(Eppendorf vial)中混合培养液共同培养(coculture)一段时间以得到非人类“胚-细胞”聚合体(embryo-cell aggregate);以及继续培养非人类“胚-细胞”聚合体以获得非人类嵌合胚(chimeric embryo)。 前述之产制非人类之哺乳动物嵌合胚的方法,系可进一步包括以下步骤:将前述之非人类嵌合胚经由胚移置(embryo transfer)入非人类受胚动物(recipient)体内;以及使前述非人类嵌合胚于前述非人类受胚动物体内发育至妊娠满期而得到非人类嵌合动物(chimera)或得到由非人类胚干细胞所形成之动物(embryonic stem cell-derived animal)。本发明之另一目的系提供一种产制非人类之嵌合哺乳动物的方法,其步骤系包括:取得细胞;取得去除透明带(zona pellucida)之非人类1-细胞期胚至桑椹胚(morula);将前述细胞与前述去除透明带(zona pellucida)之非人类1-细胞期胚至桑椹胚(morula)于微量离心管(Eppendorf vial)中混合培养液共同培养(coculture)一段时间以得到非人类“胚-细胞”聚合体(embryo-cell aggregate);继续培养非人类“胚-细胞”聚合体以获得非人类嵌合胚(chimeric embryo);将前述之非人类嵌合胚经由胚移置(embryo transfer)入非人类受胚动物(recipient)体内;以及使前述非人类嵌合胚于前述非人类受胚动物体内发育至妊娠满期而得到非人类嵌合动物(chimera)或得到由非人类胚干细胞所形成之动物(embryonic stem cell-derived animal)。 利用本发明之产制非人类之哺乳动物嵌合胚的方法系可成功地将前述非人类嵌合胚成功埋植(implantation)入非人类受胚动物,并于妊娠满期时,可自然分娩或剖腹产得到非人类嵌合动物(chimera)或得到由非人类胚干细胞所形成之动物(embryonic stem cell-derived animal)。 前述在微量离心管中共同培养时,系可视实际操作需要而使用合适的培养液,包括,例如,但不限于:STO、KSOM、KSOM-AA、CZB或M16培养液等;亦可依照需要,于培养液中添加有合适浓度之血清(serum)或化学粘着剂,例如:凝集素(lectins)。 前述在“胚-细胞”聚合体、嵌合胚培养所用之培养液,系可视实际操作需要而使用合适的培养液,包括,例如,但不限于:STO、KSOM、KSOM-AA、CZB或M16培养液等;亦可依照需要,于培养液中添加有合适浓度之血清。 前述之方法所使用之细胞可为所有种类细胞株(cell line)细胞或非株化初代细胞(primary cell);可以是经纯化(purified)或未经纯化处理之细胞;亦可以是遗传物质(DNA或RNA)未经改变或经过改变之细胞,例如:基因随机插入(random insertion)、基因定位(gene targeting)等改变者。 前述之去除透明带1-细胞期胚~桑椹胚可以是正常染色体二套(2n)或多套,例如:四套(4n)或八套(8n)者。 前述之取得去除透明带之非人类1-细胞期胚至桑椹胚之方式系包括活体内(in vivo)发育、活体外(in vitro)培养系统或混合活体内发育和活体外培养系统所得。 前述之方法所使用之细胞及去除透明带之非人类1-细胞期胚至桑椹胚之来源系为同种(species)或不同种非人类之哺乳动物。 前述方法所述之胚移置入非人类受胚动物体内非人类受胚动物之体内系包括移置入非人类受胚动物之输卵管、子宫或子宫角。 前述方法所使用之微量离心管系可为任何规格管状产品,其材质为可供灭菌处理(例如,但不限于,高压灭菌、γ-射线照射、酒精灭菌、紫外线灭菌、干熱灭菌等)、其容量不拘。 前述之“哺乳动物”系指韦氏医学桌上辞典407(Webster’s Medical Desk Dictionary 407)(1986)所定义之较高等嵴椎动物(higher vertebrate),包括哺乳动物纲(Mammalia class)之任何组员,本发明之方法系可使用于除人类以外之前述定义之哺乳动物。